Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

Kontrast Imaging i Mouse Embryoer hjelp Høyfrekvente ultralyd

Published: March 4, 2015 doi: 10.3791/52520
Automatic Translation
1,2, 1,2, 1,2,3, 1,2
1Department of Medical Biophysics, University of Toronto, 2Sunnybrook Research Institute, 3Lunenfeld-Tanenbaum Research Institute, Mount Sinai Hospital, Toronto

Summary

Her presenterer vi en protokoll for å injisere ultralyd mikrobobleutskillere kontrastmidler i stue, isolerte sent svangerskap scenen murine embryoer. Denne metoden gjør det mulig å studere perfusjon parametere og av vaskulære molekylære markører innenfor embryo ved hjelp av kontrastforsterket høyfrekvente ultralydavbildning.

Introduction

Kontrastforsterket ultralydavbildning gjør bruk av agenter mikrobobleutskillere kontrast å visualisere og karakterisere vaskulær miljø. Disse agentene aktiver invasiv vurdering av mikrosirkulasjonen, vaskularitet og kardiovaskulær funksjon. I tillegg kan modifikasjon av bobleoverflaten resulterer i målrettet mikroboble-binding til endotelceller biomarkører, som vist i prekliniske anvendelser av angiogenese, aterosklerose og inflammasjon 1,2 gjør molekylultralydavbildning av vaskulære hendelser mulige. Kontrastforsterket ultralyd kan derfor brukes til å identifisere de komplekse og ulike miljøer som påvirker friske og syke vaskulære tilstander 3-5.

I det siste nummeret av årene har interessen for nytten av mikroboble bildebehandling utvidet til den allsidige museembryo modell. Som en modell for pattedyr utvikling, innføring av mikrobobler inn i den embryonale blodkar forbedrer fysiologiskestudie av utviklingen av sirkulasjonssystemet (for eksempel blodstrøm, minuttvolum) og i tilfeller av transgene og målrettede mutante mus modeller av hjertesykdom 6,7, kan gi innsikt i hvordan genetiske faktorer endre kardiovaskulær funksjon. Faktisk analyserer kvantitativt og kvalitativt 2D av embryonale hjerne vaskulaturen har allerede blitt oppnådd 8. Videre presenterer museembryo som en utmerket modell for å undersøke bindingen av målrettede mikrobobler til vaskulære markører in vivo. Bartelle et al. 9, for eksempel, har innført avidinbelagte mikrobobler inn embryo hjerte ventriklene å vurdere målrettet binding i Biotag-Bira transgene embryoer og undersøke vaskulær anatomi. Generering av heterozygote og homozygote musemodeller kan også brukes som et surrogat for tumormodellstudier tar sikte på å definere den kvantitative innholdet av molekylært ultralyd - et viktig referansesette denne teknikken til klinikken.

8-10. I utero injeksjoner, men står overfor en rekke utfordringer. Disse inkluderer injeksjon veiledning, behovet for å motvirke bevegelse i mor og exteriorized embryo, vedlikehold av hemodynamisk levedyktighet hos mor og utlagte embryoer, adressering langsiktige effektene av anestesi og komplikasjoner på grunn av blødning 11. Derfor er målet med undersøkelsen har vært å utvikle en teknikk for å injisere mikrobobler inn i isolert levende sent stadium embryoer 12. Dette alternativet gir mer frihet i form av injeksjon kontroll og posisjonering, reproduserbarhet på bildeplanet uten hindringer, og forenklet bildeanalyse og kvantifisering.

I denne studien, skisserer vi en roman prosedyre for injeksjon av mikrobobler i levende museembryoer for det formål å studere mikroboble kinetisk atferd og studere målrettet mikrobobleutskillere binding til endogene endothelial markører overflate. Ikke-lineær kontrast spesifikk ultralydavbildning brukes til å måle av en rekke grunnleggende perfusjon parametere inkludert peak enhancement (PE), vaske-in rate og tid til maksimal (TTP) i isolerte E17.5 embryoer. Vi demonstrerer også gyldigheten av embryoet modell for vurdering av kvantitativ natur molekylær ultralyd i en embryonale endoglin tap av funksjon transgen musemodell, hvor endoglin er en klinisk relevant mål på grunn av sin høye uttrykk i vaskulære endotelceller på steder med aktiv angiogenese 13 . Heft endoglin-målrettet (MB E), rotte isotypen IgG 2 kontroll (MB C) og vilkårlige (MB U) mikrobobler evalueres i heterozygot endoglin (Eng +/-) og homozygot endoglin (Eng + / +) uttrykker embryoer. Analyse av målrettet binding avslører at molekyl ultralyd er i stand til å skille mellom endoglin genotyper og relatert reseptor-tettheter for å kvantifiserbare molekylultralydnivåer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

MERK: De eksperimentelle prosedyrer utført i denne studien ble godkjent av Animal Care Utvalget ved Sunnybrook Research Institute (Toronto, Ontario, Canada). Prosedyrer for human behandling av dyr må følges til enhver tid. Det forutsettes at etterforskeren er opplært i grunnleggende bruk av en ultralyd imaging system. Denne protokollen fungerer best med to personer.

1. Dyre Modeller

  1. Mate CD-en mannlig og kvinnelig Mus musculus å få villtype embryoer for perfusjon studier.
  2. For molekylær imaging studier, generere Eng +/- mus ved homolog rekombinasjon bruker embryonale stamceller av 129 / Ola opprinnelse som beskrevet av Bourdeau et al. 14.
    1. Backcross B6- Eng +/- mus, ber vi kjøpt fra Dr. Michelle Letarte, til CD-en bakgrunn. Bruk Eng +/- CD-en backcrossed embryoer, samt deres Eng + / + littermate controls. Mate musene å produsere iscenesatt embryoer.

2. Eksperimentell Forberedelse

  1. Initiere parring av mus og sjekk kontakt daglig. Embryoniske dag 0.5 er definert som noon av dagen en vaginal plugg er observert.
  2. Forbered embryo medier ved tilsetning av 50 ml føtalt bovint serum, 5 ml 1 M HEPES og 5 ml Penicillin-Streptomycin (10 000 enheter penicillin, 10.000 pg streptomycin) i 500 ml Dulbeccos modifiserte Eagles medium (DMEM) med høy glukose (4,500 mg / L). Pakk flasken i folie og holde kjølt ved 4 ° C.
  3. Sentrifuger klart ultralyd gel i 50 ml koniske rør ved 140 xg i 20 min. Trekke gel opp i 30 ml sprøyter. Fyll ytterligere (merket) 30 ml sprøyter med fosfatbufret saltvann (PBS) og satt til side. Ett kull av befruktede egg vil vanligvis kreve mellom 2-3 sprøyter med ultralyd gel og 4 sprøyter med PBS.
  4. Trekk ca 30 glass nåler og forsiktig feste til en stripe av plastilinai en 100 x 20 mm cellekulturskål. Dette sikrer at nålene blir separert og sikker under håndtering. Ved hjelp av en glass avtrekker, kan du bruke følgende innstillinger på en x 90 mm glasskapillærer med glødetråd: Heater 77, Sub magnet 55, Main magnet 70.
  5. Forbered ti på tolv disseksjon plater (nok til å sikre at hver embryo i et kull får sin egen rett), ved anvendelse av en 1: 8 volumforhold av herdemiddel til basen. Hell 40 ml av basen i et 50 ml konisk rør. Legg 5-6 ml herder og røre med trepinne.
    1. Hell i 60 x 15 mm kultur retter, fylle hver til omtrent halvparten. La stå O / N for å stille.
  6. Feste hunn luers til 400 mm lange stykker av polyvinylklorid (PVC) rør (indre diameter: 0,79 mm). Slangen må komme fra sprøytepumpen til ultralyd scenen komfortabelt.

3. Eksperimentell Set-up

  1. Ordne bildeplattformen under kirurgisk mikroskop med en 3D-motor og lineær rekke 21 MHz svinger.
    1. Orient plattformen, slik at skinnen montere ligger på venstre side, med scenen plassert direkte under mikroskop.
    2. Fest 3D motoren til kuleleddet av forløp arm av plattformen. Skru hurtigkoblingen innlegg av svingeren klemme inn hurtigkoblingen montere på motor, vendt forover, og plassere svingeren hodet i klemme, feste sperren.
    3. Fest transduserkoblingen i den aktive porten på frontpanelet på vognen. Slå på maskinen.
  2. Initiere 21 MHz ultralydtransducer, velge "kardiologi 'innstilling for molekylær imaging studier, og' generelle 'for perfusjon studier. Skift alle tids gain-kompensasjon glidere til den nøyaktige plasseringen midten. For 'Contrast Mode', angi følgende parametere: Frekvens: 18 MHz, overføre makt: 4%, (0,39 MPa), Contrast Gain: 30 dB, Foci: 6 & 10 mm, Contrast Mode: Nonlinear, Burst tid: 100% på 0,1sek, Strålebredde: Wide.
  3. Alikvote 40 ml embryo media hver i fire 50 ml koniske rør. Plassere på is.
  4. Varm 1 liter vann i et 2 liters beger på en varm plate. Opprettholde ved 45 ° C. Tilsett en sprøyte med ultralyd gel og PBS til begeret til å forvarme. Opprettholde denne temperatur ved overvåking med et termometer til alle tider.
  5. Avsatt ti på tolv 1 ml sprøyter og ti på tolv 21 G nåler for injeksjon av mikrobobler.

4. Kirurgisk prosedyre

MERK: Ha en assistent forberede boblene (stadium 5) mens kirurgen starter den kirurgiske prosedyren. Protokollen er beskrevet her har blitt tilpasset fra Whiteley et al. 15

  1. Samle E16.5 eller E17.5 embryoer fra den gravide kvinnelige mus følgende halsdislokasjon.
    MERK: Effekten av anestesi på embryoer har ennå ikke blitt studert i detalj 16. Ytterligere fremgangsmåter, inkludert halshogging, kan være hensiktsmessig opninger for ofringen av de gravide mus.
    1. Skjære opp magen for å avsløre livmoren og embryoer. Nøye og raskt fjerne livmoren ved å kutte på tuppen av livmor horn (kappe ovarian og livmor fartøy) og severing på vagina og urinblæren.
    2. Ved hjelp av utbryter tang, overføre livmoren til en tube på 40 ml iskald embryo media så raskt som mulig uten å skade embryoer. Kast mus kadaveret.
  2. Omplassering til mikroskop og scene. Deponere livmoren til en 100 x 20 mm cellekultur parabolen. Overfør livmoren til en ny tallerken fylt med 50 ml frisk embryo media.
  3. Ved hjelp av sterilisert (70% etanol-spray) fin pinsett, forsiktig rive og trekke bort de ytre membraner av livmoren som starter ved den ene ende. Utsett morkake decidua, parietal plommesekken og Reichert membran for å skille og fjerne fra den underliggende visceral plommesekken.
  4. Skjær ut embryoene en etter en, holde visceral yOLK sacs intakt og håndtering morkaken så skånsomt som mulig 17. Ta vare å unngå ruptur av plommesekken som embryoene sprette ut umiddelbart.
    1. Bruk den perforerte skjeen å flytte embryoene til en annen tallerken holdt på is med ferske embryo media. Hold embryoene kjølt inntil nødvendig. Endre media i embryoet parabolen hver 1-1,5 time. Med disse forholdene embryoer er levedyktig for opp til fire timer etter disseksjon.

5. mikrobobleutskillere Forberedelse

MERK: Utfør molekylær avbildning med ultralyd ved hjelp av både målrettede og uønskede mikrobobler. Et enkelt eksperiment kan kreve så mange som tre separate ampuller med mikrobobler: i) antistoff målrettet mikrobobler, ii) kontroll isotypen antistoff målrettede mikrobobler og iii) uønskede mikrobobler. Kontrastmiddelet kommer som en tørr-fryse pulver og må rekonstitueres med saltvann før injeksjon. Det er ~ 2 x 10 9 mikrobobler i hvert uønskede Microbubble hetteglass og ~ 8,8 x 10 8 mikrobobler i målet klare hetteglass. Mikroboblene er stabile i opp til 3 timer etter rekonstituering.

  1. Rekonstituering av Target Klar Ampuller
    MERK: Eksempler på mål ferdige preparater: endoglin målrettede mikrobobler (MB E, med biotinylerte rotte MJ 7/18 antistoff mot mus endoglin, i huset hybridomcellelinje anlegget); vaskulær endotelial vekstfaktor reseptor 2 (VEGFR2) målrettede mikrobobler (MB V, med biotin anti-mus CD309); rotte isotypen IgG 2 kontroll antistoff målrettede mikrobobler (MB C, biotin rotte isotypen IgG 2 kontroll rettet mot mus IgG2a).
    1. Fortynn antistoffløsning (20 ug) i 1 ml (endelig volum) av saltvann. Hold på is.
    2. Fyll sprøyte med 1 ml saltvann, fjerne alle luftbobler. Feste en 21 G nål, injisere løsningen sakte inn i mikrobobleutskillere hetteglasset.
    3. Sakte trekke stempelet, fjerne en ml luft, og ta ut nålen. Forsiktigagitere. La stå 5 min på is.
      MERK: Ultralyd mikrobobler kan bli ødelagt under høyt trykk miljøer.
    4. Etter medgått tid, fylle en ny sprøyte med antistoffet fortynning og legge til den aktuelle flasken. Beveg lett. La blandingen (som nå 2 ml) stå i 10 min. Hold på is. Antar hele overflaten konjugering, gjennomsnittlig antall bundet ligand for mikrobobler er ca 18 7600 ligander / mikrometer to.
  2. Tilberedning av vilkårlige Ampuller
    1. Fyll sprøyte med 1 ml saltvann, fjerne alle luftbobler. Feste en 21 G nål, injisere løsningen sakte inn i mikrobobleutskillere hetteglasset.
    2. Sakte trekke stempelet, fjerne en ml luft, og ta ut nålen. Beveg lett. La stå 5 min. Legg til en ytterligere 1 ml saltløsning, som beskrevet ovenfor. Beveg lett og la stå 10 minutter på isen.
  3. Coulter Counting
    1. Forsiktig agitere ønsket mikrobobleutskillere hetteglass og tegne ~50 pl av oppløsningen i en 1 ml sprøyte med 21 G nål. Injisere mikrobobler inn i en tom 2 ml mikro tube.
    2. Pipetter en 10 pl prøve av mikroboblestamløsning i 10 ml fortynningsmiddel.
    3. Etter forsiktig omrøring, vurdere konsentrasjon og størrelsesfordeling av mikroboble befolkningen ved å bruke labben telling (se liste over materialer). Tell minst tre 50 mL målinger (per ampulle prøve) under anvendelse av en 30 um åpning.
  4. Forbereder Microbubbles for Injection
    MERK: Assistenten utfører dette trinnet når 'Injeksjon av Microbubbles inn embryoer' (trinn 6) er påbegynt. Hver embryo blir injisert en gang, med den type mikroboble valgt for hver injeksjon for å bli tilfeldig utvalgt av assistent, slik at alle typer av mikroboble er jevnt fordelt i hele fremgangsmåten, men gitt i en tilfeldig rekkefølge. Sørge for at kirurgen er blinde for den type boble som injiseres.
    1. Fastslå the volum av lager boble som er nødvendig for å frembringe en sluttkonsentrasjon på 1 x 10 8 MB ​​/ ml i et volum på 400 ul (beregne volumet ved hjelp av lager-konsentrasjoner målt i 5.3.3). Alikvoter av den tilsvarende volum av saltoppløsning i en tom mikrosentrifugerør.
    2. Forsiktig omrøre den valgte mikroboblehetteglass og trekke en overskytende volum (~ 50 mL større enn det som beregnes ovenfor) av løsningen i en 1 ml sprøyte med 21 G nål. Injiser mikrobobler inn i en tom mikrosentrifugerør.
    3. Pipette nødvendig volum av mikroboblestamløsning og legge til delmengde av saltvann. Bland forsiktig ved å røre med spissen av pipetten.
    4. Tegn den fortynnede mikrobobleutskillere løsning i en ren sprøyte med 21 G nål. Fjerne nålen, eliminere eventuelle luftbobler fra sprøyten og fest luer og slangen. Trykk forsiktig løsning på enden av slangen og pass på at ikke å generere eventuelle luftbobler.
    5. Sett syringe inn i en sprøyteinfusjonspumpe innstilt for å utlevere de mikrobobler i en mengde på 20 ul / min for et totalvolum på 20 ul. Fest et trukket glassålen til enden av slangen. Flytter pumpen nær injeksjonstrinnet.

6. Injeksjon av Microbubbles inn Embryoet

  1. Tilfeldig velge og fjerne (med perforert skje) ett embryo fra kjølt media parabolen. Plasser i disseksjon fatet ligger på ultralyd scenen under stereoskop og fjerne plommesekken og amniotiske membraner med fin pinsett, kutte / rive fra siden som vises minst vaskulariserte (den antimesometrial side). Dette er lettest oppnås ved piercing et område som grenser til hoderegionen.
    1. Skjær nok til å fjerne embryoet innenfra, men ikke mer. Stabilisere disseksjon retter med små biter av plastilina.
  2. Forsiktig manøvrere sac fra hele embryo. Plasser embryo på sin side, med morkaken ogumbilical fartøy i front. Bruke insekt pins, pin ned plommesekken (4 pinner anbefales) og kanter av morkaken som er nødvendig for å feste på plass. Unngå store fartøy.
  3. Vask embryo med forvarmet 45 ° C PBS inntil fosteret gjenoppliver. Identifiser navlevenen og dens tilhørende vaskulære nettverk. Plasser parabolen slik at injeksjon kan gjøres komfortabelt.
    MERK: Når varmet, vil blod i embryoet begynner å flyte, synlig pumping i navlearterien. Når strømningen først begynner, vil venene være en lys rød, med blodet i begge fartøyer raskt vises identiske. Grenene som oppstår fra navlevenen vanligvis overlappe de fra navlearterien på morkake overflaten.
  4. Når fosteret har gjenopplivet, dekke det (men ikke morkaken) med forvarmet amerikanske gel, være sikker på å delikat fjerne eventuelle luftbobler (ved bruk av fine tang) fra rundt embryo. Fyll opp fatet med forvarmet PBS.
    MERK: Hold øye med nivået av solutipå i PBS og gel sprøyter og legge backup sprøyter til varme begeret etter behov.
  5. Montere glass nål på en stor ball av plastilina på kanten av disseksjon fatet og stikk nålen enden inn i PBS. Velge en blodåre på chorionic overflaten av morkake plate, så langt fra den viktigste grenen som rimelig, trim tips til størrelse med saks. Injeksjon er enklest hvis spissen er kuttet med en liten vinkel. Fjern eventuelle ujevne kanter på glasset ved hjelp kanten av våren saks.
  6. Ved hjelp av sprøytepumpen, injiser langsomt mikroboble oppløsning ved 20 mL / min inn i glassålen inntil all luft er fordrevet fra nålespissen og mikrobobler kan sees å strømme fritt inn i PBS. Stoppe pumpen og tilbake for et injeksjonsvolum på 20 ul. Ikke slippe inn luft fosteret karsystemet under injeksjon.
  7. Sett glasset nålespissen forsiktig inn i en av blodårene i morkaken, og sikre at det er ubevegelig. Svinge bort stereoscope hode og posisjon svingeren over fosteret. Initiere bildebehandling.

7. Ultralyd Molecular Imaging

MERK: Bruk av kontrast lineære bilde betingelsene som tidligere, plassere svingeren slik at fosteret ligger jevnt mellom brennpunktene på 6 og 10 mm. Når plasseringen, starte bolusinjeksjon av mikrobobler. Når injeksjonen er fullført, starter tidtakeren.

  1. Perfusjonsbilleddannende
    1. Sørg for at det maksimale antall bilder for ikke-lineær kontrast modus velges ved å trykke på "studieadministrasjon 'knappen og klikke på" Prefs-fanen på toppen av studien leseren. Sjekk den aktuelle boksen i 'Preferences' vinduet.
    2. Justere bildeinnstillingene ved å initiere lineær avbildning. Trykk 'kontrastmodus-knappen på kontrollpanelet. Avgrense 2D gevinst ved å justere "gain & #8217; ringe til 30 dB, redusere strøm til 4% ved hjelp av "makt" dial, redusere frekvensen til 1 Hz ved hjelp av "frekvens" dial og angi bredden strålen (nederst i venstre hjørne) til bred bruk av roller ball / mus.
      MERK: Alle kontroller er plassert på kontrollpanelet av ultralydsystemet.
    3. Fange hele vask-in og spredning av mikroboble bolus ved å spille inn en 20 min cine sløyfe på en bildefrekvens på 1 Hz. Trykk scan / fryse for å starte datainnsamlingen.
    4. Når full sekvens av bilder er blitt tatt til fange, trykker du på "cine store 'knappen på kontrollpanelet for å lagre sekvensen av bilder i systemet buffer. Systemet skaper en dato-stemplet cine løkke av de ulineære kontrast modell data ervervet.
  2. Målrettet mikrobobleutskillere Imaging
    1. Under "Prefs", satt sprengingstiden til 0,1 sek. Stille de riktige bildeparametere ved hjelp av kontrollene desskribert ovenfor (7.1.2.).
    2. Initiere lineær kontrast bildebehandling ved å trykke på 'kontrastmodus-knappen på kontrollpanelet. Sørge for at fosteret er riktig plassert under transduser, og at strømningen av mikroboblekontrastmiddel gjennom embryo er synlig i det ulineære kontrastmodus bilde.
    3. For å vurdere målrettet mikroboble binding under embryonale molekylavbildningsstudier tillate mikroboblene til å sirkulere uforstyrret i 3 minutter og 40 sekunder etter fullføring av injeksjonen. Denne gangen er å tillate oppbevaring av sirkulerende mikrobobler. Trykk 'scan / fryse "for å stoppe bilde løpet av denne tiden.
    4. På 3 min og 40 sek, for å gjenoppta bilde bekrefte at fosteret er fortsatt synlig, er tilstrekkelig dekket med PBS, og at mikrobobler fortsetter å sirkulere. Trykk 'scan / fryse "for å starte bilde.
    5. Erverve avbrudd / påfyll sekvens på 3 min og 50 sek etter injeksjon ved å spille inn en "pre-ødeleggelsesjon 'akustisk respons sekvens ved 29 Hz. Trykk 'scan / fryse' for å starte datainnsamlingen. På 4 min etter injeksjon 18,19, initiere en 0,1 sek høyfrekvente akustisk briste. Trykke på "burst" -knappen for å gjennomføre et utbrudd.
    6. Fortsett å spille inn rammer for resten av sekvensen (inntil bufferen linjen er full) og lagre film løkke ved å trykke på "cine store '.
    7. Samle en ekstra cine løkke av sirkulerende mikrobobler. Dette påfølgende "post-ødeleggelse" bildesekvens antas å inneholde bare sirkulerte boble signaler som er etterfylles strålen. Trykk 'scan / fryse "for å starte bilde og" smalfilm store' for å samle bildene.
    8. Merke cine looper etter bildebehandling hvert embryo. Trykk 'studie management', uthever du filen ved hjelp av kulen og "velge" -knappen, trykk 'image etiketten' og navn på riktig måte.

    8. Håndtering av embryoer etter injeksjon

    1. Innlegg imaging, flytte svingeren, løsne embryoet og avlive (via halshogging, cervical forvridning, karbondioksid kvelning, eller anestesi etterfulgt av rask frysing eller fiksering) som ønsket.
    2. For hvert påfølgende embryo injeksjon en frisk disseksjon fatet, nål, sprøyte og slange segment må brukes, med utarbeidelse av neste gruppe av mikroboble injeksjon løsning finner sted i løpet av disseksjon og vekkelse.
    3. Lagre vevsprøver (f.eks hale, hjerne) for ytterligere analyser (f.eks genotyping bestemmes av PCR-analyse av isolerte hale DNA, lacZ flekker, eller semi-kvantitative mål av biomarkør uttrykk ved hjelp av vestlige blotter 21).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Injeksjon av ultralydkontrastmidler i ex utero mus embryo er avhengig av den vellykkede isolering av levende, sen-svangerskaps trinns embryoer fra livmor og opprettholdelse av levedyktighet i løpet av injeksjonen, og tilhørende ultralydavbildning. Når embryoet har blitt exteriorized og posisjonert, som vist i figur 1, er imidlertid injeksjon av kontrastmidlet inn i den embryoniske blodkar mulig. En typisk B-modus ultralydbilde av et E17.5 mus embryo er vist i figur 2A. Vaske-in av mikrobobler og tilsvarende forbedring i vena cava inferior, hjertet, hjernen, og i det hele dyret kan fanges ved hjelp av lineære kontrast avbildningsmetoder, og dermed demonstrere gjennomførbarheten av denne teknikken. Individuelle tidspunkter er avbildet i figur 2B og viser endringen i kontrast over tid.

Ved å ta opp hele vask-in og utvasking of mikroboble bolus, er det mulig å måle forskjellige parametere perfusjon. I en frakoblet analyse, ble kontrasten region kurveverktøyet brukes til å lage 1,5 mm 2 regioner av interesse (ROI) i de embryonale venstre og høyre hjernehalvdelene. Den gjennomsnittlige signalintensitet innenfor disse ROIs ble deretter plottet som en funksjon av tid og glattet ved hjelp av en syv-punkt medianfilter. Fra den resulterende kontrastintensitetskurven (vist i figur 2C), ble hjernen topp forsterkning bestemmes. Vask-i hastighet, definert som stigningen mellom 10% og 50% av den maksimale toppforsterkning (PE), ble også beregnet. Til slutt, tid til topp (TTP) ble beregnet fra starten av signalforsterkning til topp tid. Forskjeller i gjennomsnitts perfusjon parametere på tvers av ulike boble typer ble testet ved hjelp av egne t-tester 12. Resultatene, oppsummert i tabell 1, viser at injeksjon av mikrobobler gir en kostbarstand metode for å fastslå viktige perfusjon parametere i utviklings mus.

Innføringen av mikrobobler i det embryoniske blodkar muliggjør også bruk av museembryoer som modellsystemer for å definere og karakterisere de kvantitative kapasiteter molekylultralydavbildning. I følgende eksempel, et tap av funksjon modell, hvor genetisk manipulasjon generert heterozygote og homozygote uttrykk mønstre av endoglin i embryonale mus, ble brukt til å teste evnen til molekylær ultralydavbildning å skille mellom genotyper. Etter at mikrobobleinjeksjon og innføring av ødeleggelse / etterfylling avbildning, ble forholdet mellom den gjennomsnittlige signalstyrken for "pre-destruksjon" til "post-ødeleggelse 'sekvenser anvendt for å produsere et mål på molekyl signal kalt kontrast betyr effektforhold (CMPR ). En lineær blandet modell (med Bonferroni justeringer som er gjort for multiple sammenligninger) ble utført for å fastslå w hether var det ingen signifikant forskjell mellom endoglin målrettet, kontroll og vilkårlige mikroboble-binding til Eng + / + og Eng +/- embryoer (identifisert post injeksjon via polymerasekjedereaksjon (PCR) av haleprøver). De estimerte CMPR midler (middel ± 95% konfidensintervall (CI)) er presentert for hver mikroboble og embryo typen i figur 3, og er oppsummert i tabell 2.

Disse funn gir en betong demonstrasjon av at injeksjon av ultralydkontrastmidler i isolerte levende embryoer kan oppnås. Videre letter denne protokollen vurderingen av perfusjon parametere og kan brukes til å sammenligne målrettet mikrobobleutskillere binding i embryo modeller av vaskulær sykdom i et forsøk på å belyse de kapasiteter på molekylær ultralydavbildning.

.jpg "/>
Figur 1. eksperimentelle oppsettet for injeksjon av mikrobobler inn i isolerte embryoer. En 21 MHz-lineær oppstilling transduser er plassert over en exteriorized levende E16.5 embryo som en 20 ul mikroboble oppløsningen blir injisert i et placental vene ved hjelp av en glass kanyle. Skala bar = 10 mm. Fra Denbeigh, JM et al. 12 med tillatelse. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 2
Figur 2. Ultralyd Imaging av exteriorized Stue E17.5 embryoer. (A) B-modus ultralydbilde av et embryo. Før injeksjon av målrettede mikrobobler (t = 0) sek. (B) Ikke-lineær kontrastbilde av embryoet før og etter injeksjon av mikrobobler. Ikke-lineær kontrast prieller til mikrobobleutskillere injeksjon (t = 0 sek). Bare de sterkeste reflekterende grensesnitt (f.eks bein) er synlig, med minimal signal fra det myke vevet. Nedenfor, ikke-lineær kontrastrikt bilde av mikrobobler innenfor embryo ved t = 50 sek, t = 120 sek og t = 420 sek etter en bolusinjeksjon. Kontrast oppdages hele dyret, inkludert hjertet og hjernen. (C) perfusjon parametere som stammer fra tidsintensitetskurvene. Intensitet plott av mikrobobler som en funksjon av tiden i løpet av en enkelt ROI i embryonale hjernen. Perfusjon parametere er identifisert på grafen, inkludert topp enhancement (PE), vaske-in rate (helling), og tid til maksimal (TTP). Pilspisser: R = ribber, Ht = hjerte, Br = hjerne. au, vilkårlige enheter; ROI, region av interesse; sek, sekunder. Skala bar = 3 mm. Dette tallet har blitt forandret fra Denbeigh, JM et al. 12. Klikk her for å se et størreversjon av denne figur.

Figur 3
Figur 3. Oversikt over gjennomsnittlig kontrast bety strømforhold (CMPR) for endoglin målrettet (MB E), kontroll (MB C) og uønskede mikrobobler (MB U) i Eng + / + og Eng +/- embryoer. CMPRs fra endoglin målrettet mikrobobler var signifikant høyere (***, p <0,001) enn de som er oppsamlet for MB MB C og U, (ikke signifikant forskjellige fra hverandre, uavhengig av genotype). MB E binding ble funnet å være betydelig høyere i Eng + / + embryoer (mørke markører) sammenlignet medEng +/- embryoer (lys markører). Resultatene presentert som gjennomsnitt ± 95% konfidensintervall. n angir antall unike embryoer i hver kategori. Fra Denbeigh, JM et al. 22 med tillatelse. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Mikrobobleutskillere Type T-tester
p-verdi
Perfusjons Parameter MB U MB C MB V MB U vs MB C MB U vs MB V MB <sub> C vs MB V
Peak Enhancement, PE (au) 0,427 ± 0,063 0,490 ± 0,079 0,499 ± 0,064 0,19 0,06 0.81
Wash-in rate (au / sek) 0,008 ± 0,002 0,009 ± 0,002 0,011 ± 0,002 0,18 0,01 0.09
Tid til Peak, TTP (sek) 53.75 ± 7.96 51.75 ± 4.46 45.00 ± 5.33 0.55 0.03 0.03
# embryoer injisert 4 4 3

Tabell 1. Sammendrag av E17.5 embryonale perfusjon parametere. Mean ± standardavvik som stammer fra tids intensitet tomter for alle embryo Rois (a.u. = Vilkårlige enheter). Tabellen inkluderer målinger for vilkårlige (MB U), IgG 2 kontroll målrettet (MB C) og VEGFR2 målrettet (MB V) mikrobobler. Separate t-tester ble utført for å sammenligne grupper. Denne tabellen har blitt forandret fra Denbeigh, JM et al. 12.

Mikrobobleutskillere typen Genotype CMPR Mean 95% konfidensintervall
MB E Eng + / + 9.71 9.05, 10.38
Eng +/- 5,51 4.87, 6.15
MB C Eng + / + 1,42 0.41, 2.43
Eng +/- 1,46 0.45, 2.47
MB U Eng + / + 1.7 0.65, 2.75
Eng +/- 1.76 0.67, 2.84
Linear Mixed Model: Mellom-lagt Effects
df F p-verdi
Genotype 1 12.75 <0,001
Mikrobobleutskillere typen 2 147,65 <0,001
Genotype * mikrobobleutskillere typen 2 18.29 <0,001

Tabell 2. Oppsummering av lineær blandet modell analyse formikroboble binding i embryoer, med en Bonferroni korreksjon for multiple sammenligninger. Genotype, mikrobobletypen, og den kombinerte interaksjon (genotype * mikrobobletype) ble funnet å være viktige faktorer i å bestemme CMPR. df = frihetsgrader. Fra Denbeigh, JM et al. 22 med tillatelse.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Kontrastmidler ultralyd ble injisert i sent stadium svangerskapet museembryoer og bilder lineære kontrast ble kjøpt for å måle perfusjon parametere og målrettet mikrobobleutskillere bindende. Vellykket avbildning av mikrobobler i embryoniske blodkar var avhengig av en rekke faktorer, den første er embryo levedyktighet. Alt utstyr og apparatur ble fremstilt på forhånd, for å minimalisere den tid som er nødvendig for isolasjon av embryoer fra livmoren til begynnelsen av injeksjonen. Siden effekten av enkel eller gjentatt eksponering for anestesi på embryonale mus ikke har blitt studert i detalj, ble bruken av anestesi hos mor unngås før ofre 16. Under embryo isolasjon, var det viktig å hindre skade på plommesekken og for å sikre embryoene ble holdt kjølt til alle tider, i ofte uthvilt embryo media. Når eksteriorisere embryo før injeksjon og under låsing, ble store vitelline fartøy unngått å begrense likelihood av blødning, som kan være dødelig. Vi fant ut at når gjenopplive fosteret, var det best å først dekke morkaken og deretter embryo med PBS før vi legger ultralyd gel til embryoet i en frem og tilbake bevegelse og fjerne eventuelle store bobler med pinsett. Resten av petriskålen ble deretter fylt med PBS. Bruken av gel og PBS begrenset mulighet for luftlommer mellom embryoet og transduseren, noe som kan påvirke bildekvaliteten. Som embryo gjenopplivet, begynte blodet å strømme, synlig pumping i navlearterien mens de umbilical årer dukket knallrød 23. For referanse, grenene som kommer fra umbilical vein vanligvis overlappe de fra navlearterien på morkake overflaten. Selv om det var mulig å injisere inn i de placen labyrint arterioler, injisering av mikroboblene i strømningsretningen redusert placental blødning og venule injeksjoner også tillatt mikroboblene til å passere direkte gjennom embryoet før sirkulerende thgrov morkaken.

På grunn av sin skjørhet, mikrobobleutskillere forberedelse og håndtering også nødvendig omsorg. Ultralyd mikrobobler kan bli ødelagt under høyt trykk miljøer. Derfor ble den samme prosedyre gjentatt i løpet av hver tilberedning og boblekonsentrasjonen ble målt for å sikre eksperimentell konsistens. En enkelt hetteglass med mikrobobler var typisk nok for ca 5-7 embryoer. Siden mikroboblene er stabile inne i ampullen for opp til 3 timer, ble flere ampuller ofte nødvendig for et enkelt eksperiment. For å unngå å rive vev, det var best for glasset spissen av kanylen for å være skarpe og kuttet på en liten vinkel mens nærmer fartøyet på en så liten vinkel som mulig. Når trimmet, spissen av nålen måtte være stort nok for at boblene til å flyte lett gjennom utløpet uten klumpdannelse, men liten nok til å passe lett inne i beholderen. Den ideelle størrelsen var generelt <100 mikrometer. Noen praksis på å bedømme den aktuelleStørrelsen var nødvendig. I tilfelle at spissen ble kuttet for stor, eller ble blokkert, ble et nytt glass nål brukt. Det enkelte tilfeller var det mulig å trimme nålen litt over blokkeringen. Det var viktig at luften ikke få lov til å gå inn i embryoet karsystemet under injeksjon, da dette kan føre til død av dyret og var uønsket under avbildning (luftbobler kunne ta inn i blodkar av embryo og kan påvises i ultralydbildet , kunstig øke noe målte signal). Ikke-lineær kontrast bildebehandling utført i denne protokollen som brukes en state of the art med høy frekvens (21 MHz) micro-ultralydsystem (Vevo2100) paret med lineære arrays spesielt utviklet for små dyr imaging (MS250). Mikro- eller høy frekvens -ultrasound er en av de få modaliteter stand, på dette tidspunktet, for å gi bilder av levende mus embryoer og nyfødte 16 høyoppløselige. Dette systemet kan oppnå aksial og lateral oppløsning på 75 mikrometer og 165 μm henholdsvis på dybder så stor som 15 mm. Det var derfor mulig å avbilde hele embryo på mye høyere oppløsninger enn vanligvis oppnås ved hjelp av kliniske instrumenter og det akustiske signalet fra mikrobobler kan skilles fra vev ved hjelp av lineære kontrast avbildningsmetoder (inkludert puls inversjon og amplitude modulasjonsteknikker 24). Selv om vi hadde den beste suksess med ultralyd innstillingene som er beskrevet her, er det mulig at noen justering til disse parametrene vil også gi dårlige resultater. I alle tilfeller er en lav strøm som kreves for mikroboble-avbildning for å unngå uønsket ødeleggelse av mikroboblene før initiering av et utbrudd, mens det korte utbrudd eliminerer bare en liten brøkdel av mikroboblepopulasjonen. Med praksis hele prosedyren for en enkelt embryo, fra posisjonering til gjennomføring av molekylultralydavbildning, tok ca. 15 min. Vi har med hell injisert så mange som 12 embryoer fra ett kull ien enkelt økt.

Injeksjons eksperimenter ble begrenset til en 4 timers vindu på grunn av den begrensede levedyktigheten til embryoene. Siden fordelingen av mikroboblene var avhengig av sirkulasjonen av embryoet i seg selv, kan injeksjoner ikke finne sted før hjerteslag (E8.5) og påvisbar strømning i vitelline og navle sirkulasjon (E9.5) ble etablert 25. Med modning av morkaken ikke komplett før E14.5, ble injeksjon av kontrastmidler gjennom placenta labyrinten begrenset til embryoer fra midten til slutten av svangerskapslengde. Basert på observasjoner, embryoer nærmere til begrepet var hardføre og kan tåle en økning i deres karvolum bedre enn sine yngre kolleger. Kombinert, disse faktorene begrenset kontrastforsterket ultralyd avbildning av embryonale blodkar til senere stadier av utvikling og angiogent vekst. Dette kan påvirke tilgjengeligheten av transgene musemodeller, siden manipulering av reseptorer som er involvert i VASCular utvikling og vedlikehold (f.eks VEGFR2, VCAM-1) kan føre til embryonale dødelighet eller defekter i utvikling og regulering av embryonale sirkulasjons-systemer 26,27. Ikke desto mindre en rekke relevante modellsystemer er tilgjengelig for vaskulære biomarkører av interesse, inkludert α 2 β 1 28, α v β 3 29, blodplate endothelial cell adhesion molecule-1 30, og vaskulær celleadhesjonsmolekyl-1 31, intercellulært adhesjonsmolekyl -1 32 og -2 33 og P-selectin 34. Hva er mer, begynner hjernen histogenesis etter midten av svangerskapet 11, noe som gjør uttrykket av angiogeniske markører i dette vevet sannsynlig og dermed gi et utmerket alternativ til den tradisjonelle svulst modell for studier som vurderer de kvantitative sidene ved molekylær avbildning.

Ex vivo natur injeksjoner gjør presentere noen limitations. Det er viktig å merke seg at etter embryoene ble fjernet fra moren og placenta labyrint punktert, det var generelt ikke mulig (eller ønskelig) å gjøre gjentatte injeksjoner. I tillegg isolerer embryoet fra morens sirkulasjon begrenser tilførselen av næringsstoffer og O 2, og embryonale helse forventes å svekkes med tiden. Mens chilling og vekkelse forlenger levedyktigheten av embryoene, kan det også påvirke hjertefunksjon. For eksempel, observerte vi at isolerte embryoer hadde en redusert hjertefrekvens (data ikke inkludert, se Denbeigh et al. 12) sammenlignet med de tidligere observert in vivo 35. Det er derfor sannsynlig at studier som vurderer kardiovaskulær fysiologi vil ikke nøyaktig gjenspeiler in vivo forhold. Med få studier som karakteriserer sirkulasjons hemodynamics i den levende sent stadium mus embryo, er det imidlertid vanskelig å si med sikkerhet i hvilken grad disse eksperimentelle forhold kan bruke alter fysiologisk funksjon. Ett alternativ er å gjennomføre injeksjoner i utero, enten gjennom et laparoskopisk snitt 36 eller gjennom magen til den gravide mor direkte 37, selv om denne tilnærmingen kan presentere sitt eget sett med utfordringer 11. I noen tilfeller kan isolering og exteriorization av embryoet også resultere i betydelig blødning fra plommesekken. Selv om vi funnet at vi kan hemme blodstrømmen med ultralyd gel, kunne noe betydelig tap av blod påvirke leveringen og konsentrasjonen av mikrobobler, og disse dyrene ble ekskludert fra analysen. Til slutt, mens isolasjon gjør grense mors og embryonale kilder til bevegelse, periodisk bevegelse relatert til hjerteaktivitet er uunngåelig. Vi valgt å avbilde den statiske hjernen for å direkte undersøke effekten av reseptor uttrykk på målrettet mikrobobleutskillere signal, men implementering av sanntidsbevegelseskompensert kontrastforsterket ultralydavbildning 38 maiforlenge disse studiene til andre organer.

Det er få bildebehandlingsprogrammer som for øyeblikket er i stand til å vurdere vaskulær landskapet i levende utvikle museembryo. Noen studier har lykkes ført live avbildning av blodstrøm i ex vivo murine embryoer ved hjelp av Doppler feide-kilde optisk koherens tomografi 39,40, mens magnetic resonance imaging, vaskulær korrosjon kaster, microcomputed tomografi og optisk projeksjon tomografi er iverk post mortem 16. Dette er uheldig, siden denne perioden av foster vekst kan avsløre viktig informasjon angående tidlig vaskulær utvikling og funksjon. Mikrobobleutskillere bildebehandling i levende embryoer kan derfor bidra til vår forståelse av utviklings fysiologi. Det kan også brukes til å visualisere fordelingen biomarkør i hele kroppen av den levende mus fosteret i sann tid, selv om denne teknikken er usannsynlig å erstatte eksisterende metoder (inkludert histologiog fluorescent avbildning) for måling av molekyl signal i embryonisk vev. Det raskt voksende massen av fartøy i embryoene, men ligner tumorvekst, med uttrykk av mange av de samme nøkkel reseptorer identifisert i tumorangiogenese 41,42 og kan derfor fungere som en utmerket svulst surrogat for studier som undersøker de kvantitative evner av molekylære ultralyd. Vi forventer derfor at de beskrevne metoder vil være nyttig ikke bare for å vurdere og karakterisere embryonale modeller av vaskulær helse og sykdom gjennom funksjonell avbildning, men tilbyr en avenue for å utforske styrker og begrensninger av molekylær avbildning også. Sin søknad kan også utvide til andre interessante områder av etterforskning, blant annet i utero genoverføring terapi hvor mikrobobler har blitt testet som et middel til å levere nakent DNA til foster mus vev 10. Alternativt er det også mulig 3D vaskulær kartlegging av levende foster,som kan gi uvurderlig informasjon som til de morfologiske abnormiteter i genmodifiserte mus. Innføring av ultralydkontrastmidler i isolerte levende embryoer kan derfor være et annet verktøy for å øke vår forståelse av vaskulær sykdom og oversette kontrastforsterket ultralyd applikasjoner til klinikken.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reagents
Antibodies (biotinylated, eBioscience) — Antibody choice depends on the experiment
  • rat isotype IgG2 control
 eBioscience 13-4321-85 This antibody/microbubble combination is often required as experimental control 
  • biotin anti-mouse CD309
 eBioscience 13-5821-85
Biotinylated rat MJ 7/18 antibody to mouse endoglin In house hybridoma Outside antibodies may also be appropriate: we  have used eBioscience (13-1051-85 ) in the past
Distilled water
Embryo media
  • 500 ml Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium with high glucose
 Sigma D5796
  • 50 ml Fetal Bovine Serum
 ATCC 30-2020 lot # 7592456
  • Hepes
 Gibco 15630 5 ml, 1 M
  • Penicillin-Streptomycin
 Gibco 15140-122 5 ml, 10,000 units Pen., 10,000 μg Strep
Ethanol, 70%
Ice
Paraformaldehyde Sigma 76240 4%
Phosphate Buffered Saline [1x]  Sigma D8537 1x, w/o calcium chloride & magnesium chloride
Pregnant mouse, CD-1 Charles River Laboratories Inc. 
0.9% sodium chloride (saline) Hospira 0409-7984-11
Ultrasound contrast agent, target ready and untargeted MicroMarker; VisualSonics Inc.
Ultrasound gel (Aquasonic 100, colourless) CSP Medical 133-1009
Equipment
Cell culture plates (4) :  100 x 20 mm Fisher Scientific 08-772-22
Cell culture plates (12) : 60 x 15 mm Sigma D8054
Centrifuge Sorvall Legend RT centrifuge 
Conical tubes, 50 ml BD Falcon VWR 21008-938
Diluent Beckman Coulter Isoton II Diluent, 8448011
Dissection scissors (Wagner) Fine Science Tools Wagner 14068-12
Forceps (2), Dumont SS (0.10 x 0.06 mm) Fine Science Tools 11200-33
Forceps, splinter VWR 25601-134
Glass beaker, 2 L (Griffin Beaker) VWR 89000-216
Glass capillaries, 1 x 90 mm GD-1 with filament Narishige GD-1
Glass needle puller Narishige PN-30
Gloves Ansell 4002
Gross anatomy probe Fine Science Tools 10088-15
Hot plate VWR 89090-994
Ice bucket Cole Parmer RK 06274-01
Imaging Platform VisualSonics Inc. Integrated Rail System
Light source, fiber-optic Fisher Scientific 12-562-36 Ideally has adjustable arms
Luers (12), polypropylene barbed female ¼-28 UNF thread Cole Parmer 45500-30
Micro-ultrasound system, high-frequency VisualSonics Inc. Vevo2100
Needles, 21 gauge  (1”) VWR 305165
Particle size analyzer Beckman Coulter Multisizer 3 Coulter Counter
Perforated spoon (Moria) Fine Science Tools MC 17 10373-17
Pins (6), black anodized minutien 0.15 mm Fine Science Tools 26002-15
Pipettors [2-20 μl, 20-200 μl, 100-1,000 μl] Eppendorf Research Plus  adjustable 3120000038;       3120000054;       3120000062
Pipettor tips [2-200 μl, 50-1,000 μl] Eppendorf epT.I.P.S.                   22491334;             022491351
Scissors
Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit Dow Corning
Tubing, Tygon laboratory 1/32” x 3/32” VWR 63010-007
Wooden applicator stick (swab, cotton head) VWR CA89031-270
Surgical microscope 5-8X magnification Fisher Scientific Steromaster
Syringes, 1 ml Normject Fisher 14-817-25
Syringes (10), 30 ml VWR CA64000-041
Syringe infusion pump  Bio-lynx  NE-1000
Thermometer, -20-110 °C VWR 89095-598
Timer VWR 33501-418
Tubes, Eppendorf VWR 20170-577
Tube racks (3) VWR 82024-462
Ultrasound transducer, 20 MHz VisualSonics Inc. MS250
Vannas-Tubingen, angled up Fine Science Tools 15005-08

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Voigt, J. U. Ultrasound molecular imaging. Methods. 48 (2), 92-97 (2009).
  2. Klibanov, A. Preparation of targeted microbubbles: Ultrasound contrast agents for molecular imaging. Medical Biological Engineering Computing. 47 (8), 875-882 (2009).
  3. Cosgrove, D., Lassau, N. Imaging of perfusion using ultrasound. European Journal Of Nuclear Medicine And Molecular Imaging. 37 (S1), 65 (2010).
  4. Williams, R., et al. Dynamic microbubble contrast-enhanced US to measure tumor response to targeted therapy: A proposed clinical protocol with results from renal cell carcinoma patients receiving antiangiogenic therapy. Radiology. 260 (2), 581 (2011).
  5. Burns, P. N., Wilson, S. R. Focal liver masses: Enhancement patterns on contrast-enhanced Images - Concordance of US scans with CT scans and MR images. Radiology. 242 (1), 162 (2006).
  6. Phoon, C. K. L., Aristizabal, O., Turnbull, D. H. 40 MHz doppler characterization of umbilical and dorsal aortic Blood flow in the early mouse embryo. Ultrasound. In Medicine And Biology. 26 (8), 1275-1283 (2000).
  7. Phoon, C. K. L., Aristizabal, O., Turnbull, D. H. Spatial velocity profile in mouse embryonic aorta and doppler-derived volumetric flow: A preliminary model. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 283, H908-H916 (2002).
  8. Aristizábal, O., Williamson, R., Turnbull, D. H. 12A-4 in vivo 3D contrast-enhanced imaging of the embryonic mouse vasculature. Paper presented at Ultrasonics Symposium. , IEEE. New York, NY. (2007).
  9. Bartelle, B. B., et al. Novel genetic approach for in vivo vascular imaging in mice. Circ.Res. 110 (7), 938-947 (2012).
  10. Endoh, M., et al. Fetal gene transfer by intrauterine injection with microbubble-enhanced ultrasound. Molecular Therapy. 5 (5), 501-508 (2002).
  11. Yamada, M., Hatta, T., Otani, H. Mouse exo utero development system: Protocol and troubleshooting. Congenital Anomalies. 48 (4), 183-187 (2008).
  12. Denbeigh, J. M., Nixon, B. A., Hudson, J. M., Purin, M. C., Foster, F. S. VEGFR2-targeted molecular imaging in the mouse embryo: An alternative to the tumor model. Ultrasound in medicine and biology. 40 (2), 389-399 (2014).
  13. Paauwe, M., Dijke, ten, P,, Hawinkels, L. J. A. C. Endoglin for tumor imaging and targeted cancer therapy. Expert Opinion On Therapeutic Targets. 17 (4), 421-435 (2013).
  14. Bourdeau, A., Faughnan, M. E., Letarte, M. Endoglin-deficient mice, a unique model to study hereditary hemorrhagic telangiectasia. Trends Cardiovasc. Med. 10 (7), 279-285 (2000).
  15. Whiteley, K. J., Adamson, S. L., Pfarrer, C. D. Vascular corrosion casting of the uteroplacental and fetoplacental vasculature in mice. Placenta And Trophoblast: Methods And Protocols. 121 (121), Humana Press. Totowa, NJ. 371-392 (2006).
  16. Kulandavelu, S., et al. Embryonic and neonatal phenotyping of genetically engineered mice. ILAR Journal. 47 (2), 103-10 (2006).
  17. Kalaskar, V. K., Lauderdale, J. D. Mouse embryonic development in a serum-free whole embryo culture system. Journal of Visualized Experiments. 85, (2014).
  18. Willmann, J. K., et al. Targeted contrast-enhanced ultrasound imaging of tumor angiogenesis with contrast microbubbles conjugated to integrin-binding knottin peptides. The Journal of Nuclear Medicine. 51 (3), 433-440 (2010).
  19. Deshpande, N., Ren, Y., Foygel, K., Rosenberg, J., Willmann, J. K. Tumor angiogenic marker expression levels during tumor growth: Longitudinal assessment with molecularly targeted microbubbles and US imaging. Radiology. 258 (3), 804-811 (2011).
  20. Lyshchik, A., et al. Molecular imaging of vascular endothelial growth factor receptor 2 expression using targeted contrast-enhanced high-frequency ultrasonography. Journal Of Ultrasound In Medicine. 26 (11), 1575-1586 (2007).
  21. Jerkic, M., et al. Endoglin regulates nitric oxide-dependent vasodilatation. The FASEB Journal. 18 (3), 609-611 (2004).
  22. Denbeigh, J. M., Nixon, B. A., Lee, J. J. Y., et al. Contrast-Enhanced Molecular Ultrasound Differentiates Endoglin Genotypes in Mouse Embryos. , Angiogenesis. Press. (2014).
  23. Adamson, S. L., Lu, Y., Whiteley, K. J., et al. Interactions between trophoblast cells and the maternal and fetal circulation in the mouse placenta. Dev Biol. 250, 358-35 (2002).
  24. Needles, A., et al. Nonlinear contrast imaging with an array-based micro-ultrasound system. Ultrasound. Medicine Biology. 36 (12), 2097 (2010).
  25. Watson, E. D., Cross, J. C. Development of structures and transport functions in the mouse placenta. Physiology. 20 (3), 180-193 (2005).
  26. Shalaby, F., Rossant, J., Yamaguchi, T. P., et al. Failure of blood-island formation and vasculogenesis in Flk-1-deficient mice. Nature. 376, 62-66 (1995).
  27. Kwee, L., Baldwin, H. S., Shen, H. M., et al. Defective development of the embryonic and extraembryonic circulatory systems in vascular cell adhesion molecule (VCAM-1) deficient mice. Development. 121, (1995).
  28. Mercurio, A. M. Lessons from the α2 integrin knockout mouse. The American journal of pathology. , 161-163 (2002).
  29. Hodivala-Dilke, K. αvβ3 integrin and angiogenesis: a moody integrin in a changing environment. Curr Opin Cell Biol. 20, 514-519 (2008).
  30. Pysz, M. A., Gambhir, S. S., Willmann, J. K. Molecular imaging: current status and emerging strategies. Clinical radiology. 65, 500-516 (2010).
  31. Cybulsky, M. I., Iiyama, K., Li, H., et al. A major role for VCAM-1, but not ICAM-1, in early atherosclerosis. J Clin Invest. 107, 1255-1262 (2001).
  32. Xu, H., Gonzalo, J. A., St Pierre,, Y,, et al. Leukocytosis and resistance to septic shock in intercellular adhesion molecule 1-deficient mice. J Exp Med. 180, 95-109 (1994).
  33. Gerwin, N., Gonzalo, J. A., Lloyd, C., et al. Prolonged eosinophil accumulation in allergic lung interstitium of ICAM-2-deficient mice results in extended hyperresponsiveness. Immunity. 10, 9-19 (1999).
  34. Johnson, R. C., Mayadas, T. N., Frenette, P. S., et al. Blood cell dynamics in P-selectin-deficient mice. Blood. 86, 1106-1114 (1995).
  35. Corrigan, N., Brazil, D., McAuliffe, F. High-frequency ultrasound assessment of the murine heart from embryo through to juvenile. Reproductive Sciences. 17 (2), 147-14 (2010).
  36. Turnbull, D. H., Bloomfield, T. S., Baldwin, H. S., Foster, F. S., Joyner, A. L. Ultrasound backscatter microscope analysis of early mouse embryonic brain development. Proc Natl Acad Sci U S A. 92, 2239-2243 (1995).
  37. Greco, A., Mancini, M. L., Gargiulo, S., et al. Ultrasound Biomicroscopy in Small Animal Research: Applications in Molecular and Preclinical Imaging. Journal of Biomedicine and Biotechnology. 2012, (2012).
  38. Pysz, M. A., Guracar, I., Foygel, K., Tian, L., Willmann, J. K. Quantitative assessment of tumor angiogenesis using real-time motion-compensated contrast-enhanced ultrasound imaging. Angiogenesis. 15, 433-442 (2012).
  39. Larina, I. V., et al. Live imaging of blood flow in mammalian embryos using doppler swept-source optical coherence tomography. J.Biomed.Opt. 13 (6), 060506-06 (2008).
  40. Garcia, M. D., Udan, R. S., Hadjantonakis, A. K., Dickinson, M. E. Live imaging of mouse embryos. 4 (4), Cold Spring Harbor. 104-10 (2011).
  41. Teichert, A., et al. Endothelial nitric oxide synthase gene expression during murine embryogenesis. Commencement of expression in the embryo occurs with the establishment of a unidirectional circulatory system. Circulation Research. 103 (1), 24-33 (2008).
  42. Walls, J. R., Coultas, L., Rossant, J., Henkelman, R. M. Three-dimensional analysis of vascular development in the mouse embryo. PLoS One. 3 (8), (2008).

Tags

Developmental Biology Micro-ultralyd molekylær avbildning mus embryo mikrobobleutskillere ultralyd kontrastmiddel Perfusjons
Kontrast Imaging i Mouse Embryoer hjelp Høyfrekvente ultralyd
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Denbeigh, J. M., Nixon, B. A., Puri, … More

Denbeigh, J. M., Nixon, B. A., Puri, M. C., Foster, F. S. Contrast Imaging in Mouse Embryos Using High-frequency Ultrasound. J. Vis. Exp. (97), e52520, doi:10.3791/52520 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter