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Chemistry

O bioconjugação e radiossíntese de Published: February 12, 2015 doi: 10.3791/52521
Automatic Translation
1, 1
1Department of Radiology, Memorial Sloan Kettering Cancer Center

Abstract

A excepcional afinidade, especificidade e selectividade dos anticorpos torná-los vectores extraordinariamente atraentes para radiofármacos PET-alvo tumorais. Devido à sua multi-dia meia vida biológica, os anticorpos devem ser marcados com radionuclídeos emissores de positrões com deterioração física relativamente longas semi-vidas. Tradicionalmente, os isótopos emissores de positrões 124-I (t 1/2 = 4,18 d), 86 Y (t 1/2 = 14,7 h), e 64 Cu (t 1/2 = 12,7 h) foram utilizados para marcar os anticorpos de imagens de PET. Mais recentemente, no entanto, o campo tem testemunhado um aumento dramático na utilização do emissor de positrões radiometal 89 Zr em agentes de imagem baseados em anticorpos PET. 89 é um radioisótopo de Zr quase ideal para imagiologia por PET com imunoconjugados, uma vez que possui uma metade física -vida (T 1/2 = 78,4 h), que é compatível com a farmacocinética in vivo de anticorpos e emite um relativamente baixo enopósitrons rgy que produz imagens de alta resolução. Além disso, os anticorpos podem ser directamente marcado com 89 Zr utilizando o quelante de desferrioxamina derivado de sideróforos (DFO). Neste protocolo, o antigénio da membrana alvo J591 anticorpo específico da próstata irá ser usado como um sistema modelo para ilustrar (1) a bioconjugação do quelante bifuncional DFO-isotiocianato de um anticorpo, (2) o radioss�tese e purificação de um 89 ZR DFO-mAb radioimunoconjugado, e (3) a imagem in vivo de PET com 89 um de Zr-DFO-mAb radioimunoconjugado em um modelo murino de cancro.

Introduction

Devido à sua notável sensibilidade, afinidade e selectividade, os anticorpos têm sido considerados promissores vectores para a entrega de radioisótopos a células cancerosas. No entanto, a sua aplicação em tomografia por emissão de pósitrons (PET) tem sido dificultada pela falta de um radioisótopo emissor de positrões adequado para a sua rotulagem. 1-3 Uma das considerações mais importantes no projeto de radioimunoconjugados está combinando a decadência física meia- vida do radioisótopo para os farmacocinética in vivo do anticorpo. Mais especificamente, os anticorpos têm muitas vezes, de vários dias biológicos meia-vida relativamente longa e, portanto, devem ser rotulados com radioisótopos com meia-vida física comparáveis. Para aplicações de imagem PET, os anticorpos têm sido tradicionalmente radiolabeled com 64 Cu (t 1/2 = 12,7 horas), 86 Y (t 1/2 = 14,7 horas), ou 124 I (t 1/2 = 4,18 d). 4, 5 No entanto, cada um dosesses radioisótopos possui limitações significativas que dificultam a sua adequação para a imagem latente clínica. Enquanto radioimunoconjugados marcados com 86 Y e 64 Cu provaram promissora em investigações pré-clínicas, ambos os isótopos possuem meias-vidas físicas que são demasiado curto para ser eficaz para imagiologia em humanos. 124 I, em contraste, possui uma meia-vida física quase ideal para imagiologia com anticorpos, mas é caro e tem características de degradação que levam à sub-óptimos relativamente baixa resolução de imagens clínicas. Além disso, 124 radioimunoconjugados marcado-I podem estar sujeitos a desalogenação in vivo, um processo que pode diminuir índices de atividade tumoral-a-fundo. 6,7

O esforço para encontrar um radioisótopo emissor de pósitrons para suplantar 64 Cu, 86 Y, e 124 I em radioimunoconjugados tem alimentado a recente onda de pesquisa em 89 anticorpos Zr-marcados. 8-12 Tele razão para o advento de Zr 89 é bastante simples: o metal radioactivo possui propriedades físicas, químicas e quase ideal para o uso em diagnóstico PET radioimunoconjugados 13 89 Zr é produzido através da 89 Y (p, n) 89 Zr reacção num ciclotrão utilizando um. comercialmente disponível e de 100% natural abundante alvo Y 89. 14,15 O metal radioactivo tem um rendimento de 23% de positrões, decai com uma meia-vida de 78,4 horas, e emite positrões com a energia relativamente baixa de 395,5 keV (Figura 1). 13,16,17 É importante notar que 89 Zr também emite uma energia alta, 909 keV γ-raios com 99% de eficiência. Enquanto esta emissão não interfere activamente com as emitidas 511 fótons keV, requer consideração extra no que diz respeito ao transporte, manuseio, e dosimetria. Apesar dessa ressalva, estas características de degradação em última análise, significa que 89 Zr não só tem um h mais favorávelalf-vida para a imagem latente com anticorpos do que 86 Y e 64 Cu, mas também pode produzir imagens de alta resolução de 124 I, que emite pósitrons com energias superiores de 687 e 975 keV, bem como um número de fótons com energias dentro de 100-150 keV de os fotões criado-positrão 511 keV. 13 Além disso, 89 Zr também é mais seguro de manusear, menos caros de produzir, e residualizes nos tumores de forma mais eficaz do que a sua contrapartida com iodo radioactivo. 18,19 Uma limitação potencial de 89 Zr é que ela não possui um isotop�ogo terapêutico, por exemplo, 86 Y (PET) vs. 90 Y (terapia). Isso impede a construção de agentes de imagem quimicamente idênticos, substitutos que podem ser utilizados como batedores de dosimetria para os seus homólogos terapêuticas. Dito isso, as investigações sugerem que 89 anticorpos Zr-rotulados têm potencial como substitutos de imagem para 90 Y- e 177 imunocon Lu-marcados.20,21

De um ponto de vista químico, tal como um metal do Grupo IV, 89 Zr existe como um catião 4 em solução aquosa. Ion O Zr 4+ é altamente carregada, relativamente grande (raio efetivo = 0,84 Å), e pode ser classificado como um cátion "hard". Como tal, ele exibe uma preferência para os ligandos de rolamento até oito doadores de oxigénio, rígidos aniónicos. Facilmente o quelante mais comum usado em 89 radioimunoconjugados Zr-rotulados é desferrioxamine (DFO), um quelante acíclico derivados de siderophore tendo três grupos hidroxamato. O ligando de forma estável coordena o catião Zr 4+ rapidamente e de forma limpa à temperatura ambiente a níveis de pH biologicamente relevantes, e o complexo de Zr-DFO resultante permanece estável ao longo de vários dias em soro fisiológico, soro do sangue, e sangue total. 22 Estudos computacionais sugerem fortemente DFO que forma um complexo com hexacoordinate Zr 4+, em que o centro metálico está coordenado a três neutral e três dadores de oxigénio aniónicos do ligando, bem como dois ligandos de água exógenos (Figura 2). 23,24 O comportamento in vivo dos radioimunoconjugados empregando a conjugação de andaime 89 Zr-DFO tem sido geralmente excelente. No entanto, em alguns casos, a imagiologia e estudos de biodistribuição agudas revelaram níveis elevados de actividade nos ossos dos ratinhos injectados com 89 anticorpos marcados, Zr dados que sugerem que o osteophilic 89 Zr 4+ catião é libertado do quelante in vivo e, subsequentemente, mineraliza no osso. 25 Recentemente, uma série de investigações sobre o desenvolvimento de novos 89 Zr 4+ quelantes particularmente ligandos doadores de oxigénio, com oito têm aparecido na literatura. 24,26,27 No entanto, no presente, o DFO é o quelante mais amplamente empregado em 89 radioimunoconjugados Zr marcado por uma larga margem. Uma variedade de diferentesbioconjugação estratégias têm sido utilizadas para fixar o DFO aos anticorpos, incluindo clique química bioorthogonal, a reacção da tiol-reactivo DFO constrói com cisteínas em que o anticorpo, e a reacção de activado DFO-éster tendo constrói com lisinas do anticorpo. 4,28- 30 facilmente a estratégia mais comum, no entanto, tem sido a utilização de um derivado de isotiocianato de rolamento de DFO, o DFO-NCS (Figura 2). 22 Este quelante bifuncional disponível comercialmente de forma robusta e fiável, forma ligações covalentes estáveis ​​com as lisinas de tioureia da anticorpo (Figura 3).

Ao longo dos últimos anos, uma grande variedade de 89 radioimunoconjugados Zr-DFO-rotulados foram relatados na literatura. Investigações pré-clínicas têm sido especialmente abundante, com anticorpos que vão desde o mais conhecido cetuximab, bevacizumab, e trastuzumab para anticorpos mais esotéricas, como o de segmentação CD105 TRC105 e fPSA-targeting 5A10. 30-36 Mais recentemente, um pequeno número de ensaios clínicos de fase precoce utilizando 89 anticorpos Zr-DFO-rotulados têm surgido na literatura. Ensaios Especificamente, os grupos na Holanda publicaram que empregam 89 Zr-DFO-IACM U36, 89 Zr-DFO-ibritumomab tiuxetan, e 89 Zr-DFO-trastuzumab. 21,32,37 Além disso, uma série de outros estudos clínicos com 89 radioimunoconjugados Zr-marcadas estão em andamento, incluindo as investigações aqui no Memorial Sloan Kettering Cancer Center, usando o PSMA-alvo 89 Zr-DFO-J591 para geração de imagens de câncer de próstata e 89 Zr-DFO-trastuzumab-alvo HER2 para geração de imagens de câncer de mama. 23, 30 Além disso, enquanto que os anticorpos radiomarcados permanecem as mais comuns 89 Zr-radiofármacos marcados, o metal radioactivo tem sido cada vez mais utilizado com outros vectores, incluindo péptidos, proteínas e 38-43 nanomateriais.

A modularidade deste 89 Zr-DFO metodologia rotulagem é uma enorme vantagem. O repertório de anticorpos de segmentação de biomarcadores é cada vez maior, e o interesse em realizar em imagem PET vivo usando essas construções está crescendo em ritmo acelerado. Como resultado, acreditamos que o desenvolvimento de práticas mais padronizados e protocolos poderia beneficiar o campo. Um excelente protocolo experimental escrito para DFO-NCS conjugação e 89 Zr radiolabeling já foi publicada por Vosjan, et al. 22 Consideramos que a demonstração visual proporcionado por este trabalho poderia ajudar ainda mais os investigadores novos para estas técnicas. No protocolo a mão, o antigénio da membrana alvo J591 anticorpo específico da próstata irá ser usado como um sistema modelo para ilustrar (1) a bioconjugação do quelante bifuncional DFO-isotiocianato de um anticorpo, (2) o radioss�tese e a purificação do 89 Zr-DFO-mAb radioimunoconjugado,e (3) in vivo imagiologia de PET com 89 um de Zr-DFO-mAb radioimunoconjugado em um modelo murino de cancro. 23,44,45

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Protocol

Todas as experiências com animais in vivo descritos foram realizados de acordo com um protocolo aprovado e sob as diretrizes éticas do Memorial Sloan Kettering Cancer Center, Animal Care Institucional e Comitê de Uso (IACUC).

1. Conjugação de DFO-NCS J591

  1. Num tubo de microcentrífuga de 1,7 ml, preparar uma solução de 2-5 mg / ml de J591 em 1 ml de solução salina tamponada 1x com fosfato (pH 7,4) ou em tampão HEPES 0,5 M (pH 7,4).
  2. Dissolve-se o DFO-NCS em DMSO seco a uma concentração entre 5-10 mM (3,8-7,6 mg / ml). Sonicar ou vórtice a solução cuidadosamente, a fim de facilitar a dissolução completa.
  3. Ajustar o pH da solução para 8,8-9,0 J591 pela adição de pequenas alíquotas (<10 ul) de 0,1 M de Na 2 CO 3.
  4. Uma vez que a solução de anticorpo é o pH correcto, adicionar um volume da solução de DFO-NCS correspondente a 3-4 vezes o excesso molar do agente quelante bifuncional.
    1. Para exameplo, adicionar 4-5 mL de uma solução 10 mM (7,6 mg / ml) Solução de DFO-NCS (40,4 nmol DFO-NCS) a 1 mL de uma solução 2 mg / anticorpo J591 (13,3 nmol J591). A quantidade de DMSO na mistura final de reacção aquosa não deverá exceder 2% v / v.
  5. Incubar a reacção durante 30 min a 37 ° C num bloco de aquecimento a agitação a 350 rpm.
  6. Depois de 1 hora a 37 ° C, purificar o imunoconjugado resultante utilizando uma coluna de exclusão de tamanho descartável dessalinização pré-embalados com um peso molecular de 50.000 de corte usando tampão HEPES 0,5 M (pH 7,4) como o eluente. Este passo irá produzir uma solução do construto J591-DFO completado 2 ml.
  7. Medir a concentração da J591-DFO construir num espectrofotómetro de UV-Vis.
  8. Se uma concentração mais elevada da construção é desejado, concentra-se a solução J591-DFO usando uma unidade de filtração centrífuga com um peso molecular de 50.000 de corte.
  9. Guardar a solução do imunoconjugado J591-DFO concluída a -20 ° C no escuro.

2. Radiomarcação J591-DFO com 89 Zr

ATENÇÃO: Esta etapa do protocolo envolve a manipulação e manipulação de radioatividade. Antes de executar estas etapas ou realizar qualquer outro trabalho com pesquisadores de radioactividade deve consultar com Radiação Departamento de Segurança da sua instituição de origem. Devem ser tomadas todas as medidas possíveis para minimizar a exposição à radiação ionizante.

NOTA: No interesse do bom radioquímica nota de manutenção, a quantidade de radioactividade na amostra deverá ser medida utilizando um calibrador de dose e registrados antes e depois de Passos 2,2-2,13 no protocolo abaixo. Isso vai ajudar com a determinação exata da yields radioquímica e atividades específicas.

  1. Prepara-se uma solução de 0,5-2,0 mg de J591-DFO em 200 ul de tampão HEPES 0,5 M, pH 7,5.
  2. Pipetar um volume da <sup> 89 Zr 4+ solução estoque (normalmente fornecidos em 1,0 M de ácido oxálico) correspondente a 1,0-6,0 mCi (37-222 MBq) em 2 ml de um tubo de plástico de microcentrífuga com tampa de rosca. Ajuste o volume desta solução para um total de 300 l com ácido oxálico 1,0 M.
  3. Ajustar o pH da solução de 89 Zr 4+ para 6,8-7,5 usando 1,0 M de Na 2 CO 3. Começar pela adição de 250 ul de 1,0 M de Na 2 CO 3 a 89 Zr 4+ solução e subsequentemente adicionar menor (<10 ul) de alíquotas de base para se atingir o pH desejado.
  4. Adicionar a quantidade desejada de solução de pH ajustado 89 Zr 4+ à solução J591-DFO preparado no passo 2.1.
  5. Verifique o pH da mistura de reacção radiolabeling para garantir que ele esteja dentro do intervalo desejado de 6,8-7,5.
  6. Incubar a reacção de marcação radioactiva durante 60 min a RT num bloco de aquecimento a agitação a 350 rpm.
  7. Após 60 min de incubação, medir a radiolabeling rendimento da reacção usando rádio-TLC.
    1. Para este fim, manchar 1 uCi de a mistura de reacção sobre uma TLC de radiomarcação tira impregnada em sílica. Permitir que a alíquota para secar, executar o TLC utilizando um eluente de 50 mM de DTPA (pH 5,5) e a tira de análise de TLC utilizando um scanner de rádio-TLC. 89 Zr 4+ ligado ao construto J591-DFO aparece na origem (R f <0,1), enquanto que 89 livres Zr 4+ catiões serão quelado com DTPA e elui-se com a frente do solvente (Rf> 0,9).
    2. Calcula-se o rendimento da reacção de marcação radioactiva, integrando o radiocromatograma, dividindo a área sob a curva de Rf de 0,0-0,1 pela área total sob a curva, e multiplicando por 100.
  8. Se o rendimento de radiomarcação é suficiente (tipicamente uma actividade específica teórica de> 2 mCi / mg), temperar a reacção com 5 mL de DTPA 50 mM, pH 5,5.
  9. Purifica-se o imunoconjugado resultante using um tamanho descartável coluna pré-embalada com uma exclusão de dessalinização de 50.000 de peso molecular de corte usando um eluente de 0,9% ou soro fisiológico estéril com 5 mg / ml de ácido gentísico ou 0,25 M de acetato de sódio (pH 5,5) com 5 mg / ml de ácido gentisico . Este passo irá produzir uma solução de completado o radioimunoconjugado 89 Zr-DFO-J591 2 ml.
  10. Após a purificação, a verificar a pureza radioquímica do 89 Zr-DFO-J591 usando radio-TLC como descrito no passo 2.7.
  11. Calcula-se o rendimento global de radiomarcação da reacção dividindo-se a quantidade de actividade inicialmente adicionados à solução de anticorpo por a quantidade de radioactividade isolado purificado com o radioimunoconjugado 89 Zr-DFO-J591.
  12. Calcula-se a actividade específica final, dividindo a quantidade de actividade isolado purificado com a 89 Zr-DFO-J591 radioimunoconjugado pela massa inicial de DFO-J591 na reacção de marcação radioactiva.
  13. Se uma concentração mais elevada é desejada, concentrar the 89 solução de Zr-DFO-J591 usando uma unidade de filtração centrífuga com um peso molecular de 50.000 de corte.
    NOTA: O ácido gentisico utilizado no passo de purificação final é um rádio-protector utilizado para minimizar a degradação do anticorpo devido à radiólise 46 Enquanto o armazenamento do radioimunoconjugado 89 Zr-DFO-J591 durante até 48 horas a 4 ° C. é possível, não é recomendável. Se o radioimunoconjugado é para ser armazenada, usar 0,25 M de acetato de sódio (pH 5,5) com 5 mg / ml de ácido gentisico como o tampão de armazenamento, a fim de minimizar o risco de radiólise mediada por hipoclorito. 47

3. Imagem In Vivo de PET com 89 Zr-DFO-J591

CUIDADO: Como no Protocolo Secção 2, este passo do protocolo envolve o manuseamento e manipulação de radioactividade. Antes de executar estes passos pesquisadores deve consultar com Radiação Secretaria de Segurança de sua instituição de origem. Todos possibdevem ser tomadas medidas le minimizar a exposição a radiações ionizantes.

  1. Em camundongos nus atímicos masculinos, implante subcutâneo 5 x 10 células cancerosas da próstata 6 LNCaP e permitir que estes a crescer a um 100-150 mm 3 heterólogo (3-4 semanas após a inoculação). 44
  2. Dilui-se o radioimunoconjugado 89 Zr-DFO-J591 a uma concentração de 1,0 mCi / ml em 0,9% de solução salina estéril.
  3. Injectar 200 ul de solução a 89 Zr-DFO-J591 (200 uCi; 7,4 MBq). Na veia lateral da cauda dos ratinhos portadores do xenoenxerto 48
  4. No ponto de tempo de imagem desejada (por exemplo, 12, 24, 48, 72, 96, ou 120 horas pós-injecção), anestesiar a um rato com isoflurano a 2%: mistura de gás oxigénio.
  5. Posicione o mouse em cima da cama do pequeno scanner de PET animal, e manter a anestesia durante a varredura usando um isoflurano 1%: mistura de gás oxigênio. Antes de colocar o animal na mesa do scanner, verifique anestesia utilizando o método toe-pitada e applpomada oftálmica y aos olhos do mouse para evitar o ressecamento durante a anestesia. 49
  6. Adquirir os dados de PET para o mouse através de uma verificação estática com um mínimo de 40 milhões de eventos coincidentes, utilizando uma janela de energia de 350-700 keV e uma janela de tempo coincidência de 6 ns. 50
  7. Depois de concluir a aquisição da imagem, não deixe o mouse autônoma e não colocá-lo em uma gaiola com outros ratos até que recuperou a consciência.

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Representative Results

O primeiro passo deste protocolo a conjugação de DFO-NCS para o anticorpo é tipicamente muito robusto e fiável. Geralmente, a purificada, imunoconjugado modificado por quelante pode ser obtido em> 90% de rendimento, e utilizando 3 equivalentes molares de DFO-NCS inicial na reacção de conjugação vai proporcionar um graus de rotulagem do quelante de aproximadamente 1,0-1,5 DFO / mAb. Os 89 Zr radiomarca�o e etapas de purificação do processo são igualmente simples. Nas concentrações descritas no protocolo anterior, os rendimentos de marcação do> 80% e, assim, atividades específicas de> 2,0 mCi / mg são típicos após 60 min em temperatura ambiente. O cromatograma de rádio-CCF da mistura em bruto de radiomarcação provavelmente irá revelar algumas DTPA-bound 89 Zr 4+ que elui a frente de solvente (Figura 4A). No entanto, depois de se temperar a reacção com DTPA e purificando a 89 Zr-DFO-mAb construir através de cromatografia de exclusão de tamanho, a radiocpureza hemical do purificada, isolado 89 Zr-DFO-mAb conjugado deve ser> 95% (Figura 4B). No caso em que a pureza radioquímica do isolado 89 Zr-DFO-mAb conjugado é inferior a 95%, o procedimento de purificação deve ser repetido antes de se efectuar qualquer in vitro ou in vivo.

Passando para as experiências in vivo, no protocolo descrito acima, ratinhos nus atimicos rolamento, que expressam PSMA xenoenxertos de cancro da próstata LNCaP foi empregue para investigar o comportamento in vivo de 89 Zr-DFO-J591. Ambos biodistribuição aguda e experimentos com imagens de PET revelou que 89 Zr-DFO-J591 delineia claramente os xenotransplantes de câncer de próstata com excelente contraste de imagem e altas taxas de tumor-a-fundo de atividade (Figura 5). A captação do radioimunoconjugado no tumor é evidente tão cedo quanto 24 h (20,9% ± 5,6% ID / g), e a actividadeconcentração no tumor aumenta até um máximo de 57,5% ± 5,3% ID / g às 96 h pós-injecção. Como é típico para radioimunoconjugados, uma relativamente alta concentração de traçador está presente no sangue em pontos de tempo iniciais (9,1% ± 5,3% ID / g às 24 h), seguido por uma lenta diminuição da quantidade de radioactividade no sangue durante o curso do experimento. O tecido não-alvo com a maior concentração de actividade era o osso, que exibiu valores de absorção de cerca de 10% ID / g ao longo da experiência, presumivelmente como resultado da libertação in vivo do catião osteophilic 89 Zr 4+. Todos os outros órgãos, incluindo o coração, pulmão, fígado, baço, estômago, intestino grosso e delgado, rim, músculo e exibida concentrações relativamente baixas de actividade, muitas vezes abaixo de 5% ID / g. Como um controlo, um conjunto adicional de ratinhos foi injectado o co-injectados 300 ug não marcado DFO-J591, de modo a saturar o antigénio e, assim, ilustram bloqueio selectivo. Criti camente, o experimento de bloqueio reduzido absorção do radioimunoconjugado no tumor de 48,9% ± 9,3% ID / g a 23,5% ± 11,1% ID / g às 72 h pós-injecção, indicando claramente que 89 Zr-DFO-J591 direcciona selectivamente a sua antigénio.

Figura 1
Figura 1. (A) Um esquema de decadência simplificada e (B) algumas características marcantes de decaimento de 89 Zr 13,16,17 IT = transição isomérica.; EC = captura de elétrons. Modificado e reproduzido com permissão da Deri, et al. Medicina Nuclear e Biologia. 40, 3-14 (2013). Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 2. (A) A estrutura de DFO-NCS, com os átomos de oxigénio de coordenação de cor vermelha; (B) Uma estrutura DFT-derivado do complexo de coordenação de Zr-DFO. Modificado e reproduzido com permissão da Deri, et al. Journal of Medicinal Chemistry. 57, 4.849-4.860 (2014). Direitos de autor 2014 American Chemical Society. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3

Figura 3. Esquema do bioconjugação e de marcação de 89 Zr-DFO-J591.et = "_ blank"> Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4
Figura 4. Os cromatogramas representativos de rádio-TLC da mistura em bruto de radiomarcação (A) e o produto purificado (B) de 89 Zr-DFO-J591. Radio-TLCs foram executados em tiras de sílica usando um eluente de DTPA 50 mM, pH 5,0. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 5
Figura 5. coronal imagens de PET de 89 Zr-DFO-J591 (11,1-12,9 MBq [300-345 uCi] injectados através da veia da cauda em 200 uL de soro fisiológico estéril a 0,9%) em ratinhos nus atimicos com subcutânea, que expressam PSMAXenografts câncer de próstata LNCaP (setas brancas) entre 24 e 120 horas após a injecção. Modificado e reproduzido com permissão da Zeglis, et al. Bioconjugate Química. 24, 1057-1067 (2013). Direitos de autor 2013 American Chemical Society. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Discussion

Enquanto a construção, radioimunoconjugados radiolabeling e imagiologia de 89 Zr-DFO-labled geralmente é um procedimento bastante simples, é importante manter algumas considerações-chave em mente durante cada etapa do processo. Por exemplo, talvez a causa mais provável para preocupação durante o passo de conjugação do procedimento é a agregação do anticorpo durante a reacção de conjugação. Este problema é mais frequentemente um produto de mistura pobre da reacção de conjugação após a adição da solução de estoque DFO-NCS. 22 Quando isto acontece, a distribuição não-homogénea do DFO-NCS pode causar níveis excessivamente elevados de reacção local com o anticorpo, o que por sua vez pode levar à agregação. Este problema pode ser relativamente facilmente contornada pela adição da solução de estoque DFO-NCS em pequenas alíquotas (<5 ul), misturando cuidadosamente a mistura de reacção após a adição do DFO-NCS, e agitando a mistura de reacção sobre uma temperaturcontrolados por e shaker. Além disso, após a conjugação e purificação da construção DFO-mAb, é importante para determinar com precisão o número de DFO conjugado para cada mAb. A caracterização completa do número de quelatos DFO por anticorpo pode ser conseguida utilizando experiências de diluição isotópica radiométricos semelhantes às desempenhadas por Holland 14,23, et ai et al., Embora espectrometria de massa MALDI-TOF é uma alternativa viável. E Anderson,. , 30,51,52 Durante a etapa de marcação radioactiva, facilmente o problema mais comum é menor do que o esperado rendimentos radiomarca�o. Se inesperadamente baixos rendimentos ocorrer apesar assiduamente seguindo o protocolo acima, três estratégias diferentes de resolução de problemas estão disponíveis: (1) incubação da reacção a marcação radioactiva por longos períodos de tempo (por exemplo, 2-3 horas); (2) repetindo a reacção radiomarcação utilizando uma concentração mais elevada de anticorpo; ou (3) repetindo a reacção de conjugação DFO-NCS inicial usando um excesso molar mais elevado de the quelante bifuncional.

Enquanto a conjugação DFO-NCS é fácil e robusto, uma das suas fraquezas inegável é que não é específica do local: DFO-NCS faz ligações de tiouréia com lisinas disponíveis no anticorpo, independentemente da sua posição. Como resultado, é possível que os agentes quelantes podem tornar-se anexado a região de ligação ao antigénio do anticorpo, afectando assim adversamente a imunoreactividade do conjugado 89 Zr-DFO-rotulados. Portanto, um bom equilíbrio deve ser atingido na construção de 89 radioimunoconjugados Zr-rotulados: números mais elevados de quelantes por anticorpo facilitar as atividades de maior específicos, mas graus mais elevados de rotulagem também aumentar o risco de comprometer a immunoreactivity do construto. No final, o objetivo é simples: anexar tantos quelantes como necessários sem comprometer immunoreactivity. Após a obtenção do purificada radioimunoconjugado 89 Zr-DFO-mAb, é crítico para determinar o in vivo. Para este fim, recomenda-se utilizar os métodos in vitro publicadas por Lindmo et al. 53,54 Se a imunorreactividade da construção é mais baixa do que 80-90%, pode ser necessário para voltar à reacção de conjugação e anexar menos porções de DFO por anticorpo. Alternativamente, se a imunorreactividade do purificada 89 Zr-DFO-mAb é elevado (> 90%) e as actividades específicas mais elevado são desejados, pode ser possível fixar mais quelantes para o anticorpo sem diminuir a imunorreactividade.

Finalmente, o comportamento in vivo de um anticorpo 89 de Zr-DFO-rotulado é, claro, altamente dependente tanto a identidade do anticorpo e o modelo de tumor empregues. No sistema modelo aqui apresentado, o valor máximo de absorção em que o tumor atinge aproximadamente 60% ID / g; Entretanto, relatos na literatura para o máximo de tumor captação de valores variar de tão baixo quanto 15-20% ID / g a tão elevada quanto 80-90% ID / g 33,44,55-57 Da mesma forma, a quantidade de absorção em tecidos não-alvo -., em particular, o fígado e baço - pode variar muito, dependendo do sistema de ligação anticorpo / antigénio em estudo. A atividade específica do anticorpo 89 Zr-DFO marcado é uma consideração importante para os experimentos in vivo. Os valores da literatura para as actividades específicas de 89 Zr-DFO-mAb variam tipicamente entre 1-6 mCi / mg (37-222 MBq / mg). 8,10 Geralmente, as actividades específicas mais elevado são preferíveis, uma vez que diminui a probabilidade de o inadvertida saturação do antigénio (isto é, de auto-bloqueio). Isto torna-se especialmente verdade nos sistemas com níveis inferiores de expressão do antigénio. Independentemente do sistema de ligação anticorpo / antigénio, nenhuma investigação in vivo de um agente de imagiologia de 89 Zr-DFO-marcado é completa sem uma demonstração da selectividade. Isto pode ser conseguido por meio de experiências de bloqueamento utilizandograndes quantidades de biomoléculas não marcado ou o uso de uma linha de células que não expressam o antigénio em questão. No âmbito do processo aqui descrito, a primeira foi empregue, mas a selectividade de 89 Zr-DFO-J591 também foi demonstrada utilizando xenoenxertos de cancro da próstata PC3 PSMA-negativa. 23

É importante notar que, apesar das suas claras vantagens, esta metodologia sintética baseada-DFO-NCS não é perfeito. Como já discutimos, DFO não é um quelante ideal para 89 Zr 4+, e a natureza não-específica do local da reação de conjugação pode ser um pouco complicado. Para contornar esses problemas, os esforços emocionantes para desenvolver novos agentes quelantes para 89 Zr 4+ e metodologias radiomarca�o específicas do local estão em andamento, mas essas novas tecnologias ainda precisam ser otimizado e validado, tanto no laboratório e clínica. 24,26,27, 29,44 Finalmente, a metodologia DFO-NCS para a construção de89 Zr-DFO anticorpos marcados provou ser uma ferramenta poderosa para a síntese de radioimunoconjugados e tem o potencial de ser utilizado para criar uma grande variedade de radiofármacos clinicamente úteis.

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Disclosures

Os autores não têm nada a revelar.

Acknowledgments

Os autores agradecem ao Prof. Thomas Reiner, Dr. Jacob Houghton, e Dr. Serge Lyaschenko para achou conversas.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
p-SCN-Bn-DFO Macrocyclics B-705 Store at -80 °C
[89Zr]Zr-oxalate Various, including Perkin-Elmer Caution: Radioactive material
PD-10 Desalting Columns GE Healthcare 17-0851-01  Store at room temperature
Amicon Ultra-4 Centrifugal Filter Units EMD Millipore UFC805024 Store at room temperature
Silica Gel Impregnated RadioTLC Paper Agilent Technologies SGI0001 Cut into strips 0.5 cm wide

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Química Edição 96 Positron Emission Tomography Anticorpo bioconjugação Imunoconjugados Desferrioxamina,
O bioconjugação e radiossíntese de<sup&gt; 89</sup&gt; Anticorpos Zr-DFO-rotulados
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Zeglis, B. M., Lewis, J. S. The Bioconjugation and Radiosynthesis of 89Zr-DFO-labeled Antibodies. J. Vis. Exp. (96), e52521, doi:10.3791/52521 (2015).

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