Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Chemistry
Click here for the English version

Chemistry

De bioconjugatie en radiosynthese van Published: February 12, 2015 doi: 10.3791/52521
Automatic Translation
1, 1
1Department of Radiology, Memorial Sloan Kettering Cancer Center

Abstract

De uitzonderlijke affiniteit, specificiteit en selectiviteit van antilichamen maken ze bijzonder aantrekkelijk vectoren voor tumor gerichte PET radiofarmaca. Door hun meerdaagse biologische halfwaardetijd, moet antilichamen met positron emitterende radionucliden met relatief lange fysieke verval halfwaardetijden worden gelabeld. Traditioneel, de positron emitterende isotopen 124 I (t 1/2 = 4,18 d), 86 Y (t 1/2 = 14,7 uur) en 64 Cu (t 1/2 = 12,7 uur) gebruikt om antilichamen te labelen PET beeldvorming. Meer recent is echter het veld is getuige een dramatische toename van het gebruik van de positron emitterende radiometaal 89 Zr in antilichamen gebaseerde PET beeldvorming. 89 Zr is een nagenoeg ideaal radioisotoop PET beeldvorming met immunoconjugaten, als het product heeft een fysische halveringstijd -leven (t 1/2 = 78,4 uur) die verenigbaar is met de in vivo farmacokinetiek van antilichamen en zendt een relatief lage energy positron dat hoge resolutie beelden produceert. Bovendien kunnen antilichamen ronduit worden gemerkt met 89 Zr behulp van de-siderofoor afgeleid chelator desferrioxamine (DFO). In dit protocol wordt het prostaatspecifiek membraan antigen gericht antilichaam J591 worden gebruikt als een modelsysteem illustreert (1) de bioconjugatie van de bifunctionele chelator DFO-isothiocyanaat met een antilichaam, (2) de radiosynthese en zuivering van 89 Zr- DFO-mAb radioimmunoconjugaat, en (3) In vivo PET beeldvorming met een 89 Zr-DFO-mAb radioimmunoconjugaat in een muismodel van kanker.

Introduction

Vanwege hun opmerkelijke gevoeligheid, affiniteit en selectiviteit zijn antilichamen lang beschouwd als veelbelovend vectoren voor de afgifte van radio-isotopen kankercellen. Echter hun toepassing in positron emissie tomografie (PET) beeldvorming belemmerd door het ontbreken van een geschikte positron emitterende radio-isotopen voor etikettering. 1-3 Eén van de belangrijkste overwegingen bij het ​​ontwerpen van radioimmunoconjugaten is matching de fysieke verval half- levensduur van de radio-isotoop voor de in vivo farmacokinetiek van het antilichaam. Meer specifiek antilichamen vaak relatief lange meerdaagse biologische halfwaardetijden en dienen derhalve met radioisotopen met vergelijkbare fysische halfwaardetijd worden gelabeld. Voor PET-imaging-toepassingen, hebben antilichamen oudsher radioactief gemerkt geweest met 64 Cu (t 1/2 = 12,7 uur), 86 Y (t 1/2 = 14,7 uur), of 124 I (t 1/2 = 4.18 d). 4, 5 Echter, elk vandeze radio-isotopen bezit belangrijke beperkingen die hun geschiktheid voor klinische beeldvorming belemmeren. Terwijl radioimmunoconjugaten gelabeld met 86 Y en 64 Cu veelbelovend preklinische onderzoeken hebben aangetoond, zowel isotopen bezitten de fysische halfwaardetijd te korte effectief voor beeldvorming bij de mens zijn. 124 I daarentegen een bijna ideale fysische halfwaardetijd beeldvorming met antilichamen, maar het is duur en heeft suboptimale verval eigenschappen die leiden tot relatief lage resolutie ziektebeelden. Bovendien kan 124-gemerkte radioimmunoconjugaten gelden dehalogenering in vivo, een proces dat tumor-tot-achtergrond activiteit verhoudingen kunnen verlagen. 6,7

De rit naar een positron emitterende radio-isotoop te verdringen 64 Cu, 86 Y vinden, en 124 ik in radioimmunoconjugaten heeft de recente stijging van onderzoek aangewakkerd op 89 Zr-gelabelde antilichamen. 8-12 THij reden voor de komst van 89 Zr is eenvoudig: het radiometaal bezit bijna ideaal chemische en fysische eigenschappen voor gebruik in diagnostische PET radioimmunoconjugaten 13 89 Zr wordt geproduceerd via de 89 Y (p, n) 89 Zr reactie op een cyclotron met een. commercieel verkrijgbaar en 100% natuurlijk voorkomende 89 Y doel. 14,15 De radiometaal een positron opbrengst van 23%, vervalt met een halfwaardetijd van 78,4 uur en zendt positronen met relatief lage energie van 395,5 keV (figuur 1). 13,16,17 Het is belangrijk op te merken dat 89 Zr geeft ook een hoge energie 909 keV γ-ray 99% rendement. Hoewel deze emissie niet energetisch bemoeien met de uitgezonden 511 keV fotonen, is het nodig extra aandacht met betrekking tot transport, handling, en dosimetrie. Ondanks dit voorbehoud kan bederf eigenschappen uiteindelijk dat 89 Zr niet alleen een gunstiger half-leven voor beeldvorming met antilichamen dan 86 Y en 64 Cu maar kunnen ook hogere resolutie beelden dan 124 I, die positronen uitzendt met hogere energieën van 687 en 975 keV en een aantal fotonen met energieën in 100-150 keV van de 511 keV-positron gemaakt fotonen. 13 Voorts, 89 Zr is ook veiliger te hanteren, minder duur om te produceren, en residualizes in tumoren effectiever dan de radioactieve tegenhanger. 18,19 Een mogelijke beperking van 89 Zr is dat het niet hoeft een therapeutisch isotopoloog, bijvoorbeeld 86 Y (PET) vs. 90 Y (therapie). Dit voorkomt de opbouw van chemisch identieke, surrogaat beeldvormende middelen die kunnen worden toegepast als dosimetrische scout hun therapeutische tegenhangers. Dat gezegd hebbende, onderzoeken suggereren dat 89 Zr-gelabelde antilichamen hebben potentieel als beeldvorming surrogaten voor 90 Y- en 177 Lu-gelabeld immuunconjugaten.20,21

Vanuit chemisch oogpunt, een groep IV metaal, 89 Zr bestaat als een 4 kation in waterige oplossing. De Zr 4+ ion is zeer geladen, relatief groot (effectieve ionenradius = 0,84 Å), en kan worden aangemerkt als een "harde" catie. Als zodanig vertoont een voorkeur voor liganden dragen maximaal acht harde, anionisch zuurstof donoren. Gemakkelijk de meest voorkomende chelator gebruikt in 89 Zr-gemerkte radioimmunoconjugaten is desferrioxamine (DFO), een siderophore afgeleide acyclische chelator dragende drie hydroxamaat groepen. De ligand stabiel coördineert de Zr 4+ kation snel en zuiver bij kamertemperatuur in biologisch relevante pH, en het verkregen Zr-DFO complex blijft stabiel in de loop van meerdere dagen in zoutoplossing, bloed serum, en volbloed. 22 Computational studies suggereren sterk dat DFO vormt een hexagecoördineerd complex met Zr 4+ waarbij het ​​metaalcentrum gecoördineerd om de drie neutral en drie anionische zuurstof donors van het ligand en twee exogene water liganden (Figuur 2). 23,24 De in vivo gedrag van radioimmunoconjugaten gebruik 89 Zr-DFO conjugatie scaffold is over het algemeen uitstekend. In sommige gevallen, beeldvorming en acute biodistributie studies hebben verhoogde activiteit in de botten van muizen geïnjecteerd met 89 Zr-gemerkte antilichamen, gegevens blijkt dat de osteophilic 89 Zr 4+ kation vrijkomt uit de chelator in vivo en vervolgens Hermineraliseert geopenbaard in het bot. 25 Onlangs is een aantal onderzoeken naar de ontwikkeling van nieuwe 89 Zr 4+ chelatoren bijzonder liganden met acht zuurstof donors zijn verschenen in de literatuur. 24,26,27 echter momenteel DFO is de meest toegepaste chelator in 89 Zr gelabeld radioimmunoconjugaten met een ruime marge. Een verscheidenheid van verschillendebioconjugatie strategieën zijn gebruikt om DFO hechten aan antilichamen, waaronder bioorthogonal click chemie, de reactie van thiol reactieve DFO constructen met cysteïnen in het antilichaam en de reactie van geactiveerde ester dragende DFO constructen met lysinen in het antilichaam. 4,28- 30 Gemakkelijk de meest algemene strategie, echter is het gebruik van een isothiocyanaat dragende derivaat van DFO DFO-NCS (figuur 2). 22 Deze handel verkrijgbaar bifunctionele chelator robuust en betrouwbaar vormt stabiele, covalente bindingen thioureum met de lysinen van de antilichaam (Figuur 3).

De afgelopen jaren zijn diverse 89 Zr-DFO-gelabelde radioimmunoconjugaten gerapporteerd in de literatuur. Preklinische onderzoeken bijzonder overvloedig zijn, die antilichamen variëren van de meer bekende cetuximab, bevacizumab, en trastuzumab meer esoterische antilichamen zoals T-CD105 targetingRC105 en fPSA-targeting 5A10. 30-36 Meer recent, een klein aantal van de vroege fase van klinisch onderzoek met 89 Zr-DFO-gelabelde antilichamen naar voren zijn gekomen in de literatuur. Concreet groepen in Nederland hebben gepubliceerde studies in dienst 89 Zr-DFO-cmAb U36, 89 Zr-DFO-ibritumomabtiuxetan, en 89 Zr-DFO-trastuzumab. 21,32,37 Daarnaast is er een reeks andere klinische studies met 89 Zr-gelabelde radioimmunoconjugaten zijn momenteel aan de gang, met inbegrip van onderzoek hier in het Memorial Sloan Kettering Cancer Center met behulp van het PSMA-targeting 89 Zr-DFO-J591 voor prostaatkanker beeldvorming en de HER2-targeting 89 Zr-DFO-trastuzumab voor borstkanker beeldvorming. 23, 30 Bovendien, terwijl radiogelabelde antilichamen blijven de meest voorkomende 89 Zr-gemerkte radiofarmaceutica, het radiometaal ook steeds meer gebruikt met andere vectoren, zoals peptiden, proteïnen en nanomaterialen. 38-43

De modulariteit van deze 89 Zr-DFO etikettering methodiek is een enorme aanwinst. Het repertoire van-biomarker targeting antilichamen is steeds groeiende, en de belangstelling voor het uitvoeren van in vivo PET beeldvorming met deze constructen wint steeds meer terrein. Hierdoor wij dat de ontwikkeling van gestandaardiseerde werkwijzen en protocollen het veld kunnen profiteren. Een uitstekende schriftelijke experimentele protocol voor DFO-NCS vervoeging en 89 Zr radiomerking is al gepubliceerd door Vosjan, et al. 22 We hebben het gevoel dat de visuele demonstratie die door dit werk verder zou kunnen helpen onderzoekers nieuw voor deze technieken. In het protocol bij de hand, zal het prostaatspecifiek membraan antigen gericht antilichaam J591 worden gebruikt als een modelsysteem illustreert (1) de bioconjugatie van de bifunctionele chelator DFO-isothiocyanaat met een antilichaam, (2) de radiosynthese en zuivering van de 89 Zr-DFO-mAb radioimmunoconjugaat,en (3) In vivo PET beeldvorming met 89 Zr-DFO-mAb radioimmunoconjugaat in een muismodel van kanker. 23,44,45

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle van de in vivo dierproeven beschreven werden uitgevoerd volgens een goedgekeurd protocol en onder de ethische richtlijnen van het Memorial Sloan Kettering Cancer Center Institutional Animal Care en gebruik Comite (IACUC).

1. Vervoeging van DFO-NCS naar J591

  1. In een 1,7 ml microcentrifugebuis bereiden 2-5 mg / ml oplossing van J591 in 1 ml van ofwel 1x fosfaat gebufferde zoutoplossing (pH 7,4) of 0,5 M HEPES buffer (pH 7,4).
  2. Los DFO-NCS in droog DMSO bij een concentratie van 5-10 mM (3,8-7,6 mg / ml). Ultrasone trillingen of vortex de oplossing grondig met het oog op een volledige oplossing te vergemakkelijken.
  3. Stel de pH van de J591 oplossing 8,8-9,0 door toevoeging van kleine hoeveelheden (<10 pi) 0,1 M Na 2 CO 3.
  4. Zodra het antilichaam oplossing de juiste pH, voeg een volume van DFO-NCS die overeenkomt met een 3-4-voudige molaire overmaat van de bifunctionele chelator.
    1. Voor examenple, voeg 4-5 ul van 10 mM (7,6 mg / ml) DFO-NCS-oplossing (40,4 nmol DFO-NCS) 1 ml van een 2 mg / ml J591 antilichaam oplossing (13,3 nmol J591). De hoeveelheid van DMSO in het uiteindelijke waterige reactiemengsel niet meer dan 2% v / v.
  5. Incubeer het reactiemengsel gedurende 30 minuten bij 37 ° C op een verwarmingsblok roeren bij 350 rpm.
  6. Na 1 uur bij 37 ° C, zuivert het resulterende immunoconjugaat met voorverpakte disposable size exclusion ontzoutingskolom met een 50.000 molecuulgewicht cut-off toepassing van 0,5 M HEPES buffer (pH 7,4) als elutiemiddel. Deze stap zal een 2 ml oplossing van het voltooide J591-DFO constructie opleveren.
  7. Meet de concentratie van de J591-DFO construct op een UV-Vis spectrofotometer.
  8. Als een hogere concentratie van het construct gewenst, concentreren de J591-DFO oplossing wordt met een centrifugale filtereenheid met een 50.000 molecuulgewicht cut-off.
  9. Bewaar de oplossing van de voltooide J591-DFO immunoconjugaat bij -20 ° C in het donker.

2. Radioactief J591-DFO met 89 Zr

WAARSCHUWING: Deze stap van het protocol omvat het hanteren en manipuleren van radioactiviteit. Voordat u deze stappen nemen of andere werkzaamheden met radioactiviteit onderzoekers moeten overleggen met Radiation Safety Department hun eigen instelling. Alle mogelijke maatregelen moeten worden genomen om de blootstelling aan ioniserende straling te minimaliseren.

NB: In het belang van een goede radiochemische noot-houden, moet de hoeveelheid radioactiviteit in het monster worden gemeten met behulp van een dosiskalibrator en vóór opgenomen en na Stappen 2,2-2,13 in onderstaand protocol. Dit zal helpen bij de nauwkeurige bepaling van de radiochemische opbrengst en specifieke activiteiten.

  1. Bereid een oplossing van 0,5-2,0 mg J591-DFO in 200 gl 0,5 M HEPES buffer, pH 7,5.
  2. Pipetteer een hoeveelheid van de <sup> 89 Zr 4+ stockoplossing (meestal geleverd in 1,0 M oxaalzuur) die overeenkomt met 1,0-6,0 mCi (37-222 MBq) in een 2 ml plastic schroefdop microcentrifugebuisje. Pas het volume van deze oplossing tot een totaal 300 ul met behulp van 1,0 M oxaalzuur.
  3. Stel de pH van de 89 Zr 4+ oplossing 6,8-7,5 met 1,0 M Na 2 CO 3. Begin met het toevoegen van 250 ui van 1,0 M Na 2 CO 3 tot 89 Zr 4+ oplossing en alsnog kleinere (<10 pi) aliquots van base om de gewenste pH te bereiken.
  4. Voeg de gewenste hoeveelheid pH-ingestelde 89 Zr 4+ oplossing van het J591-DFO bereid in stap 2.1.
  5. Controleer de pH van het radioactief reactiemengsel zodat deze binnen het gewenste bereik van 6,8-7,5 valt.
  6. Incubeer de radioactief reactiemengsel gedurende 60 minuten bij kamertemperatuur op een verwarmingsblok roeren bij 350 rpm.
  7. Na 60 min incubatie, het meten van het radiolabeling opbrengst van de reactie met radio-TLC.
    1. Hiertoe spot 1 uCi van het radioactief reactiemengsel op een silica geïmpregneerde TLC strip. Laat het monster te drogen, lopen de TLC met behulp van een eluens van 50 mM DTPA (pH 5,5) en het analyseren van de TLC strook met behulp van een radio-TLC scanner. 89 Zr 4+ gebonden aan de J591-DFO construct zal verschijnen op de oorsprong (V f <0,1), terwijl de gratis 89 Zr 4+ kationen worden gechelateerd door DTPA en elueren met het oplosmiddel voorzijde (R f> 0,9).
    2. Bereken de radiolabeling opbrengst van de reactie door integratie van de radiochromatogram, het gebied verdelen onder de curve van Rf 0,0-0,1 door het totale gebied onder de curve en met 100 te vermenigvuldigen.
  8. Als de radiolabeling rendement voldoende (typisch een theoretische specifieke activiteit van> 2 mCi / mg), Schrik de reactie af met 5 ui 50 mM DTPA, pH 5,5.
  9. Zuiveren het resulterende immunoconjugaat USING voorverpakte disposable size exclusion ontzoutingskolom met een 50.000 molecuulgewicht cut-off met een eluens van ofwel 0,9% steriele zoutoplossing met 5 mg / ml gentisinezuur of 0,25 M natriumacetaat (pH 5,5) met 5 mg / ml gentisinezuur . Deze stap zal een 2 ml oplossing van het voltooide 89 Zr-DFO-J591 radioimmunoconjugaat opleveren.
  10. Na zuivering, controleren de radiochemische zuiverheid van de 89 Zr-DFO-J591 middels radio-TLC zoals beschreven in stap 2.7.
  11. Bereken de totale radiolabeling opbrengst van de reactie van de hoeveelheid activiteit aanvankelijk de antilichaamoplossing toegevoegd door de hoeveelheid radioactiviteit die met het gezuiverde 89 Zr-DFO-J591 radioimmunoconjugaat delen.
  12. Bereken de uiteindelijke specifieke activiteit van de hoeveelheid activiteit die met het gezuiverde 89 Zr-DFO-J591 radioimmunoconjugaat de oorspronkelijke massa van DFO-J591 in de radiolabeling reactie verdelen.
  13. Als een hogere concentratie gewenst, concentreren the 89 Zr-DFO-J591-oplossing met behulp van een centrifugaal filter unit met een 50.000 moleculair gewicht cut-off.
    OPMERKING: De gentisinezuur in de laatste zuiveringsstap een radio-beschermende gebruikt om de degradatie van het antilichaam die worden veroorzaakt door radiolyse 46 Hoewel het opslaan van de 89 Zr-DFO-J591 radioimmunoconjugaat gedurende 48 uur bij 4 ° C. mogelijk is, wordt het niet aanbevolen. Als de radioimmunoconjugaat wordt opgeslagen, gebruikt 0,25 M natriumacetaat (pH 5,5) met 5 mg / ml gentisinezuur als opslagbuffer om het risico van hypochloriet gemedieerde radiolyse minimaliseren. 47

3. In vivo PET beeldvorming met 89 Zr-DFO-J591

LET OP: Net als in Protocol paragraaf 2, deze stap van het protocol heeft betrekking op de behandeling en manipulatie van radioactiviteit. Voordat u deze stappen onderzoekers moeten overleggen met Radiation Safety Department hun eigen instelling. Alle possible maatregelen moeten worden genomen om de blootstelling aan ioniserende straling te minimaliseren.

  1. In mannelijke athymische naakt muizen, subcutaan implantaat 5 x 10 6 LNCaP prostaatkankercellen en laat deze door te groeien naar een 100-150 mm 3 xenogreffe (3-4 weken na inenting). 44
  2. Verdun 89 Zr-DFO-J591 radioimmunoconjugaat tot een concentratie van 1,0 mCi / ml in 0,9% steriele zoutoplossing.
  3. Injecteer 200 ui 89 Zr-DFO-J591 (200 uCi; 7,4 MBq). In de laterale staartader van de xenograft-dragende muizen 48
  4. Op het gewenste beeldvormende tijdstip (bijvoorbeeld 12, 24, 48, 72, 96 of 120 uur na injectie), verdoven de muis met een 2% isofluraan: zuurstof gasmengsel.
  5. Plaats de muis op het bed van het kleine dier PET-scanner en anesthesie onderhouden tijdens de scan met een 1% isofluraan: zuurstof gasmengsel. Voorafgaand aan het plaatsen van het dier op de scanner bed, controleren verdoving met behulp van de teen-snuifje methode en apply oogzalf om de ogen van de muis om te drogen tijdens de anesthesie te voorkomen. 49
  6. Het verwerven van de PET gegevens voor de muis via een statische scannen met een minimum van 40 miljoen samenvallende gebeurtenissen met een energie raam van 350-700 keV en toeval timingvenster 6 nsec. 50
  7. Na het voltooien van de overname van het beeld, hoeft de muis niet onbeheerd achter en plaats het niet in een kooi met andere muizen tot hij weer bij bewustzijn is.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

De eerste stap in dit protocol de vervoeging van DFO-NCS aan het antilichaam is meestal vrij robuust en betrouwbaar. In het algemeen kan de gezuiverde-chelator gemodificeerde immunoconjugaat verkregen in> 90% opbrengst en met 3 molaire equivalenten van DFO-NCS in de eerste conjugatiereactie een mate-van-labeling van de chelator van ongeveer 1.0-1.5 DFO verkregen / mAb. De 89 Zr radiomerking en zuivering stappen van de procedure zijn eveneens eenvoudig. Bij de concentraties die in het bovenstaande protocol, radiolabeling opbrengsten van> 80% en derhalve specifieke activiteiten van> 2,0 mCi / mg typisch na 60 minuten bij kamertemperatuur. De radio-TLC-chromatogram van de ruwe radiomerking mengsel zal waarschijnlijk onthullen een aantal DTPA-gebonden 89 Zr 4+ dat elueert bij het ​​oplosmiddel voorzijde (figuur 4A). Na afschrikken van het reactiemengsel met DTPA en zuiveren van de 89 Zr-DFO-mAb construct via gelpermeatiechromatografie, de radiocCHEMISCHE zuiverheid van de gezuiverde, geïsoleerde 89 Zr-DFO-mAb conjugaat moet> 95% (figuur 4B). Indien de radiochemische zuiverheid van de geïsoleerde 89 Zr-DFO-mAb conjugaat minder dan 95%, moet de zuiveringsprocedure worden herhaald voor het uitvoeren van een in vitro of in vivo experimenten.

Verplaatsen naar de in vivo experimenten in het hierboven beschreven protocol, athymische naakt muizen met PSMA-expressie, LNCaP prostaatkanker xenotransplantaten werden toegepast om de in vivo gedrag van 89 Zr-DFO-J591 onderzoeken. Acute biodistributie en PET imaging experimenten bleek dat 89 Zr-DFO-J591 schetst duidelijk de prostaatkanker xenotransplantaten met uitstekende beeldcontrast en hoge tumor-tot-achtergrond activiteit verhoudingen (Figuur 5). De opname van de radioimmunoconjugaat in de tumor merkbaar vanaf 24 uur (20,9% ± 5,6% ID / g), en de activiteitconcentratie in de tumor toeneemt tot een maximum van 57,5% ± 5,3% ID / g bij 96 uur na injectie. Zoals typisch voor radioimmunoconjugaten een relatief hoge concentratie van tracer in het bloed aanwezig is op vroege tijdstippen (9,1% ± 5,3% ID / g bij 24 uur), gevolgd door een langzame afname in de hoeveelheid radioactiviteit in het bloed via Tijdens het experiment. De niet-doelweefsel met de hoogste activiteit concentratie het bot, die opname weergegeven waarden ongeveer 10% ID / g gedurende het experiment, waarschijnlijk als gevolg van de in vivo afgifte van het osteophilic kation 89 Zr 4+. Alle andere organen waaronder hart, long, lever, milt, maag, dikke en dunne darm, nieren, spieren en weergegeven betrekkelijk lage concentraties activiteit vaak ruim onder 5% ID / g. Als controle werd een extra cohort van muizen werden geïnjecteerd gezamenlijk geïnjecteerd 300 ug ongelabeld DFO-J591 om het antigeen te verzadigen en derhalve illustreren selectieve blokkering. Criti tisch, het blokkeren experiment verlaagde opname van de radioimmunoconjugaat in de tumor van 48,9% ± 9,3% ID / g tot 23,5% ± 11,1% ID / g bij 72 uur na de injectie, waaruit duidelijk blijkt dat 89 Zr-DFO-J591 richt selectief zijn antigen.

Figuur 1
Figuur 1. (A) Een vereenvoudigde verval regeling en (B) een aantal saillante verval kenmerken van 89 Zr 13,16,17 IT = isomere overgang.; EC = electron capture. Gewijzigd en herdrukt met toestemming van Deri, et al. Nucleaire geneeskunde en biologie. 40, 3-14 (2013). Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

re 2 "src =" / files / ftp_upload / 52521 / 52521fig2highres.jpg "width =" 700px "/>
Figuur 2. (A) De structuur van DFO-NCS met de coördinerende zuurstofatomen rood gekleurd; (B) een DFT-afgeleide structuur van het Zr-DFO coördinatie complex. Gewijzigd en herdrukt met toestemming van Deri, et al. Journal of Medicinal Chemistry. 57, 4849-4860 (2014). Copyright 2014 American Chemical Society. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Figuur 3

Figuur 3. Schema van de bioconjugatie en radiomerking van 89 Zr-DFO-J591.et = "_ blank"> Klik hier om een ​​grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Figuur 4
Figuur 4. Representatieve radio-TLC chromatogrammen van de ruwe radioactief mengsel (A) en gezuiverd product (B) van 89 Zr-DFO-J591. Radio-TLC's werden op silica stroken met een eluens van 50 mM DTPA, pH 5,0. Zoom klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Figuur 5
Figuur 5. coronale PET-beelden van 89 Zr-DFO-J591 (11,1-12,9 MBq [300-345 gCi] geïnjecteerd via staartader in 200 ul 0,9% steriele zoutoplossing) in athymische naakt muizen die subcutane, PSMA-uitingLNCaP prostaatkanker xenotransplantaten (witte pijlen) tussen de 24 en 120 uur na de injectie. Modified en herdrukt met toestemming van Zeglis, et al. Bioconjugaatchemie. 24, 1057-1067 (2013). Copyright 2013 American Chemical Society. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Tijdens de constructie, radiolabeling en beeldvorming van 89 Zr-DFO-gelabeld radioimmunoconjugaten algemeen een tamelijk eenvoudige procedure, is het belangrijk om een aantal belangrijke overwegingen in gedachten tijdens elke stap van het proces houden. Bijvoorbeeld, misschien wel de meest waarschijnlijke bron van zorg tijdens de vervoeging stap van de procedure is de samenvoeging van het antilichaam tijdens de conjugatiereactie. Dit probleem is meestal een product van slechte menging van de conjugatie reactie na de toevoeging van DFO-NCS voorraadoplossing. 22 Wanneer dit gebeurt, de niet-homogene verdeling van DFO-NCS kunnen te hoge niveaus van plaatselijke reactie met het veroorzaken antilichaam, wat weer kan leiden tot aggregatie. Dit probleem kan relatief eenvoudig worden omzeild door toevoeging van het reactiemengsel DFO-NCS voorraadoplossing in kleine hoeveelheden (<5 ui), het reactiemengsel grondig te mengen na de toevoeging van het DFO-NCS, en roeren op een temperatuur-e gecontroleerde shaker. Bovendien, na conjugatie en zuivering van DFO-mAb construct, is het belangrijk om het aantal DFO geconjugeerd aan elk mAb precies te bepalen. De volledige karakterisering van het aantal DFO chelaten per antilichaam kan worden verkregen door radiometrische isotopenverdunning experimenten vergelijkbaar met die door Holland, et al. En Anderson, et al., Hoewel MALDI-TOF massaspectrometrie een levensvatbaar alternatief. 14,23 , 30,51,52 Tijdens de radiomerking stap, gemakkelijk de meest voorkomende probleem is een lager dan verwachte radioactief opbrengsten. Als onverwacht lage opbrengsten optreden, ondanks ijverig volgens het protocol dat bovenstaande drie verschillende strategieën voor probleemoplossing zijn beschikbaar: (1) het incuberen van het radioactief reactie voor langere bedragen van de tijd (bijvoorbeeld, 2-3 uur); (2) het herhalen van de radioactief reactie met een hogere concentratie van antilichaam; of (3) het herhalen van de eerste DFO-NCS conjugatiereactie met een hogere molaire overmaat the bifunctionele chelator.

Terwijl DFO-NCS conjugatie gemakkelijk en robuust, een van onbetwistbare tekortkomingen is dat het niet plaatsspecifieke: DFO-NCS vormt thioureum bindingen met de beschikbare lysines in het antilichaam ongeacht hun positie. Hierdoor is het mogelijk dat de chelatoren bijgevoegde kunnen worden voor het antigeen bindende gebied van het antilichaam, dat dit evenwel de immunoreactiviteit van de 89 Zr-DFO-gemerkt conjugaat. Daarom moet een goede balans worden gevonden in de constructie van 89 Zr-gemerkte radioimmunoconjugaten: hogere aantallen chelatoren per antilichaam vergemakkelijken hogere specifieke activiteiten, maar hogere graden van etikettering het risico van aantasting van de immunoreactiviteit van het construct te verhogen ook. Op het einde, het doel is simpel: hechten zoveel chelators als nodig is, zonder afbreuk te doen aan immunologische. Na het behalen van het gezuiverde 89 Zr-DFO-mAb radioimmunoconjugaat, is het essentieel om het bepalen in vivo experimenten. Daarom raden wij de in vitro werkwijzen gepubliceerd door Lindmo et al. 53,54 Wanneer de immunoreactiviteit van het construct lager dan 80-90%, kan het nodig zijn om naar de conjugatiereactie en voeg minder DFO resten per antilichaam. Alternatief, indien de immunoreactiviteit van het gezuiverde 89 Zr-DFO-mAb hoog (> 90%) en hogere specifieke activiteiten worden gewenst, kan het mogelijk zijn meer chelatoren hechten aan het antilichaam zonder vermindering van immunoreactiviteit.

Tenslotte, de in vivo gedrag van een 89 Zr-DFO-gemerkt antilichaam is natuurlijk sterk afhankelijk van zowel de identiteit van het antilichaam en het tumormodel toegepast. In het modelsysteem hier gepresenteerde de maximale waarde opname in de tumor bereikt ongeveer 60% ID / g; echter, rapporteert in de literatuur maximale tumoropname vaarden variëren van zo laag als 15-20% ID / g tot wel 80-90% ID / g 33,44,55-57 Ook de hoeveelheid opname in niet-doelweefsels. - met name de lever en milt - kan sterk variëren afhankelijk van het antilichaam / antigen onderzochte systeem. De specifieke activiteit van 89 Zr-DFO-gemerkte antilichaam een belangrijke overweging voor in vivo experimenten. Literatuurwaarden voor de specifieke activiteiten van 89 Zr-DFO-mAbs doorgaans variëren 1-6 mCi / mg (37-222 mBq / mg). 8,10 algemeen hogere specifieke activiteiten voorkeur, omdat zij de waarschijnlijkheid van het onbedoeld verlagen verzadiging van het antigeen (dat wil zeggen, zelf-blocking). Dit wordt met name het geval bij systemen met lagere niveaus antigeenexpressie. Ongeacht het antilichaam / antigen systeem, geen in vivo onderzoek van een 89 Zr-DFO-gelabelde imaging-agent is niet compleet zonder een demonstratie van selectiviteit. Dit kan worden bereikt door blokkeren proeven metgrote hoeveelheden ongelabelde biologische molecule of het gebruik van een cellijn die geen expressie van het antigeen in kwestie. In de hierin beschreven werkwijze, werd de vroegere toegepast, maar de selectiviteit van 89 Zr-DFO-J591 is ook aangetoond met PSMA-negatieve PC3 prostaatkanker xenotransplantaten. 23

Het is belangrijk op te merken dat ondanks zijn duidelijke voordelen, dit DFO-NCS-gebaseerde synthetische methode is niet perfect. Zoals we hebben besproken, DFO is geen ideale chelator voor 89 Zr 4+, en de niet-plaats-specifieke aard van de vervoeging reactie kan lastig te bewijzen. Om deze problemen te omzeilen, spannende inspanningen om nieuwe chelators voor het ontwikkelen van 89 Zr 4+ en site-specific radiomerking methodieken zijn momenteel aan de gang, maar deze nieuwe technologieën moeten nog worden geoptimaliseerd en gevalideerd, zowel in het laboratorium en de kliniek. 24,26,27, 29,44 Uiteindelijk is het DFO-NCS methodologie voor de bouw van89 Zr-DFO-gemerkte antilichamen heeft bewezen een zeer krachtig hulpmiddel voor de synthese van radioimmunoconjugaten zijn en heeft het potentieel om te worden gebruikt om een breed scala van klinisch bruikbare radiofarmaca creëren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs hebben niets te onthullen.

Acknowledgments

De auteurs danken prof Thomas Reiner, Dr. Jacob Houghton, en Dr. Serge Lyaschenko voor behulpzaam gesprekken.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
p-SCN-Bn-DFO Macrocyclics B-705 Store at -80 °C
[89Zr]Zr-oxalate Various, including Perkin-Elmer Caution: Radioactive material
PD-10 Desalting Columns GE Healthcare 17-0851-01  Store at room temperature
Amicon Ultra-4 Centrifugal Filter Units EMD Millipore UFC805024 Store at room temperature
Silica Gel Impregnated RadioTLC Paper Agilent Technologies SGI0001 Cut into strips 0.5 cm wide

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Wu, A. M. Antibodies and antimatter: The resurgence of immuno-PET. Journal of Nuclear Medicine. 50 (1), 2-5 (2009).
  2. Wu, A. M., Olafsen, T. Antibodies for molecular imaging of cancer. Cancer Journal. 14 (3), 191-197 (2008).
  3. Wu, A. M., Senter, P. D. Arming antibodies: prospects and challenges for immunoconjugates. Nature Biotechnology. 23 (9), 1137-1146 (2005).
  4. Zeglis, B. M., Lewis, J. S. A practical guide to the construction of radiometallated bioconjugates for positron emission tomography. Dalton Transactions. 40 (23), 6168-6195 (2011).
  5. Zalutsky, M. R., Lewis, J. S. Handbook of Radiopharmaceuticals. Welc, M. J., Redvanly, C. S. 24, Wiley. New York, NY. 685-714 (2003).
  6. Carrasquillo, J. A., et al. 124I-huA33 antibody PET of colorectal cancer. Journal of Nuclear Medicine. 52 (8), 1173-1180 (2011).
  7. Divgi, C. R., et al. Preoperative characterisation of clear-cell renal carcinoma using iodine-124-labelled antibody chimeric G250 (124I-cG250) and PET in patients with renal masses: a phase I trial. The Lancet Oncology. 8 (4), 304-310 (2007).
  8. Severin, G. W., Engle, J. W., Barnhart, T. E., Nickles, R. J. Zr-89 radiochemistry for positron emission tomography. Medicinal Chemistry. 7 (5), 389-394 (2012).
  9. Nayak, T. K., Brechbiel, M. W. Radioimmunoimaging with longer-lived positron-emitting radionuclides: potentials and challenges. Bioconjugate Chemistry. 20 (5), 825-841 (2009).
  10. Vugts, D. J., Van Dongen, G. 89Zr-labeled compounds for PET imaging guided personalized therapy. Drug Discovery Today. 8 (2), e53-e61 (2011).
  11. Dongen, G. A. M. S., Visser, G. W. M., de Hooge, M. N. L. ub-, de Vries, E. G., Perk, L. R. Immuno-PET: a navigator in monoclonal antibody development and applications. Oncologist. 12 (12), 1379-1389 (2007).
  12. Deri, M. A., Zeglis, B. M., Francesconi, L. C., Lewis, J. S. PET imaging with 89Zr: From radiochemistry to the clinic. Nuclear Medicine and Biology. 40 (1), 3-14 (2013).
  13. Holland, J. P., Williamson, M. J., Lewis, J. S. Unconventional nuclides for radiopharmaceuticals. Molecular Imaging. 9 (1), 1-20 (2010).
  14. Holland, J. P., Sheh, Y. C., Lewis, J. S. Standardized methods for the production of high specific-activity zirconium-89. Nuclear Medicine and Biology. 36 (7), 729-739 (2009).
  15. Meijs, W. E., et al. Production of highly pure no-carrier added 89Zr for the labelling of antibodies with a positron emitter. Applied Radiation and Isotopes. 45 (12), 1143-1147 (1994).
  16. Vugts, D. J., van Dongen, G. A. M. S. 89Zr-labeled compounds for PET imaging guided personalized therapy. Drug Discovery Today: Technologies. 8 (2-4), e53-e61 (2011).
  17. Severin, G. W., Engle, J. W., Barnhart, T. E., Nickles, R. J. 89Zr radiochemistry for positron emission tomography. Medicinal Chemistry. 11 (7), 389-394 (2011).
  18. Perk, L. R., et al. Quantitative PET imaging of Met-expressing human cancer xenografts with 89Zr-labelled monoclonal antibody DN30. European Journal of Nuclear Medicine and Molecular Imaging. 35 (10), 1857-1867 (2008).
  19. Knowles, S. M., et al. Quantitative immunoPET of prostate cancer xenografts with Zr-89- and I-124-labeled anti-PSCA A11 minibody. Journal of Nuclear Medicine. 55 (3), 452-459 (2014).
  20. Rizvi, S. F., et al. radiation dosimetry and scouting of 90Y-ibritumomab tiuxetan therapy in patients with relapsed B-cell non-Hodgkin's lymphoma using 89Zr-ibritumomab tiuxetan and PET. European Journal of Nuclear Medicine and Molecular Imaging. 39 (3), 512-520 (2012).
  21. Perk, L. R., et al. Preparation and evaluation of Zr-89-Zevalin for monitoring of Y-90-Zevalin biodistribution with positron emission tomography. European Journal of Nuclear Medicine and Molecular Imaging. 33 (11), 1337-1345 (2006).
  22. Vosjan, M., et al. Conjugation and radiolabeling of monoclonal antibodies with zirconium-89 for PET imaging using the bifunctional chelate p-isothiocyanatobenzyl-desferrioxamine. Nature Protocols. 5 (4), 739-743 (2010).
  23. Holland, J. P., et al. Zr-89-DFO-J591 for ImmunoPET of prostate-specific membrane antigen expression in vivo. Journal of Nuclear Medicine. 51 (8), 1293-1300 (2010).
  24. Deri, M. A., et al. Alternative chelator for (89)Zr-radiopharmaceuticals: Radiolabeling and evaluation of 3,4,3-(LI-1,2-HOPO). Journal of Medicinal Chemistry. 57 (11), 4849-4860 (2014).
  25. Abou, D. S., Ku, T., Smith-Jones, P. M. In vivo biodistribution and accumulation of 89Zr in mice. Nuclear Medicine and Biology. 38 (5), 675-681 (2011).
  26. Guerard, F., Lee, Y. S., Brechbiel, M. W. Rational design, synthesis, and evaluation of tetrahydroxaminc acid chelators for stable complexation of zirconium(IV). Chemistry: A European Journal. 20 (19), 5584-5591 (2014).
  27. Guerard, F., et al. Investigation of Zr(IV) and 89Zr(IV) complexation with hydroxamates: progress towards designing a better chelator than desferrioxamine B for immuno-PET imaging. Chemical Communications. 49 (10), 1002-1004 (2013).
  28. Zeglis, B. M., et al. Modular strategy for the construction of radiometalated antibodies for positron emission tomography based on inverse electron demand Diels-Alder click chemistry. Bioconjugate Chemistry. 22 (10), 2048-2059 (2011).
  29. Tinianow, J. N., et al. Site-specifically Zr-89-labeled monoclonal antibodies for ImmunoPET. Nuclear Medicine and Biology. 37 (3), 289-297 (2010).
  30. Holland, J. P., et al. Measuring the pharmacodynamic effects of a novel Hsp90 inhibitor on HER2/neu expression in mice using Zr-89-DFO-trastuzumab. PLoS ONE. 5 (1), (2010).
  31. Aerts, H., et al. Disparity between in vivo EGFR expression and Zr-89-labeled cetuximab uptake assessed with PET. Journal of Nuclear Medicine. 50 (1), 123-131 (2009).
  32. Nagengast, W. B., et al. Zr-89-Bevacizumab PET of early antiangiogenic tumor response to treatment with HSP90 inhibitor NVP-AUY922. Journal of Nuclear Medicine. 51 (5), 761-767 (2010).
  33. Nagengast, W. B., et al. In vivo VEGF imaging with radiolabeled bevacizumab in a human ovarian tumor xenograft. Journal of Nuclear Medicine. 48 (8), 1313-1319 (2007).
  34. Dijkers, E. C. F., et al. Development and characterization of clinical-grade Zr-89-trastuzumab for HER2/neu immunoPET imaging. Journal of Nuclear Medicine. 50 (6), 974-981 (2009).
  35. Ulmert, D., et al. Imaging androgen receptor signaling with a radiotracer targeting free prostate-specific antigen. Cancer Discovery. 2 (4), 320-327 (2012).
  36. Hong, H., et al. Positron emission tomography imaging of CD105 expression with 89Zr-Df-TRC105. European Journal of Nuclear Medicine and Molecular Imaging. 39 (1), 138-148 (2012).
  37. Dijkers, E. C., et al. Biodistribution of Zr-89-trastuzumab and PET omaging of HER2-positive lesions in patients with metastatic breast cancer. Clinical Pharmacolog., & Therapeutics. 87 (5), 586-592 (2012).
  38. Heneweer, C., Holland, J. P., Divilov, V., Carlin, S., Lewis, J. S. Magnitude of enhanced permeability and retention effect in tumors with different phenotypes: Zr-89-abumin as a model system. Journal of Nuclear Medicine. 52 (4), 625-633 (2011).
  39. Holland, J. P., et al. Annotating MYC status with 89Zr-transferrin imaging. Nature Medicine. 18 (10), 1586-1591 (2012).
  40. Jacobson, O., et al. MicroPET imaging of integrin avB3 expressing tumors using 89Zr-RGD peptides. Molecular Imaging and Biology. 13 (6), 1224-1233 (2011).
  41. Keliher, E. J., et al. 89Zr-labeled dextran nanoparticles allow in vivo macrophage imaging. Bioconjugate Chemistry. 22 (12), 2383-2389 (2011).
  42. Abou, D. S., et al. 89Zr-labeled paramagnetic octreotide-liposomes for PET-MR imaging of cancer. Pharmaceutical Research. 30 (3), 878-888 (2013).
  43. Miller, L., et al. Synthesis, characterization, and biodistribution of multiple 89Zr-labeled pore-expanded mesoporous silica nanoparticles for PET. Nanoscale. 6 (9), 4928-4935 (2014).
  44. Zeglis, B. M., et al. An enzyme-mediated methodology for the site-specific radiolabeling of antibodies based on catalyst-free click chemistry. Bioconjugate Chemistry. 24 (6), 1057-1067 (2013).
  45. Nanus, D. M., et al. Clinical use of monoclonal antibody HuJ591 therapy: targeting prostate specific membrane antigen. Journal of Urology. 170 (6 Pt 2), S84-S88 (2003).
  46. Joshi, R., Gangabhagirathi, R., Venu, S., Adhikari, S., Mukherjee, T. Antioxidant activity and free radical scavenging reactions of gentisic acid: in vitro and pulse radiolysis studies. Free Radical Research. 46 (1), 11-20 (2012).
  47. Saran, M., Bors, W. Radiation chemistry of physiological saline reinvestigated: evidence that chloride-derived intermediates play a key role in cytotoxicity. Radiation Research. 147 (1), 70-77 (1997).
  48. Machholz, E., Mulder, G., Ruiz, C., Corning, B. F., Prichett-Corning, K. R. Manual restraint and common compound administration routes in mice and rats. Journal of Visualized Experiments. (67), e2771 (2012).
  49. Collier, H., Warner, B. T., Skerry, R. Multiple toe-pinch method for testing analgesic drugs. British Journal of Pharmacology and Chemotherapeutics. 17, 28-40 (1961).
  50. Zanzonico, P. Positron emission tomography: a review of basic principles, scanner design and performance, and current systems. Seminars in Nuclear Medicine. 34 (2), 87-111 (2004).
  51. Anderson, C. J., et al. Copper-64-labeled antibodies for PET imaging. Journal of Nuclear Medicine. 33 (9), 1685-1691 (1992).
  52. Anderson, C. J., et al. Preparation, biodistribution and dosimetry of copper-64-labeled anti-colorectal carcinoma monoclonal antibody fragments 1A3-F(ab')2. Journal of Nuclear Medicine. 36 (5), 850-858 (1995).
  53. Lindmo, T., Boven, E., Cuttitta, F., Fedorko, J., Bunn, P. A. Determination of the immunoreactive fraction of radiolabeled monoclonal antibodies by linear extrapolation to binding at infinite antigen excess. Journal of Immunological Methods. 72 (1), 77-89 (1984).
  54. Lindmo, T., Bunn, P. A. Determination of the true immunoreactive fraction of monoclonal antibodies after radiolabeling. Methods in Enzymology. 121 (1), 678-691 (1986).
  55. Cohen, R., et al. Inert coupling of IRDye800CW to monoclonal antibodies for clinical optical imaging of tumor targets. European Journal of Nuclear Medicine and Molecular Imaging. 1 (1), 31-43 (2011).
  56. Ruggiero, A., et al. Targeting the Internal Epitope of Prostate-Specific Membrane Antigen with Zr-89-7E11 Immuno-PET. Journal of Nuclear Medicine. 52 (10), 1608-1615 (2011).
  57. Nayak, T. K., Garmestani, K., Milenic, D. E., Brechbiel, M. W. PET and MRI of Metastatic Peritoneal and Pulmonary Colorectal Cancer in Mice with Human Epidermal Growth Factor Receptor 1-Targeted Zr-89-Labeled Panitumumab. Journal of Nuclear Medicine. 53 (1), 113-120 (2012).

Tags

Chemie Positron Emissie Tomografie Antibody bioconjugatie Immunoconjugaten desferrioxamine,
De bioconjugatie en radiosynthese van<sup&gt; 89</sup&gt; Zr-DFO-gemerkte antilichamen
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Zeglis, B. M., Lewis, J. S. The… More

Zeglis, B. M., Lewis, J. S. The Bioconjugation and Radiosynthesis of 89Zr-DFO-labeled Antibodies. J. Vis. Exp. (96), e52521, doi:10.3791/52521 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter