Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Developmental Biology

Contrast Imaging i musembryon Använda Högfrekvent Ultraljud

Published: March 4, 2015 doi: 10.3791/52520

Summary

Här presenterar vi ett protokoll för att injicera ultraljudsmikrobubblor kontrastmedel i levande, isolerade sena dräktighetsstadiet murina embryon. Denna metod gör det möjligt att studera perfusion parametrar och kärl molekylära markörer inom embryot använder kontrastförstärkt högfrekvent ultraljud.

Introduction

Kontrastförstärkt ultraljud använder mikrobubblor kontrastmedel för att visualisera och karakterisera vaskulära miljön. Dessa medel möjliggör icke-invasiv bedömning av mikrocirkulationen, kärlteckning och kardiovaskulär funktion. Dessutom kan modifiering av bubblan ytan resultera i målinriktad mikrobubblor bindning till endotelceller biomarkörer, som visats i prekliniska applikationer av angiogenes, åderförkalkning och inflammation 1,2 gör molekylär ultraljud av vaskulära händelser möjliga. Kontrastförstärkt ultraljud kan därför användas för att identifiera de komplexa och skiftande miljöer som påverkar friska och sjuka kärltillstånd 3-5.

Under det senaste antal år har intresset för nyttan av mikrobubblor avbildning utvidgas till den mångsidiga musembryo modell. Som en modell för utveckling däggdjur, förbättrar fysiologisk införandet av mikrobubblor i embryonala kärlstudie av utvecklingscirkulationssystemet (t.ex. blodflöde, hjärtminutvolym) och i fall av transgena och riktade muterade musmodeller av hjärtsjukdom 6,7, kan ge insikter i hur genetiska faktorer förändrar kardiovaskulär funktion. I själva verket, analyserar kvantitativ och kvalitativ 2D av embryonala hjärnkärl har redan uppnåtts 8. Dessutom presenterar musen embryot som en utmärkt modell för att undersöka bindningen av riktade mikrobubblor till vaskulära markörer in vivo. Et al. Bartelle 9, till exempel, har infört avidin mikrobubblor i embryohjärt ventriklarna att bedöma genom riktad bindning i Biotag-BirA transgena embryon och undersöka kärlanatomi. Den generation av heterozygota och homozygota musmodeller kan också användas som ett surrogat för tumörmodellstudier som syftar till att definiera kvantitativa natur molekylär ultraljud - ett viktigt riktmärke i att översätta denna teknik till kliniken.

8-10. I livmodern injektioner, dock står inför ett antal utmaningar. Dessa inkluderar injektion vägledning, behovet av att motverka rörelse i modern och exterioriserad embryo, underhåll av hemodynamisk livskraft hos modern och exterioriserades embryon, adresse långsiktiga effekter av narkos och komplikationer på grund av blödning 11. Därför var målet med undersökningen att utveckla en teknik för att injicera mikrobubblor i isolerade levande slutskedet embryon 12. Detta alternativ ger större frihet i fråga om insprutningsstyrning och positionering, reproducerbarhet av avbildningsplanet utan hinder, och förenklad bildanalys och kvantifiering.

I den aktuella studien, vi beskriva ett nytt förfarande för injektion av mikrobubblor i levande murina embryon for att studera mikrobubblor kinetiska beteende och studera riktade mikrobubblor bindning till endogena endotelceller ytmarkörer. Icke-linjär kontrastspecifika ultraljud används för att mäta om ett antal grundläggande perfusion parametrar inklusive toppförstärkning (PE), tvätta-in hastighet och tid till maximal (TTP) i isolerade E17.5 embryon. Vi visar också giltigheten av embryot modell för bedömning av kvantitativ karaktär molekylär ultraljud i en embryonal endoglin funktionsförlust transgen musmodell där endoglin är en kliniskt relevant mål på grund av dess höga uttryck i vaskulära endotelceller på ställen där aktiv angiogenes 13 . Vidhäftningen av endoglin inriktade (MB E), råtta isotypkontroll IgG 2 kontroll (MB C) och oriktade (MB U) mikrobubblor utvärderas i heterozygot endoglin (Eng +/-) och homozygot endoglin (Eng + / +) uttrycker embryon. Analys av den målinriktade binding avslöjar att molekylär ultraljud är kapabel att skilja mellan endoglin genotyper och avser receptortäthet till kvantifierbara molekylära ultraljudsnivåer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

OBS: De experimentella granskningsåtgärder som vidtas i denna studie godkändes av Animal Care kommittén vid Sunnybrook Research Institute (Toronto, Ontario, Kanada). Rutiner för human behandling av djur skall iakttas vid alla tillfällen. Det antas att utredaren är utbildad i den grundläggande hanteringen av ett ultraljud bildsystem. Detta protokoll fungerar bäst med två personer.

1. Djur Modeller

  1. Mate CD-1 manliga och kvinnliga Mus musculus att erhålla vildtyp embryon för perfusion studier.
  2. För molekylära imaging studier, generera Eng +/- möss genom homolog rekombination med hjälp embryonala stamceller från 129 / Ola ursprung som beskrivs av Bourdeau et al. 14.
    1. Tillbakakorsning B6- Eng +/- möss, vänligen förvärvats från Dr Michelle Letarte, till CD-1 bakgrund. Använd Eng +/- CD-1 återkorsas embryon, liksom deras Eng + / + kull controls. Mate mössen för att producera iscensatta embryon.

2. Experimentellt Framställning

  1. Initiera parning av möss och kolla pluggar dagligen. Embryonala dag 0.5 definieras som middagstid på dagen en vaginal plugg observeras.
  2. Förbered embryomedier genom att tillsätta 50 ml av fetalt bovint serum, 5 ml 1 M HEPES och 5 ml av penicillin-streptomycin (10.000 enheter penicillin, 10.000 xg streptomycin) till 500 ml Dulbeccos modifierade Eagles medium (DMEM) med hög glukoshalt (4.500 mg / L). Wrap flaskan i folie och hålla kyld vid 4 ° C.
  3. Centrifugera tydlig ultraljuds gel i 50 ml koniska rör vid 140 xg under 20 min. Rita gel upp i 30 ml sprutor. Fyll ytterligare (markerade) 30 ml sprutor med fosfatbuffrad saltlösning (PBS) och ställ åt sidan. En kull av embryon kommer i allmänhet att kräva mellan 2-3 sprutor med ultraljud gel och 4 sprutor PBS.
  4. Dra cirka 30 glas nålar och försiktigt fäst till en remsa av modeli en 100 x 20 mm cellodlingsskål. Detta säkerställer att nålarna är separerade och säker vid hantering. Med hjälp av en glas avdragare, använd följande inställningar på 1 x 90 mm glaskapillärer med filament: Heater 77, Sub magnet 55, Main magnet 70.
  5. Förbered 11:50 dissektion plattor (tillräckligt för att garantera varje embryo i en kull kommer att få sin egen maträtt), med hjälp av en 1: 8 volymförhållande av härdare till basen. Häll 40 ml av bas i en 50 ml koniska rör. Lägg 5-6 ml härdare och rör om med träpinne.
    1. Häll i 60 x 15 mm odlingsskålar, varvid varje till ungefär hälften. Låt stå O / N för att ställa.
  6. Fäst kvinnliga Luers till 400 mm långa bitar av polyvinylklorid (PVC) slang (innerdiameter: 0,79 mm). Slangen måste nå från sprutpumpen till ultraljudsstadiet bekvämt.

3. Experimentell Set-up

  1. Ordna bild plattform under operationsmikroskop med en 3D motor och linjär grupp 21 MHz transduktor.
    1. Orient plattformen så att skenan fästet är till vänster, med scenen placerad direkt under mikroskopet.
    2. Fäst 3D motorn till kulkopplingen av den utsträckande armen av plattformen. Skruva den snabbt frigör posten som givarklämman i snabbfrigörfästet på motorn, vänd framåt, och placera givaren huvudet i klämman, fästa spärren.
    3. Fäst givarkontakten i den aktiva porten på frontpanelen på vagnen. Sätt på maskinen.
  2. Initiera 21 MHz ultraljudgivaren, välja inställningen "kardiologi" för molekylära imaging studier, och "allmänt" för perfusion studier. Shift alla reglagen tidsvinst för ersättning till exakt mittläget. För "Contrast Mode ', ange följande parametrar: Frekvens: 18 MHz, överföra makt: 4%, (0,39 MPa), Contrast Gain: 30 dB, Foci: 6 & 10 mm, Contrast Läge: Nonlinear, Burst tid: 100% vid 0,1sek, Beam Bredd: Bred.
  3. Alikvotera 40 ml embryo media vardera i fyra 50 ml koniska rör. Placera på is.
  4. Värm en liter vatten i en 2 liter bägare på en varm platta. Bibehåll vid 45 ° C. Lägg en spruta av ultraljud gel och PBS till bägaren att förvärma. Behåll denna temperatur genom övervakning med en termometer vid alla tillfällen.
  5. Ställ åt sidan 11:50 1 ml sprutor och 11:50 21 G nålar för injektion av mikrobubblor.

4. Kirurgisk Tillvägagångssätt

OBS: Låt en medhjälpare förbereder bubblorna (stadium 5) medan kirurgen börjar det kirurgiska ingreppet. Protokollet som beskrivs här har anpassats från Whiteley et al., 15

  1. Samla E16.5 eller E17.5 embryon från den gravida kvinnliga musen efter halsdislokation.
    OBS: Effekterna av anestesi på embryon har ännu inte studerats i detalj 16. Ytterligare metoder, bland annat halshuggning, kan vara lämpligt opningar för offret av de dräktiga möss.
    1. Skär öppna buken för att avslöja livmodern & embryon. Försiktigt och snabbt ta bort livmodern genom att skära vid spetsarna på livmoderhornen (avskiljer äggstocks- och livmoderfartyg) och avskiljande vid slidan och urinblåsan.
    2. Använda splitter pincett, överföra livmodern till en tub med 40 ml iskall embryo media så snabbt som möjligt utan att skada embryon. Kassera mus stommen.
  2. Flytta till mikroskop och scen. Insättning livmodern i en 100 x 20 mm cellodlingsskål. Överför livmodern till en ny maträtt fylld med 50 ml färsk embryo medium.
  3. Med användning steriliserades (70% etanol-spray) fin pincett, försiktigt riva och dra bort de yttre membranen hos livmodern börjar vid en ände. Exponera placenta decidua, parietalceller gulesäcken och Reichert membran för att separera och ta bort från den underliggande viscerala gulesäcken.
  4. Dissekera ut embryona en av ett, att hålla den viscerala yOLK sacs intakta och hantering moderkakan så försiktigt som möjligt 17. Var noga med att undvika bristning av gulesäcken som embryona pop ut omedelbart.
    1. Använd den perforerade sked för att flytta embryon till en annan maträtt på is med färska embryo media. Håll embryon kylda tills det behövs. Ändra media i embryot maträtt varje 1-1,5 tim. Med dessa förutsättningar embryon är lönsamt för upp till 4 timmar efter dissektion.

5. mikrobubblor Framställning

OBS: Utför molekylär avbildning med ultraljud använder både riktade och oriktade mikrobubblor. En enda experiment kan kräva så många som 3 separata injektionsflaskor med mikrobubblor: i) antikropps riktade mikrobubblor, ii) kontroll isotyp antikropp riktade mikrobubblor och iii) oriktade mikrobubblor. Kontrastmedlet kommer som ett torrt fryspulver och måste beredas med saltlösning före injektion. Det finns ~ 2 x 10 9 mikrobubblor i varje oriktade Microbubble flaska och ~ 8.8 x 10 8 mikrobubblor i målet färdiga flaskorna. Mikrobubblorna är stabil i upp till 3 timmar efter beredning.

  1. Beredning av Target Ready Flaskor
    OBS: Exempel på målgrupp färdiga preparat: endoglin riktade mikrobubblor (MB E, med biotinylerad råtta MJ 7/18 antikropp mot mus endoglin; i huset hybridom anläggning); vaskulär endotelial tillväxtfaktorreceptor 2 (VEGFR2) riktade mikrobubblor (MB V, med biotin-anti-mus CD309); råtta isotyp IgG 2 kontrollantikropps riktade mikrobubblor (MB C, biotin råtta isotyp IgG 2 kontroll inriktning mus IgG2a).
    1. Späd lösningen antikropp (20 ^ g) i 1 ml (slutlig volym) saltlösning. Håll på is.
    2. Fyll sprutan med 1 ml koksaltlösning, ta bort alla luftbubblor. Bifoga en 21 G nål, injicera lösningen långsamt i mikrobubblor flaskan.
    3. Dra långsamt kolven, ta bort 1 ml luft, och dra ut nålen. Försiktigtagitera. Låt stå 5 minuter på is.
      OBS: Ultraljud mikrobubblor kan förstöras under högtrycks miljöer.
    4. Efter förfluten tid, fylla en ny spruta med antikropputspädning och lägg till lämplig flaskan. Skaka försiktigt. Låt blandningen (nu 2 ml) stå under 10 minuter. Håll på is. Förutsatt komplett yta konjugering, är det genomsnittliga antalet av bunden ligand för mikrobubbloma cirka 18 7600 ligander / xm 2.
  2. Beredning av oriktade Flaskor
    1. Fyll sprutan med 1 ml koksaltlösning, ta bort alla luftbubblor. Bifoga en 21 G nål, injicera lösningen långsamt i mikrobubblor flaskan.
    2. Dra långsamt kolven, ta bort 1 ml luft, och dra ut nålen. Skaka försiktigt. Låt stå 5 min. Tillsätt ytterligare 1 ml saltlösning, såsom beskrivits ovan. Försiktigt agitera och låt stå 10 minuter på is.
  3. Coulter-räkning
    1. Skaka försiktigt önskad mikrobubblor flaskan och dra ~50 pl av lösningen till en 1 ml spruta med användning av 21 G-nål. Injicera mikrobubblorna i en tom 2 ml mikrocentrifugrör.
    2. Pipettera ett prov av mikrobubbelstamlösning 10 | il i 10 ml spädningsmedel.
    3. Efter försiktig blandning, bedöma koncentrations och storleksfördelningen av mikrobubblor befolkningen med hjälp billräkning (se Förteckning över Materials). Räkna minst tre 50 il mätningar (per flaska prov) med hjälp av en 30 um öppning.
  4. Förberedelse Mikrobubblor för Injektion
    OBS: Assistenten utför detta steg när "Injektion av mikrobubblor i embryon" (steg 6) påbörjas. Varje embryo injiceras en gång, med den typ av mikrobubblor som väljs för varje injektion för att vara slumpmässigt utvalda av assistenten så att alla typer av mikrobubblor är jämnt fördelade under hela förfarandet men med tanke på en slumpmässig ordning. Säker kirurgen är blind för den typ av bubblan som injiceras.
    1. Bestäm the volym aktiebubblan lösning krävs för att producera en slutlig koncentration av 1 x 10 8 MB ​​/ ml i en volym av 400 | il (beräkna volymen med aktie koncentrationer som uppmätts i 5.3.3). Alikvotera motsvarande volym av saltlösning i en tom mikrocentrifugrör.
    2. Skaka försiktigt den valda mikrobubblor flaskan och rita ett överskott volym (~ 50 l större än den som beräknats ovan) av lösningen i en 1 ml spruta med hjälp av 21 G nål. Injicera mikrobubblorna i en tom mikrocentrifugrör.
    3. Pipet den nödvändiga volymen av mikrobubblor stamlösning och lägga till i alikvot av saltlösning. Blanda genom omröring försiktigt med spetsen av pipetten.
    4. Rita den utspädda mikrobubblor lösningen i en ren spruta med hjälp av 21 G nål. Ta bort nålen, eliminera eventuella luftbubblor från sprutan och fäst luer och slang. Tryck långsamt lösningen till slutet av slangen se till att inte generera några luftbubblor.
    5. Sätt i syrinGE i en spruta infusionspump inställd för att dispensera mikrobubbloma med en hastighet av 20 | il / min för en total volym av 20 | il. Bifoga en drog glasnål till slutet av slangen. Flytta pumpen nära injektionssteget.

6. Injektion av Mikrobubblor till embryon

  1. Slumpmässigt välja och ta bort (med perforerad sked) ett embryo från kylda medie skålen. Placera i dissekering skålen ligger på ultraljud scenen under stereoskopet och ta gulesäcken och fostervatten membran med fin pincett, skärning / riva från sidan som visas stone kärl (den antimesometrial sidan). Detta uppnås enklast genom att genomborra en yta intill huvudet regionen.
    1. Klipp nog att ta bort embryot inifrån, men inte mer. Stabilisera dissektion rätter med små bitar av modellera.
  2. Manövrera försiktigt säcken från hela embryot. Placera embryot på sin sida, med moderkakan ochnavel fartyg i fronten. Med hjälp av insekter stift, stift ner gulesäcken (4 stift rekommenderas) och kanter moderkakan som nödvändigt att anbringa på plats. Undvik stora fartyg.
  3. Tvätta embryo med förvärmda 45 ° C PBS tills embryot återupplivar. Identifiera navelsträngsvenen och dess tillhörande vaskulära nätverket. Placera skålen så att injektionen kan göras bekvämt.
    OBS: När värmde, kommer blod i embryot börja flöda, synbart pumpa i navelartär. När flödet först börjar, kommer venerna vara en klarröd, med blodet i båda fartygen snabbt visas identiska. Grenarna som följer navelsträngsvenen brukar lägga över dem från navelartär på placenta ytan.
  4. När embryot har återupplivat, täck den (men inte moderkakan) med förvärmda amerikanska gel, som är noga med att försiktigt ta bort eventuella luftbubblor (med hjälp av fin pincett) från hela embryot. Fyll skålen med förvärmda PBS.
    OBS: Håll ett öga på nivån av solutipå i PBS och gel sprutor och lägg backup sprutor till värme bägaren efter behov.
  5. Montera glas nålen på en stor boll av model vid kanten av dissekerings skålen och för in nålen änden i PBS. Att välja en ven på chorionic ytan av placenta skivan, så långt från huvudgren som rimligt, trimma tips till storleken med sax. Injektion är lättast om spetsen skärs med en liten vinkel. Ta bort eventuella ojämna kanter glaset med hjälp av kanten av fjäder sax.
  6. Använda sprutpumpen, långsamt injicera mikrobubbellösningen vid 20 | j, l / min in i glaset nålen tills all luft drivs ut från nålspetsen och mikrobubblor kan ses att flöda fritt in i PBS. Stoppa pumpen och återställas för en injektionsvolym av 20 ul. Låt inte luft att komma in i embryots vaskulära system under injektion.
  7. Sätt i glas nålspetsen försiktigt i en av venerna i moderkakan och se till att den är orörlig. Sväng bort stereoscope huvudet och position givaren ovanför embryot. Initiera avbildning.

7. Ultraljud Molecular Imaging

OBS: Använda kontrast olinjära avbildnings villkoren tidigare, placera givaren så att embryot ligger jämnt mellan foci vid 6 och 10 mm. När placerad, starta bolusinjektion av mikrobubblor. När injektionen är klar, starta timern.

  1. Perfusion Imaging
    1. Se till att det maximala antalet ramar för olinjära kontrastläge väljs genom att trycka på "studieadministration" -knappen och klicka på fliken "Prefs" högst upp i studie webbläsaren. Markera lämplig ruta i fönstret "Inställningar".
    2. Justera bildinställningarna genom att initiera olinjär avbildning. Tryck på "kontrastläge" på kontrollpanelen. Förfina 2D vinsten genom att justera "förstärkningen & #8217; ratten 30 dB, minska strömmen till 4% med hjälp av "makt" slå, minska frekvensen till 1 Hz med hjälp av "frekvens" slå och ställa balkbredden (nedre vänstra hörnet) till bred användning av rullboll / mus.
      OBS: Alla reglage sitter på kontrollpanelen för ultraljudssystemet.
    3. Fånga hela tvätt in och försvinnande av mikrobubblor bolus genom att spela in en 20 min cine slinga med en bildfrekvens på 1 Hz. Tryck scan / frysa för att starta datainsamling.
    4. När den fullständiga sekvensen av bilder har tagits, tryck på 'cine store "knappen på kontrollpanelen för att spara bildsekvensen i systembufferten. Systemet skapar ett datumstämplas cine slinga av de olinjära kontrastmodelldata förvärvade.
  2. Riktade mikrobubblor Imaging
    1. Under "Prefs", ställ in brast tid till 0,1 sek. Ställ lämpliga avbildnings parametrarna med kontrollerna desfaktorer beskrivs ovan (7.1.2.).
    2. Initiera olinjär kontrast avbildning genom att trycka på "kontrastläge" på kontrollpanelen. Säker embryot är korrekt belägen under givaren och att flödet av mikrobubbelkontrastmedlet genom embryot är synlig i den icke-linjära kontrastläge bild.
    3. För att bedöma riktad mikrobubbla bindning under embryonala molekylära avbildningsstudier, tillåta mikrobubblorna att cirkulera ostörd under 3 min och 40 sek efter att insprutningen. Denna tid är att medge retention av de cirkulerande mikrobubblor. Tryck 'scan / frysa "för att stoppa bild under denna tid.
    4. Vid 3 min och 40 sek, för att återuppta bild bekräfta att embryot är fortfarande synliga, är täcks med PBS, och att mikrobubblor fortsätter att cirkulera. Tryck 'scan / frysa "för att initiera avbildning.
    5. Förvärva störningen / påfyllning sekvens på 3 min och 50 sek efter injektion genom att spela in en "pre-förstöringtion "akustisk svarssekvensen vid 29 Hz. Tryck 'scan / frysa "för att starta datainsamling. Vid 4 minuter efter injektion 18,19, initiera en 0,1 sek högfrekvent akustisk sprack. Tryck på "burst" för att genomföra en explosion.
    6. Fortsätt att spela in bilder för resten av sekvensen (tills bufferten linjen är full) och spara cine slingan genom att trycka "cine store".
    7. Samla ytterligare cine slinga av cirkulerande mikrobubblor. Denna senare "efter förstörelse" avbildningssekvens antas innehålla endast cirkulerar bubbla signaler som har fyllas balken. Tryck 'scan / frysa "att initiera bildbehandling och" cine store "för att samla in bilderna.
    8. Märk Cine loopar efter avbildning varje embryo. Tryck på 'studiehantering ", markera filen med rullboll och" välj "knappen, tryck på' bildmärke" och namnet på lämpligt sätt.

    8. Hantering av embryon efter Injection

    1. Post avbildning, flytta givaren, unpin embryot och avliva (via halshuggning, halsdislokation, koldioxid kvävning eller anestesi följt av snabb frysning eller fixering) som önskas.
    2. För varje efterföljande embryo injektion en fräsch dissektion maträtt, nål, spruta och slangsegmentet måste användas, med förberedelserna inför nästa omgång av mikrobubblor injektionslösning som sker under dissekering och väckelse.
    3. Spara vävnadsprover (t.ex. svans, hjärnan) för ytterligare analyser (t.ex. genotypning bestäms av PCR-analys av isolerat svans DNA, lacZ färgning, eller halv kvantitativa mått på biomarkör uttryck använder western blottar 21).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Injektion av ultraljudskontrastmedel till ex utero musembryon är beroende av framgångsrika isolering av levande, sen graviditetsscen embryon från livmodern och underhåll av lönsamheten under loppet av injektionen och tillhörande ultraljudsundersökningar. När fostret har exterioriseras och placeras, såsom visas i fig 1, är det möjligt noggrann injicering av kontrastmedel in i embryonala vaskulaturen. En typisk B-mode ultraljudsbild av en E17.5 musembryo visas i fig 2A. Tvätt-in för mikrobubblor och motsvarande förbättring i nedre hålvenen, hjärtat, hjärnan, och i hela djuret kan fångas med hjälp olinjära kontrast avbildningsmetoder, vilket visar att det är möjligt att denna teknik. Individuella tidpunkter visas i Figur 2B och visar förändringen i kontrast över tiden.

Genom att spela in hela tvätt in och tvätta ut of mikrobubblor bolus, är det möjligt att mäta olika perfusion parametrar. I en offline analys, var kontrasten regionen spår verktyg som används för att skapa 1,5 mm 2 regioner av intresse (ROI) i de embryonala vänster och höger hjärnhalva. Den genomsnittliga signalintensiteten inom dessa ROI därefter ritas som en funktion av tid och glättas med användning av en sju poäng medianfilter. Från den resulterande kontrastintensitetskurva (visas i figur 2C), fram hjärnan toppförbättring bestäms. Tvätt-in takt, definierat som lutningen mellan 10% och 50% av den maximala toppförstärkning (PE), beräknades också. Slutligen tillsattes tid till topp (TTP) beräknat från början av signalförstärkning till topptid. Skillnader i medel perfusion parametrar på olika bubbla typer testades med separata t-test 12. Dessa resultat, sammanfattade i tabell 1, visar att injektion av mikrobubblor ger en valukunna metod för att fastställa viktiga perfusion parametrar i utvecklings musen.

Införande av mikrobubblor i den embryonala kärl möjliggör också användningen av musembryon som modellsystem för att definiera och karaktärisera de kvantitativa kapacitet molekylär ultraljudsundersökningar. I följande exempel, en förlust av funktionsmodell, där genmanipulation genererade heterozygota och homozygota uttrycksmönster endoglin i embryonala möss, användes för att testa förmågan hos molekylär ultraljudsundersökningar för att skilja mellan genotyper. Efter mikrobubbel injektion och genomförande av destruktion / påfyllning avbildning, var förhållandet av den genomsnittliga signalintensiteten av "pre-förstörelse" till "post-förstöring" sekvenser som används för att ta fram ett mått på den molekylära signal kallad kontrasten betyda effektförhållandet (CMPR ). En linjär blandad modell (med Bonferroni justeringar för multipla jämförelser) utfördes för att utröna w hether det fanns någon signifikant skillnad mellan endoglin riktade, kontroll och oriktade mikrobubblor bindning till Eng + / + eller Swe +/- embryon (identifierade post injektion via polymeraskedjereaktion (PCR) av svansprov). De uppskattade CMPR medel (medelvärde ± 95% konfidensintervall (CI)) presenteras för varje mikrobubblor och embryo typ i figur 3 och sammanfattas i tabell 2.

Dessa resultat ger ett konkret uttryck som kan uppnås injektion av ultraljudkontrastmedel i isolerade levande embryon. Dessutom underlättar detta protokoll bedömningen av perfusion parametrar och kan användas för att jämföra riktade mikrobubblor bindande i embryo modeller av kärlsjukdom i ett försök att klarlägga kapacitet molekylär ultraljudsundersökningar.

.jpg "/>
Figur 1. Experimentell set-up för injektion av mikrobubblor i isolerade embryon. En 21 MHz linjär array givare är placerad ovanför en exterioriserad levande E16.5 embryo som en 20 pl mikrobubblor lösningen injiceras i en placenta ven med hjälp av ett glas kanyl. Skalstreck = 10 mm. Från Denbeigh, al. JM et 12 med tillstånd. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 2
Figur 2. Ultraljud avbildning av exterioriserades Living E17.5 embryon. (A) B-mode ultraljudsbild av ett embryo. Före injektion av riktade mikrobubblor (t = 0 sek). (B) Icke-linjär kontrastbild av embryot före och efter injektion av mikrobubblor. Nonlinear kontrast bild prieller att mikrobubbel injektion (t = 0 sek). Endast de starkt reflekterande gränssnitt (t.ex. ben) är synliga, med minimal signal från de mjuka vävnaderna. Nedan olinjär kontrastbild av mikrobubblor inom embryot vid t = 50 sek, t = 120 sek och t = 420 sek efter en bolusinjektion. Kontrast upptäcks hela djuret, inklusive hjärtat och hjärnan. (C) perfusion parametrar härledda ur tidsintensitetskurvor. Intensitet plot av mikrobubblor som en funktion av tiden inom en enda ROI i den embryonala hjärnan. Perfusion parametrar identifieras på grafen, inklusive toppförstärkning (PE), tvätta-in ränta (lutning), och tid till maximal (TTP). Pilspetsar: R = revben, Ht = hjärta, Br = hjärna. au, godtyckliga enheter; ROI, region av intresse; sek, sekunder. Skalstreck = 3 mm. Denna siffra har modifierats Denbeigh, al. JM et 12. Klicka här för att se en störreversion av denna siffra.

Figur 3
Figur 3. Sammanfattning av den genomsnittliga kontrast betyder effektförhållanden (CMPR) för endoglin riktad (MB E), kontroll (MB C) och oriktade mikrobubblor (MB U) i Eng + / + och Eng +/- embryon. CMPRs från endoglin riktade mikrobubblor var betydligt högre (*** p <0,001) än de som samlas in för MB C och MB U, (inte signifikant från varandra, oavsett genotyp). MB E-bindning befanns vara betydligt högre i Eng + / + embryon (mörka markörer) jämfört medSwe +/- embryon (ljusa markörer). Resultat presenteras som medelvärde ± 95% konfidensintervall. n anger antalet unika embryon i varje kategori. Från Denbeigh, al. JM et 22 med tillstånd. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Mikrobubblor Typ T-test
p-värde
Perfusion Parameter MB U MB C MB V MB U vs MB C MB U vs MB V MB <sub> C vs MB V
Peak Enhancement, PE (au) 0,427 ± 0,063 0,490 ± 0,079 0,499 ± 0,064 0,19 0,06 0,81
Wash-in hastighet (au / sek) 0,008 ± 0,002 0,009 ± 0,002 0,011 ± 0,002 0,18 0,01 0,09
Dags att Peak, TTP (sek) 53,75 ± 7,96 51,75 ± 4,46 45,00 ± 5,33 0,55 0,03 0,03
# embryon injicerade 4 4 3

Tabell 1. Sammanfattning av E17.5 embryonala perfusion parametrar. Medelvärde ± standardavvikelser härrör från tidsintensitets tomter för alla embryo ROI (a.u. = Godtyckliga enheter). Tabellen inkluderar mätningar för oriktade (MB U), IgG 2 kontroll riktad (MB C) och VEGFR2 riktade (MB V) mikrobubblor. Separata t-test utfördes för att jämföra grupper. Denna tabell har ändrats från Denbeigh, JM et al. 12.

Mikrobubblor typ Genotyp CMPR Medelvärde 95% konfidensintervall
MB E Eng + / + 9,71 9,05, 10,38
Eng +/- 5,51 4,87, 6,15
MB C Eng + / + 1,42 0,41, 2,43
Eng +/- 1,46 0,45, 2,47
MB U Eng + / + 1,7 0,65, 2,75
Eng +/- 1,76 0,67, 2,84
Linjär Blandad Modell: Mellan-ämnes Effects
df F p-värde
Genotyp 1 12,75 <0,001
Mikrobubblor typ 2 147,65 <0,001
Genotyp * mikrobubblor typ 2 18.29 <0,001

Tabell 2. Sammanfattning av linjär blandad modell analys förmikrobubblor bindning i embryon, med en Bonferroni korrektion för multipla jämförelser. Genotyp, mikrobubblor typ och den kombinerade interaktion (genotyp * mikrobubblor typ) befanns vara viktiga faktorer för att bestämma CMPR. DF = frihetsgrader. Från Denbeigh, al. JM et 22 med tillstånd.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Ultraljudskontrastmedel injicerades i slutskedet dräktighet musembryon och olinjära kontrastbilder förvärvades för att mäta perfusion parametrar och riktade mikrobubblor bindande. Framgångsrik avbildning av mikrobubblor i embryonal kärl var beroende av ett antal faktorer, den första är embryot livskraft. All utrustning och apparater framställdes i förväg för att minimera den tid som krävs för isolering av embryon från livmodern till början av injektionen. Eftersom effekterna av enstaka eller upprepad exponering för anestesi på embryonala möss har inte studerats i detalj, var användningen av anestesi hos modern undvikas innan offra 16. Under embryo isolering, var det viktigt att förhindra skador på gulesäcken och säkerställa embryon hållas nedkylda vid alla tidpunkter, i ofta uppdateras embryo media. När exteriorizing embryot före injektion och under pinning gjordes stora vitelline fartyg undvikas för att begränsa likelihood för blödning, som kan vara dödlig. Vi fann att när återuppliva embryot, var det bäst att först täcka placenta och därefter embryot med PBS, innan applicering ultraljudsgel till embryot i en fram och återgående rörelse och avlägsnande av eventuella stora bubblor med pincett. Återstoden av petriskålen fylldes sedan med PBS. Användningen av gel och PBS begränsade möjligheten att luftfickor mellan embryot och givaren, vilket kan påverka bildkvaliteten. Som embryot återupplivades, började blodet rinna, synbart pumpa i navelartär medan navel venerna verkade klarröd 23. För referens, grenarna som följer navelsträngsvenen brukar lägga över dem från navelartär på placenta ytan. Även om det var möjligt att injicera i moderkakan labyrint arterioler, injicera mikrobubblorna i flödesriktningen reducerad placenta blödning och venule injektioner också tillåtet mikrobubbloma passera direkt genom embryot innan cirkulerande thgrov placenta.

På grund av deras bräcklighet, mikrobubblor beredning och hantering krävs också hand. Ultraljudsmikrobubblor kan förstöras under högtrycks miljöer. Därför var den exakt samma procedur upprepas under varje beredning och bubbelkoncentration mättes för att säkerställa experimentell konsistens. En enda flaska med mikrobubblor var typiskt nog för ca 5-7 embryon. Eftersom mikrobubblorna är stabila inom flaskan för upp till 3 timmar, var flera flaskor ofta krävs för ett enda experiment. För att undvika att riva sönder vävnaden, det var bäst för glasspets injektionsnålen ska vara vass och skär på en liten vinkel samtidigt närmar fartyget vid så liten vinkel som möjligt. När trimmas, spetsen på nålen måste vara tillräckligt stor för bubblorna flöda lätt genom slutet utan klumpar, men liten nog att passa enkelt i kärlet. Den ideala storleken var generellt <100 nm. Viss praxis vid bedömningen av lämpligtstorlek var nödvändigt. I händelse av att spetsen skars för stor eller blev blockerad har en ny glasnål tillämpas. Det vissa fall var det möjligt att trimma nålen något över blockeringen. Det var viktigt att luften inte tillåtas komma in embryot kärlsystem under injektion, eftersom det kan leda till döden för djuret och var oönskad under avbildning (luftbubblor kan fastna i kärl av embryot och kunna upptäckas i ultraljudsbilden artificiellt öka något uppmätt signal). Nonlinear kontrast imaging utförs i detta protokoll som används en toppmodern hög frekvens (21 MHz) mikroultraljudssystem (Vevo2100) paras med linjära matriser särskilt utformade för små djur imaging (MS250). Mikro- eller hög frekvens -ultrasound är en av de få metoder som kan, vid denna tid, för att ge högupplösta bilder av levande murina embryon och nyfödda 16. Detta system kan uppnå axiella och laterala resolutioner av 75 pm och 165 μm respektive på djup så stora som 15 mm. Det var därför möjligt att bilden hela embryot vid mycket högre upplösningar än normalt uppnås med hjälp av kliniska instrument och den akustiska signalen från mikrobubblor kunde särskiljas från vävnad med hjälp olinjära kontrastavbildningsmetoder (inklusive puls inversion och amplitud moduleringstekniker 24). Även om vi hade den bästa framgång med ultraljud inställningar som beskrivs här, är det möjligt att en viss anpassning till dessa parametrar också kommer ge tillfredsställande resultat. I samtliga fall är en låg effekt som krävs för mikrobubblor avbildning för att undvika oönskad förstörelse av mikrobubblor före initiering av en skur, medan den korta burst eliminerar bara en liten bråkdel av mikrobubblor befolkningen. Med övning, hela proceduren för en enda embryo, från positionering till slutförandet av molekylär ultraljud, tog ca 15 min. Vi har framgångsrikt injicerat så många som 12 embryon från en kull påen enda session.

Injektions experiment var begränsade till ett 4 tim fönstret på grund av den begränsade livskraft embryona. Eftersom fördelningen av mikrobubblor var beroende av cirkulationen av embryot självt kunde injektioner inte ske innan hjärtrytm (E8.5) och detekterbara flöde i vitelline och navel cirkulation (E9.5) bildades 25. Med mognad av moderkakan inte komplett förrän E14.5 ades injektion av kontrastmedel via placenta labyrinten begränsad till embryon från mitten till slutet av graviditetslängd. Baserat på observationer, embryon närmare till bestämmelsen var härdigare och kunde tåla ökningar i deras kärlvolym bättre än yngre. Tillsammans har dessa faktorer begränsade kontrastförstärkt ultraljud av embryonala kärl till senare stadier av utveckling och angiogenes tillväxt. Detta kan påverka tillgängligheten av transgena musmodeller, eftersom manipulation av receptorer involverade i Vaseular utveckling och underhåll (t.ex. VEGFR2, VCAM-1) kan leda till embryonal dödlighet eller defekter i utvecklingen och regleringen av embryonala cirkulationssystem 26,27. Ändå ett antal relevanta modellsystem är tillgängliga för vaskulära biomarkörer för intresse, däribland α 2 β 1 28, α v β 3 29, trombocyter endotelcellsadhesion molekyl-1 30, och vaskulär celladhesionsmolekyl-1 31, intercellulär adhesionsmolekyl -1 32 och -2 33 och P-selektin 34. Vad är mer, börjar hjärn histogenes efter mitten av dräktigheten 11, vilket gör uttrycket av angiogena markörer i denna vävnad sannolikt och därmed ger ett utmärkt alternativ till den traditionella tumörmodell för studier som bedömer de kvantitativa aspekterna av molekylär avbildning.

Den ex vivo natur injektionerna gör presentera några limitations. Det är viktigt att notera att efter embryona togs bort från modern och placenta labyrinten punkterade, var det i allmänhet inte möjligt (eller önskvärt) att göra upprepade injektioner. Dessutom isolerar embryot från moderns cirkulation begränsar tillförseln av näringsämnen och O 2, och embryonala hälsa förväntas försämras med tiden. Medan kylning och väckelse förlänger livskraft embryona, kan det också påverka hjärtfunktionen. Till exempel, konstaterade vi att enstaka embryon hade en reducerad hjärtfrekvens (data ingår ej, se Denbeigh et al. 12) jämfört med de som tidigare observerats in vivo 35. Det är därför troligt att studier som bedömer kardiovaskulär fysiologi inte exakt kommer att återspegla in vivo förhållanden. Med få studier som kännetecknar cirkulations hemodynamik i levande sen musembryo, är det dock svårt att säga med säkerhet i vilken utsträckning dessa experimentella betingelser kan alter fysiologisk funktion. Ett alternativ är att bedriva injektioner i livmodern, antingen genom en laparoskopisk snitt 36 eller genom magen på den gravida mamman direkt 37, även om denna metod kan presentera sin egen uppsättning utmaningar 11. I vissa fall kan isolering och exteriorisering av embryot också resultera i signifikant blödning från gulesäcken. Även om vi fann att vi kunde hämma blodflödet med ultraljud gel, kunde någon betydande förlust av blod påverka leveransen och koncentrationen av mikrobubblor, och dessa djur uteslöts från analysen. Slutligen medan isolering gör gräns mödra- och embryonala källor rörelse, är periodisk rörelse med anknytning till hjärtaktivitet oundviklig. Vi valde att avbilda den statiska hjärnan för att direkt undersöka effekten av receptoruttryck på riktade mikrobubblor signal, men genomförandet av realtidsrörelsekompenserade kontrastförstärkt ultraljud 38 majutvidga dessa studier till andra organ.

Det finns få bildprogram som för närvarande kan bedöma kärl landskapet i vardags utveckla musembryo. Vissa studier har framgångsrikt utfört levande avbildning av blodflödet i ex vivo murina embryon med doppler svepte källkod optisk koherens tomografi 39,40, medan magnetisk resonanstomografi, vaskulär korrosion kastar, har microcomputed tomografi och optisk projektion tomografi genomförts obduktion 16. Detta är olyckligt, eftersom denna period av embryonala tillväxten kan avslöja viktig information om tidiga vaskulär utveckling och funktion. Mikrobubblor avbildning i levande embryon kan därför bidra till vår förståelse av utvecklings fysiologi. Det kan också användas för att visualisera biomarkör distribution i hela kroppen av den levande musen fostret i realtid, även om denna teknik är osannolikt att ersätta befintliga metoder (inklusive histologioch fluorescerande avbildning) för mätning av molekylär signal i embryonal vävnad. Den snabbt växande massan av fartyg i embryon, dock liknar nära tumörtillväxt, med uttryck av många av samma nyckel receptorer identifierats i tumör angiogenes 41,42 och kan därför fungera som en utmärkt tumör surrogat för studier som undersökt de kvantitativa förmågor molekylär ultraljud. Vi räknar därför att de beskrivna metoderna kommer att vara till nytta inte bara för att bedöma och karakterisera embryonala modeller av vaskulär hälsa och sjukdom genom funktionell avbildning, men erbjuder en väg för att utforska styrkor och begränsningar molekylär avbildning samt. Dess tillämpning kan också omfatta andra intressanta områden i undersökningen, bland annat i livmodern genöverföring terapi där mikrobubblor har testats som ett sätt att leverera naket DNA till foster musvävnad 10. Alternativt är också möjligt 3D kärl kartläggning av levande embryo,vilket kan ge ovärderlig information om de morfologiska avvikelser i genetiskt modifierade möss. Införande av ultraljudskontrastmedel i isolerade levande embryon kan därför vara ett annat verktyg för att öka vår förståelse av kärlsjukdom och översätta kontrastförstärkt ultraljud applikationer till kliniken.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reagents
Antibodies (biotinylated, eBioscience) — Antibody choice depends on the experiment
  • rat isotype IgG2 control
eBioscience 13-4321-85 This antibody/microbubble combination is often required as experimental control 
  • biotin anti-mouse CD309
eBioscience 13-5821-85
Biotinylated rat MJ 7/18 antibody to mouse endoglin In house hybridoma Outside antibodies may also be appropriate: we  have used eBioscience (13-1051-85 ) in the past
Distilled water
Embryo media
  • 500 ml Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium with high glucose
Sigma D5796
  • 50 ml Fetal Bovine Serum
ATCC 30-2020 lot # 7592456
  • Hepes
Gibco 15630 5 ml, 1 M
  • Penicillin-Streptomycin
Gibco 15140-122 5 ml, 10,000 units Pen., 10,000 μg Strep
Ethanol, 70%
Ice
Paraformaldehyde Sigma 76240 4%
Phosphate Buffered Saline [1x]  Sigma D8537 1x, w/o calcium chloride & magnesium chloride
Pregnant mouse, CD-1 Charles River Laboratories Inc. 
0.9% sodium chloride (saline) Hospira 0409-7984-11
Ultrasound contrast agent, target ready and untargeted MicroMarker; VisualSonics Inc.
Ultrasound gel (Aquasonic 100, colourless) CSP Medical 133-1009
Equipment
Cell culture plates (4) :  100 x 20 mm Fisher Scientific 08-772-22
Cell culture plates (12) : 60 x 15 mm Sigma D8054
Centrifuge Sorvall Legend RT centrifuge 
Conical tubes, 50 ml BD Falcon VWR 21008-938
Diluent Beckman Coulter Isoton II Diluent, 8448011
Dissection scissors (Wagner) Fine Science Tools Wagner 14068-12
Forceps (2), Dumont SS (0.10 x 0.06 mm) Fine Science Tools 11200-33
Forceps, splinter VWR 25601-134
Glass beaker, 2 L (Griffin Beaker) VWR 89000-216
Glass capillaries, 1 x 90 mm GD-1 with filament Narishige GD-1
Glass needle puller Narishige PN-30
Gloves Ansell 4002
Gross anatomy probe Fine Science Tools 10088-15
Hot plate VWR 89090-994
Ice bucket Cole Parmer RK 06274-01
Imaging Platform VisualSonics Inc. Integrated Rail System
Light source, fiber-optic Fisher Scientific 12-562-36 Ideally has adjustable arms
Luers (12), polypropylene barbed female ¼-28 UNF thread Cole Parmer 45500-30
Micro-ultrasound system, high-frequency VisualSonics Inc. Vevo2100
Needles, 21 gauge  (1”) VWR 305165
Particle size analyzer Beckman Coulter Multisizer 3 Coulter Counter
Perforated spoon (Moria) Fine Science Tools MC 17 10373-17
Pins (6), black anodized minutien 0.15 mm Fine Science Tools 26002-15
Pipettors [2-20 μl, 20-200 μl, 100-1,000 μl] Eppendorf Research Plus  adjustable 3120000038;       3120000054;       3120000062
Pipettor tips [2-200 μl, 50-1,000 μl] Eppendorf epT.I.P.S.                   22491334;             022491351
Scissors
Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit Dow Corning
Tubing, Tygon laboratory 1/32” x 3/32” VWR 63010-007
Wooden applicator stick (swab, cotton head) VWR CA89031-270
Surgical microscope 5-8X magnification Fisher Scientific Steromaster
Syringes, 1 ml Normject Fisher 14-817-25
Syringes (10), 30 ml VWR CA64000-041
Syringe infusion pump  Bio-lynx  NE-1000
Thermometer, -20-110 °C VWR 89095-598
Timer VWR 33501-418
Tubes, Eppendorf VWR 20170-577
Tube racks (3) VWR 82024-462
Ultrasound transducer, 20 MHz VisualSonics Inc. MS250
Vannas-Tubingen, angled up Fine Science Tools 15005-08

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Voigt, J. U. Ultrasound molecular imaging. Methods. 48 (2), 92-97 (2009).
  2. Klibanov, A. Preparation of targeted microbubbles: Ultrasound contrast agents for molecular imaging. Medical Biological Engineering Computing. 47 (8), 875-882 (2009).
  3. Cosgrove, D., Lassau, N. Imaging of perfusion using ultrasound. European Journal Of Nuclear Medicine And Molecular Imaging. 37 (S1), 65 (2010).
  4. Williams, R., et al. Dynamic microbubble contrast-enhanced US to measure tumor response to targeted therapy: A proposed clinical protocol with results from renal cell carcinoma patients receiving antiangiogenic therapy. Radiology. 260 (2), 581 (2011).
  5. Burns, P. N., Wilson, S. R. Focal liver masses: Enhancement patterns on contrast-enhanced Images - Concordance of US scans with CT scans and MR images. Radiology. 242 (1), 162 (2006).
  6. Phoon, C. K. L., Aristizabal, O., Turnbull, D. H. 40 MHz doppler characterization of umbilical and dorsal aortic Blood flow in the early mouse embryo. Ultrasound. In Medicine And Biology. 26 (8), 1275-1283 (2000).
  7. Phoon, C. K. L., Aristizabal, O., Turnbull, D. H. Spatial velocity profile in mouse embryonic aorta and doppler-derived volumetric flow: A preliminary model. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 283, H908-H916 (2002).
  8. Aristizábal, O., Williamson, R., Turnbull, D. H. 12A-4 in vivo 3D contrast-enhanced imaging of the embryonic mouse vasculature. Paper presented at Ultrasonics Symposium. , IEEE. New York, NY. (2007).
  9. Bartelle, B. B., et al. Novel genetic approach for in vivo vascular imaging in mice. Circ.Res. 110 (7), 938-947 (2012).
  10. Endoh, M., et al. Fetal gene transfer by intrauterine injection with microbubble-enhanced ultrasound. Molecular Therapy. 5 (5), 501-508 (2002).
  11. Yamada, M., Hatta, T., Otani, H. Mouse exo utero development system: Protocol and troubleshooting. Congenital Anomalies. 48 (4), 183-187 (2008).
  12. Denbeigh, J. M., Nixon, B. A., Hudson, J. M., Purin, M. C., Foster, F. S. VEGFR2-targeted molecular imaging in the mouse embryo: An alternative to the tumor model. Ultrasound in medicine and biology. 40 (2), 389-399 (2014).
  13. Paauwe, M., Dijke, ten, P,, Hawinkels, L. J. A. C. Endoglin for tumor imaging and targeted cancer therapy. Expert Opinion On Therapeutic Targets. 17 (4), 421-435 (2013).
  14. Bourdeau, A., Faughnan, M. E., Letarte, M. Endoglin-deficient mice, a unique model to study hereditary hemorrhagic telangiectasia. Trends Cardiovasc. Med. 10 (7), 279-285 (2000).
  15. Whiteley, K. J., Adamson, S. L., Pfarrer, C. D. Vascular corrosion casting of the uteroplacental and fetoplacental vasculature in mice. Placenta And Trophoblast: Methods And Protocols. 121 (121), Humana Press. Totowa, NJ. 371-392 (2006).
  16. Kulandavelu, S., et al. Embryonic and neonatal phenotyping of genetically engineered mice. ILAR Journal. 47 (2), 103-10 (2006).
  17. Kalaskar, V. K., Lauderdale, J. D. Mouse embryonic development in a serum-free whole embryo culture system. Journal of Visualized Experiments. 85, (2014).
  18. Willmann, J. K., et al. Targeted contrast-enhanced ultrasound imaging of tumor angiogenesis with contrast microbubbles conjugated to integrin-binding knottin peptides. The Journal of Nuclear Medicine. 51 (3), 433-440 (2010).
  19. Deshpande, N., Ren, Y., Foygel, K., Rosenberg, J., Willmann, J. K. Tumor angiogenic marker expression levels during tumor growth: Longitudinal assessment with molecularly targeted microbubbles and US imaging. Radiology. 258 (3), 804-811 (2011).
  20. Lyshchik, A., et al. Molecular imaging of vascular endothelial growth factor receptor 2 expression using targeted contrast-enhanced high-frequency ultrasonography. Journal Of Ultrasound In Medicine. 26 (11), 1575-1586 (2007).
  21. Jerkic, M., et al. Endoglin regulates nitric oxide-dependent vasodilatation. The FASEB Journal. 18 (3), 609-611 (2004).
  22. Denbeigh, J. M., Nixon, B. A., Lee, J. J. Y., et al. Contrast-Enhanced Molecular Ultrasound Differentiates Endoglin Genotypes in Mouse Embryos. , Angiogenesis. Press. (2014).
  23. Adamson, S. L., Lu, Y., Whiteley, K. J., et al. Interactions between trophoblast cells and the maternal and fetal circulation in the mouse placenta. Dev Biol. 250, 358-35 (2002).
  24. Needles, A., et al. Nonlinear contrast imaging with an array-based micro-ultrasound system. Ultrasound. Medicine Biology. 36 (12), 2097 (2010).
  25. Watson, E. D., Cross, J. C. Development of structures and transport functions in the mouse placenta. Physiology. 20 (3), 180-193 (2005).
  26. Shalaby, F., Rossant, J., Yamaguchi, T. P., et al. Failure of blood-island formation and vasculogenesis in Flk-1-deficient mice. Nature. 376, 62-66 (1995).
  27. Kwee, L., Baldwin, H. S., Shen, H. M., et al. Defective development of the embryonic and extraembryonic circulatory systems in vascular cell adhesion molecule (VCAM-1) deficient mice. Development. 121, (1995).
  28. Mercurio, A. M. Lessons from the α2 integrin knockout mouse. The American journal of pathology. , 161-163 (2002).
  29. Hodivala-Dilke, K. αvβ3 integrin and angiogenesis: a moody integrin in a changing environment. Curr Opin Cell Biol. 20, 514-519 (2008).
  30. Pysz, M. A., Gambhir, S. S., Willmann, J. K. Molecular imaging: current status and emerging strategies. Clinical radiology. 65, 500-516 (2010).
  31. Cybulsky, M. I., Iiyama, K., Li, H., et al. A major role for VCAM-1, but not ICAM-1, in early atherosclerosis. J Clin Invest. 107, 1255-1262 (2001).
  32. Xu, H., Gonzalo, J. A., St Pierre,, Y,, et al. Leukocytosis and resistance to septic shock in intercellular adhesion molecule 1-deficient mice. J Exp Med. 180, 95-109 (1994).
  33. Gerwin, N., Gonzalo, J. A., Lloyd, C., et al. Prolonged eosinophil accumulation in allergic lung interstitium of ICAM-2-deficient mice results in extended hyperresponsiveness. Immunity. 10, 9-19 (1999).
  34. Johnson, R. C., Mayadas, T. N., Frenette, P. S., et al. Blood cell dynamics in P-selectin-deficient mice. Blood. 86, 1106-1114 (1995).
  35. Corrigan, N., Brazil, D., McAuliffe, F. High-frequency ultrasound assessment of the murine heart from embryo through to juvenile. Reproductive Sciences. 17 (2), 147-14 (2010).
  36. Turnbull, D. H., Bloomfield, T. S., Baldwin, H. S., Foster, F. S., Joyner, A. L. Ultrasound backscatter microscope analysis of early mouse embryonic brain development. Proc Natl Acad Sci U S A. 92, 2239-2243 (1995).
  37. Greco, A., Mancini, M. L., Gargiulo, S., et al. Ultrasound Biomicroscopy in Small Animal Research: Applications in Molecular and Preclinical Imaging. Journal of Biomedicine and Biotechnology. 2012, (2012).
  38. Pysz, M. A., Guracar, I., Foygel, K., Tian, L., Willmann, J. K. Quantitative assessment of tumor angiogenesis using real-time motion-compensated contrast-enhanced ultrasound imaging. Angiogenesis. 15, 433-442 (2012).
  39. Larina, I. V., et al. Live imaging of blood flow in mammalian embryos using doppler swept-source optical coherence tomography. J.Biomed.Opt. 13 (6), 060506-06 (2008).
  40. Garcia, M. D., Udan, R. S., Hadjantonakis, A. K., Dickinson, M. E. Live imaging of mouse embryos. 4 (4), Cold Spring Harbor. 104-10 (2011).
  41. Teichert, A., et al. Endothelial nitric oxide synthase gene expression during murine embryogenesis. Commencement of expression in the embryo occurs with the establishment of a unidirectional circulatory system. Circulation Research. 103 (1), 24-33 (2008).
  42. Walls, J. R., Coultas, L., Rossant, J., Henkelman, R. M. Three-dimensional analysis of vascular development in the mouse embryo. PLoS One. 3 (8), (2008).

Tags

Utvecklingsbiologi Micro-ultraljud Molecular Imaging mus embryo mikrobubblor Ultraljud kontrastmedel Perfusion
Contrast Imaging i musembryon Använda Högfrekvent Ultraljud
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Denbeigh, J. M., Nixon, B. A., Puri, More

Denbeigh, J. M., Nixon, B. A., Puri, M. C., Foster, F. S. Contrast Imaging in Mouse Embryos Using High-frequency Ultrasound. J. Vis. Exp. (97), e52520, doi:10.3791/52520 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter