Abstract
Sitosolik Ca + 2 iyonları, gen transkripsiyonu, elektriksel uyanlabilirliği ve hücre çoğalması gibi çok kapsamlı işlemlerin kontrol, hemen hemen tüm hücre tiplerinde hücresel aktivitesi sayısız yönlerini düzenleyen. Ca 2 + sinyalizasyon çeşitliliği ve özgünlüğü yerel geçici Ca 2 + microdomains dakika süre boyunca meydana gelen hücre çapında titreşimler ve dalgalar arasında değişen Ca 2 + sinyalleri farklı zaman ve mekansal ölçekler üzerinde hareket oluşturulur hangi mekanizmalar, türemiştir (Ca 2+ ponponları) kalıcı milisaniye. Elektron son gelişmeler CCD (EMCCD) kameralar artık> 500 kare saniye -1 (fps) oranlarında 128 x 128 piksel mekansal çözünürlüğe sahip yerel Ca 2 + sinyalleri görüntüleme için izin çarpılır. Bu yaklaşım son derece paralel ve tek bir deneyde kanallar veya puf sitelerin yüzlerce eşzamanlı izlenmesini sağlar. Ancak, verilerin büyük miktarlarda üretilen (yaklaşık 1 Gb per dk) 2+ olayları uygulanamaz yerel Ca görsel kimlik ve analiz kılıyor. Burada tarif ve satın alma, algılama için prosedürleri göstermek ve geniş alan epi-floresan (WF) ve toplam iç yansıma ikisini de kullanarak Ca 2 + göstergeleri ile yüklenen sağlam memeli hücrelerinde Ca 2+ sinyalleri aracılı 3 yerel IP analizi floresan (TIRF) mikroskopi. Ayrıca, bu yerel Ca 2 + sinyallerin belirlenmesi ve analizi otomatik açık kaynak yazılım ortamı Python içinde geliştirilen bir algoritma tarif. algoritma alt piksel çözünürlüğe sahip Ca 2+ sürümü siteleri lokalize; veri kullanıcı gözden sağlar; ve bir Excel uyumlu tabloda genlik ve kinetik verileri ile birlikte floresan oranı sinyallerinin zaman dizilerini çıktılar.
Introduction
Kalsiyum iyonları (Ca 2+) yayg gen ifadesi, sekresyon ve sinaptik plastisite 1 uzun ömürlü değişiklikler dahil olmak üzere biyolojik süreçlerin, çeşitli bir yelpazede düzenler. Ca 2 + Böyle farklı bir şekilde hareket hangi aracılığıyla bir yolu Ca 2+ farklı mekansal ve zamansal desenleri ile bir hücre oluşturabilir sinyalleri. Sitozolik örnek küresel yükselme düz kas dokusu 2 ise daha küçük [Ca 2+] tetik daralma, lokalize geçici yükselmeler (yerel Ca 2 + mikro bölgeler) için öğrenme ve bellek 3 için gerekli gen ifadesini teşvik.
Ücretsiz sitozolik [Ca 2 +] ~ 100 nM dinlenme tutulur, fakat hızla Ca ile sitozolüne Ca 2+ akını aşağıdaki birkaç mikro-molar plazma zarı ve yanında bulunan 2 + -geçirgen iyon kanallarını çıkabilir hücre içi s Ca 2+ kurtuluştores. Bizim laboratuvar endoplazmik retikulum (ER) zarında bulunan Ca 2 + bırakma kanalı oluşturan inositol 1,4,5-trifosfat alıcısı (IP 3 R), odaklanır. Reseptör siteleri aktive sitozolik hem IP 3 ve Ca 2+ bağlanması üzerine, IP 3 R kanalı Ca 2 + ER lümeninde tecrit kurtarmak açılır. Ca 2+ salınımı uzamsal (Ca 2 + puf 4) 2+ Ca yerel sitozolik mikro oluşturmak için IP 3 Rs küçük bir küme sınırlı kalabilir veya IP 3 Rs komşu kümelerinin yakınlığı bağlı olabilir Ca 2+ indüklediği Ca 2 + -salınımı (YÜÇAM) 5,6 süreciyle birden puf siteleri işe bir hücre boyunca yaymak.
Gelişmiş mikroskobu IMAGI ile birleştiğinde Tsien 7 Roger tarafından geliştirilen floresan küçük moleküllü Ca 2+ gösterge boyaların tanıtımı,teknikleri ng, Ca 2+ sinyalizasyon anlayışımızı büyük katkı sağlamaktadır. Mikroskopi için kullanılan kameralar son gelişmeler şimdi böyle görülmemiş mekansal ve zamansal çözünürlüğe sahip ponponları gibi geçici yerel Ca 2 + olayları görüntüleme için izin verir. Şu anda mevcut EMCCD kameralar> 500 kare saniye -1 (fps) ve tamamlayıcı metal oksit yarı iletken yeni nesil 128 x 128 piksel ile görüntüleme sağlayan (CMOS) kameralar biraz daha yüksek pahasına yüksek piksel çözünürlük, ve hatta daha hızlı sağlamak gürültü seviyeleri. Toplam iç yansıma (TIRF) mikroskopi ile birlikte bu görüntüye artık tek Ca 2 + kanal olayları 8,9 mümkündür. Impracticable manuel işleme, görsel kimlik ve analiz hale ve otomatik algoritmalarının geliştirilmesi yapma yükümlülüğü büyük veri setleri (min başına yaklaşık 1Gb) oluştururken Bu yaklaşım, aynı zamanda kanal / olayların yüzlerce görüntüleme için izin verir.
2 + göstergeleri kullanarak sağlam memeli hücrelerinde yerel Ca 2 + sinyalleri görüntüleme prosedürlerini ve protokolleri sunuyoruz. Biz daha TIRF ve geleneksel geniş alan epi-floresan (WF) mikroskopi hem görüntülü yerel Ca 2 + olayların belirlenmesi ve analizi otomatik açık kaynak kodlu ortam Python geliştirilen bir algoritma göstermek. Biz IP Ca 2 + sinyalleri -generated 3 bağlamında bu yaklaşımları açıklamak rağmen, [Ca 2 +] Ca çeşitli ya yüzeye bulunan 2+ -geçirgen iyon kanallarını yayılan sitozolik yerel değişiklikleri incelemek için kolayca mükellef olan Membran ya da hücre içi organellerin 8-10.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Biz insan nöroblastom SH-SY5Y hücrelerinde yerel Ca 2 + olayları görüntüleme ayrıntılı prosedürler sunuyoruz. Bu prosedürler, çoğu hücre tipinde 8-10 görüntü hücre içi Ca + 2 sinyallere uyarlanabilir.
Hücreler 1. Hazırlık
- Kültür hücreleri tedarikçinin Web sitesinde listelenen talimatlara göre yansıması için.
- Görüntü vermeden önce birkaç gün, hasat hücreleri, 1 ml 0.25% tripsin / EDTA (2-3 dakika) kullanılarak bir doku kültürü şişesi içinde büyütülür. Dekolmanı ardından, tripsin inaktive kültür ortamı eşit hacimde ekleyin.
- Tabağı başına 3-7 x 10 4 hücre yoğunluğunda cam alt görüntüleme kapları içine bir hemasitometre ve tohum hücreleri kullanılarak bir hücre sayımı yapın. Görüntüleme deneyleri için hücreleri seçin onlar% 60 izdiham (2-3 gün) ulaştığınızda.
Çözümler ve Reaktifler 2. Hazırlık
- Tamponlu Ca 2+ çözülebilmekle HEPES hazırlayın(mM) oluşan tuz çözeltisi (Ca 2 + -HBSS): 135 NaCl, CaCI2, 1 MgCl2, 10 HEPES, 10 glukoz 5.4 KCI, 2; pH = 7.4 NaOH ile oda sıcaklığında (RT). 4 ° C 'de glikoz ve mağaza eklenmeden Ca 2 + -HBSS hazırlanması; kullanımdan hemen önce solüsyona glikoz ekleyin.
- Floresan Ca2 + göstergesi Cal-520 (1 mM) zara nüfuz edici formları çözünür, Cı-IP 3 (200 uM) ve EGTA% 20 Pluronic F-127 içeren bir dimetil sülfoksit (100 mM), (DMSO). -20 ° C de, nem ve ışıktan korunan Eppendorf tüpleri ve mağaza içine, bu reaktif maddeleri bir kısım.
3. Yükleme Hücreler Membran-geçirgen, Cal-520 ci-IP 3 ve EGTA
- Ca + 2 -HBSS sırasıyla 5 uM ve 1 uM nihai bir konsantrasyona kadar zara nüfuz edici Cal-520 ve CI-IP 3 stok çözelti seyreltilerek "yükleme tamponu" hazırlayın.
- Aspire culture medya ve Ca 2+ -HBSS üç kez medya değiştirerek hücreleri durulayın.
- Ca2 + çıkarın -HBSS ve karanlıkta, oda sıcaklığında 60 dakika süre ile yükleme tampon maddesi içinde hücrelerin inkübe edin.
- Yükleme tamponu çıkarın ve Ca 2+ -HBSS üç kez medya değiştirerek hücreleri durulayın.
- Arzu edildiği takdirde, bu aşamada, daha sonra yük Ca 2 + -HBSS 5 mM'lik bir son konsantrasyona kadar stok çözelti seyreltilerek EGTA / AM ile hücreler ve karanlıkta, oda sıcaklığında, 30-60 dakika boyunca kuluçkalayın. Bu inkübasyonun ardından, 3.5 adıma devam etmeden önce, hücreler Ca + 2 -HBSS ile üç kez yıkayın.
- Yüklenen reaktifler de-esterifikasyonu için izin vermek için 30 dakika süre ile Ca + 2 -HBSS hücreleri inkübe edin.
- Görüntüleme hemen önce, son inkübasyon sırasında banyoya sızan olabilecek boya kaldırmak için "taze" Ca 2 + -HBSS Ca 2+ -HBSS değiştirin.
4. Ca 2+
- 100X APO TIRF objektif üzerine daldırma yağ küçük bir damla (NA 1.49) yerleştirin.
- Ters mikroskop sahnede görüntüleme çanak monte ve iletilen ışık kullanarak odak noktası haline getirmek hücreleri. Bu kayıt sırasında hareket etmesini önlemek için görüntüleme çanak sabitlemek için önemlidir.
- Yüksek hızlı EMCCD kamera kullanılarak yayılan floresan (λ> 510 nm) Cal-520 heyecanlandırmak ve toplamak için bir 488 nm lazer ile hücreleri aydınlatın.
NOT: mikroskop faaliyet yazılım paketi kullanıcı lazer ışını ya ("WF" uyarma için) daha merkezi ya da (TIRF uyarma için) objektif arka diyafram aşırı kenarında tanıtılacak sağlayan bir odaklama lens çevirmek için izin verir. - EMCCD yazılımı kullanarak, yerel Ca 2 + olayları yakalamak için gerekli zamansal çözünürlükte veri toplamak için tam 512 x 512 piksel görüntüleme alanını azaltır.
NOT: Örneğin, orta dörtlü256 x 256 piksel edinimi 66 fps'ye satın alma oranını hızlandırır. Bundan başka, bir izole edilmiş Bitki Mod fonksiyonu kullanılarak 500 fps EMCCD kameranın kare hızını arttırmak için de mümkündür. - Otomatik, bazal aktivite birkaç saniye kayıt hücrelere UV flaş teslim ve başka 10-30 saniye kayıt devam etmek yazılım yapılandırın.
NOT: UV flaş mikroskop arka limanında dikroik ayna yansıtan bir UV ile tanıtıldı Xenon ark ışık kaynağı kullanılarak teslim edilir. UV flaş süresi ve yoğunluğu yerel Ca 2 + olayların İstenen frekansı uyandırmak için ampirik ayarlanır. - Görüntü off-line analiz için yığılırken dosyaları kaydedin.
5. Otomatik Ca 2+ Görüntü Analizi
NOT: Bu görüntülemek, süreç ve birçok ticari yazılım paketleri kullanılarak yakalanan verileri analiz etmek mümkündür. Ancak, hızla tanımlanması bir otomatikleştirmek için bir algoritma geliştirdikYerel Ca 2 + sinyalleri d analizi. Bu algoritma, mekansal ve zamansal filtre ayrıntılı bir tarifi, mesafe kadar taşınmış / F 0 ve kimlik / analiz rutinleri üretimi 11 bulunabilir. Bu algoritma, açık kaynak kodlu bir yazılım platformu Python üzerinde çalıştırmak için geliştirilmiştir, tarafından, birlikte örnek deneysel verilere ve detaylı kullanıcı talimatları ile elde edilebilir, e-posta gelen yazar (ismith@uci.edu).
- Dosyalarını dönüştürme çoklu uçağın .tiff dosya formatına özel yazılmış algoritma ithal edilecek.
- Analiz algoritması içeren klasörü bulun ve çift tıklayın RUN.EXE.
- .tiff Dosyayı seçin analiz edilecek.
- Açık iletişim kutusunda analiz parametrelerini seçin. Örnek verileri için varsayılan parametreleri Şekil 2A bakın.
- Siyah seviyesini belirlemek ya n yapar görüş alanının bir kısmına imleci hareket ettirerek görüntü yığını ofset edilecekot hücreyi içerirler (Şekil 2B bakınız) veya elle 'Set Siyah Seviye' istemini kullanarak siyah seviyesi girerek.
- Yazılım (Şekil 2C-F) tarafından analiz aşağıdaki ekranda dört pencere gözlemleyin. C hücrelerinden floresan istirahat bir tek renkli görüntü analiz ediliyor. Bu resmin üzerine bindirilmiş Beyaz kareler olaylara takılı iki boyutlu Gauss fonksiyonları sentroid pozisyonları olarak belirlenen etkinlik konumları vardır.
- Her olay yere tıklayın ya da olaylar arasında dolaşmak için imleç tuşlarına basın. Bunu yaparken üzerine arka plan çıkarılır, Gauss penceresi D. bu siteler güncelleme her floresan oranı değişiklikleri (mesafe kadar taşınmış / F 0) düzeltti
NOT: Kırmızı olayları komşu sitelere lokalize faaliyetten 'sızdırma-through' o belirli sitesinden kaynaklanan ve kararlı olduklarını vurguladı. Seçilen yerinde floresan sinyal algılama aştı nerede alt mavi iz gösterirSiyah çizgi söz konusu sitesinden kaynaklanan olayları tanımlar ise eşik, (kırmızı karşılık gelen olayları vurgulanan). - Bir kırmızı tıklayın olayın zamansal evrimi görüntüler pencere E, ve birlikte takılan Gauss fonksiyonu mekansal profili ile, olayın mekansal profil zamanı boyunca ortalama görüntüler pencere F güncellemek için olay vurgulanır.
- El eserler analiz reddedilmesi, böylece tespit edilmiştir olaylarını. Sağ kırmızı tıklayarak tür olayları silmek olayları vurgulanır.
NOT: Bizim ellerde, Ca tek bir IP 3 R kanallardan 2+ akı kadar taşınmış / F 0 yaklaşık 0.11 ile sinyalleri çağrıştırıyor, bu nedenle bu ölçüde daha küçük herhangi bir tespit 'etkinlikleri' yanlış pozitif olması muhtemeldir. - Kaydet CellR ilgi hücrenin etrafında çizim ve 'seçerek hücre bazında bir veri veya ihracat' Excel kaydet 'seçerek İhracat verileri17 ;.
NOT: Veriler, orijinal görüntü yığınıyla aynı klasöre kaydedilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Şekil 1A, CI-IP 3 yüklü insan nöroblastoma SH-SY5Y hücrelerinin Cal-520 floresan dinlenme bir WF görüntüsünü gösterir. Fotoğraf-sürüme 100 milisaniye UV flaş bu hücrelerin Pozlama i-IP 3 (Şekil 1A beyaz çevreler tarafından not) ayrık siteleri geçici Ca 2 + ponponları ortaya çıkardı. Bu sitelerde ölçülen Floresan izleri yavaş yavaş bırakma sitesinden yayılan 2+ Ca gibi bir çok yavaş düşen faz (Şekil 1B ve 1C) izledi IP 3 Rs geçici açıklıklar, sayesinde hızlı yükselen faz gösterdi. Kırmızı Şekil 1B olaylar algoritma ile belirlenmiştir Ca 2+ sinyalleri seçilen sitesinden kaynaklanmış için vardır vurguladı. Sigara vurgulanan olaylar ca yakından bitişik sitelerden difüzyon 2+ sinyalleri kirletici temsil eder.
Yerel Ca yüksek çözünürlüklü görüntüleme elde etmek için
Bu şekilde yakalanan görüntü yığınlarının analizi büyük ölçüde açık kaynak yazılım platformu Python 11 bizim laboratuar çalışan geliştirilen özel bir algoritma ile yazılı kolaylaştırılır. Şekil 2A kullanıcı tanımlama ve görüntü yığınlarının sonraki analiz için kullanılacak parametreleri girdiği açılış iletişim penceresini gösterir. Bunu takiben, kullanıcı tüm görüntü yığından çıkarılacak bir siyah seviyesini seçmesi istenir sonra kimlik ve analiz algoritması çalışır Şekil 2C-F gösterisi, sırasıyla, yerel Ca 2+ sürümü subselüler siteleri.; Seçilen sitelerde etkinlik; genişletilmiş zaman ölçeği üzerinde bireysel olaylar; ve temsili olayların mekansal profilleri (detaylar için Şekil 2 efsane bakınız). Belirlenen sitelerin kullanıcı inceleme sonucunda, tüm olayların (Tablo 1) 'Kaydet Excel' fonksiyonunu seçerek ihraç edilebilir için verileri analiz.
Içinde TIRF görüntüleme elde çözünürlükte iyileşme hem gösteren Şekil 3 hediye veriler yüklenmemiş hücrelerde WF görüntüleme ile karşılaştırıldığında hücreleri EGTA yüklü, ve pbelirlenmesi ve yerel Ca 2 + sinyalleri analiz algoritması ower. Şekil 3A Cal-520 ve ci-IP 3 ile sadece yüklü bir hücrede WF tarafından görüntülenmiş bir temsilci yerel olayı gösterir. Karşılaştırma için, Şekil 3B benzer bir olay gösterir ama şimdi daha EGTA yüklü bir hücrede TIRF mikroskobu ile görüntülenmiş. Şekil 3C ve 3D üst üste izleri. Zamansal (C) ve mekansal (D) EGTA (siyah) olmadan ve EGTA yükleme (kırmızı) ile TIRF mikroskopi ile WF floresan tarafından kaydedilen olayların profilleri ilgili göstermek 3E araziler puf genliklerinin ölçümleri ortalama Şekil Bu iki koşul altında bozunma süreleri ve mekansal genişliği, yaklaşık 44 (WF) ve 88 (TIRF) olayları analiz algoritmasını kullanarak belirlemiştir.
Şekil 1: IP
Şekil 2: otomatik TIRF mikroskobu ile görüntülendi SH-SY5Y hücrelerinde yerel Ca 2 + sinyalleri tespit ve analiz etmek için tasarlanmış özel kod Kullanıcı arabirimi (A) tanımlama ve analiz parametreleri girilir iletişim kutusunu açma (B) kullanıcı seçer.. . Görüntü yığını tüm kareleri çıkarılır siyah seviyesini tanımlamak için hiçbir hücreleri içeren görüntünün bölgesi (C - F). Nihai / tanımlama analizi pencerelerin Ekran (C) istirahat resmi Cal-5 Ca 2 + transientler (beyaz kareler) tespit edilmiştir nerede 20 floresan yerleri üst üste. Kullanıcı can resmin üzerinde fareyi hareket veya imleç tuşlarına basarak siteler arasında döngü. (D) Pencere gösteren floresan oranı (mesafe kadar taşınmış / F 0) seçilen olay iz. Kırmızı vurgulanan olaylar seçilen yerinde ortaya çıkan sahip olarak tanımlanır. Alt mavi çubuk bu sitede algılama eşiğini aşan olayları gösterir; Kırmızı vurgulanan olmayan olayların komşu siteye lokalize edilmiştir. Mavi çubuk üzerine tıklayarak bu olay sitesine kullanıcı alır. Fare ile kırmızı olay üzerine tıklayarak mekansal profili ile birlikte olay (solda) zamanı boyunca ortalama genişletilmiş bir zaman çizelgesi (E) ve mekansal profilleri (F) olayın zamansal evrimi gösteren diğer iki pencere açılır monte Gauss (sağda).e.jpg "target =" _ blank "> bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için burayı tıklayınız.
Şekil 3: EGTA hücre içi yükleme ile birlikte TIRF mikroskopi kullanılarak elde puf görüntüleme zamansal ve mekansal sadakat İyileştirme için floresan istirahat bir arka plan görüntüsü üzerine bindirilmiş tepe genlik anda yakalanan bir puf (A) anlık görüntüsü. Hücre anahat gösterir. Görüntü EGTA ile yüklü bir hücre WF mikroskopi ile elde edilmiştir. puf görüntü giderek 'sıcak' renklerle gösterilen yüksek Ca 2 + seviyeleri ile, yalancı olduğunu. (B) EGTA yüklü bir hücrede TIRF mikroskobu ile görüntülenmiş bir puf görüntüsünü İlgili. (C) İzler, WF (siyah) ya da TIRF + EGTA (kırmızı), Cal-520 fluorescenc karşılık gelen değişiklik gösterebilir(A) 'da gösterilen Ca 2 + Puffs zaman ve yukarıdaki (B) üzerine ör. İzler aynı tepe genlik normalize ve onların kinetik karşılaştırmasını kolaylaştırmak için kendi zirve zaman hizalanmış. Açıklamalar olay parametreleri 2+ Ca ölçümleri göstermektedir (genlik ve zaman düşme) (E) nicel. (D) İzleri, WF (siyah) ya da TIRF + EGTA (kırmızı), bir çizgi floresan yoğunluğu Ca 2 üzerinden tarama göstermek + (A) 'da gösterilen kabarıp, (B) gerçekleştirildi. Hat taramaları kendi pik genlikleri normalize ve ortalanır. açıklama (E) 'de sayısal olarak, yarı-maksimum genlik (FWHM) tam genişliğinin ölçümü gösterir. Ortalama pik genlikleri (üst) gösteren (E) Çubuk grafikler, tarafından EGTA (açık çubuklar) olmadan hücrelerde WF mikroskobu ile görüntülü ponponları tepe genlik (orta) ve mekansal genişliği (FWHM)% 20% 80 den kez düşme ve EGTA yüklü hücrelerde TIRF mikroskobu (gri çubuklar). Veriler en az 37 ponponları bir n ortalama ± SEM olarak sunulmaktadırTIRF için WF ve 79 için. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
| A. | Grup # | Olay sitesi kimlik numarası |
| B. | GroupX: | Belirli bir site tüm olayların alt-piksel x konumunu ortalama |
| C. | Groupy: | Belirli bir site tüm olayların alt-piksel y konumunu ortalama |
| D. | Hayır Olaylar: | Deney boyunca bir sitede meydana gelen olaylar Hayır. |
| E. | Max Amp: | Bu site bir olayın maksimum genlik (mesafe kadar taşınmış / F 0) |
| F. | X: | Olayın Alt piksel x lokalizasyonu |
| G. | Hasılat: | Alt piksel ilEtkinliğin ocalization |
| H. | T_peak: | Olay (kare sayısı) pik genlik ulaştığı Zaman |
| I. | Genlik: | Her sitede kaynaklanan tüm olayların Genlik (mesafe kadar taşınmış / F 0) |
| J. | Sigmax: | Gauss profilin X SD (piksel) olay zamanla monte |
| K. | Sigmay: | Gauss profilin Y SD (piksel) olay zamanla monte |
| L. | Açı: | Gauss çıkan eliptik fonksiyon uzun ekseni açısı olay zamanla takıldı |
| M. | R20: | Süre (dilimlerinde) maksimum genlik% 20 yükselmeye |
| N. | R50: | Süre (dilimlerinde) maksimum genlik% 50 yükselmeye |
| O. | R80: | Zaman yükselmeyemaksimum genlik% 80 (çerçevelerde) için |
| P. | R100: | Süre (dilimlerinde) maksimum amplitüd% 100'e kadar yükselmesi |
| S. | F80: | Süre (dilimlerinde) maksimum genlik% 80 Fall |
| R. | F50: | Süre (dilimlerinde) maksimum genlik% 50 Fall |
| S. | F20: | Süre (dilimlerinde) maksimum genlik% 20 Fall |
| T. | F0: | Süre (dilimlerinde) olay öncesi taban değere dönmelerine |
Tablo 1: algoritma Çıktı verileri.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Biz burada açıklamak floresan Ca 2 + göstergeleri kullanarak kültürlü memeli hücrelerinde yerel Ca 2 + olayları görüntüleme için protokolleri. Ayrıca, kimlik ve elde edilen verilerin analizi otomatik bir sezgisel kullanıcı arayüzü ile bir algoritma tanımlamaktadır. Burada tarif edilen prosedür floresan Ca 2 + göstergesi Cal-520 kullanmak, ancak Flu-3, Flu-4, Flu-8 ve Oregon Yeşil BAPTA-1 gibi diğer birçok Ca 2 + duyarlı boyalar görüntü Ca yeterince iyi performans 2+ mikro bölgeler. Bakım Bu göstergelerin yüksek afinite sürümleri (~ 200-400 nm K d) görüntü yerel Ca 2 + mikro bölgelerini kullanılmasını sağlamak için alınması gereken etmez ve bu göstergelerin optimal yükleme koşulları için ampirik olarak tespit edilmesi gerekir Soruşturma kapsamında, her hücre tipi. Doğaları Ca 2+ göstergeler 2+ tamponlar Ca gibi hareket dolayısıyla Ca bağlayan 2+ ve; indica yüksek yükleme konsantrasyonlarıBurada anlatılan yükleme koşulları iyi bir başlangıç noktası olmasına rağmen ları, Ca 2+ sinyalleri kaydedilen ve / veya hücre içi organellere içine saklamış olabilir müdahale potansiyeline sahiptir. Genel olarak, yerel Ca 2 + olayların aktivitesini görüntüleme Ca 2 + mikro bölgelerini altında yatan kanalları düzenleyen olabilir hücre ve sitozolik faktörler doğal mimarisini koruyarak, minimal invaziv.
Biz TIRF mikroskopi kullanılarak yerel Ca 2 + sinyalleri yüksek çözünürlüklü görüntüleme için burada açıklamak protokolü kaybolan alanında yalan Ca 2+ kanalları kaynaklanan olaylara ölçümleri kısıtlar bariz bir sınırlama yer vardır. Ancak, sadece plazma membranında kanallara sınırlıdır ve bu tür tercihen plazma membranı 12 yakınında bulunan ancak bulunmuştur hücre içi organel IP 3 R kanallara uygulanabilirliğini göstermek değildirAksi takdirde yerli hücresel ortamda faaliyet elektrofizyolojik kayıt için erişilemez olacaktır. Konfokal görüntüleme sinyallerinin görüntüleme hücreye derin oluşturulan sağlayacak, ancak optik kısmın kalınlığı geniş (~ 800, 100-200 nm vs nm) ihtiyacı ile zamansal çözünürlüğü sınırlıdır olmasıyla TIRF görüntüleme ile karşılaştırıldığında dezavantajları vardır olur konfokal nokta (lar) taramak için. Görüntüleme içbükey bir mikroskop kullanarak bir epi-floresan biçiminde yapılır için lokal ve tek kanallı Ca + 2 sinyallerinin optik kayıt hali hazırda aynı anda elektrofizyolojik yama kelepçe kayıt ile birleştirilebilir.
Floresan istirahat bir oranı olarak floresan Ca 2 + sinyalleri ifade tarafından (mesafe kadar taşınmış / F 0) sinyal genliklerinin iyi göreceli bir ölçü elde etmek mümkündür. Ancak, mutlak Ca 2 + konsantrasyonları açısından ise yerel, geçici floresan değişiklikleri bu kalibrasyon dikkatli olunUygun değil. Ca 2 + sürümü kanal veya kanallar küme etrafında serbest [Ca 2+] ve Ca 2+ TT-bağlı gösterge geçişlerini optik mikroskop ile çözülebilir ve böylece mikroskop nokta dağılım fonksiyonu ile bulanık olacak daha dardır. Kanal açılır ve kapanır Dahası, yerel [Ca 2+] kanal gözenek yakın çevresinde bir mikrosaniye zaman ölçeği üzerinde değişecektir. Böylece, floresan sinyalleri yerel Ca 2 + sinyalleri 13 yatan gerçek Ca 2 + nanodomain sadece bulanık (uzayda ve zamanda) temsilini sağlamak.
büyük ölçüde burada anlatılan algoritma kamera tabanlı görüntüleme yerel Ca 2 + sinyalleri analiz kolaylaştırır. Birden fazla olaylardan zamansal ve mekansal veri hem de verimli, kimlik ve analiz sadece otomatize ederek kullanıcı önyargı ortadan kalkar, ancak görüntü yığınlarının gigabayt oldukça paralel bir şekilde birkaç dakika içinde işlenebilireş zamanlı olarak tek bir hücre.
Bu yazıda veriler IP Ca 2 + sinyalleri aracılı 3 kapsamında sunulmaktadır rağmen, açıklanan yaklaşımlar kolaylıkla sitozolik yerel değişiklikleri görüntüleme için uzatılabilir [Ca 2+] ligand, ikinci messenger- sayısız türde kaynaklanan ve voltaj-kapılı Ca 2 + geçirgen iyon kanalları. Yerel Ca 2 + olayların otomasyona tanımlanması ve analizi için algoritma yüksek verimlilik doğa da Alzheimer hastalığı ve otizm spektrum bozukluğu gibi tek hücreli modelleri aracılığı ile Ca hastalık durumlarında 2+ kanalopatiler görüntüleme için son derece yararlı olduğu ispatlamak zorundadır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Human Neuroblastoma SH-SY5Y cells | ATCC | CRL-2266 | |
| Cal-520/AM | AAT Bioquest Inc. | 21130 | |
| ci-IP3 (D-23-O-Isopropylidene-6-O-(2-nitro-4,5-dimethoxy)benzyl-myo-Inositol 1,4,5-trisphosphate-Hexakis(propionoxymethyl) Ester | SiChem | cag-iso-2-145-10 | |
| DMSO/20% pluronic F127 | Invitrogen | P-3000MP | |
| EGTA/AM | Invitrogen | E-1219 | |
| 35 mm glass-bottom imaging dishes | MatTek | P35G-1.5-14-C |
References
- Berridge, M. J., Lipp, P., Bootman, M. D. The versatility and universality of calcium signalling. Nat Rev Mol Cell Biol. 1 (1), 11-21 (2000).
- Hill-Eubanks, D. C., Werner, M. E., Heppner, T. J., Nelson, M. T. Calcium signaling in smooth muscle. Cold Spring Harb Perspect Biol. 3 (9), a004549 (2011).
- Hagenston, A. M., Bading, H. Calcium signaling in synapse-to-nucleus communication. Cold Spring Harb Perspect Biol. 3 (11), a004564 (2011).
- Berridge, M. J. Elementary and global aspects of calcium signalling. J Physiol. 499 (Pt 2), 291-306 (1997).
- Lipp, P., Niggli, E. A hierarchical concept of cellular and subcellular calcium signalling). Prog Biophys Mol Biol. 65 (3), 265-296 (1996).
- Parker, I., Yao, Y., Ilyin, V. Fast kinetics of calcium liberation induced in Xenopus oocytes by photoreleased inositol trisphosphate. Biophys J. 70 (1), 222-237 (1996).
- Minta, A., Kao, J. P., Tsien, R. Y. Fluorescent indicators for cytosolic calcium based on rhodamine and fluorescein chromophores. J Biol Chem. 264 (14), 8171-8178 (1989).
- Demuro, A., Parker, I. Imaging the activity and localization of single voltage-gated Ca(2+) channels by total internal reflection fluorescence microscopy. Biophys J. 86 (5), 3250-3259 (2004).
- Smith, I. F., Parker, I. Imaging the quantal substructure of single inositol trisphosphate receptor channel activity during calcium puffs in intact mammalian cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (15), 6404-6409 (2009).
- Reissner, K. J., et al. A novel postsynaptic mechanism for heterosynaptic sharing of short-term plasticity. J Neurosci. 30 (26), 8797-8806 (2010).
- Ellefson, K. S., Parker, B., Smith, I., F, I. An algorithm for automated detection, localization and measurement of local calcium signals from camera-based imaging. Cell Calcium. , (2014).
- Smith, I. F., Wiltgen, S. M., Parker, I. Localization of puff sites adjacent to the plasma membrane: Functional and spatial characterization of calcium signaling in SH-SY5Y cells utilizing membrane-permeant caged inositol trisphosphate. Cell Calcium. 45, 65-76 (2009).
- Shuai, J., Parker, I. Optical single-channel recording by imaging calcium flux through individual ion channels: theoretical considerations and limits to resolution. Cell Calcium. 37 (4), 283-299 (2005).
