Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Developmental Biology

Контраст изображений в эмбрионов мыши с помощью высокочастотной ультразвуковой

Published: March 4, 2015 doi: 10.3791/52520

Summary

Здесь мы приводим протокол для употребления инъекционных ультразвуковые микропузырьков контрастных агентов в живую, изолированных поздно созревания эмбрионов на стадии мышиных. Этот метод позволяет изучать параметров перфузии и сосудистых молекулярных маркеров в пределах эмбриона с использованием высокочастотного изображений контрастным усилением УЗИ.

Introduction

Контрастное ультразвуковое исследование использует микропузырьков контрастных агентов для визуализации и характеризуют сосудистой оболочке. Эти агенты позволяют неинвазивного оценку микроциркуляции, кровеносных сосудов и сердечно-сосудистой системы. Кроме того, модификация поверхности пузырька может привести к целевой микропузырьков связывания с эндотелиальными биомаркеров, как показано в доклинических приложений ангиогенеза, атеросклероза и воспаления 1,2 делая молекулярную ультразвуковой визуализации сосудистых событий возможных. Поэтому Контраст усиливается ультразвук может быть использован для идентификации сложные и разнообразные среды, влияющие на здоровых и больных сосудистые состояния 3-5.

В последние несколько лет интерес к полезности изображений микропузырьков расширилась до универсала модели мышиного эмбриона. В качестве модели развития млекопитающих, введение микропузырьков в эмбриональном сосудистой повышает физиологическиеИсследование развивающихся сердечно-сосудистой системы (например, потока крови, сердечный выброс) и в тех случаях, трансгенных и целевых мутантных мышах болезни сердца 6,7, может дать представление о том, как генетические факторы изменения сердечно-сосудистой системы. В самом деле, количественный и качественный 2D анализ эмбрионального сосудистой мозговой уже достигнуты 8. Кроме того, эмбрион мыши представляет как прекрасным примером для изучения связывания целевых микропузырьков сосудистых маркеров в естественных условиях. Bartelle и др. 9, например, ввели авидин микропузырьков в зачаточном желудочков сердца с целью оценки целенаправленное связывание в Biotag-Бира трансгенных эмбрионов и изучить сосудистую анатомию. Поколение гетерозиготных и гомозиготных мышиных моделях может быть также использован в качестве суррогата модели опухоли исследований, направленных на определение количественного природы молекулярного УЗИ - важный ориентир в переводе эту технику в клинику.

8-10. В утробе матери инъекций, однако, сталкиваются с целым рядом проблем. Они включают в себя инъекции руководство, необходимость борьбы с движением у матери и экстериоризированного эмбриона, поддержание гемодинамики жизнеспособности у матери и выводили эмбрионов, обращаясь долгосрочные последствия анестезии и осложнения, связанные с кровотечением 11. Таким образом, цель исследования состояла в разработке методики для введения микропузырьков в изолированных жилых поздней стадии эмбрионов 12. Эта опция предлагает больше свободы в плане управления впрыском и позиционирования, воспроизводимости плоскости изображения, без препятствий, и упрощенного анализа изображений и количественной оценки.

В настоящем исследовании мы опишем новый порядок введения микропузырьков в живых эмбрионов мышей FOR целях изучения микропузырьков кинетическое поведение и изучения целевой микропузырьков связывания эндогенных эндотелиальных поверхностных маркеров. Нелинейная конкретных изображений контраст УЗИ используется для измерения ряда основных параметров перфузии в том числе пик повышения (PE), промыть в скорости и времени до пика (ТТП) в изолированных зародышей E17.5. Мы также продемонстрировать справедливость модели эмбриона для оценки количественной природы молекулярной ультразвука в эмбриональной потере эндоглин функции трансгенных мышах, где эндоглин является клинически значимым целевой благодаря своей высокой экспрессии в эндотелиальных клетках сосудов в местах активного ангиогенеза 13 , Адгезия эндоглина ориентированные (MB E), крысы изотипического IgG 2 управления (MB C) и нецелевые (MB U) микропузырьков оценивали в гетерозиготном эндоглина (Eng +/-) и гомозиготной эндоглина (Eng + / +), выражающая эмбрионов. Анализ целевого биндинг показывает, что молекулярная УЗИ способны дифференцироваться между эндоглина генотипов и относящихся плотности рецепторов к количественному уровнях молекулярных ультразвука.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

ПРИМЕЧАНИЕ: экспериментальные методики, проведенные в этом исследовании, были одобрены Комитетом по уходу за животными в Sunnybrook научно-исследовательского института (Торонто, Онтарио, Канада) на. Процедуры для гуманного обращения с животными должны соблюдаться во все времена. Предполагается, что следователь обучение по основам эксплуатации ультразвуковой системы визуализации. Этот протокол работает лучше всего с двумя людьми.

1. Животные модели

  1. Mate CD-1 самец и самка Mus Musculus получить диких эмбрионов типа для перфузионных исследований.
  2. Для молекулярных методов визуализации, создавать мышей ENG +/- путем гомологичной рекомбинации с использованием эмбриональных стволовых клеток 129 / Ola происхождения, как описано Бурдо и др. 14.
    1. Мышей обратное скрещивание B6- ENG +/-, любезно приобрел у доктора Мишель Letarte, в CD-1 фоновом режиме. Использовать Eng +/- компакт-1 обратному скрещиванию эмбрионов, а также их Eng + / + однопометница соntrols. Mate мышей, чтобы произвести постановочные эмбрионов.

2. Экспериментальная Подготовка

  1. Инициировать спаривания мышей и проверить пробки ежедневно. Эмбриональные день 0,5 определяется как полдень дня наблюдается влагалища плагин.
  2. Подготовка эмбриона носитель путем добавления 50 мл фетальной бычьей сыворотки, 5 мл 1 М HEPES и 5 мл пенициллина-стрептомицина (10000 единиц пенициллина, 10000 мкг стрептомицина) до 500 мл модифицированного Дульбекко среде Игла (DMEM) с высоким содержанием глюкозы (4500 мг / л). Оберните бутылку в фольге и держать охлажденным при температуре 4 ° С.
  3. Центрифуга ясно, ультразвуковой гель в 50 мл конические пробирки при 140 х г в течение 20 мин. Нарисуйте гель вверх в 30 мл шприцев. Заполните дополнительные (отмечены) 30 мл шприцы с фосфатным буферным раствором (PBS) и отложите в сторону. Один помет эмбрионов, как правило, требуют от 2-3 шприцев ультразвуковой гель и 4 шприцы PBS.
  4. Потяните около 30 стеклянных иглы и аккуратно крепятся к полосе пластилинав 100 х 20 мм клеток культуральной чашке. Это гарантирует, что иглы разделены и безопасно во время обработки. Используя стеклянную съемника использовать следующие параметры на 1 х 90 мм стеклянных капилляров с нитью: автономный отопитель 77, Sub магнита 55, главным магнитом 70.
  5. Подготовка 11:50 рассечение пластины (достаточно, чтобы обеспечить каждого эмбриона в помете получает свой блюдо), используя соотношение 1: 8 громкости отвердителя на базу. Налейте 40 мл базы в 50 мл коническую трубку. Добавить 5-6 мл отвердителя и перемешать деревянной палкой.
    1. Налейте в 60 х 15 мм культуры блюд, заполняя каждый приблизительно на половину. Позвольте стенду O / N, чтобы установить.
  6. Прикрепите женские Luers до 400 мм длинные куски из поливинилхлорида (ПВХ) труб (внутренний диаметр: 0,79 мм). Трубки должны добраться из шприца на сцену ультразвуковой комфортно.

3. Экспериментальная установка

  1. Упорядочить изображений платформу под операционным микроскопом с 3D двигателем и линейкой 21 MHг датчик.
    1. Orient платформа, так что рейку находится слева, со стадией, расположенного непосредственно под микроскопом.
    2. Установите 3D двигатель с шаровым шарниром части, проходящей рычага платформы. Винт быстрого выпуска должность зажима датчика в быстрое освобождение смонтировать на двигателе, лицом вперед, и положение датчика голову в хомут, закрыв защелку.
    3. Закрепите разъем датчика в активном порту на передней панели корзине. Включите машину.
  2. Инициировать ультразвуковой датчик 21 МГц, выбрав установку "кардиология" для молекулярных методов визуализации и «Общие положения» перфузионных исследований. Установить все время усиления компенсации ползунки для точной средней позиции. Для "Контраст Режим" установите следующие параметры: Частота: 18 МГц, мощность передачи: 4%, (0,39 МПа), Контраст усиления: 30 дБ, очаги: 6 & 10 мм, Контраст Режим: нелинейная, взрыв время: 100% в 0,1сек, ширина ширина: Широкий.
  3. Алиготе 40 мл эмбрион СМИ каждый на четыре 50 мл конические пробирки. Поместите на льду.
  4. Тепло 1 л воды в 2 л химический стакан на плитке. Поддержание при 45 ° С. Добавить один шприц ультразвукового геля и PBS в стакан для предварительного нагрева. Поддерживать эту температуру путем мониторинга с термометром во все времена.
  5. Отложите 11:50 1 мл шприцев и 11:50 21 G иглы для инъекции микропузырьков.

4. Хирургические процедуры

ПРИМЕЧАНИЕ: Есть помощник подготовить пузыри (стадия 5), а хирург приступает к хирургической процедуры. Протокол, описанный здесь, была заимствована из Уайтли и др. 15

  1. Сбор E16.5 или E17.5 эмбрионов от беременной женской мыши следующие смещения шейных позвонков.
    ПРИМЕЧАНИЕ: эффекты анестезии на эмбрионах до сих пор не изучены в деталях 16. Дополнительные методы, в том числе декапитации, может быть целесообразным опния в жертву беременных мышей.
    1. Разрежьте брюшко, чтобы выявить матку & эмбрионов. Аккуратно и быстро удалить матку, сокращая на кончиках рогов матки (отделяя яичников и маточных сосудов) и разрыва в влагалище и мочевого пузыря.
    2. Использование Пинцет, трансфер матку трубки 40 мл ледяной эмбриона СМИ как можно быстрее без ущерба для эмбрионов. Откажитесь от туши мыши.
  2. Переезд с микроскопом и на сцене. Депозит матку в 100 х 20 мм для культивирования клеток блюдо. Передача матки в новую тарелки, заполненной 50 мл свежего эмбрионального сред.
  3. Использование стерилизованной (70% этанола спрей) тонких щипцов, осторожно оторвать и оторваться наружные мембраны матки, начиная с одного конца. Expose плацентарный децидуальной, теменной желточного мешка и мембрану REICHERT к отделять и удалять из основного висцерального желточного мешка.
  4. Рассеките из эмбрионов один за другим, сохраняя висцерального уOlk мешки неповрежденные и обработки плаценты как можно осторожнее 17. Будьте осторожны, чтобы избежать разрыва желточного мешка, как эмбрионы выскочить немедленно.
    1. Используйте перфорированный ложку, чтобы переместить эмбрионов другое блюдо держали на льду со свежими СМИ эмбриона. Держите эмбрионов в охлажденном, пока не понадобится. Изменить носитель в зачаточном блюдо каждый 1-1,5 ч. С этих условиях эмбрионы являются жизнеспособными на срок до 4 ч после вскрытия.

5. Микросепаратор Подготовка

ПРИМЕЧАНИЕ: Выполните молекулярная визуализация при помощи ультразвука с использованием как целевые и нецелевые микропузырьков. Один эксперимент может потребоваться до 3 отдельных ампулах микропузырьков: я) антител направлены микропузырьки, II) контроль изотипа целевых микропузырьков и III) нецелевые микропузырьков. Контрастное вещество приходит в виде сухого порошка, замораживания и должна быть восстановлена ​​с физиологическим раствором перед инъекцией. Есть ~ 2 х 10 9 микропузырьки в каждом нецелевого MicroBubble флакон и ~ 8,8 х 10 8 микропузырьки в целевых готовых ампул. Микропузырьки стабильны в течение до 3 ч после приготовления.

  1. Восстановление Целевые Готово флаконов
    ПРИМЕЧАНИЕ: Примеры целевых готовых препаратов: эндоглина целевые микропузырьки (MB E, биотинилированными крыс MJ 7/18 антитела к мыши эндоглина; в доме гибридом объекта); сосудистый эндотелиальный фактор роста рецептора 2 (VEGFR2) целевые микропузырьки (МБ В, с биотином мышиного анти-CD309); крыса изотипу IgG 2 контрольное антитело целевые микропузырьки (MB C, биотин крыса изотипу IgG 2 управления ориентации мыши IgG2a).
    1. Развести раствор антител (20 мкг) в 1 мл (конечный объем физиологического раствора). Держите на льду.
    2. Заполните шприц с 1 мл физиологического раствора, удаляя все пузырьки воздуха. Прикрепление 21 G иглу, вводят раствор медленно в микропузырьков флаконе.
    3. Медленно снять поршень, удаление 1 мл воздуха, и извлеките иглу. Мягкоагитировать. Дайте постоять 5 мин на льду.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Ультразвуковые микропузырьки могут быть уничтожены в соответствии с средах с высоким давлением.
    4. После прошедшего времени, заполнить новый шприц с разведения антитела и добавить к соответствующему флаконе. Аккуратно агитировать. Пусть смесь (теперь 2 мл) стоять в течение 10 мин. Держите на льду. Предполагая полную поверхность сопряжения, среднее количество связанного лиганда для микропузырьков составляет примерно 18 7600 лиганды / мкм 2.
  2. Восстановление нецелевого флаконов
    1. Заполните шприц с 1 мл физиологического раствора, удаляя все пузырьки воздуха. Прикрепление 21 G иглу, вводят раствор медленно в микропузырьков флаконе.
    2. Медленно снять поршень, удаление 1 мл воздуха, и извлеките иглу. Аккуратно агитировать. Дайте постоять 5 мин. Добавить еще 1 мл физиологического раствора, как описано выше. Аккуратно агитировать и дать постоять 10 мин на льду.
  3. Coulter подсчета
    1. Аккуратно агитировать нужный микропузырьков флакон и сделать ~50 мкл раствора в шприц емкостью 1 мл с использованием иглы 21 G. Вводите микропузырьков в пустую 2 мл микроцентрифужных трубки.
    2. Пипетки 10 мкл образца раствора микропузырьков в 10 мл разбавителя.
    3. После осторожного перемешивания, оценки концентрации и размера распределения населения микропузырьков с помощью сошника счета (см перечень материалов). Граф минимум три 50 измерений мкл (в одном флаконе образца), используя 30 мкм диафрагмы.
  4. Подготовка Микропузырьки для инъекций
    ПРИМЕЧАНИЕ: помощник выполняет этот шаг, когда "инъекции микропузырьков в эмбрионы" (шаг 6) началось. Каждый эмбрион вводят один раз, в зависимости от типа микропузырьков выбраны для каждой инъекции, чтобы быть случайным образом выбирается с заместителем таким образом, что все виды микропузырьков равномерно распределены в течение всей процедуры, но, приведенной в случайном порядке. Убедитесь, хирург слеп к тип пузырька вводили.
    1. Определить йе объем фондового пузыря решения, необходимого для получения конечной концентрации 1 х 10 8 Мб / мл в объеме 400 мкл (рассчитать объем с помощью концентрации акций, измеренные в 5.3.3). Алиготе соответствующий объем физиологического раствора в пустую пробирку микроцентрифужных.
    2. Осторожно перемешивать выбранный микропузырьков пробирку и провести избыточного объема (~ 50 мкл, большую, чем рассчитано выше) раствора в 1 мл шприц с помощью иглы 21 G. Вводите микропузырьков в пустую пробирку микроцентрифужных.
    3. Внесите необходимый объем микропузырьков маточного раствора и добавить к аликвоты раствора. Смешайте осторожным перемешиванием с кончиком пипетки.
    4. Нарисуйте разбавленный микропузырьков раствор в чистый шприц, используя иглу 21 G. Снятие иглы, устранить любые воздушные пузырьки из шприца и прикрепите Луер и трубы. Медленно нажать решение конец трубки решений, чтобы не генерировать пузырьки воздуха.
    5. Вставьте СиринGE в шприц инфузионного насоса, установленного для выдачи микропузырьков со скоростью 20 мкл / мин при общем объеме 20 мкл. Приложить вытащил стеклянную иглу до конца трубки. Перемещение насоса ближе к стадии впрыска.

6. Введение микропузырьков в эмбрионы

  1. Случайно выбрать и удалить (с перфорированной ложкой) один эмбрион от охлажденной СМИ блюдо. Место в рассечение блюдо, расположенной на этапе ультразвукового под стереоскоп и удалить желточный мешок и амниотической мембраны с тонким пинцетом, резки / разрыв со стороны появившемся мере васкуляризированной (antimesometrial сторона). Это легко достигается путем прокалывания на территории, прилегающей к области головы.
    1. Вырезать достаточно, чтобы удалить эмбрион изнутри, но не более. Стабилизировать рассечение блюда, приготовленные из маленьких кусочков пластилина.
  2. Аккуратно маневрировать мешочек со всего эмбриона. Установите эмбриона на его стороне, с плацентой иСосуды пуповины впереди. Использование насекомых штифты, придавить желточный мешок (4 контакта рекомендуется) и на кромки плаценты, при необходимости, чтобы прикрепить на месте. Избегайте крупных сосудов.
  3. Вымойте эмбриона с подогретого 45 ° C PBS до эмбриона не приходит в себя. Определить пупочную вену и связанный с ним сосудистой сети. Расположите тарелку так, чтобы инъекция может быть сделано удобно.
    ПРИМЕЧАНИЕ: При нагреве, кровь в эмбрионе потечет, явно накачке в артерии пуповины. Когда впервые начинает поток, вены будут ярко-красные, с кровью в оба судна быстро появляются идентичны. Ветви, вытекающие из пупочной вены обычно перекрывают те из пупочной артерии на поверхности плаценты.
  4. После того, как эмбрион возродился, покрыть его (но не плаценты) с предварительно нагретой США геля, будучи уверенным, деликатно удалить воздушные пузырьки (с использованием тонких щипцов) со всего эмбриона. Долить блюдо с подогретого PBS.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Следите за уровнем Solutiна в PBS и гель шприцы и добавить резервные шприцы отопительного стакане по мере необходимости.
  5. Установить стекло иглу на большой шар пластилина на краю рассечение блюдо и вставить конец иглы в PBS. Выбор вены на хорионический поверхности плаценты диска, как далеко от главной ветви, как разумно, обрезать кончик размера с помощью ножниц. Инъекции легче, если кончик разрезают под небольшим углом. Удалите все зубчатые края стекла, используя лезвие весенних ножницами.
  6. Использование шприца, медленно впрыскивают раствор микропузырьков при 20 мкл / мин в стеклянной иглы, пока весь воздух не будет исключен из кончика иглы и микропузырьки можно увидеть свободно течь в PBS. Остановите насос и сбросить за объемом впрыска от 20 мкл. Не впустить воздух сосудистой системы эмбриона во время инъекции.
  7. Вставьте кончик стекла иглы осторожно в один из вены в плаценте и убедиться, что он неподвижен. Качели прочь стерoscope головы и положение выше эмбриона преобразователь. Инициировать изображений.

7. УЗИ молекулярной визуализации

Примечание: Использование контрастных нелинейные условия формирования изображения, установленные ранее, положение датчика так, что эмбрион расположен равномерно между фокусами 6 и 10 мм. Однажды расположенные начать внутривенную инъекцию микропузырьков. При инъекции завершено, запустить таймер.

  1. Перфузии
    1. Убедитесь, что максимальное количество кадров для нелинейного режима контрастности выбрать, нажав кнопку "Управление исследование» и перейдите на вкладку «префов» в верхней части исследования браузере. Отметьте соответствующий квадрат в окне "Настройки".
    2. Настройте параметры обработки изображений, инициируя нелинейной изображений. Нажмите кнопку "Контраст Режим" на панели управления. Уточнить 2D усиления путем корректировки «усиление & #8217; набрать 30 дБ, снизить мощность до 4% с помощью «власть» циферблата, уменьшить частоту 1 Гц с помощью 'частоту' набора и установить ширину луча (левый нижний угол), чтобы широкое использование ролик мяч / мышь.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Все органы управления расположены на панели управления ультразвуковой системы.
    3. Захват всего мыть-ин и рассеивание микропузырька болюса с помощью записи кинопетли 20 мин при частоте кадров 1 Гц. Пресс-скан / замораживания, чтобы начать сбор данных.
    4. После того, как полная последовательность изображений была захвачена, нажмите кнопку "киношный Store ', расположенный на панели управления, чтобы сохранить последовательность изображений в системном буфере. Система создает дате метками кинопетли нелинейных данных контраст модели приобрели.
  2. Целевые Микросепаратор изображений
    1. В разделе "Prefs", установите время серийной съемки до 0,1 сек. Задайте соответствующие параметры изображения с помощью кнопок управления дезсываются выше (7.1.2.).
    2. Инициировать нелинейного изображений контрастности, нажав на кнопку "Контраст Режим" на панели управления. Обеспечить эмбрион правильно расположен под датчиком, и что поток микропузырьков контрастного вещества через эмбриона видна в нелинейном режиме контраст изображения.
    3. Для оценки целевой микропузырьков связывания на стадии эмбриона, исследования молекулярной визуализации, позволяют микропузырьки циркулировать в покое на 3 мин и 40 сек после завершения инъекции. Это время, чтобы сохранение оборотных микропузырьков. Нажмите «Сканировать / заморозить", чтобы остановить изображений в течение этого времени.
    4. В 3 мин и 40 сек, резюме визуализации, чтобы подтвердить, что эмбрион еще видны, адекватно покрыты PBS, и что микропузырьки продолжают циркулировать. Нажмите «Сканировать / заморозить", чтобы начать визуализацию.
    5. Приобретать последовательность нарушение / пополнения запасов 3 мин и 50 сек после инъекции с помощью записи 'пре-сового уничтоженияПоследовательность зации », акустический ответ, в 29 Гц. Нажмите «Сканировать / заморозить", чтобы начать сбор данных. В 4 мин после инъекции 18,19, инициировать 0,1 сек высокочастотный акустический взрыв. Нажмите кнопку "всплеск" для реализации взрыв.
    6. Продолжайте записывать кадры для остальной части последовательности (до буфера линия не полностью) и сохраните кинопетли нажав на кнопку "киношный магазин».
    7. Соберите дополнительную кинопетли оборотных микропузырьков. Предполагается, что эта последующая последовательность изображений «пост-уничтожение", чтобы содержать только циркулирующие сигналы пузырь, который пополнили луч. Нажмите «Сканировать / заморозить", чтобы начать визуализацию и "киношный магазин" собрать изображения.
    8. Этикетка петли киношных после съемки каждого эмбриона. Нажмите 'Управление исследование ", выделите файл, используя ролик мяч и' выберите 'кнопки, нажмите' изображения этикетку 'и имя соответствующим образом.

    8. Обработка эмбрионов после инъекции

    1. Сообщение изображения, перемещать преобразователь, открепить эмбрион и эвтаназии (с помощью декапитации, цервикальной дислокации, асфиксией диоксидом углерода, или анестезии с последующим быстрым замораживанием или фиксации), по желанию.
    2. Для каждого последующего введения эмбрионов свежие рассечение блюдо, игла, шприц и труб сегмент должен быть использован, с подготовкой следующей партии впрыска микропузырьков решение, происходящих во время вскрытия и возрождения.
    3. Сохранить образцы ткани (например, хвост, мозг) для дополнительных анализов (например, генотипирование определяется с помощью ПЦР анализа изолированной хвоста ДНК, окрашивания LacZ, или полу-количественные показатели экспрессии биомаркеров с помощью вестерн-блоттинга 21).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Инъекция ультразвуковых контрастных агентов в бывших маточно мышиных эмбрионов зависит от успешного выделения живых, в конце гестационного эмбрионов на стадии от матки и поддержание жизнеспособности в течение курса инъекций и связанной изображений ультразвука. После того, как эмбрион был выводили и расположены, как показано на рисунке 1, осторожно инъекции контрастного вещества в эмбриональной сосудистой возможно. Типичный ультразвука В-типа изображения эмбриона мыши E17.5 показано на фиг.2А. Мыть в микропузырьков и соответствующих повышение в нижней полой вене, сердце, мозг, и во всем животном может быть получены с помощью методов нелинейной контраст изображений, тем самым демонстрируя осуществимость этого метода. Отдельные установленные временные точки показаны на фиг.2В и показывают изменение контраста с течением времени.

По регистрировать весь стирки-ин и вымывания ОF микропузырьков болюса, можно измерять различные параметры перфузии. В автономного анализа, инструмент трассировки контраст область была использована для создания 1,5 мм 2 регионах, представляющих интерес (ROI) в эмбриональных левого и правого полушарий головного мозга. Средняя интенсивность сигнала в этих трансформирования затем на графике как функцию времени и сглажены с помощью семь точек медианный фильтр с. Из полученной кривой интенсивности контраста (как показано на фиг.2С), пик мозга повышение было определено. Скорость промывки в, определяется как наклон между 10% и 50% от максимальной пиковой повышение (PE), и рассчитывали. И, наконец, время пика (ТТП) была вычислена с наступлением усиление сигнала в пиковое время. Различия в средних параметров перфузии через различные типы пузырьков были испытаны с использованием отдельных т-тесты 12. Эти результаты, приведены в таблице 1, показывают, что введение микропузырьков обеспечивает VALUвозможность способ для установления важных параметров перфузии у мышей развития.

Введение микропузырьков в эмбриональном сосудистой также позволяет использовать эмбрионов мыши, как модельных систем для определения и описания количественных возможностей визуализации молекулярной ультразвука. В следующем примере, потеря функциональной модели, где генетические манипуляции, генерируемого гетерозиготных и гомозиготных паттерны экспрессии эндоглина в эмбриональных мышей, была использована для тестирования способности визуализации молекулярной ультразвуковой различать генотипов. После микропузырьков инъекции и реализации визуализации разрушение / пополнения, отношение средней интенсивности сигнала и используется для предварительного разрушения 'до' пост-разрушения »последовательностей была использована для создания меру молекулярного сигнала под названием контраст означает отношение мощности (CMPR ). Линейная смешанная модель (с Бонферрони корректировок, сделанных для множественных сравнений) было проведено с целью выяснить, W hether есть ли существенная разница между эндоглина целевых, управления и нецелевого микропузырька привязки к Eng + / + или эмбрионов ENG +/- (определены после инъекции с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) образцов хвост). По оценкам средства CMPR (средний ± 95% доверительный интервал (ДИ)) представлены для каждого микропузырьков и эмбрионов типа на рисунке 3 и приведены в таблице 2.

Эти результаты дают конкретный демонстрация того, что введение ультразвуковых контрастных агентов в изолированных зародышей жизни может быть достигнуто. Кроме того, этот протокол облегчает оценку параметров перфузии и может быть использован для сравнения целевого микропузырьков связывания в эмбриональных моделей сосудистых заболеваний с целью выяснения возможности визуализации молекулярной ультразвука.

.jpg "/>
Рисунок 1. Экспериментальная установка для инъекции микропузырьков в изолированных зародышей. 21 МГц датчик линейный массив расположен выше в экстериоризированного гостиная E16.5 эмбриона микропузырьков решение 20 мкл вводят в плацентарной вены с помощью стеклянной канюли. Шкала бар = 10 мм. С Denbeigh, JM и др. 12 с разрешения правообладателя. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой цифры.

Фиг.2
Рисунок 2. Ультразвуковое исследование из экстериоризированного жизни E17.5 эмбрионов. (А) ультразвука В-типа изображения эмбриона. Перед инъекцией целевых микропузырьков (Т = 0 сек). (Б) Нелинейный контрастность изображения эмбриона до и после инъекции микропузырьков. Нелинейная контрастность изображения PRIили микропузырьков инъекции (T = 0 сек). Только сильно отражающие интерфейсы (например, костные) открыты, с минимальным сигналом от мягких тканей. Ниже, нелинейное контрастное изображение микропузырьков внутри эмбриона при Т = 50 сек Т = 120 сек и Т = 420 сек после болюсной инъекции. Контраст обнаружении в течение животного, в том числе сердца и головного мозга. Параметры (C) перфузии, полученные из кривых интенсивности времени. Интенсивность участок микропузырьков как функцию времени в пределах одного ROI в эмбрионального мозга. Параметры перфузии обозначены на графике, в том числе пик повышения (PE), промыть в ставке (наклон), и времени, чтобы пик (ТТП). Наконечники: R = ребра, Ht = сердце, Br = мозг. AU, условные единицы; ROI, область интересов; сек, с. Шкала бар = 3 мм. Эта цифра была изменена с Denbeigh, JM и др. 12. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большеверсия этой фигуры.

Рисунок 3
Рисунок 3. Основная среднего отличие означает, коэффициенты мощности (CMPR) для эндоглина целевой (MB E), управления (MB C) и нецелевые микропузырьков (MB U) Eng + / + и эмбрионы ENG +/-. CMPRs из эндоглина целевой микропузырьки были значительно выше (*** р <0,001), чем те, собирают для МБ С и U Мб, (не существенно отличаются друг от друга, независимо от генотипа). МБ Е связывания было установлено, что значительно выше в Eng + / + эмбрионов (темные маркеры) по сравнению сЭмбрионы ENG +/- (легкие маркеры). Результаты представлены в виде среднего значения ± 95% доверительного интервала. п указывает количество уникальных эмбрионов в каждой категории. С Denbeigh, JM и др. 22 с разрешения правообладателя. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой цифры.

Микросепаратор Тип T-тесты
р-значение
Перфузии Параметр MB U MB C MB V MB U против Мб С MB U против Мб V MB <суб> C против Мб V
Пик аксессуаров, PE (AU) 0,427 ± 0,063 0,490 ± 0,079 0,499 ± 0,064 0,19 0,06 0,81
Вымойте в скорости (AU / сек) 0,008 ± 0,002 0,009 ± 0,002 0,011 ± 0,002 0,18 0,01 0,09
Время пик, TTP (сек) 53.75 ± 7.96 51.75 ± 4.46 45.00 ± 5.33 0,55 0,03 0,03
# эмбрионы вводят 4 4 3

Таблица 1. Резюме E17.5 параметров эмбриональных перфузии. Среднее ± стандартное отклонение, полученные из участков интенсивности времени для всех трансформирования эмбриональных (.и. = Произвольные единицы). Таблица включает измерения для нецелевого (MB U), IgG 2 управления направлены (MB C) и VEGFR2 целевой (MB V) микропузырьков. Отдельные т-тесты проводились для сравнения групп. Эта таблица была изменена с Denbeigh, JM и др. 12.

Микросепаратор тип Генотип CMPR Среднее 95% доверительный интервал
MB E Eng + / + 9.71 9.05, 10.38
Eng +/- 5,51 4,87, 6,15
MB C Eng + / + 1,42 0.41, 2.43
Eng +/- 1,46 0,45, 2,47
MB U Eng + / + 1,7 0,65, 2,75
Eng +/- 1,76 0.67, 2.84
Линейный смешанной модели: токарно-подлежащих действию
DF F Значение р
Генотип 1 12.75 <0,001
Микросепаратор тип 2 147,65 <0,001
Генотип * Тип Микросепаратор 2 18.29 <0,001

Таблица 2. линейной смешанной модели анализа длямикропузырек обязательными эмбрионов, с поправкой Bonferroni для множественных сравнений. Генотип, микропузырьков типа и в сочетании взаимодействие (генотип * Тип микропузырьков) оказались значительные факторы в определении CMPR. DF = степенями свободы. С Denbeigh, JM и др. 22 с разрешения правообладателя.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Ультразвуковые контрастные агенты вводили в поздней стадии эмбрионов беременность мыши и нелинейных контрастных изображений были приобретены для измерения параметров перфузии и целевых микропузырьков обязательными. Успешное изображений микропузырьков в пределах эмбрионального сосудистую зависит от ряда факторов, первый из которых жизнеспособности эмбриона. Все оборудование и устройства были подготовлены заранее, с тем чтобы свести к минимуму время, необходимое для выделения эмбрионов из матки до начала инъекции. Поскольку воздействие однократной или многократной экспозиции к анестезии на эмбриональных мышей не были изучены в деталях, использование анестезии у матери удалось избежать, прежде чем принести в жертву 16. Во время изоляции эмбриона, важно, чтобы предотвратить повреждение желточного мешка и обеспечить эмбрионы были сохранены охлажденным в любое время, в часто обновленной эмбриона СМИ. Когда экстериоризации эмбриона до инъекции и в течение закрепления, основные желточные суда были избегать, чтобы ограничить likelihood кровотечения, которое может привести к летальному исходу. Мы обнаружили, что, когда возрождается эмбрион, это было лучше сначала покрыть плаценту, а затем эмбрион с PBS, перед применением ультразвука гель эмбриона в возвратно-поступательное движение и удаление любых больших пузырей с щипцами. Остальная часть чашки Петри была затем заполнена PBS. Использование геля и PBS ограничило возможность воздушных карманов между зародышем и датчика, которые могут повлиять на качество изображения. Как эмбрион ожил, потекла кровь, видимо накачке в артерии пуповины в то время как в пуповинной вены появились ярко-красные 23. Для справки, филиалы, вытекающие из пупочной вены обычно перекрывают те из пупочной артерии на поверхности плаценты. Хотя можно было вводить в плацентарных лабиринта артериол, потребители инъекционных микропузырьков в направлении снижается расход плаценты кровотечение и венулы инъекций также позволило микропузырьки пройти непосредственно через эмбриона до его распространения тысгрубая плацента.

Из-за их хрупкости, микропузырек подготовка и обработка также требуется помощь. Ультразвуковые микропузырьки могут быть уничтожены в соответствии с средах с высоким давлением. Таким образом, точно такой же процедуру повторяют при каждом восстановление и пузырь концентрация была измерена экспериментально, чтобы обеспечить согласованность. Один флакон микропузырьков обычно хватает примерно на 5-7 эмбрионов. Поскольку микропузырьки стабильны в пробирку до 3 ч, несколько флаконы часто требуется для одного эксперимента. Во избежание разрыва ткани, что лучше для стекла кончиком инъекционной иглы, чтобы быть острым и нарезать на небольшой угол при приближении судна в качестве небольшой угол, как это возможно. После того, как обрезать, кончик иглы должен быть достаточно большим для пузырьки легко проходить через конца без комков, но достаточно малы, чтобы поместиться в сосуде. Идеальный размер в целом <100 мкм. Некоторые практика в судя необходимостиРазмер надо было. В том случае, если наконечник был сокращен слишком большой, или стали заблокирован, новое стекло наносили иглы. Это в некоторых случаях, можно было урезать, чтобы строчка немного выше блокировки. Это было важно, чтобы воздух не будет разрешено въезжать сосудистой системы эмбриона во время инъекции, так как это может привести к смерти животного и нежелательно во время съемки (пузырьки воздуха могут подать в сосудистой системе эмбриона и можно будет определить в ультразвуковом изображении , искусственно увеличивая любого измеряемого сигнала). Нелинейная контраст изображения осуществляется в этом протоколе использовали по последнему слову техники высоких частот (21 МГц) микро-ультразвуковой системы (Vevo2100) в паре с линейными массивами, специально разработанных для малых животных томографии (MS250). Микро- и высоких частот -ultrasound является одним из нескольких способов, способных, в это время, чтобы обеспечить изображений с высоким разрешением живых мышиных эмбрионов и новорожденных 16. Эта система может достичь осевые и боковые резолюции 75 мкм и 165 μм соответственно на глубинах так велика, как 15 мм. Поэтому было возможно к изображению весь эмбрион на очень высоких разрешениях, чем обычно достигается с помощью клинических инструментов и звуковой сигнал от микропузырьков можно выделить из ткани, с помощью методов нелинейной контраст изображений (в том числе инверсии импульса и амплитуды методов модуляции 24). Хотя у нас был лучший успех с настройками ультразвуковых описанных здесь, вполне возможно, что некоторая корректировка этих параметров также будет производить удовлетворительные результаты. Во всех случаях, низкая мощность требуется для визуализации микропузырьков, чтобы избежать нежелательного разрушения микропузырьков до начала всплеска, в то время как короткая очередь исключает лишь малую часть населения микропузырьков. С практикой, вся процедура для одного эмбриона, из позиционирования до завершения визуализации молекулярной ультразвуковой, взял приблизительно 15 мин. Мы успешно вводят столько, сколько 12 эмбрионов из одной подстилке вза один сеанс.

Инъекционные эксперименты были ограничены окна 4 ч из-за ограниченной жизнеспособности эмбрионов. Поскольку распределение микропузырьков зависит от циркуляции эмбрионом, инъекции не может состояться до сердцебиения (E8.5) и выявляемой потока в желточные и пупочной циркуляции (E9.5) была создана 25. С созревания плаценты не является полным, пока E14.5, введение контрастных веществ через плацентарный лабиринт был ограничен эмбрионов середины до конца срока беременности. На основе наблюдений, эмбрионы ближе к сроку были выносливее и может выдержать увеличение их сосудов объемом более, чем их более молодые коллеги. В совокупности эти факторы ограничения усиленном контрасте ультразвуковой визуализации эмбриональных сосудов в более поздних стадиях развития и кровеносных сосудов, роста. Это может повлиять на доступность трансгенных мышах, так как манипуляции рецепторов, вовлеченных в Vascулар разработка и техническое обслуживание (например, VEGFR2, VCAM-1), может привести к эмбриональной летальности или дефектов в развитии и регулировании эмбриональных сосудистой системы 26,27. Тем не менее, количество соответствующих модельных системах доступны сосудистых биомаркеров интерес, в том числе α 2 β 1, α 28 об β 3, 29 пластинчатых эндотелиальных Молекулы клеточной адгезии-1 30, и адгезии сосудистых клеток-1 молекулу 31, межклеточной молекулы адгезии -1 32 и -2 33 и Р-селектина 34. Более того, мозг гистогенез начинается после середины беременности 11, что делает выражение кровеносных сосудов маркеров в этой ткани, скорее всего, и тем самым обеспечивая отличную альтернативу традиционной модели опухоли для исследований по оценке количественных аспектов молекулярной визуализации.

Экс естественных условиях природы инъекций представляет некоторые limitatioнс. Важно отметить, что после того, как эмбрионы были удалены из матери и плацентарный лабиринта проколотой, в целом было не возможно (и нежелательно), чтобы сделать повторные инъекции. Кроме того, выделение эмбриона от материнской циркуляции ограничивает поступление питательных веществ и O 2, и эмбриональные здоровья будет ухудшаться с течением времени. В то время как охлаждение и возрождение продлевает жизнеспособность эмбрионов, он также может влиять на сердечную функцию. Например, мы обнаружили, что отдельные зародыши имеет пониженное частоту сердечных сокращений (данные не включены, обратитесь к Denbeigh и др. 12) по сравнению с ранее наблюдались в естественных условиях 35. Поэтому вполне вероятно, что исследования, оценивающие сердечно-сосудистой физиологии не будет точно отражать в естественных условиях условиях. С несколько исследований, характеризующих кровообращения гемодинамики в живом поздней стадии эмбриона мыши, однако, трудно с уверенностью сказать, в какой степени эти экспериментальные условия могут альтэ физиологическую функцию. Одним из вариантов является проведение инъекции в период внутриутробного развития, либо через лапароскопической разреза 36 или через живот беременной матери непосредственно 37, хотя этот подход может представить свой ​​собственный набор проблем 11. В некоторых случаях, изоляция и экстериоризацией эмбриона может также привести к значительным кровотечением из желточного мешка. Хотя мы обнаружили, что может препятствовать кровоток с помощью ультразвука гель, значительной потери крови может повлиять на доставку и концентрацию микропузырьков, и эти животные были исключены из анализа. Наконец, в то время как изоляция действительно ограничивает матери и эмбриона источники движения, периодическое движение связано с сердечной деятельностью является неизбежным. Мы выбрали для изображения статическое мозг для того, чтобы непосредственно изучить влияние экспрессии рецептора на целевой микропузырьков сигнала, однако выполнение в режиме реального времени с компенсацией движения с контрастным усилением ультразвуковой визуализации 38 маярасширить эти исследования на другие органы.

Есть несколько приложений визуализации, которые в настоящее время в состоянии оценить сосудистую пейзаж живого развития эмбриона мыши. Некоторые исследования успешно выступили живого изображения кровотока в Экс Vivo мышиных эмбрионов с использованием доплеровского прокатилась исходным кодом оптической когерентной томографии 39,40, в то время как магнитно-резонансная томография, сосудистая коррозии бросает, microcomputed томография и оптическая проекция томография были реализованы посмертное 16. Это печально, так как этот период эмбрионального развития может выявить важную информацию о начале развития сосудов и функции. Поэтому Микросепаратор изображений внутри живых эмбрионов может способствовать нашему пониманию физиологии развития. Он также может быть использован для визуализации распределения биомаркеров в целом организме плода живой мыши в режиме реального времени, хотя этот метод вряд ли заменить существующие методы (в том числе гистологиии флуоресцентные изображения) для измерения молекулярного сигнала в эмбриональной ткани. Быстро развивается масса сосудов у эмбрионов, однако, напоминает рост опухоли, с выражением многие из тех же ключевых рецепторов, определенных в опухолевый ангиогенез 41,42, и поэтому может служить отличным суррогатом опухоли для исследований по изучению количественных способности молекулярной УЗИ. Поэтому мы ожидаем, что описанные методы будут полезны не только для оценки и классификации эмбриональных модели сосудистого здоровья и болезней с помощью функциональной визуализации, но предлагает путь для изучения сильных и слабых сторон молекулярной визуализации, а также. Его применение может также распространяться на другие интересные областях исследования, в том числе внутриутробно переноса генов терапии, где микропузырьки были испытаны в качестве средства доставки голой ДНК плода мыши ткани 10. С другой стороны, 3D-сосудистой отображение живого эмбриона также возможно,которые могут оказать неоценимую информацию о том, морфологических аномалий у генетически модифицированных мышей. Поэтому Введение ультразвуковых контрастных агентов в изолированных, живущих эмбрионов может быть еще одним инструментом для повышения нашего понимания сосудистых заболеваний и перевод с контрастным усилением применения ультразвука в клинике.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reagents
Antibodies (biotinylated, eBioscience) — Antibody choice depends on the experiment
  • rat isotype IgG2 control
eBioscience 13-4321-85 This antibody/microbubble combination is often required as experimental control 
  • biotin anti-mouse CD309
eBioscience 13-5821-85
Biotinylated rat MJ 7/18 antibody to mouse endoglin In house hybridoma Outside antibodies may also be appropriate: we  have used eBioscience (13-1051-85 ) in the past
Distilled water
Embryo media
  • 500 ml Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium with high glucose
Sigma D5796
  • 50 ml Fetal Bovine Serum
ATCC 30-2020 lot # 7592456
  • Hepes
Gibco 15630 5 ml, 1 M
  • Penicillin-Streptomycin
Gibco 15140-122 5 ml, 10,000 units Pen., 10,000 μg Strep
Ethanol, 70%
Ice
Paraformaldehyde Sigma 76240 4%
Phosphate Buffered Saline [1x]  Sigma D8537 1x, w/o calcium chloride & magnesium chloride
Pregnant mouse, CD-1 Charles River Laboratories Inc. 
0.9% sodium chloride (saline) Hospira 0409-7984-11
Ultrasound contrast agent, target ready and untargeted MicroMarker; VisualSonics Inc.
Ultrasound gel (Aquasonic 100, colourless) CSP Medical 133-1009
Equipment
Cell culture plates (4) :  100 x 20 mm Fisher Scientific 08-772-22
Cell culture plates (12) : 60 x 15 mm Sigma D8054
Centrifuge Sorvall Legend RT centrifuge 
Conical tubes, 50 ml BD Falcon VWR 21008-938
Diluent Beckman Coulter Isoton II Diluent, 8448011
Dissection scissors (Wagner) Fine Science Tools Wagner 14068-12
Forceps (2), Dumont SS (0.10 x 0.06 mm) Fine Science Tools 11200-33
Forceps, splinter VWR 25601-134
Glass beaker, 2 L (Griffin Beaker) VWR 89000-216
Glass capillaries, 1 x 90 mm GD-1 with filament Narishige GD-1
Glass needle puller Narishige PN-30
Gloves Ansell 4002
Gross anatomy probe Fine Science Tools 10088-15
Hot plate VWR 89090-994
Ice bucket Cole Parmer RK 06274-01
Imaging Platform VisualSonics Inc. Integrated Rail System
Light source, fiber-optic Fisher Scientific 12-562-36 Ideally has adjustable arms
Luers (12), polypropylene barbed female ¼-28 UNF thread Cole Parmer 45500-30
Micro-ultrasound system, high-frequency VisualSonics Inc. Vevo2100
Needles, 21 gauge  (1”) VWR 305165
Particle size analyzer Beckman Coulter Multisizer 3 Coulter Counter
Perforated spoon (Moria) Fine Science Tools MC 17 10373-17
Pins (6), black anodized minutien 0.15 mm Fine Science Tools 26002-15
Pipettors [2-20 μl, 20-200 μl, 100-1,000 μl] Eppendorf Research Plus  adjustable 3120000038;       3120000054;       3120000062
Pipettor tips [2-200 μl, 50-1,000 μl] Eppendorf epT.I.P.S.                   22491334;             022491351
Scissors
Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit Dow Corning
Tubing, Tygon laboratory 1/32” x 3/32” VWR 63010-007
Wooden applicator stick (swab, cotton head) VWR CA89031-270
Surgical microscope 5-8X magnification Fisher Scientific Steromaster
Syringes, 1 ml Normject Fisher 14-817-25
Syringes (10), 30 ml VWR CA64000-041
Syringe infusion pump  Bio-lynx  NE-1000
Thermometer, -20-110 °C VWR 89095-598
Timer VWR 33501-418
Tubes, Eppendorf VWR 20170-577
Tube racks (3) VWR 82024-462
Ultrasound transducer, 20 MHz VisualSonics Inc. MS250
Vannas-Tubingen, angled up Fine Science Tools 15005-08

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Voigt, J. U. Ultrasound molecular imaging. Methods. 48 (2), 92-97 (2009).
  2. Klibanov, A. Preparation of targeted microbubbles: Ultrasound contrast agents for molecular imaging. Medical Biological Engineering Computing. 47 (8), 875-882 (2009).
  3. Cosgrove, D., Lassau, N. Imaging of perfusion using ultrasound. European Journal Of Nuclear Medicine And Molecular Imaging. 37 (S1), 65 (2010).
  4. Williams, R., et al. Dynamic microbubble contrast-enhanced US to measure tumor response to targeted therapy: A proposed clinical protocol with results from renal cell carcinoma patients receiving antiangiogenic therapy. Radiology. 260 (2), 581 (2011).
  5. Burns, P. N., Wilson, S. R. Focal liver masses: Enhancement patterns on contrast-enhanced Images - Concordance of US scans with CT scans and MR images. Radiology. 242 (1), 162 (2006).
  6. Phoon, C. K. L., Aristizabal, O., Turnbull, D. H. 40 MHz doppler characterization of umbilical and dorsal aortic Blood flow in the early mouse embryo. Ultrasound. In Medicine And Biology. 26 (8), 1275-1283 (2000).
  7. Phoon, C. K. L., Aristizabal, O., Turnbull, D. H. Spatial velocity profile in mouse embryonic aorta and doppler-derived volumetric flow: A preliminary model. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 283, H908-H916 (2002).
  8. Aristizábal, O., Williamson, R., Turnbull, D. H. 12A-4 in vivo 3D contrast-enhanced imaging of the embryonic mouse vasculature. Paper presented at Ultrasonics Symposium. , IEEE. New York, NY. (2007).
  9. Bartelle, B. B., et al. Novel genetic approach for in vivo vascular imaging in mice. Circ.Res. 110 (7), 938-947 (2012).
  10. Endoh, M., et al. Fetal gene transfer by intrauterine injection with microbubble-enhanced ultrasound. Molecular Therapy. 5 (5), 501-508 (2002).
  11. Yamada, M., Hatta, T., Otani, H. Mouse exo utero development system: Protocol and troubleshooting. Congenital Anomalies. 48 (4), 183-187 (2008).
  12. Denbeigh, J. M., Nixon, B. A., Hudson, J. M., Purin, M. C., Foster, F. S. VEGFR2-targeted molecular imaging in the mouse embryo: An alternative to the tumor model. Ultrasound in medicine and biology. 40 (2), 389-399 (2014).
  13. Paauwe, M., Dijke, ten, P,, Hawinkels, L. J. A. C. Endoglin for tumor imaging and targeted cancer therapy. Expert Opinion On Therapeutic Targets. 17 (4), 421-435 (2013).
  14. Bourdeau, A., Faughnan, M. E., Letarte, M. Endoglin-deficient mice, a unique model to study hereditary hemorrhagic telangiectasia. Trends Cardiovasc. Med. 10 (7), 279-285 (2000).
  15. Whiteley, K. J., Adamson, S. L., Pfarrer, C. D. Vascular corrosion casting of the uteroplacental and fetoplacental vasculature in mice. Placenta And Trophoblast: Methods And Protocols. 121 (121), Humana Press. Totowa, NJ. 371-392 (2006).
  16. Kulandavelu, S., et al. Embryonic and neonatal phenotyping of genetically engineered mice. ILAR Journal. 47 (2), 103-10 (2006).
  17. Kalaskar, V. K., Lauderdale, J. D. Mouse embryonic development in a serum-free whole embryo culture system. Journal of Visualized Experiments. 85, (2014).
  18. Willmann, J. K., et al. Targeted contrast-enhanced ultrasound imaging of tumor angiogenesis with contrast microbubbles conjugated to integrin-binding knottin peptides. The Journal of Nuclear Medicine. 51 (3), 433-440 (2010).
  19. Deshpande, N., Ren, Y., Foygel, K., Rosenberg, J., Willmann, J. K. Tumor angiogenic marker expression levels during tumor growth: Longitudinal assessment with molecularly targeted microbubbles and US imaging. Radiology. 258 (3), 804-811 (2011).
  20. Lyshchik, A., et al. Molecular imaging of vascular endothelial growth factor receptor 2 expression using targeted contrast-enhanced high-frequency ultrasonography. Journal Of Ultrasound In Medicine. 26 (11), 1575-1586 (2007).
  21. Jerkic, M., et al. Endoglin regulates nitric oxide-dependent vasodilatation. The FASEB Journal. 18 (3), 609-611 (2004).
  22. Denbeigh, J. M., Nixon, B. A., Lee, J. J. Y., et al. Contrast-Enhanced Molecular Ultrasound Differentiates Endoglin Genotypes in Mouse Embryos. , Angiogenesis. Press. (2014).
  23. Adamson, S. L., Lu, Y., Whiteley, K. J., et al. Interactions between trophoblast cells and the maternal and fetal circulation in the mouse placenta. Dev Biol. 250, 358-35 (2002).
  24. Needles, A., et al. Nonlinear contrast imaging with an array-based micro-ultrasound system. Ultrasound. Medicine Biology. 36 (12), 2097 (2010).
  25. Watson, E. D., Cross, J. C. Development of structures and transport functions in the mouse placenta. Physiology. 20 (3), 180-193 (2005).
  26. Shalaby, F., Rossant, J., Yamaguchi, T. P., et al. Failure of blood-island formation and vasculogenesis in Flk-1-deficient mice. Nature. 376, 62-66 (1995).
  27. Kwee, L., Baldwin, H. S., Shen, H. M., et al. Defective development of the embryonic and extraembryonic circulatory systems in vascular cell adhesion molecule (VCAM-1) deficient mice. Development. 121, (1995).
  28. Mercurio, A. M. Lessons from the α2 integrin knockout mouse. The American journal of pathology. , 161-163 (2002).
  29. Hodivala-Dilke, K. αvβ3 integrin and angiogenesis: a moody integrin in a changing environment. Curr Opin Cell Biol. 20, 514-519 (2008).
  30. Pysz, M. A., Gambhir, S. S., Willmann, J. K. Molecular imaging: current status and emerging strategies. Clinical radiology. 65, 500-516 (2010).
  31. Cybulsky, M. I., Iiyama, K., Li, H., et al. A major role for VCAM-1, but not ICAM-1, in early atherosclerosis. J Clin Invest. 107, 1255-1262 (2001).
  32. Xu, H., Gonzalo, J. A., St Pierre,, Y,, et al. Leukocytosis and resistance to septic shock in intercellular adhesion molecule 1-deficient mice. J Exp Med. 180, 95-109 (1994).
  33. Gerwin, N., Gonzalo, J. A., Lloyd, C., et al. Prolonged eosinophil accumulation in allergic lung interstitium of ICAM-2-deficient mice results in extended hyperresponsiveness. Immunity. 10, 9-19 (1999).
  34. Johnson, R. C., Mayadas, T. N., Frenette, P. S., et al. Blood cell dynamics in P-selectin-deficient mice. Blood. 86, 1106-1114 (1995).
  35. Corrigan, N., Brazil, D., McAuliffe, F. High-frequency ultrasound assessment of the murine heart from embryo through to juvenile. Reproductive Sciences. 17 (2), 147-14 (2010).
  36. Turnbull, D. H., Bloomfield, T. S., Baldwin, H. S., Foster, F. S., Joyner, A. L. Ultrasound backscatter microscope analysis of early mouse embryonic brain development. Proc Natl Acad Sci U S A. 92, 2239-2243 (1995).
  37. Greco, A., Mancini, M. L., Gargiulo, S., et al. Ultrasound Biomicroscopy in Small Animal Research: Applications in Molecular and Preclinical Imaging. Journal of Biomedicine and Biotechnology. 2012, (2012).
  38. Pysz, M. A., Guracar, I., Foygel, K., Tian, L., Willmann, J. K. Quantitative assessment of tumor angiogenesis using real-time motion-compensated contrast-enhanced ultrasound imaging. Angiogenesis. 15, 433-442 (2012).
  39. Larina, I. V., et al. Live imaging of blood flow in mammalian embryos using doppler swept-source optical coherence tomography. J.Biomed.Opt. 13 (6), 060506-06 (2008).
  40. Garcia, M. D., Udan, R. S., Hadjantonakis, A. K., Dickinson, M. E. Live imaging of mouse embryos. 4 (4), Cold Spring Harbor. 104-10 (2011).
  41. Teichert, A., et al. Endothelial nitric oxide synthase gene expression during murine embryogenesis. Commencement of expression in the embryo occurs with the establishment of a unidirectional circulatory system. Circulation Research. 103 (1), 24-33 (2008).
  42. Walls, J. R., Coultas, L., Rossant, J., Henkelman, R. M. Three-dimensional analysis of vascular development in the mouse embryo. PLoS One. 3 (8), (2008).

Tags

Биология развития выпуск 97 Micro-ультразвук Молекулярная визуализация мышиного эмбриона Микросепаратор УЗИ контрастное вещество перфузии
Контраст изображений в эмбрионов мыши с помощью высокочастотной ультразвуковой
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Denbeigh, J. M., Nixon, B. A., Puri, More

Denbeigh, J. M., Nixon, B. A., Puri, M. C., Foster, F. S. Contrast Imaging in Mouse Embryos Using High-frequency Ultrasound. J. Vis. Exp. (97), e52520, doi:10.3791/52520 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter