Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Chemistry

바이오 콘쥬 게이션과의 Radiosynthesis Published: February 12, 2015 doi: 10.3791/52521

Abstract

항체의 탁월한 친화력, 특이도, 선택은 그들에게 종양을 대상으로 PET 방사성 의약품에 대한 매우 매력적인 벡터를 확인합니다. 으로 인해 여러 날 생물학적 반감기, 항체는 비교적 긴 물리적 붕괴 반감기 양전자 방출 방사성 핵종으로 표시해야합니다. 전통적으로, 양전자 방출 동위 원소 (124)는 I (t 1/2 = 4.18 D), (86) Y (t 1/2 = 14.7 시간), 64 구리 (t 1/2 = 12.7 시간)은 대한 항체를 라벨 사용되어왔다 PET 영상. 그러나 최근 필드는 항체 기반 PET 이미징 에이전트에 양전자 방출 방사성 89 ZR의 사용이 크게 증가를 목격 하였다. 그것이 물리적 반을 가지고 89 ZR은 면역 접합체와 PET 이미징에 대한 거의 이상적인 방사성 동위 원소 인 항체의 생체 내 약물 동태와 호환되며 상대적으로 낮은 에너지를 방출 - 생활 (t 1/2 = 78.4 시간)고해상도 이미지를 생성 RGY의 양전자. 또한, 항체는 노골적 시데로 포어 파생 킬레이트 desferrioxamine (DFO)를 사용하여 89 ZR으로 표시 할 수 있습니다. 이 프로토콜에서, 전립선 특이 막 항원 표적 항체 J591은 예시 모델 시스템으로 사용한다 (1) 항체, (2) radiosynthesis 및 89 Zr-의 정제 - 이소 티오 시아 네이트 DFO 관능 킬레이트 바이오 콘쥬 게이션 암의 뮤린 모델 ZR-89-DFO 단클론 radioimmunoconjugate와-DFO 단클론 radioimmunoconjugate, 및 (3) 생체 내 PET 영상화.

Introduction

인해 현저한 감도, 친화력 및 선택성으로, 항체는 긴 암 세포에 방사선 동위 원소의 전달을 위해 유망 벡터를 고려되었다. 그러나, 양전자 방출 단층 촬영 (PET) 영상에의 응용들은 표지 용 적당한 양전자 방출 동위 원소의 부족에 의해 방해되어왔다. radioimmunoconjugates의 설계에서 가장 중요한 고려 사항 중 1-3 하나의 물리적 붕괴 매칭되는 하프 항체의 생체 내 약물 동태에 방사성 동위 원소의 생활. 보다 구체적으로, 항체는 종종 비교적 긴 멀티 일 생물학적 반감기를 가지므로 비교 물리적 반감기의 방사성 동위 원소로 표지되어야한다. PET 영상 응용 프로그램의 경우, 항체는 전통적으로 (64) 구리 (t 1/2 = 12.7 시간), (86) Y (t 1/2 = 14.7 시간), 또는 (124) I (t 1/2 = 4.18 D). (4) 방사성 동위 원소 표지왔다, 5 단, 각이러한 방사성 동위 원소 임상 영상에 대한 적합성을 방해 상당한 한계를 가지고있다. 86 Y 64 구리로 표지 radioimmunoconjugates 전임상 연구에서 유망한 입증하는 동안, 동위 원소는 인간의 이미지에 대한 효과가 너무 짧은 물리적 반감기를 가지고있다. (124) 나는 반면에,에 대한 거의 이상적인 물리적 반감기 항체 촬상 있지만 고가이고 상대적으로 낮은 해상도 이미지를 임상 적으로 이어질 차선 감쇠 특성을 갖는다. 또한, I-124 표지 radioimmunoconjugates는 생체 내 종양 대 배경 활성 비율을 낮출 수를 탈 할로겐 처리의 대상이 될 수있다. -6,7-

이 드라이브는 64 잘라 내기, (86) Y를 대체 할 수있는 양전자 방출 방사성 동위 원소를 발견하고, radioimmunoconjugates 12489 ZR 표지 항체에 대한 연구의 급등을 자극했다. 8-12에게 T를89 ZR의 출현에 대한 그 이유는 간단하다 : 방사성 진단 PET의 radioimmunoconjugates에 사용하기 위해 가까운 이상적인 화학적 및 물리적 특성을 가지고 13 89 ZR은 89 Y (P, N)을 사용하여 사이클로트론에 89 ZR의 반응을 통해 생성된다. 시판되는 100 % 천연 풍부한 89 Y 타겟. 14,15 방사성은, 23 %의 양전자 수율을 갖는다 78.4 시간의 반감기로 붕괴 및 395.5 keV의 (도 1)의 비교적 낮은 에너지로 양전자를 방출한다. 그것은 89 13,16,17 ZR 또한 높은 에너지를 방출하는 것이 중요하고, 909 keV의 γ 선 99 % 효율. 방출이 방출 광자 511 keV의 에너지 적으로 방해하지 않는 반면, 전송, 처리, 선량에 대해서 고려를 필요 여분 않는다. 이 경고에도 불구하고, 이러한 부패의 특성은 궁극적으로 89 ZR이 더 유리한 시간을 가지고뿐만 아니라 의미구리 86 Y 64 이상 항체 이미징을위한 ALF 생활뿐만 아니라 더 높은 687, 975 케빈의 에너지뿐만 아니라의 100 ~ 150 keV의 내부 에너지와 광자의 번호와 양전자를 방출하는 124 I보다 높은 해상도의 이미지를 생성 할 수 있습니다 511 keV의 양전자 생성 된 광자. (13) 또한, 89 ZR은 방사성 옥소 대응보다 더 효과적으로 또한 종양, 처리 할 안전 생산 저렴하고 residualizes이다. 89의 Zr (18, 19) 하나의 잠재적 인 제한이없는 것입니다 isotopologue 치료, 예를 들면, Y (86) (PET) 90 대 Y (치료). 이것은 그들의 대응 치료 용 선량 정찰병으로 사용할 수있는 화학적으로 동일 대리 조영제의 구성을 배제한다. 그것은 말했다 조사는 89 ZR 표지 항체는 90 Y- 177 루 표지 면역 접합체에 대한 이미징 대리로 잠재력을 가지고 수행하는 것이 좋습니다.(20, 21)

화학적 인 관점에서, 그룹 IV 금속으로서, 89 ZR은 수용액 중의 양이온 +4로서 존재한다. ZR 4+ 이온은 높은, 비교적 큰 (유효 이온 반경 = 0.84 Å) 충전되고, "하드"양이온로 분류 될 수있다. 이와 같이, 여덟 하드 음이온 산소 도너 리간드 담까지 선호를 나타낸다. 쉽게 ZR-89 radioimmunoconjugates 표지에 사용되는 가장 일반적인 킬레이트가 desferrioxamine이다 (DFO), 세 그룹 히드 담지 시데로 포어 유래 비 환식 킬레이트. 리간드 안정적 생물학적 관련성의 pH 레벨에서 RT로 신속하고 깨끗하게 ZR 4+ 양이온을 조정하고, 생성 ZR-DFO 착체는 식염수, 혈청에서 여러 날에 걸쳐 안정적으로 유지하고, 전혈. 22 전산 연구가 강하게 시사 DFO는 금속 중심에 배위 세 neut되는 ZR 4+ hexacoordinate 복합체를 형성하도록RAL과 리간드의 세 음이온 산소 기증자뿐만 아니라 두 개의 외생 물 리간드 (그림 2). (23, 24) 89 ZR-DFO의 접합 발판을 사용 radioimmunoconjugates의 생체 내 행동은 일반적으로 우수한있다. 그러나 어떤 경우에는, 이미징 및 급성 생체 분포 연구는 89 ZR - 표지 된 항체를 주입 한 쥐의 뼈 높은 활동 수준, ZR 4+ 양이온은이어서 생체 내에서 킬레이트로부터 방출되고, 89 osteophilic가 mineralizes 제안 데이터를 밝혀냈다 뼈. 여덟 산소 도너가 문헌에 나타난 25 최근, 신규 ZR 89 4+ 킬레이트 제의 개발에 대한 조사의 수는 특히, 현재, 그럼에도 24,26,27. DFO 리간드는 가장 널리 사용되는 킬 레이터 89 넓은 여백에 의해 radioimmunoconjugates을 ZR은 표지. 다른 다양한바이오 콘쥬 게이션 전략 bioorthogonal 클릭 화학, 항체의 시스테인 구축 티올 반응 DFO의 반응, 에스테르 베어링 DFO는 항체에 라이신 구축 활성화의 반응을 포함하여, 항체 DFO를 연결하는 데 사용되어왔다. 4,28- 30 쉽게 가장 일반적인 방법은, 그러나, 22 견고이 시판 관능 킬레이트. DFO, DFO-NCS의 이소 티오 시아 네이트 - 함유 유도체의 사용을 (도 2)이었다 안정적의 리신으로 안정한 공유 결합 티오 우레아 결합을 형성했다 항체 (그림 3).

지난 몇 년 동안, 89 ZR-DFO - 표지 radioimmunoconjugates 다양한는 문헌에보고되어있다. 전임상 연구는 CD105-대상으로 T로 세툭시 맙, 베바 시주 맙과 트라 스투 주맙 난해한 항체로 더 잘 알려진 이르기까지 항체를 특징으로, 특히 풍부한되었습니다RC105 및 5A10을 FPSA를가 타겟팅. 30-36 최근 89 ZR-DFO 표지 된 항체를 사용하여 초기 단계의 임상 시험 소수 문헌에 등장했다. 89 ZR-DFO-cmAb의 U36, 89 ZR-DFO-ibritumomab의 tiuxetan, 89 ZR-DFO - 트라 스투 주맙. 21,32,37 또한, 89와 다른 임상 시험의 범위를 사용 특히, 네덜란드 그룹이 발행 한 시험 ZR 표지 radioimmunoconjugates 전립선 암 이미징 PSMA 타겟팅 89 ZR-DFO-J591과 유방암 이미징 HER2-대상으로 89 ZR-DFO - 트라 스투 주맙을 사용하여 기념 슬로안 케터링 암 센터에서 여기에 조사를 포함하여, 현재 진행되고있다. 23, 방사성 표지 된 항체는 가장 일반적인 ZR (89) 표지 된 방사성 의약품을 유지하면서 또 30, 방사성도 점점 펩티드, 단백질, 및 나노 물질을 포함하는 다른 벡터들과 함께 사용되어왔다. 38-43

89 ZR-DFO 라벨링 방법의 모듈화는 엄청난 자산입니다. 바이오 마커 타겟팅 항체의 레퍼토리는 끊임없이 확장하고, 이러한 구조를 사용하여 생체 PET 영상에서 공연에 대한 관심은 빨리 성장하고있다. 결과적으로, 우리는 더 표준화 된 방법 및 프로토콜이 개발 분야 이익을 얻을 수 있다고 믿고있다. DFO-NCS의 활용 89 지르코늄의 방사선 물질에 대한 우수한 기록 실험 프로토콜이 이미 Vosjan에 의해 출판 된, 등. (22) 우리는이 작품에서 제공하는 시각적 데모 더 이러한 기술에 새로운 연구자에게 도움이 될 수 있다고 생각합니다. 손 프로토콜, 전립선 특이 막 항원 표적 항체 J591은 예시 모델 시스템으로 사용한다 (1) 항체에 DFO - 이소 티오 시아 네이트 관능 킬레이트 바이오 콘쥬 게이션, 89 (2) radiosynthesis 정제 ZR-DFO-단클론 항체 radioimmunoconjugate,및 (3)에서 암의 뮤린 모델에서 ZR-89-DFO 단클론 radioimmunoconjugate 생체 내 PET 영상화. 23,44,45

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

설명 생체 내 동물 실험의 모든 승인 된 프로토콜과 기념 슬로안 케터링 암 센터의 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC)의 윤리적 지침에 따라 따라 수행 하였다.

J591에 DFO-NCS 1. 활용

  1. 1.7 ml의 마이크로 원심 분리 튜브에서, 1X 인산 완충 생리 식염수 (PH 7.4), 0.5 M HEPES 완충액 (pH 7.4) 중 어느 하나를 1ml의 J591 2-5 ㎎ / ㎖의 용액을 제조 하였다.
  2. 5 내지 10㎜ (3.8-7.6 ㎎ / ㎖)의 농도로 DMSO에 건조 DFO-NCS 녹인다. 초음파 처리 또는 소용돌이 완전히 용해를 용이하게하기 위해 충분히 용액.
  3. 작은 분량 씩 0.1 M 나 2의 (<10 μL) CO 3를 추가하여 8.8-9.0로 J591 용액의 pH를 조정합니다.
  4. 항체 용액은 pH에서 올바른되면 관능 킬레이트 3-4 배 몰 과량 대응 DFO-NCS 용액의 볼륨.
    1. 시험을위한PLE, 2 ㎎ / ㎖ J591 항체 액 1 ㎖ (13.3 nmol의 J591)에 10 mM의 (7.6 ㎎ / ㎖) DFO-NCS 용액 (40.4 nmol의 DFO-NCS)의 4 ~ 5 μl를 추가합니다. 최종 수성 반응 혼합물에서 DMSO의 양은 2 % V / V를 초과하지 않아야한다.
  5. 350 rpm에서 교반 가열 블록에 37 ° C에서 30 분 동안 반응물을 인큐베이션.
  6. 37 ° C에서 1 시간 후, 용리액으로서 0.5 M HEPES 완충액 (pH 7.4)을 사용하여 50,000 분자량 컷 - 오프로 미리 충전 일회용 탈염 크기 배제 컬럼을 사용하여 생성 된 면역 접합체를 정제. 이 단계는 완료 J591-DFO 구조의 2 ml의 솔루션을 얻을 것입니다.
  7. 비스 - UV 분광 광도계에 구축 J591-DFO의 농도를 측정한다.
  8. 구조물의 높은 농도가 요구되는 경우, 50,000 분자량 컷 - 오프로 원심 필터 유닛을 이용 J591-DFO 용액을 농축시킨다.
  9. 어둠 속에서 -20 ° C에서 완성 된 J591-DFO의 면역 접합체의 솔루션을 저장합니다.

89 ZR 2. 방사성 표지 J591-DFO

주의 : 프로토콜의이 단계는 취급 및 방사능의 조작을 포함한다. 다음 단계를 수행하거나 자신의 집 기관의 방사선 안전 부서와상의해야합니다 방사능 연구자와 다른 작업을 수행하기 전에. 가능한 모든 단계는 이온화 방사선에 대한 노출을 최소화하기 위해주의해야한다.

참고 : 적절한 방사 화학 노트 유지의 관심에서, 샘플에서 방사능의 양을 투여 교정기를 사용하여 측정하고 이전에 기록되어야한다 아래의 프로토콜의 단계 2.2-2.13 후. 이 방사 화학적 수율 및 특정 활동의 정확한 결정에 도움이 될 것입니다.

  1. 0.5 M HEPES 버퍼, 산도 7.5의 200 μL에 J591-DFO의 0.5 ~ 2.0 mg의 용액을 준비합니다.
  2. 의 볼륨을 피펫 <2 ml의 플라스틱 스크류 캡 microcentrifuge 관에 1.0-6.0 mCi의 (37-222 MBq의)에 해당하는 (일반적으로 1.0 M 옥살산 공급) SUP> 89 ZR 4+ 원액. 1.0 M 옥살산을 사용하여 총 300 μL이 용액의 양을 조정한다.
  3. 1.0 M 나 2 CO 3를 사용하여 6.8-7.5로 89 ZR 4+ 용액의 pH를 조정합니다. 원하는 산도를 달성하기 위해베이스의 분량을 작은 (<10 μL)를 추가 이후 89 ZR 4+ 솔루션 CO 3 1.0 M 나 2의 250 μl를 추가하여 시작합니다.
  4. 2.1 단계에서 제조 된 J591-DFO 용액의 pH 조정 89 ZR 4+ 솔루션의 원하는 금액을 추가합니다.
  5. 이 6.8-7.5의 목적하는 범위 내에 있도록 방사성 표지 된 반응 혼합물의 pH를 확인한다.
  6. 350 rpm에서 교반 가열 블록에 실온에서 60 분 동안의 방사선 반응을 품어.
  7. 인큐베이션 60 분 후, 측정 RAD무선-TLC를 이용하여 반응 수율을 iolabeling.
    1. 이를 위해, 실리카를 함침 TLC 스트립 방사성 표지 반응 혼합물을 1 μCi를 스팟. 50 mM의 DTPA (PH 5.5)의 전개 용매를 사용하여 TLC를 실행, 나누어지는 건조 할 수 있도록 허용하고, 무선 TLC 스캐너를 사용하여 TLC 스트립을 분석 할 수 있습니다. 89 ZR을 4+ 원점에 나타납니다 J591-DFO 구조에 결합 (R <ZR 89 무료 4+ 양이온 DTPA에 의해 킬레이트 화되고 용매 앞 (R F를 용출 반면 0.1),> 0.9) F.
    2. , radiochromatogram 통합 곡선 아래의 총 면적으로 0.0-0.1 f를 R에서 곡선 아래의 영역을 분할하고, 100을 곱해서 반응하여 표지 수율을 계산한다.
  8. 방사성 표지 수율이 충분 (전형적으로> mCi의 2 / MG의 이론적 비활성) 인 경우의 50 mM DTPA, pH가 5.5의 5 μL 반응물을 켄칭.
  9. 그 결과 면역 접합체의 USI를 정화NG 5 ㎎ / ㎖ 겐티 론산 5 ㎎ / ㎖ 겐티 산 또는 0.25 M 아세트산 나트륨 (PH 5.5)을 0.9 % 멸균 식염수 중의 용리액을 사용하여 50,000 분자량 컷 - 오프와 함께 미리 포장 된 일회용 크기 배제 탈염 칼럼 . 이 단계는 완료 89 ZR-DFO-J591의 radioimmunoconjugate의 2 ml의 솔루션을 얻을 것입니다.
  10. 단계 2.7에 기재된 바와 같이 정제 한 후, 무선 - TLC를 이용하여 89-DFO ZR-J591의 방사 화학적 순도를 확인한다.
  11. 처음에 정제 (89) ZR-DFO-J591 radioimmunoconjugate 절연 된 방사능의 양에 의해 항체 용액에 첨가 활동량을 나누어 전체적인 반응하여 표지 수율을 계산한다.
  12. 방사성 표지 반응에서 DFO-J591의 초기 질량 (89)에 의해 정제 ZR-DFO-J591의 radioimmunoconjugate 절연 활동량 나누어 최종 특이 적 활성을 계산한다.
  13. 높은 농도의 원하는 경우, 번째 주력전자 89 50,000 분자량 컷 - 오프와 원심 필터 유닛을 사용하여 ZR-DFO-J591 솔루션입니다.
    주 : 최종 정제 공정에서 사용 겐티 산 인해 방사선 분해에 항체의 열화를 최소화하기 위해 사용되는 무선 - 보호제 46 동안 4 ℃에서 최대 48 시간 동안 89 ZR-DFO-J591의 radioimmunoconjugate의 저장. 가능하며, 사용하지 않는 것이 좋습니다. radioimmunoconjugate이 저장 될 것이라면, 하이포 클로 라이트 - 매개 방사선 분해의 위험을 최소화하기 위해 저장 버퍼로서 5 ㎎ / ㎖ 겐티 산 0.25 M 아세트산 나트륨 (PH 5.5)를 사용한다. (47)

89 ZR-DFO-J591과 생체 PET 영상 3.

주의 : 프로토콜 섹션 2에서와 같이, 프로토콜의이 단계는 취급 및 방사능의 조작을 포함한다. 다음 단계를 수행하기 전에 연구자들은 자신의 집 기관의 방사선 안전 부서와상의해야합니다. 모든 possib제작 단계는 이온화 방사선에 대한 노출을 최소화하기 위해주의해야한다.

  1. 수컷 무 흉선 누드 마우스 피하 5 × 106 된 LNCaP 전립선 암세포 이식 및 이들 (3~4주 접종 후) 3 이종 100-150mm로 증가 할 수있다. 44
  2. 0.9 % 멸균 식염수, 1.0 mCi의 / ml의 농도로 89 ZR-DFO-J591 radioimmunoconjugate의 희석.
  3. 89 ZR-DFO-J591 용액 (200 μCi를 7.4 MBq의) 200 ㎕를 주입한다. 이종 이식 베어링 마우스의 측면 꼬리 정맥에 48
  4. 촬상 원하는 시점에서 (예를 들어, 12, 24, 48, 72, 96, 또는 120 열연 후 분사), 2 % 이소 플루 란 마취 마우스 : 산소 가스 혼합물.
  5. 작은 동물 PET 스캐너의 침대에 마우스를 놓고 1 % isoflurane을 사용하여 스캔하는 동안 마취를 유지 : 산소 가스 혼합물을. 스캐너 침대에 동물을 배치하기 전에, 토​​우 - 핀치 방법 및 출원을 이용하여 마취를 검증마취 동안 건조를 방지하기 위해 마우스의 눈 Y 안연고. 49
  6. 350-700 keV의 에너지의 창 6 나노초의 일치 타이밍 윈도우를 사용하여 4000 만 일치 이벤트 최소 정적 스캔을 통해 마우스 PET 데이터를 획득. 50
  7. 이미지의 인수를 완료 한 후, 무인 마우스를 벗어나지 않아이 의식을 회복 할 때까지 다른 마우스와 케이지로 변경하지 마십시오.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

이 프로토콜 항체 DFO-NCS의 공액의 첫 번째 단계는 일반적으로 매우 견고하고 신뢰할 수있다. 일반적으로, 정제, 킬레이트 변성 면역 접합체는> 90 %의 수율로 얻을 수 있고, 초기의 접합 반응에서 DFO-NCS의 3 몰 당량을 사용하여 차수의 표지 약 1.0-1.5의 킬레이트 DFO의 수율 것이다 / 단클론 항체. 프로 시저의 89 ZR의 방사선 및 정제 단계는 마찬가지로 간단합니다. 위의 프로토콜에 설명 된 농도> 80 %의 방사선 수율> 2.0 mCi의 / mg을 따라서 특정 활동에 실온에서 60 분 후 일반적이다. 원유의 방사선 혼합물의 무선 TLC 크로마토 그램 가능성이 용매 전면 (그림 4A)에서 용출 일부 DTPA 바인딩 89 ZR을 4+ 발표 할 예정이다. 그러나 radioc DTPA를 반응물을 급냉 (89) ZR-DFO 단클론은 크기 배제 크로마토 그래피를 통해 정제 한 후 건설정제 된, 고립 된 89 ZR-DFO - 항체 복합체의 hemical 순도> 95 % (그림 4B)해야한다. 절연 ZR-89-DFO 단클론 항체 접합체의 방사 화학적 순도는 95 % 미만임을 경우, 정제 절차는 앞서 어느 하나를 수행하는 시험 관내 또는 생체 내 실험을 반복한다.

생체 내 실험으로 넘어, 프로토콜은 무 흉선 누드 마우스는 발현 PSMA, LNCaP 또는 전립선 암 이종 이식 (89) ZR-DFO-J591의 생체 내 거동을 조사하기 위해 사용 하였다 담 상술. 급성 생체 분포 및 PET 영상 실험은 모두 89 ZR이-DFO-J591은 분명히 우수한 이미지 대비 높은 종양 - 투 - 배경 활동 비율 (그림 5)와 전립선 암 이종 이식을 묘사 것으로 나타났다. 종양의 radioimmunoconjugate의 흡수는 초기 24 시간 (5.6 %의 ID / g ± 20.9 %), 그리고 활동 등으로 알 수있다96 시간 주입 후 5.3 %의 ID / g ± 57.5 %의 최대 종양 농도 증가. radioimmunoconjugates 전형적인 바와 같이, 방사성 트레이서의 비교적 높은 농도를 통해 혈액 방사능의 양을 천천히 감소 하였다 이른 시점 (9.1 %, 24 시간에서의 ± 5.3 %의 ID / g)에 혈액에 존재 실험의 과정. 가장 높은 활성 농도를 갖는 비 표적 조직은 아마도 osteophilic 양이온 ZR 89 4+의 생체 내 방출의 결과로서, 실험 전반에 걸쳐 10 % ID / g 주위 흡수 값을 표시 뼈이었다. 심장, 폐, 간, 비장, 위, 크고 작은 창자, 신장, 비교적 낮은 농도의 활성 표시 근육 종종 잘 이하 5 % ID / g를 포함하는 모든 다른 기관. 대조군으로서, 마우스의 추가적인 코호트 항원 포화 따라서 선택적 차단 방법을 설명하기 위해 공동 주입 300 μg의 비 표지 DFO-J591을 주사 하였다. Criti 적으로는 차단 실험은 분명히 89 ZR-DFO-J591 선택적으로 그 대상을 나타내는, 72 시간 주입 후에서 11.1 %의 ID / g ± 23.5 %로 9.3 %의 ID / g ± 48.9 %에서 종양의 radioimmunoconjugate의 흡수를 저하 항원.

그림 1
도 1 (A) 단순 감쇠 방식 및 (B) (89)의 일부 현저한 감쇠 특성 ZR 13,16,17 IT 이성질체가 천이 =.; EC는 = 전자 캡처. 수정과 DERI,의 허가를 받아 재 인쇄했습니다. 핵 의학 및 생물학. (40), 3-14 (2013). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

2 다시 "SRC ="/ 파일 / ftp_upload / 52521 / 52521fig2highres.jpg "폭 ="700 픽셀 "/>
그림 2. (A) 붉은 색 조정 산소 원자와 DFO-NCS의 구조; (B) ZR-DFO 조정 단지의 DFT 파생 된 구조. 수정과 DERI,의 허가를 받아 재 인쇄했습니다. 의약 화학의 전표. 57, 4849-4860 (2014). 저작권 2014 미국 화학 학회. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 3

89 ZR-DFO-J591의 바이오 콘쥬 게이션 및 방사성 표지 그림 3. 계획.등 = "_ 빈">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 4
89 ZR-DFO-J591의 조질 방사성 표지 혼합물 (A) 및 정제 물 (B)의도 4 주제 무선 TLC 크로마토 그램. 라디오 TLCS 50 mM의 DTPA, pH 5.0으로의 용리액을 사용하여 실리카 스트립에서 실행 하였다. 주십시오 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 5
89 ZR-DFO-J591 그림 5. 관상 PET 이미지 (11.1-12.9 MBq의 [300-345은 μCi를 200 ㎕의 0.9 % 멸균 식염수에 꼬리 정맥을 통해 주사) 피하 베어링를 누드 마우스에, PSMA가 발현24, 120 시간의 포스트 분사 사이에 된 LNCaP 전립선 암 이종 이식 (흰색 화살표). 수정과, 그 외 Zeglis의 허가를 받아 재 인쇄했습니다. Bioconjugate 화학. 24, 1057-1067 (2013). 저작권 2013 미국 화학 학회. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

건설, 방사성 표지, 및 이미징의 ZR-89-DFO labled radioimmunoconjugates이 다소 간단한 절차가 일반적이지만,이 프로세스의 각 단계에서 마음에 몇 가지 주요 고려 사항을 유지하는 것이 중요하다. 예를 들어, 아마도 절차 공액 단계 동안 우려 원인은 공액 반응 동안 항체의 집합이다. 이 문제는 대개 DFO-NCS 스톡 용액의 첨가 후 접합 반응의 불량한 혼합하는 제품이다.이 경우, DFO-NCS의 비균질 분포가 로컬 반응이 과도하게 높은 수준을 유발할 수있다 (22) 결과적으로 집계 될 수 있습니다 항체. 이 문제는 비교적 용이하게 그리고 온도에서 반응 혼합물을 철저히 DFO-NCS의 첨가 후, 반응 혼합물을 혼합 (<5 μL) 작은 분량 씩 DFO-NCS 스톡 용액을 첨가하고, 교반에 의해 회피 될 수있다전자 제어 통. 또한, DFO 단클론 구조체의 접합 및 정제 한 결과, 정확하게 각각의 단클론 항체에 접합 DFO의 수를 결정하는 것이 중요하다. 항체 당 DFO 킬레이트 수의 완전 특성화 런드 수행과 동일한 방사성 동위 원소 희석 실험을 이용하여 달성 할 수있다, 등. 앤더슨, 등., MALDI-TOF 질량 분석법 비록 대안. 14,23 ,의 방사선 단계 동안 30,51,52 쉽게 가장 일반적인 문제는 예상보다 낮았의 방사선 수익률이다. 예기치 않게 낮은 수익률이 부지런히 위의 프로토콜을 다음에도 불구하고 발생하는 경우, 세 가지 문제 해결 전략을 사용할 수 있습니다 : (1) 시간의 긴 양의 방사성 표지 반응을 배양 (예를 들어, 2 ~ 3 시간) (2) 항체의 높은 농도를 사용하여 표지 반응을 반복; 또는 (3) 번째의 높은 몰 과량을 사용하여 초기 DFO-NCS 공액 반응을 반복전자 관능 성 킬레이트.

NCS-DFO 공액가 용이 한 견고한 반면, 그것의 명백한 단점 중 하나는 부위 특이 없다는 것이다 : NCS-DFO에 관계없이 자신의 위치에서의 항체 가능한 리신과 티오 우레아 결합을 형성한다. 그 결과, 킬레이트함으로써 악영향 89 ZR-DFO - 표지 된 콘쥬 게이트의 면역 반응에 영향을 미치는, 항체의 항원 - 결합 영역에 부가 될 수있다. 따라서, 미세 균형 89 ZR 표지 radioimmunoconjugates의 건설에 공격해야합니다 항체 당 킬레이트의 숫자가 높을수록 더 높은 특정 활동을 촉진하지만, 라벨의 높은 학위는 또한 구조의 면역을 저하의 위험이 증가합니다. 결국, 목표는 간단하다 : 면역 저하없이 필요한만큼의 킬레이트를 연결합니다. 정제 (89) ZR-DFO-단클론 radioimmunoconjugate를 획득 한 결과를 결정하는 것이 중요 생체 실험에 앞서 구조의 체외 면역. 이를 위해, 우리는 Lindmo 발행 시험 관내 방법을 사용하여 추천 제물의 면역 미만 80~90% 인 경우, 등. (53, 54), 상기 접합 반응로 돌아가 이하 DFO 잔기를 추가 할 필요가있다 항체 당. 정제 (89) ZR-DFO 단클론의 면역 반응성이 높은 (> 90 %)과 높은 특정 활동이 필요한 경우는 다르게, 그 면역 반응을 감소시키지 않고 더 많은 항체에 킬레이트 제를 부착하는 것이 가능할 수있다.

마지막으로, (89) ZR-DFO 표지 된 항체의 생체 내 거동은 항체의 ID 및 이용 종양 모델 모두에 크게 의존 물론이다. 여기에 제시된 모델 시스템에서, 종양에서의 최대 흡수 값은 약 60 % ID / g에 도달; 그러나, 최대 종양 흡수 V에 대한 문헌에보고alues ​​80-90 %의 ID / g만큼 높은으로 낮은 15-20 % 나 ID / g의 범위를 33,44,55-57 마찬가지로, 비 표적 조직에서의 흡수의 양 -. 간과 비장 특히 - 항체 / 항원 시스템이 연구되고에 따라 광범위하게 달라질 수있다. 89 ZR-DFO 표지 된 항체의 특이 적 활성은 생체 내 실험을위한 중요한 고려 사항이다. ZR-89-DFO 모노클 특정 활동 문헌 값은 일반적 mCi의 1-6 / MG (MBq 내지 37-222 / MG) 범위. 8,10를 일반적으로 그들이 실수의 가능성을 감소로, 높은 특정 활동은 바람직 항원 (즉, 자기 차단)의 포화. 이것은 낮은 수준의 항원 식 시스템에서 특히 그러합니다. 에 관계없이 항체 / 항원 시스템, 89 ZR-DFO 표지 영상 화제의 어떤 생체 조사는 선택의 데모없이 완전하지 않다. 이것은 사용 차단 실험을​​ 통해 달성 될 수있다표지 된 생체 분자 또는 당해 항원을 발현하지 않는 세포주의 사용 다량. 본원에 기재된 절차에있어서, 전자가 채용되었지만, ZR-89-DFO J591 선택율 또한 PSMA 음성 PC3 전립선 암 이종 이식을 사용하여 입증되었다. 23

그것은 그것의 명확한 장점에도 불구하고,이 DFO-NCS 기반 합성 방법론은 완벽하지 않습니다 것이 중요합니다. 우리는 논의했듯이 DFO 89 ZR 4+ 이상적인 킬레이트없고, 접합 반응의 비 - 부위 특이 자연 번거로울 증명할 수있다. 이러한 문제를 회피하기 위해, 흥미 진진한 노력이 새로운 킬레이트을 개발하기 위해 89 ZR 4+ 및 특정 사이트의 방사선 방법은 현재 진행되고, 아직 이러한 새로운 기술은 아직 최적화 실험실과 병원 모두에서 검증 될 필요가있다. 24,26,27, 29,44 궁극적으로의 건설을위한 DFO-NCS 방법89 ZR-DFO - 표지 항체 radioimmunoconjugates의 합성에 대해 매우 강력한 도구로 입증 임상 유용한 방사성 의약품의 다양한 생성하는데 사용될 수있는 잠재력을 가지고있다.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

저자가 공개하는 게 없다.

Acknowledgments

저자는 도움이 대화를 교수 토마스 라이너, Jacob 박사 호튼 박사 서지 Lyaschenko 감사합니다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
p-SCN-Bn-DFO Macrocyclics B-705 Store at -80 °C
[89Zr]Zr-oxalate Various, including Perkin-Elmer Caution: Radioactive material
PD-10 Desalting Columns GE Healthcare 17-0851-01  Store at room temperature
Amicon Ultra-4 Centrifugal Filter Units EMD Millipore UFC805024 Store at room temperature
Silica Gel Impregnated RadioTLC Paper Agilent Technologies SGI0001 Cut into strips 0.5 cm wide

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Wu, A. M. Antibodies and antimatter: The resurgence of immuno-PET. Journal of Nuclear Medicine. 50 (1), 2-5 (2009).
  2. Wu, A. M., Olafsen, T. Antibodies for molecular imaging of cancer. Cancer Journal. 14 (3), 191-197 (2008).
  3. Wu, A. M., Senter, P. D. Arming antibodies: prospects and challenges for immunoconjugates. Nature Biotechnology. 23 (9), 1137-1146 (2005).
  4. Zeglis, B. M., Lewis, J. S. A practical guide to the construction of radiometallated bioconjugates for positron emission tomography. Dalton Transactions. 40 (23), 6168-6195 (2011).
  5. Zalutsky, M. R., Lewis, J. S. Handbook of Radiopharmaceuticals. Welc, M. J., Redvanly, C. S. 24, Wiley. New York, NY. 685-714 (2003).
  6. Carrasquillo, J. A., et al. 124I-huA33 antibody PET of colorectal cancer. Journal of Nuclear Medicine. 52 (8), 1173-1180 (2011).
  7. Divgi, C. R., et al. Preoperative characterisation of clear-cell renal carcinoma using iodine-124-labelled antibody chimeric G250 (124I-cG250) and PET in patients with renal masses: a phase I trial. The Lancet Oncology. 8 (4), 304-310 (2007).
  8. Severin, G. W., Engle, J. W., Barnhart, T. E., Nickles, R. J. Zr-89 radiochemistry for positron emission tomography. Medicinal Chemistry. 7 (5), 389-394 (2012).
  9. Nayak, T. K., Brechbiel, M. W. Radioimmunoimaging with longer-lived positron-emitting radionuclides: potentials and challenges. Bioconjugate Chemistry. 20 (5), 825-841 (2009).
  10. Vugts, D. J., Van Dongen, G. 89Zr-labeled compounds for PET imaging guided personalized therapy. Drug Discovery Today. 8 (2), e53-e61 (2011).
  11. Dongen, G. A. M. S., Visser, G. W. M., de Hooge, M. N. L. ub-, de Vries, E. G., Perk, L. R. Immuno-PET: a navigator in monoclonal antibody development and applications. Oncologist. 12 (12), 1379-1389 (2007).
  12. Deri, M. A., Zeglis, B. M., Francesconi, L. C., Lewis, J. S. PET imaging with 89Zr: From radiochemistry to the clinic. Nuclear Medicine and Biology. 40 (1), 3-14 (2013).
  13. Holland, J. P., Williamson, M. J., Lewis, J. S. Unconventional nuclides for radiopharmaceuticals. Molecular Imaging. 9 (1), 1-20 (2010).
  14. Holland, J. P., Sheh, Y. C., Lewis, J. S. Standardized methods for the production of high specific-activity zirconium-89. Nuclear Medicine and Biology. 36 (7), 729-739 (2009).
  15. Meijs, W. E., et al. Production of highly pure no-carrier added 89Zr for the labelling of antibodies with a positron emitter. Applied Radiation and Isotopes. 45 (12), 1143-1147 (1994).
  16. Vugts, D. J., van Dongen, G. A. M. S. 89Zr-labeled compounds for PET imaging guided personalized therapy. Drug Discovery Today: Technologies. 8 (2-4), e53-e61 (2011).
  17. Severin, G. W., Engle, J. W., Barnhart, T. E., Nickles, R. J. 89Zr radiochemistry for positron emission tomography. Medicinal Chemistry. 11 (7), 389-394 (2011).
  18. Perk, L. R., et al. Quantitative PET imaging of Met-expressing human cancer xenografts with 89Zr-labelled monoclonal antibody DN30. European Journal of Nuclear Medicine and Molecular Imaging. 35 (10), 1857-1867 (2008).
  19. Knowles, S. M., et al. Quantitative immunoPET of prostate cancer xenografts with Zr-89- and I-124-labeled anti-PSCA A11 minibody. Journal of Nuclear Medicine. 55 (3), 452-459 (2014).
  20. Rizvi, S. F., et al. radiation dosimetry and scouting of 90Y-ibritumomab tiuxetan therapy in patients with relapsed B-cell non-Hodgkin's lymphoma using 89Zr-ibritumomab tiuxetan and PET. European Journal of Nuclear Medicine and Molecular Imaging. 39 (3), 512-520 (2012).
  21. Perk, L. R., et al. Preparation and evaluation of Zr-89-Zevalin for monitoring of Y-90-Zevalin biodistribution with positron emission tomography. European Journal of Nuclear Medicine and Molecular Imaging. 33 (11), 1337-1345 (2006).
  22. Vosjan, M., et al. Conjugation and radiolabeling of monoclonal antibodies with zirconium-89 for PET imaging using the bifunctional chelate p-isothiocyanatobenzyl-desferrioxamine. Nature Protocols. 5 (4), 739-743 (2010).
  23. Holland, J. P., et al. Zr-89-DFO-J591 for ImmunoPET of prostate-specific membrane antigen expression in vivo. Journal of Nuclear Medicine. 51 (8), 1293-1300 (2010).
  24. Deri, M. A., et al. Alternative chelator for (89)Zr-radiopharmaceuticals: Radiolabeling and evaluation of 3,4,3-(LI-1,2-HOPO). Journal of Medicinal Chemistry. 57 (11), 4849-4860 (2014).
  25. Abou, D. S., Ku, T., Smith-Jones, P. M. In vivo biodistribution and accumulation of 89Zr in mice. Nuclear Medicine and Biology. 38 (5), 675-681 (2011).
  26. Guerard, F., Lee, Y. S., Brechbiel, M. W. Rational design, synthesis, and evaluation of tetrahydroxaminc acid chelators for stable complexation of zirconium(IV). Chemistry: A European Journal. 20 (19), 5584-5591 (2014).
  27. Guerard, F., et al. Investigation of Zr(IV) and 89Zr(IV) complexation with hydroxamates: progress towards designing a better chelator than desferrioxamine B for immuno-PET imaging. Chemical Communications. 49 (10), 1002-1004 (2013).
  28. Zeglis, B. M., et al. Modular strategy for the construction of radiometalated antibodies for positron emission tomography based on inverse electron demand Diels-Alder click chemistry. Bioconjugate Chemistry. 22 (10), 2048-2059 (2011).
  29. Tinianow, J. N., et al. Site-specifically Zr-89-labeled monoclonal antibodies for ImmunoPET. Nuclear Medicine and Biology. 37 (3), 289-297 (2010).
  30. Holland, J. P., et al. Measuring the pharmacodynamic effects of a novel Hsp90 inhibitor on HER2/neu expression in mice using Zr-89-DFO-trastuzumab. PLoS ONE. 5 (1), (2010).
  31. Aerts, H., et al. Disparity between in vivo EGFR expression and Zr-89-labeled cetuximab uptake assessed with PET. Journal of Nuclear Medicine. 50 (1), 123-131 (2009).
  32. Nagengast, W. B., et al. Zr-89-Bevacizumab PET of early antiangiogenic tumor response to treatment with HSP90 inhibitor NVP-AUY922. Journal of Nuclear Medicine. 51 (5), 761-767 (2010).
  33. Nagengast, W. B., et al. In vivo VEGF imaging with radiolabeled bevacizumab in a human ovarian tumor xenograft. Journal of Nuclear Medicine. 48 (8), 1313-1319 (2007).
  34. Dijkers, E. C. F., et al. Development and characterization of clinical-grade Zr-89-trastuzumab for HER2/neu immunoPET imaging. Journal of Nuclear Medicine. 50 (6), 974-981 (2009).
  35. Ulmert, D., et al. Imaging androgen receptor signaling with a radiotracer targeting free prostate-specific antigen. Cancer Discovery. 2 (4), 320-327 (2012).
  36. Hong, H., et al. Positron emission tomography imaging of CD105 expression with 89Zr-Df-TRC105. European Journal of Nuclear Medicine and Molecular Imaging. 39 (1), 138-148 (2012).
  37. Dijkers, E. C., et al. Biodistribution of Zr-89-trastuzumab and PET omaging of HER2-positive lesions in patients with metastatic breast cancer. Clinical Pharmacolog., & Therapeutics. 87 (5), 586-592 (2012).
  38. Heneweer, C., Holland, J. P., Divilov, V., Carlin, S., Lewis, J. S. Magnitude of enhanced permeability and retention effect in tumors with different phenotypes: Zr-89-abumin as a model system. Journal of Nuclear Medicine. 52 (4), 625-633 (2011).
  39. Holland, J. P., et al. Annotating MYC status with 89Zr-transferrin imaging. Nature Medicine. 18 (10), 1586-1591 (2012).
  40. Jacobson, O., et al. MicroPET imaging of integrin avB3 expressing tumors using 89Zr-RGD peptides. Molecular Imaging and Biology. 13 (6), 1224-1233 (2011).
  41. Keliher, E. J., et al. 89Zr-labeled dextran nanoparticles allow in vivo macrophage imaging. Bioconjugate Chemistry. 22 (12), 2383-2389 (2011).
  42. Abou, D. S., et al. 89Zr-labeled paramagnetic octreotide-liposomes for PET-MR imaging of cancer. Pharmaceutical Research. 30 (3), 878-888 (2013).
  43. Miller, L., et al. Synthesis, characterization, and biodistribution of multiple 89Zr-labeled pore-expanded mesoporous silica nanoparticles for PET. Nanoscale. 6 (9), 4928-4935 (2014).
  44. Zeglis, B. M., et al. An enzyme-mediated methodology for the site-specific radiolabeling of antibodies based on catalyst-free click chemistry. Bioconjugate Chemistry. 24 (6), 1057-1067 (2013).
  45. Nanus, D. M., et al. Clinical use of monoclonal antibody HuJ591 therapy: targeting prostate specific membrane antigen. Journal of Urology. 170 (6 Pt 2), S84-S88 (2003).
  46. Joshi, R., Gangabhagirathi, R., Venu, S., Adhikari, S., Mukherjee, T. Antioxidant activity and free radical scavenging reactions of gentisic acid: in vitro and pulse radiolysis studies. Free Radical Research. 46 (1), 11-20 (2012).
  47. Saran, M., Bors, W. Radiation chemistry of physiological saline reinvestigated: evidence that chloride-derived intermediates play a key role in cytotoxicity. Radiation Research. 147 (1), 70-77 (1997).
  48. Machholz, E., Mulder, G., Ruiz, C., Corning, B. F., Prichett-Corning, K. R. Manual restraint and common compound administration routes in mice and rats. Journal of Visualized Experiments. (67), e2771 (2012).
  49. Collier, H., Warner, B. T., Skerry, R. Multiple toe-pinch method for testing analgesic drugs. British Journal of Pharmacology and Chemotherapeutics. 17, 28-40 (1961).
  50. Zanzonico, P. Positron emission tomography: a review of basic principles, scanner design and performance, and current systems. Seminars in Nuclear Medicine. 34 (2), 87-111 (2004).
  51. Anderson, C. J., et al. Copper-64-labeled antibodies for PET imaging. Journal of Nuclear Medicine. 33 (9), 1685-1691 (1992).
  52. Anderson, C. J., et al. Preparation, biodistribution and dosimetry of copper-64-labeled anti-colorectal carcinoma monoclonal antibody fragments 1A3-F(ab')2. Journal of Nuclear Medicine. 36 (5), 850-858 (1995).
  53. Lindmo, T., Boven, E., Cuttitta, F., Fedorko, J., Bunn, P. A. Determination of the immunoreactive fraction of radiolabeled monoclonal antibodies by linear extrapolation to binding at infinite antigen excess. Journal of Immunological Methods. 72 (1), 77-89 (1984).
  54. Lindmo, T., Bunn, P. A. Determination of the true immunoreactive fraction of monoclonal antibodies after radiolabeling. Methods in Enzymology. 121 (1), 678-691 (1986).
  55. Cohen, R., et al. Inert coupling of IRDye800CW to monoclonal antibodies for clinical optical imaging of tumor targets. European Journal of Nuclear Medicine and Molecular Imaging. 1 (1), 31-43 (2011).
  56. Ruggiero, A., et al. Targeting the Internal Epitope of Prostate-Specific Membrane Antigen with Zr-89-7E11 Immuno-PET. Journal of Nuclear Medicine. 52 (10), 1608-1615 (2011).
  57. Nayak, T. K., Garmestani, K., Milenic, D. E., Brechbiel, M. W. PET and MRI of Metastatic Peritoneal and Pulmonary Colorectal Cancer in Mice with Human Epidermal Growth Factor Receptor 1-Targeted Zr-89-Labeled Panitumumab. Journal of Nuclear Medicine. 53 (1), 113-120 (2012).

Tags

화학 이슈 (96) 양전자 방출 단층 촬영 항체 바이오 콘쥬 게이션,하는 면역 Desferrioxamine,
바이오 콘쥬 게이션과의 Radiosynthesis<sup&gt; 89</sup&gt; ZR-DFO 표지 항체
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Zeglis, B. M., Lewis, J. S. TheMore

Zeglis, B. M., Lewis, J. S. The Bioconjugation and Radiosynthesis of 89Zr-DFO-labeled Antibodies. J. Vis. Exp. (96), e52521, doi:10.3791/52521 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter