Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Chemistry
Click here for the English version

Chemistry

Биоконъюгации и Radiosynthesis из Published: February 12, 2015 doi: 10.3791/52521
Automatic Translation
1, 1
1Department of Radiology, Memorial Sloan Kettering Cancer Center

Abstract

Исключительная близость, специфичность и селективность антител делает их чрезвычайно привлекательными векторы для опухолевых ориентированных ПЭТ радиофармпрепаратов. Из-за их многодневных биологического полураспада антитела должны быть помечены позитронных-излучающих радионуклидов с относительно длинными физической полураспада. Традиционно, позитрон-излучающих изотопов 124 (Т 1/2 = 4,18 г), 86 Y (т 1/2 = 14,7 ч) и 64 Cu (т 1/2 = 12,7 ч) были использованы для обозначения антитела по ПЭТ. Совсем недавно, однако, поле стало свидетелем резкого увеличения использования позитронно-эмиссионной радиоактивный 89 Zr в основе антител ПЭТ агентов визуализации. 89 Zr является почти идеальным радиоизотопные для ПЭТ с иммуноконъюгатов, так как обладает физической половину -Life (т 1/2 = 78,4 ч), который совместим с в естественных фармакокинетики антител и излучает относительно низкую енRGY позитронно, который производит изображения с высоким разрешением. Кроме того, антитела могут быть непосредственно помечены 89 Zr помощью сидерофора, полученных хелатообразующего агента десферриоксамин (ДФО). В этом протоколе, простата-специфический мембранный антиген ориентации J591 антитела будут использованы в качестве модельной системы для иллюстрации (1) биоконъюгации бифункционального хелатообразующего агента ДФО-изотиоцианат с антителом, (2) radiosynthesis и очистки 89 Zr- ДФО МАБ radioimmunoconjugate, и (3) естественных ПЭТ в с 89 Zr-ДФО МАБ radioimmunoconjugate в мышиной модели рака.

Introduction

Из-за их замечательной чувствительностью, близость, и селективности, антитела уже давно считаются перспективными векторы для доставки радиоизотопов для раковых клеток. Тем не менее, их применение в позитронно-эмиссионной томографии (ПЭТ) была затруднена из-за отсутствия подходящего позитронно-эмиссионной радиоактивного изотопа их маркировки. 1-3 Один из наиболее важных аспектов при проектировании radioimmunoconjugates является соответствие физического распада наполовину Жизнь радиоизотопа к виво фармакокинетики в антитела. Более конкретно, антитела часто имеют относительно длинные, многодневные биологический период полураспада и, следовательно, должны быть помечены радиоактивными изотопами с сопоставимыми физическими полураспада. Для приложений, ПЭТ, антитела традиционно радиоактивным 64 Cu (T 1/2 = 12,7 ч), 86 Y (T 1/2 = 14,7 ч), или 124 (Г 1/2 = 4,18 D). 4, 5 Однако каждый изЭти изотопы обладает значительными ограничениями, которые препятствуют их пригодности для клинической визуализации. В то время как radioimmunoconjugates с маркировкой 86 Y и 64 Cu доказали перспективным в доклинических исследованиях, как изотопы обладают физическими полураспада, которые являются слишком коротка, чтобы быть эффективным для визуализации в организме человека. 124 Я, напротив, имеет почти идеальную физическую полураспада изображений с антителами, но это дорого и имеет субоптимальные характеристики распада, которые приводят к относительно низким разрешением клинических изображений. Кроме того, 124 radioimmunoconjugates I-меченого может быть предметом Дегалогенирование в естественных условиях, процесс, который может привести к снижению опухоли к фону отношения активности. 6,7

Привод, чтобы найти позитронно-эмиссионной радиоактивного изотопа вытеснить 64 Cu, 86 Y и 124 я в radioimmunoconjugates вызвал недавний всплеск исследований по 89 Zr-меченых антител. 8-12 Tон причиной появления 89 Zr прост: радиоактивный обладает почти идеальной химические и физические свойства для использования в диагностических ПЭТ radioimmunoconjugates 13 89 Zr производится через 89 Y (P, N) 89 Zr реакции на циклотроне с использованием. коммерчески доступны и 100% естественно обильные 89 Y цель. 14,15 радиоактивный имеет позитронов выход 23%, распадается с периодом полураспада 78,4 ч и излучает позитроны с относительно низкой энергией 395,5 кэВ (рис 1). 13,16,17 Важно отметить, что 89 Zr и излучает высокую энергию, 909 кэВ γ-луча с эффективностью 99%. В то время как это излучение не мешает энергично испускаемых 511 кэВ фотонов, это требует дополнительных рассмотрение в связи с транспортировки, погрузки и дозиметрии. Несмотря на это предостережение, эти характеристики распада, в конечном счете означает, что 89 Zr не только имеет более благоприятный часУкороченный жизнь для работы с изображениями с антителами, чем 86 Y и 64 Cu, но также может производить изображения более высокого разрешения, чем 124 I, который испускает позитроны с более высокими энергиями 687 и 975 кэВ, а также числа фотонов с энергиями в 100-150 кэВ на 511 кэВ позитрон-создано фотоны. 13 Кроме того, 89 Zr также более безопасным в обращении, дешевле в производстве, и в residualizes опухолей более эффективно, чем его аналог радиоактивного йода. 18,19 Одним из потенциальных ограничений на 89 Zr является то, что он не имеет Терапевтический изотополога, например, 86 Y (ПЭТ) по сравнению с 90 Y (терапия). Это исключает строительство химически идентичных суррогатных средств визуализации, которые могут быть использованы в качестве дозиметрических разведчиков для своих терапевтических аналогов. Это сказало, исследования показывают, что 89 Zr-меченые антитела имеют потенциал в качестве изображений суррогатов 90 Y- и 177 Lu-меченых иммуноконъюгатов.20,21

С химической точки зрения, в качестве металла группы IV, 89 Zr существует в виде 4 катиона в водном растворе. Ион ZR 4+ весьма напряженной, относительно большой (вступает в силу ионный радиус = 0,84 Å), и может быть классифицирован как «жесткого» катиона. Таким образом, он обладает предпочтение лигандов, имеющих до восьми жестких, анионных доноров кислорода. Легко наиболее распространенным хелатор используется в 89 Zr-меченых radioimmunoconjugates является десферриоксамин (ДФО), сидерофор происхождения, ациклические хелатор подшипник три гидроксаматные группы. Лиганд стабильно координирует катионы Zr 4+ быстро и чисто при комнатной температуре в биологически соответствующих значениях рН, и полученную Zr-ДФО комплекс остается стабильным в течение нескольких дней в физиологическом растворе, сыворотке крови, и цельной крови. 22 Вычислительные исследования убедительно свидетельствуют что ДФО образует hexacoordinate комплекс с Zr 4+, в котором металл центр координируется с тремя NEUTRAL и три анионные доноры кислорода лиганда, а также два экзогенных лигандов воды (Рисунок 2). 23,24 поведение в естественных условиях radioimmunoconjugates, использующих сопряжения эшафот 89 Zr-ДФО в целом был превосходным. Тем не менее, в некоторых случаях, изображений и острые исследования показали, биораспределени повышенные уровни активности в кости мышей, которым вводили 89 Zr-меченых антител, данные, которые показывают, что osteophilic 89 Zr 4+ катион выходит из хелатообразующего агента в естественных условиях, а затем минерализуется в кости. 25 В последнее время ряд исследований в разработке новых 89 Zr 4+ энтеросорбенты, особенно лигандов с восемью кислородные доноры появились в литературе. 24,26,27 Тем не менее, в настоящее время, ДФО является наиболее широко используется хелатор в 89 Zr-меченых radioimmunoconjugates с большим отрывом. Множество различныхСтратегии биоконъюгации были использованы для присоединения к антителам ДФО, в том числе Биоортогональные реакции щелчком, реакцию тиол-реактивного ДФО строит с цистеинов в антителе, и реакцию активированного эфира несущих конструкций с ДФО лизина в антителе. 4,28- 30 Легко наиболее распространенная стратегия, однако, было использование изотиоцианатом несущей производной ДФО ДФО-NCS (Рисунок 2). 22 Это коммерчески доступны бифункциональное хелатор решительно и надежно образует устойчивые ковалентные тиомочевины связи с лизинов антитела (фиг.3).

За последние несколько лет, широкий спектр 89 Zr-ДФО-меченых radioimmunoconjugates были описаны в литературе. Доклинические исследования были особенно многочисленны, показывая антител, начиная от более известной цетуксимаб, бевацизумаб, и трастузумаб более эзотерических антитела, такие как CD105 таргетирования TRC105 и свободного ПСА таргетирования 5À10. 30-36 Совсем недавно, небольшое количество ранней фазе клинических испытаний с использованием 89 Zr-ДФО меченых антител появились в литературе. В частности, группы в Нидерландах опубликованных исследований, использующих 89 Zr-ДФО cmAb U36, 89 Zr-ДФО Ibritumomab Tiuxetan и 89 Zr-ДФО трастузумаб. 21,32,37 Кроме того, целый ряд других клинических испытаниях с 89 Zr меченные radioimmunoconjugates являются в настоящее время, в том числе исследований здесь, в Memorial Sloan Kettering онкологический центр с использованием ПСМА-таргетинга 89 ZR-ДФО J591 для работы с изображениями рака простаты и HER2-таргетинга 89 ZR-ДФО трастузумаб для визуализации рака молочной железы. 23, 30 Кроме того, в то время как радиоактивно меченные антитела остаются наиболее распространенные 89 Zr-меченых радиофармацевтических препаратов, радиоактивного металла также чаще используют с другими векторами, в том числе пептидов, белков и наноматериалов. 38-43

Модульность этого 89 Zr-ДФО методологии маркировка огромным активом. Репертуар биомаркеров таргетирования антител постоянно расширяется, и интерес в выполнении в естественных условиях ПЭТ с использованием этих конструкций растет быстрыми темпами. В результате, мы считаем, что развитие более стандартизированной практики и протоколов может принести пользу на поле. Отличные письменные экспериментальный протокол для ДФО NCS сопряжения и 89 Zr радиомечения уже были опубликованы Vosjan и др. 22 Мы считаем, что наглядная демонстрация, предусмотренных настоящим работы могли бы еще помочь следователям, новые для этих методов. В протоколе в стороны, простата-специфический мембранный антиген ориентации J591 антитела будут использованы в качестве модельной системы для иллюстрации (1) биоконъюгации бифункционального хелатообразующего агента ДФО-изотиоцианат с антителом, (2) radiosynthesis и очистка 89 Zr-ДФО МАБ radioimmunoconjugate,и (3) в естественных ПЭТ с 89 Zr-ДФО монАТ radioimmunoconjugate в мышиной модели рака. 23,44,45

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Все в естественных условиях экспериментов на животных, описанных проводились в соответствии с утвержденным протоколом и под этических принципов в Memorial Sloan Kettering онкологический центр Институциональные животных уходу и использованию комитета (IACUC).

1. Сопряжение ДФО-NCS для J591

  1. В 1,7 мл микроцентрифужных трубки, подготовить 2-5 мг / мл раствора J591 в 1 мл либо 1x фосфатно-солевом буфере (рН 7,4) или 0,5 М HEPES-буфера (рН 7,4).
  2. Растворить ДФО-NCS в сухом ДМСО в концентрации от 5-10 мм (3.8-7.6 мг / мл). Ультразвук или вихрь тщательно решение для того, чтобы облегчить полное растворение.
  3. Отрегулируйте рН J591 раствора 8,8-9,0 путем добавления небольших аликвот (<10 мкл) 0,1 М Na 2 CO 3.
  4. После того, как раствор антитела при правильном рН, добавить объем раствора ДФО-NCS, соответствующей 3-4-кратного молярного избытка бифункционального хелатообразующего агента.
    1. Для экзаменаPLE, добавить 4-5 мкл 10 мМ (7,6 мг / мл) раствора ДФО NCS (40,4 нмоль ДФО NCS) до 1 мл мл раствора 2 мг / J591 антител (13,3 нмоль J591). Количество ДМСО в конечной водной реакционной смеси не должна превышать 2% объем / объем.
  5. Инкубируют реакционную смесь в течение 30 мин при 37 ° С на мешалкой в ​​нагревательном блоке 350 оборотов в минуту.
  6. После 1 ч при 37 ° С, в результате очистки с помощью иммуноконъюгат предварительно упакованы одноразовые размер колонки исключение обессоливания с 50000 молекулярно-весовое отсечение с использованием 0,5 М HEPES-буфера (рН 7,4) в качестве элюента. Этот шаг будет давать 2 мл раствора заполненной J591-ДФО конструкции.
  7. Измерение концентрации J591-ДФО построить на UV-VIS спектрофотометра.
  8. Если более высокая концентрация конструкции желательно, концентрат раствор J591-ДФО с использованием центробежного блок фильтра с молекулярной массой 50000 отсечки.
  9. Хранить раствор заполненной J591-ДФО иммуноконъюгата при -20 ° С в темноте.

2. радиоактивной J591-ДФО с 89 Zr

ВНИМАНИЕ: Этот шаг протокола включает обработку и манипулирование радиоактивности. Перед выполнением этих действий или при выполнении любых других работ с радиоактивностью исследователей следует проконсультироваться с Департаментом радиационной безопасности их дома учреждения. Все возможные меры должны быть приняты для сведения к минимуму воздействия ионизирующего излучения.

ПРИМЕЧАНИЕ: В интересах надлежащего радиохимического ноте учета, количество радиоактивности в образце должна быть измерена с помощью дозы калибратор и зарегистрированы до и после этапов 2.2-2.13 в следующей протокола. Это поможет с точного определения радиохимических урожайности и конкретных мероприятий.

  1. Приготовьте раствор 0,5-2,0 мг J591-ДФО в 200 мкл 0,5 М HEPES буфере, рН 7,5.
  2. Внесите объем <SUP> 89 Zr 4+ раствор (обычно поставляется в 1,0 М щавелевой кислоты), соответствующий 1,0-6,0 мКи (37-222 МБк) в 2 мл пластиковый с завинчивающейся крышкой трубки микроцентрифужных. Регулировка громкости этого раствора в общем объеме 300 мкл с использованием 1,0 M щавелевую кислоту.
  3. Отрегулируйте рН 89 Zr 4+ решение для 6,8-7,5, используя 1,0 М Na 2 CO 3. Начало добавлением 250 мкл 1,0 М Na 2 CO 3 в растворе 4+ 89 Zr и затем добавить меньший (<10 мкл) аликвоты основания для достижения желаемого рН.
  4. Добавить требуемое количество 89 Zr 4+ рН раствора доводили до-раствора J591-ДФО, полученного на стадии 2.1.
  5. Проверьте рН реакционной смеси радиоактивной метки для того, чтобы она попадает в желаемом диапазоне 6,8-7,5.
  6. Инкубируйте реакции радиоактивной метки в течение 60 мин при комнатной температуре на перемешивающего нагревательного блока в 350 оборотов в минуту.
  7. После 60-минутной инкубации, измерить радiolabeling выход реакции с использованием радио-ТСХ.
    1. С этой целью определить 1 мкКи реакционной смеси радиоактивной метки на силикагеле ТСХ с пропиткой полосы. Разрешить аликвоту, чтобы высохнуть, запустить ТСХ, используя в качестве элюента 50 мМ DTPA (рН 5,5) и проанализировать TLC полосу с помощью радио-ТСХ сканера. 89 Zr 4+ связан с конструкцией J591-ДФО появится в начале координат (R F <0,1), в то время как свободные 89 Zr 4+ катионы будут в хелатной форме DTPA и элюируют фронта растворителя (R F> 0,9).
    2. Рассчитать радиоактивной метки выход реакции путем интегрирования radiochromatogram, разделив площадь под кривой от R F 0.0-0.1 от общей площади под кривой, и умножением на 100.
  8. Если выход радиоактивной достаточно (как правило, теоретическая удельная активность> 2 мКи / мг), погасить реакцию с 5 мкл 50 мМ DTPA, рН 5,5.
  9. Очищают полученный иммуноконъюгат USIнг предварительно упакованы одноразовые гель обессоливания колонки с 50000 молекулярно-весовое отсечение с использованием в качестве элюента либо 0,9% стерильного солевого раствора с 5 мг / мл гентизиновой кислоты или 0,25 М ацетата натрия (рН 5,5) с 5 мг / мл гентизиновой кислоты , Этот шаг будет давать 2 мл раствора заполненной 89 Zr-ДФО-J591 radioimmunoconjugate.
  10. После очистки, убедитесь, радиохимической чистоты 89 Zr-ДФО-J591 с помощью радио-ТСХ, как описано в шаге 2.7.
  11. Рассчитать общий выход радиоактивной метки реакции путем деления количества активности изначально добавляют к раствору антител на величину радиоактивности, изолированные с очищенной 89 Zr-ДФО-J591 radioimmunoconjugate.
  12. Рассчитать удельную активность окончательный путем деления количества активности изолированных с очищенной 89 Zr-ДФО-J591 radioimmunoconjugate от начальной массы ДФО-J591 в реакции радиоактивной метки.
  13. Если концентрация выше, желательно, концентрат йе 89 Zr-ДФО J591 решение с использованием центробежного фильтра с 50000 молекулярная масса отсечки.
    Примечание: гентизиновая кислота, используемая в конечной стадии очистки является радиотелефонной защитное использованы, чтобы свести к минимуму деградацию антитела вследствие радиолиза 46 В то время как хранение 89 Zr-ДФО-J591 radioimmunoconjugate на срок до 48 часов при 4 ° С. можно, это не рекомендуется. Если radioimmunoconjugate должен быть сохранен, использовать 0,25 М ацетата натрия (рН 5,5) с 5 мг / мл гентизиновой кислоты в качестве буфера для хранения для того, чтобы свести к минимуму риск гипохлорита-опосредованной радиолиза. 47

3. В Vivo ПЭТ с 89 Zr-ДФО-J591

ВНИМАНИЕ: Как и в разделе 2 протокола, этот шаг протокола включает обработку и манипулирование радиоактивности. Перед выполнением этих шагов исследователи должны консультироваться с Департаментом радиационной безопасности их дома учреждения. Все possibле шаги должны быть предприняты для минимизации воздействия ионизирующего излучения.

  1. У самцов бестимусных голых мышей подкожно имплантата 5 х 10 6 LNCaP клеток рака простаты и позволить им расти до 100-150 мм 3 ксенотрансплантате (через 3-4 недели после прививки). 44
  2. Развести 89 Zr-ДФО-J591 radioimmunoconjugate до концентрации 1,0 мКи / мл в 0,9% стерильного солевого раствора.
  3. Вводят 200 мкл 89 Zr-ДФО-J591 раствора (200 мкКи; 7,4 МБк). В боковую хвостовую вену ксенотрансплантатов мышей, несущих 48
  4. В момент времени желательно изображений (например, 12, 24, 48, 72, 96, или 120 ч после инъекции), обезболить мышь с 2% в ИФ: газовой смеси кислорода.
  5. Наведите на кровати маленькое животное ПЭТ сканера и поддержания анестезии во время сканирования с помощью 1% в ИФ: газовую смесь кислорода. Перед размещением животных на планшет сканера, убедитесь, анестезии по методу схождение шнура и Applу глазная мазь для глаз мыши, чтобы предотвратить высыхание во время анестезии. 49
  6. Приобретать данные ПЭТ для мыши с помощью статического сканирования с минимальной 40000000 совпадающих событий, используя окно энергии 350-700 кэВ и окно совпадение синхронизации из 6 нс. 50
  7. После завершения сделки по приобретению изображения, не оставляйте мышь без присмотра и не кладите его в клетку с другими мышами, пока он не пришел в сознание.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Первым шагом в этом протоколе сопряжения ДФО-NCS с антителом, как правило, довольно прочными и надежными. Как правило, очищенный, хелатообразующий агент, модифицированный иммуноконъюгат может быть получено с выходом> 90%, и с помощью 3 молярных эквивалентов ДФО-NCS в начальной реакции конъюгации даст степенями маркировки хелатообразующего агента приблизительно 1,0-1,5 ДФО / МКА. В 89 Zr радиоактивной и очистки шаги процедуры также являются прямым. В концентрациях, указанных в приведенном выше протоколе, радиоактивной выходов> 80% и, таким образом, конкретных мероприятий> 2,0 мКи / мг характерны через 60 мин при комнатной температуре. Радио-ТСХ хроматограмма сырого радиоактивной смеси, скорее всего, выявить некоторые DTPA с привязкой 89 Zr 4+, что элюирует в растворителе перед (рис 4а). Тем не менее, после того, как гашение реакции DTPA и очистки 89 Zr-ДФО-мАт построить с помощью гель-проникающей хроматографии, в radiochemical чистота очищенного изолированной 89 Zr-ДФО монАТ должна быть> 95% (рис 4В). В том случае, радиохимической чистоты выделенного 89-Zr-ДФО монАТ составляет менее 95%, то процедура очистки должен быть повторен перед выполнением любой ин витро или ин виво экспериментов.

Переходя к экспериментам в естественных условиях, в протоколе описано выше, бестимусных голых мышей, несущих ПСМА-Выражая LNCaP ксенотрансплантаты рака простаты были использованы для исследования в естественных условиях поведение 89 Zr-ДФО-J591. Как острый биораспределение и эксперименты ПЭТ показало, что 89 Zr-ДФО J591 четко разграничивает ксенотрансплантаты рака простаты с превосходной контрастностью изображения и высокой скорости передачи данных опухолей к фоновой активности (рисунок 5). Поглощение в radioimmunoconjugate в опухоли очевидно еще в 24 ч (20,9% ± 5,6% ИД / г), а также активностьконцентрация в опухолевых увеличивается до максимума 57,5% ± 5,3% ID / г через 96 часов после инъекции. Как типично для radioimmunoconjugates, относительно высокую концентрацию РФП присутствует в крови на ранних временных точках (9,1% ± 5,3% ИД / г при 24 ч), с последующим медленным снижением количества радиоактивности в крови в течение Ход эксперимента. Нецелевых тканей с высокой концентрацией активность кость, которая отображается поглощения фотохимических окислителей значения около 10% ID / г на протяжении всего эксперимента, по-видимому, в результате выпуска в естественных условиях в osteophilic катиона 89 Zr 4+. Все остальные органы, в том числе сердца, легких, печени, селезенки, желудка, толстого и тонкого кишечника, почек и мышц отображается относительно низкие концентрации активности, часто значительно ниже 5% ID / г. В качестве контроля, дополнительно когорты мышей вводили ко-инъекции 300 мкг немеченого ДФО-J591, чтобы насытить антиген и, таким образом проиллюстрировать селективное блокирование. Criti ски, эксперимент блокирование снижена поглощение в radioimmunoconjugate в опухоли от 48,9% ± 9,3% ИД / г до 23,5% ± 11,1% ID / г в 72 ч после инъекции, четко указывает, что 89-Zr-J591 ДФО селективно нацелен его антиген.

Рисунок 1
Рисунок 1. () Упрощенная схема распада и (B) некоторые характерные особенности распада 89 Zr 13,16,17 IT = изомерного перехода.; EC = захват электрона. Изменено и перепечатано с разрешения Дери и др. Ядерная медицина и биология. 40, 3-14 (2013). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой цифры.

Re 2 "SRC =" / файлы / ftp_upload / 52521 / 52521fig2highres.jpg "ширина =" 700px "/>
Рисунок 2. () структура ДФО-NCS с Координационным атомов кислорода окрашиваются красным; (В) ДПФ, полученных структура координационного комплекса Zr-ДФО. Изменено и перепечатано с разрешения Дери и др. Журнал медицинской химии. 57 4849-4860 (2014). Copyright 2014 Американского химического общества. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой цифры.

Рисунок 3

Рисунок 3. Схема биоконъюгации и радиомечения 89 Zr-ДФО-J591.ET = "_ пустое"> Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой цифры.

Рисунок 4
Рисунок 4. Типичные радио-ТСХ хроматограммы сырой радиоактивной метки смеси (А) и очищенного продукта (B) в 89 Zr-ДФО-J591. Радио-ТЛЦ проводили на диоксиде кремния полос с использованием в качестве элюента 50 мМ DTPA, рН 5,0. Пожалуйста, Нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой цифры.

Рисунок 5
Рисунок 5. корональной ПЭТ изображения 89 Zr-ДФО-J591 (11.1-12.9 МБк [300-345 мКи] вводят в хвостовую вену в 200 мкл 0,9% стерильного физиологического раствора) в бестимусных голых мышей, несущих подкожный, ПСМА-выраженияLNCaP рака простаты ксенотрансплантаты (белые стрелки) между 24 и 120 ч после инъекции. Изменено и перепечатано с разрешения Zeglis и др. Bioconjugate химия. 24, 1057-1067 (2013). Copyright 2013 Американского химического общества. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой цифры.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

В то время как строительство, радиоактивной и визуализация 89 Zr-ДФО labled radioimmunoconjugates, как правило, довольно простая процедура, важно, чтобы держать несколько ключевых соображений на каждом этапе процесса. Например, возможно, наиболее вероятной причиной для беспокойства во время сопряжения этапе процедуры агрегирования антитела в ходе реакции сопряжения. Эта проблема чаще всего продукт плохой перемешивания реакции конъюгации после добавления раствора ДФО-NCS. 22 Когда это происходит, неоднородное распределение ДФО-NCS может вызвать чрезмерно высокие уровни локальной реакции с антитела, которые могут, в свою очередь привести к агрегации. Эта проблема может быть относительно легко обойти путем добавления маточного раствора ДФО-NCS в небольших аликвот (<5 мкл), тщательно перемешивая реакционную смесь после добавления в ДФО-NCS и перемешивание реакционной смеси на темпере управлением шейкер. Кроме того, после конъюгации и очистки ДФО-мАт конструкции, важно, чтобы точно определить количество ДФО, конъюгированный с каждой мАт. Полная характеристика числа хелатов ДФО на антитело может быть достигнуто с помощью радиометрических изотопного разбавления эксперименты, подобные тем осуществляется Голландии и др., А Андерсона и др., Хотя и MALDI-TOF масс-спектрометрии является хорошей альтернативой. 14,23 , 30,51,52 На этапе радиоактивной, легко Самой распространенной проблемой является ниже, чем ожидалось, урожайность радиоактивной. Если неожиданно низкие урожаи произойти, несмотря усердно следуя вышеприведенной схемой, три различные стратегии по устранению неполадок доступны: (1) инкубирование реакцию радиоактивной течение более количество времени (например, 2-3 ч); (2) повторение реакции радиоактивной метки с использованием более высокую концентрацию антитела; или (3) повторение начального ДФО-NCS сопряжения реакции с использованием более высокую молярного избытка гое бифункциональное хелатор.

В то время как сопряжение ДФО-NCS является поверхностным и надежный, один из его несомненных слабых то, что это не сайт-специфической: ДФО-NCS образует тиомочевины связи с имеющимися лизина в антитела, независимо от их позиции. В результате, можно что хелатные может стать приложенной к антигенсвязывающего участка антител, тем самым отрицательно влияет на иммунореактивность в 89 Zr-ДФО-меченого конъюгата. Таким образом, тонкий баланс должен быть поражен в строительстве 89 Zr-меченых radioimmunoconjugates: Увеличение количества энтеросорбенты на антитело способствовать более конкретные мероприятия, но более высокие степени маркировки также увеличить риск компрометации иммунореактивности конструкции. В конце концов, цель проста: приложить столько энтеросорбенты, как необходимо, и без ущерба для иммунореактивности. После получения очищенного 89 Zr-ДФО МАБ radioimmunoconjugate, очень важно, чтобы определить, в естественных условиях. Для этого, мы рекомендуем использовать методы в пробирке, опубликованные Lindmo и др. 53,54 Если Иммунореактивность конструкции ниже, чем 80-90%, это может быть необходимо, чтобы вернуться в реакции конъюгации и добавить меньше фрагменты DFO за антитела. С другой стороны, если иммунореактивность очищенного 89-Zr-ДФО мАт высока (> 90%) и выше, специфические активности желательно, то можно прикрепить более хелатообразующих агентов с антителом без снижения иммунореактивности.

И, наконец, поведение в естественных условиях из 89 Zr-ДФО-меченым антителом, конечно, в значительной степени зависит как от личности антителом и модели опухоли, используемой. В модельной системе, представленной здесь, максимальное значение поглощения в опухоли достигает приблизительно 60% ID / г; Однако, сообщает в литературе для максимальной опухоли поглощения Values ​​варьироваться от низкой до 15-20% ID / г до 80-90% ID / г 33,44,55-57 Кроме того, количество поглощения в нецелевых тканей -., в частности, печени и селезенки - может варьироваться в широких пределах в зависимости от системы антитело / антиген изучается. Удельная активность 89 Zr-ДФО-меченым антителом является важным фактором для экспериментов в естественных условиях. Значения Литература для конкретных видов деятельности 89 Zr-ДФО-МАТ, как правило, в диапазоне от 1-6 мКи / мг (37-222 МБк / мг). 8,10 Обычно, чем выше конкретные мероприятия являются предпочтительными, так как они снижают вероятность случайного насыщение антигена (т.е. с собственной блокировки). Это становится особенно актуально в системах с низким уровнем экспрессии антигенов. Независимо от системы антитело / антиген, никакого расследования в естественных условиях из 89 Zr-ДФО-меченого агента для получения изображения не обходится без демонстрации селективности. Это может быть достигнуто с помощью блокирующих эксперименты с использованиембольшие количества немеченого биомолекулы или использования клеточной линии, которая не экспрессирует антиген под вопросом. В процедуре, описанной в данном документе, первый был использован, но селективность 89 Zr-ДФО-J591 также было продемонстрировано с помощью PSMA-отрицательных ксенотрансплантатов рака простаты PC3. 23

Важно отметить, что, несмотря на очевидные преимущества, эта ДФО-NCS основе синтетического методика не идеален. Как мы уже говорили, ДФО не является идеальным хелатор 89 Zr 4+, и не сайт-специфический характер реакции конъюгации может оказаться обременительным. Чтобы обойти эти проблемы, волнующие усилия по разработке новых энтеросорбенты для 89 Zr 4+ и методологии радиоактивной сайт-специфические В настоящее время ведутся, но эти новые технологии все еще ​​должны быть оптимизированы и проверены как в лаборатории и клинике. 24,26,27, 29,44 В конечном счете, методология ДФО-NCS для строительства89 Zr-ДФО меченые антитела оказался чрезвычайно мощным инструментом для синтеза radioimmunoconjugates и имеет потенциал, чтобы быть использованы для создания широкого спектра клинически полезных радиофармпрепаратов.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторы не имеют ничего раскрывать.

Acknowledgments

Авторы выражают благодарность профессору Томас Райнер, д-р Яков Houghton, и д-р Серж Лященко за полезные беседы.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
p-SCN-Bn-DFO Macrocyclics B-705 Store at -80 °C
[89Zr]Zr-oxalate Various, including Perkin-Elmer Caution: Radioactive material
PD-10 Desalting Columns GE Healthcare 17-0851-01  Store at room temperature
Amicon Ultra-4 Centrifugal Filter Units EMD Millipore UFC805024 Store at room temperature
Silica Gel Impregnated RadioTLC Paper Agilent Technologies SGI0001 Cut into strips 0.5 cm wide

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Wu, A. M. Antibodies and antimatter: The resurgence of immuno-PET. Journal of Nuclear Medicine. 50 (1), 2-5 (2009).
  2. Wu, A. M., Olafsen, T. Antibodies for molecular imaging of cancer. Cancer Journal. 14 (3), 191-197 (2008).
  3. Wu, A. M., Senter, P. D. Arming antibodies: prospects and challenges for immunoconjugates. Nature Biotechnology. 23 (9), 1137-1146 (2005).
  4. Zeglis, B. M., Lewis, J. S. A practical guide to the construction of radiometallated bioconjugates for positron emission tomography. Dalton Transactions. 40 (23), 6168-6195 (2011).
  5. Zalutsky, M. R., Lewis, J. S. Handbook of Radiopharmaceuticals. Welc, M. J., Redvanly, C. S. 24, Wiley. New York, NY. 685-714 (2003).
  6. Carrasquillo, J. A., et al. 124I-huA33 antibody PET of colorectal cancer. Journal of Nuclear Medicine. 52 (8), 1173-1180 (2011).
  7. Divgi, C. R., et al. Preoperative characterisation of clear-cell renal carcinoma using iodine-124-labelled antibody chimeric G250 (124I-cG250) and PET in patients with renal masses: a phase I trial. The Lancet Oncology. 8 (4), 304-310 (2007).
  8. Severin, G. W., Engle, J. W., Barnhart, T. E., Nickles, R. J. Zr-89 radiochemistry for positron emission tomography. Medicinal Chemistry. 7 (5), 389-394 (2012).
  9. Nayak, T. K., Brechbiel, M. W. Radioimmunoimaging with longer-lived positron-emitting radionuclides: potentials and challenges. Bioconjugate Chemistry. 20 (5), 825-841 (2009).
  10. Vugts, D. J., Van Dongen, G. 89Zr-labeled compounds for PET imaging guided personalized therapy. Drug Discovery Today. 8 (2), e53-e61 (2011).
  11. Dongen, G. A. M. S., Visser, G. W. M., de Hooge, M. N. L. ub-, de Vries, E. G., Perk, L. R. Immuno-PET: a navigator in monoclonal antibody development and applications. Oncologist. 12 (12), 1379-1389 (2007).
  12. Deri, M. A., Zeglis, B. M., Francesconi, L. C., Lewis, J. S. PET imaging with 89Zr: From radiochemistry to the clinic. Nuclear Medicine and Biology. 40 (1), 3-14 (2013).
  13. Holland, J. P., Williamson, M. J., Lewis, J. S. Unconventional nuclides for radiopharmaceuticals. Molecular Imaging. 9 (1), 1-20 (2010).
  14. Holland, J. P., Sheh, Y. C., Lewis, J. S. Standardized methods for the production of high specific-activity zirconium-89. Nuclear Medicine and Biology. 36 (7), 729-739 (2009).
  15. Meijs, W. E., et al. Production of highly pure no-carrier added 89Zr for the labelling of antibodies with a positron emitter. Applied Radiation and Isotopes. 45 (12), 1143-1147 (1994).
  16. Vugts, D. J., van Dongen, G. A. M. S. 89Zr-labeled compounds for PET imaging guided personalized therapy. Drug Discovery Today: Technologies. 8 (2-4), e53-e61 (2011).
  17. Severin, G. W., Engle, J. W., Barnhart, T. E., Nickles, R. J. 89Zr radiochemistry for positron emission tomography. Medicinal Chemistry. 11 (7), 389-394 (2011).
  18. Perk, L. R., et al. Quantitative PET imaging of Met-expressing human cancer xenografts with 89Zr-labelled monoclonal antibody DN30. European Journal of Nuclear Medicine and Molecular Imaging. 35 (10), 1857-1867 (2008).
  19. Knowles, S. M., et al. Quantitative immunoPET of prostate cancer xenografts with Zr-89- and I-124-labeled anti-PSCA A11 minibody. Journal of Nuclear Medicine. 55 (3), 452-459 (2014).
  20. Rizvi, S. F., et al. radiation dosimetry and scouting of 90Y-ibritumomab tiuxetan therapy in patients with relapsed B-cell non-Hodgkin's lymphoma using 89Zr-ibritumomab tiuxetan and PET. European Journal of Nuclear Medicine and Molecular Imaging. 39 (3), 512-520 (2012).
  21. Perk, L. R., et al. Preparation and evaluation of Zr-89-Zevalin for monitoring of Y-90-Zevalin biodistribution with positron emission tomography. European Journal of Nuclear Medicine and Molecular Imaging. 33 (11), 1337-1345 (2006).
  22. Vosjan, M., et al. Conjugation and radiolabeling of monoclonal antibodies with zirconium-89 for PET imaging using the bifunctional chelate p-isothiocyanatobenzyl-desferrioxamine. Nature Protocols. 5 (4), 739-743 (2010).
  23. Holland, J. P., et al. Zr-89-DFO-J591 for ImmunoPET of prostate-specific membrane antigen expression in vivo. Journal of Nuclear Medicine. 51 (8), 1293-1300 (2010).
  24. Deri, M. A., et al. Alternative chelator for (89)Zr-radiopharmaceuticals: Radiolabeling and evaluation of 3,4,3-(LI-1,2-HOPO). Journal of Medicinal Chemistry. 57 (11), 4849-4860 (2014).
  25. Abou, D. S., Ku, T., Smith-Jones, P. M. In vivo biodistribution and accumulation of 89Zr in mice. Nuclear Medicine and Biology. 38 (5), 675-681 (2011).
  26. Guerard, F., Lee, Y. S., Brechbiel, M. W. Rational design, synthesis, and evaluation of tetrahydroxaminc acid chelators for stable complexation of zirconium(IV). Chemistry: A European Journal. 20 (19), 5584-5591 (2014).
  27. Guerard, F., et al. Investigation of Zr(IV) and 89Zr(IV) complexation with hydroxamates: progress towards designing a better chelator than desferrioxamine B for immuno-PET imaging. Chemical Communications. 49 (10), 1002-1004 (2013).
  28. Zeglis, B. M., et al. Modular strategy for the construction of radiometalated antibodies for positron emission tomography based on inverse electron demand Diels-Alder click chemistry. Bioconjugate Chemistry. 22 (10), 2048-2059 (2011).
  29. Tinianow, J. N., et al. Site-specifically Zr-89-labeled monoclonal antibodies for ImmunoPET. Nuclear Medicine and Biology. 37 (3), 289-297 (2010).
  30. Holland, J. P., et al. Measuring the pharmacodynamic effects of a novel Hsp90 inhibitor on HER2/neu expression in mice using Zr-89-DFO-trastuzumab. PLoS ONE. 5 (1), (2010).
  31. Aerts, H., et al. Disparity between in vivo EGFR expression and Zr-89-labeled cetuximab uptake assessed with PET. Journal of Nuclear Medicine. 50 (1), 123-131 (2009).
  32. Nagengast, W. B., et al. Zr-89-Bevacizumab PET of early antiangiogenic tumor response to treatment with HSP90 inhibitor NVP-AUY922. Journal of Nuclear Medicine. 51 (5), 761-767 (2010).
  33. Nagengast, W. B., et al. In vivo VEGF imaging with radiolabeled bevacizumab in a human ovarian tumor xenograft. Journal of Nuclear Medicine. 48 (8), 1313-1319 (2007).
  34. Dijkers, E. C. F., et al. Development and characterization of clinical-grade Zr-89-trastuzumab for HER2/neu immunoPET imaging. Journal of Nuclear Medicine. 50 (6), 974-981 (2009).
  35. Ulmert, D., et al. Imaging androgen receptor signaling with a radiotracer targeting free prostate-specific antigen. Cancer Discovery. 2 (4), 320-327 (2012).
  36. Hong, H., et al. Positron emission tomography imaging of CD105 expression with 89Zr-Df-TRC105. European Journal of Nuclear Medicine and Molecular Imaging. 39 (1), 138-148 (2012).
  37. Dijkers, E. C., et al. Biodistribution of Zr-89-trastuzumab and PET omaging of HER2-positive lesions in patients with metastatic breast cancer. Clinical Pharmacolog., & Therapeutics. 87 (5), 586-592 (2012).
  38. Heneweer, C., Holland, J. P., Divilov, V., Carlin, S., Lewis, J. S. Magnitude of enhanced permeability and retention effect in tumors with different phenotypes: Zr-89-abumin as a model system. Journal of Nuclear Medicine. 52 (4), 625-633 (2011).
  39. Holland, J. P., et al. Annotating MYC status with 89Zr-transferrin imaging. Nature Medicine. 18 (10), 1586-1591 (2012).
  40. Jacobson, O., et al. MicroPET imaging of integrin avB3 expressing tumors using 89Zr-RGD peptides. Molecular Imaging and Biology. 13 (6), 1224-1233 (2011).
  41. Keliher, E. J., et al. 89Zr-labeled dextran nanoparticles allow in vivo macrophage imaging. Bioconjugate Chemistry. 22 (12), 2383-2389 (2011).
  42. Abou, D. S., et al. 89Zr-labeled paramagnetic octreotide-liposomes for PET-MR imaging of cancer. Pharmaceutical Research. 30 (3), 878-888 (2013).
  43. Miller, L., et al. Synthesis, characterization, and biodistribution of multiple 89Zr-labeled pore-expanded mesoporous silica nanoparticles for PET. Nanoscale. 6 (9), 4928-4935 (2014).
  44. Zeglis, B. M., et al. An enzyme-mediated methodology for the site-specific radiolabeling of antibodies based on catalyst-free click chemistry. Bioconjugate Chemistry. 24 (6), 1057-1067 (2013).
  45. Nanus, D. M., et al. Clinical use of monoclonal antibody HuJ591 therapy: targeting prostate specific membrane antigen. Journal of Urology. 170 (6 Pt 2), S84-S88 (2003).
  46. Joshi, R., Gangabhagirathi, R., Venu, S., Adhikari, S., Mukherjee, T. Antioxidant activity and free radical scavenging reactions of gentisic acid: in vitro and pulse radiolysis studies. Free Radical Research. 46 (1), 11-20 (2012).
  47. Saran, M., Bors, W. Radiation chemistry of physiological saline reinvestigated: evidence that chloride-derived intermediates play a key role in cytotoxicity. Radiation Research. 147 (1), 70-77 (1997).
  48. Machholz, E., Mulder, G., Ruiz, C., Corning, B. F., Prichett-Corning, K. R. Manual restraint and common compound administration routes in mice and rats. Journal of Visualized Experiments. (67), e2771 (2012).
  49. Collier, H., Warner, B. T., Skerry, R. Multiple toe-pinch method for testing analgesic drugs. British Journal of Pharmacology and Chemotherapeutics. 17, 28-40 (1961).
  50. Zanzonico, P. Positron emission tomography: a review of basic principles, scanner design and performance, and current systems. Seminars in Nuclear Medicine. 34 (2), 87-111 (2004).
  51. Anderson, C. J., et al. Copper-64-labeled antibodies for PET imaging. Journal of Nuclear Medicine. 33 (9), 1685-1691 (1992).
  52. Anderson, C. J., et al. Preparation, biodistribution and dosimetry of copper-64-labeled anti-colorectal carcinoma monoclonal antibody fragments 1A3-F(ab')2. Journal of Nuclear Medicine. 36 (5), 850-858 (1995).
  53. Lindmo, T., Boven, E., Cuttitta, F., Fedorko, J., Bunn, P. A. Determination of the immunoreactive fraction of radiolabeled monoclonal antibodies by linear extrapolation to binding at infinite antigen excess. Journal of Immunological Methods. 72 (1), 77-89 (1984).
  54. Lindmo, T., Bunn, P. A. Determination of the true immunoreactive fraction of monoclonal antibodies after radiolabeling. Methods in Enzymology. 121 (1), 678-691 (1986).
  55. Cohen, R., et al. Inert coupling of IRDye800CW to monoclonal antibodies for clinical optical imaging of tumor targets. European Journal of Nuclear Medicine and Molecular Imaging. 1 (1), 31-43 (2011).
  56. Ruggiero, A., et al. Targeting the Internal Epitope of Prostate-Specific Membrane Antigen with Zr-89-7E11 Immuno-PET. Journal of Nuclear Medicine. 52 (10), 1608-1615 (2011).
  57. Nayak, T. K., Garmestani, K., Milenic, D. E., Brechbiel, M. W. PET and MRI of Metastatic Peritoneal and Pulmonary Colorectal Cancer in Mice with Human Epidermal Growth Factor Receptor 1-Targeted Zr-89-Labeled Panitumumab. Journal of Nuclear Medicine. 53 (1), 113-120 (2012).

Tags

Химия выпуск 96 позитронно-эмиссионная томография антитела биоконъюгации Иммуноконъюгаты десферриоксамин,
Биоконъюгации и Radiosynthesis из<sup&gt; 89</sup&gt; Zr-ДФО меченых антител
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Zeglis, B. M., Lewis, J. S. The… More

Zeglis, B. M., Lewis, J. S. The Bioconjugation and Radiosynthesis of 89Zr-DFO-labeled Antibodies. J. Vis. Exp. (96), e52521, doi:10.3791/52521 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter