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Chemistry

La bioconjugaison et radiosynthèse de Published: February 12, 2015 doi: 10.3791/52521
Automatic Translation
1, 1
1Department of Radiology, Memorial Sloan Kettering Cancer Center

Abstract

L'exceptionnelle affinité, la spécificité et la sélectivité des anticorps rendent vecteurs extrêmement attrayantes pour les médicaments radiopharmaceutiques PET tumorales ciblées. En raison de leur demi-vie biologique de plusieurs jours, les anticorps doivent être étiquetés avec des radionucléides émetteurs de positrons avec relativement longues désintégration physique des demi-vies. Traditionnellement, les isotopes émettant des positrons 124 I (t 1/2 = 4.18 d), 86 Y (t 1/2 = 14,7 h), et 64 Cu (t 1/2 = 12,7 heures) ont été utilisés pour marquer des anticorps pour l'imagerie TEP. Plus récemment, cependant, le domaine a connu une augmentation considérable de l'utilisation de la tomographie par émission de métal radioactif 89 Zr en PET agents d'imagerie à base d'anticorps. 89 Zr est un radio-isotope presque idéal pour l'imagerie PET avec des immunoconjugués, car il possède une moitié physique -La vie (t 1/2 = 78,4 h) qui est compatible avec la pharmacocinétique in vivo des anticorps et émet un relativement faible ènergy positrons qui produit des images haute résolution. En outre, les anticorps peuvent être carrément marqués avec 89 Zr utilisant le chélateur de desferrioxamine sidérophores dérivée (MPO). Dans ce protocole, l'antigène de membrane de ciblage J591 d'anticorps spécifique de la prostate est utilisé comme système modèle pour illustrer (1) la bioconjugaison du chélateur bifonctionnel DFO-isothiocyanate à un anticorps, (2) la radiosynthèse et la purification d'un 89 Zr MPO-mAb radioimmunoconjugué, et (3) in vivo l'imagerie TEP avec un 89 Zr-DFO-mAb radioimmunoconjugué dans un modèle murin de cancer.

Introduction

En raison de leur sensibilité remarquable, l'affinité et la sélectivité, les anticorps ont longtemps été considérés comme des vecteurs prometteurs pour la délivrance de radio-isotopes à des cellules cancéreuses. Toutefois, leur application dans la tomographie par émission de positons (TEP) a été entravée par l'absence d'un radio-isotope émetteur de positons adapté à leur étiquetage. 1-3 Une des considérations les plus critiques dans la conception de radioimmunoconjugués est correspondant à la décroissance physique demi- vie du radio-isotope à la pharmacocinétique in vivo de l'anticorps. Plus précisément, les anticorps ont souvent, multi-jours des demi-vies biologiques relativement longues et donc doivent être étiquetés avec des radio-isotopes avec des demi-vies physiques comparables. Pour les applications d'imagerie PET, des anticorps ont été traditionnellement marqué à 64 Cu (t 1/2 = 12,7 h), 86 Y (t 1/2 = 14,7 h), ou 124 I (t 1/2 = 4.18 d). 4, 5 Cependant, chacun deces radio-isotopes possède des limites importantes qui entravent leur aptitude à l'imagerie clinique. Alors que radioimmunoconjugués marqués avec 86 Y et 64 Cu ont prouvé prometteuse dans les enquêtes précliniques, deux isotopes possèdent des demi-vies physiques qui sont trop courts pour être efficace pour l'imagerie chez l'homme. 124 I, en revanche, a une demi-vie physique presque idéal pour l'imagerie avec des anticorps, mais il est coûteux et présente des caractéristiques de désintégration sous-optimales qui conduisent à relativement basse résolution des images cliniques. En outre, 124 radio-immunoconjugués I-marqué peut être soumis à une déshalogénation in vivo, un procédé qui peut abaisser les rapports d'activité tumeur-à-fond. 6,7

Le lecteur de trouver un radio-isotope émetteur de positons à supplanter 64 Cu, 86 Y, et 124 I dans radioimmunoconjugués a alimenté la récente flambée des recherches sur 89 anticorps Zr-étiquetés. 8-12 Til raison de l'avènement de 89 Zr est simple: l'radiométal possède des propriétés physiques et chimiques quasi-idéal et pour une utilisation dans radioimmunoconjugués PET diagnostic 13 89 Zr est produit par la 89 Y (p, de n) 89 réaction Zr sur un cyclotron en utilisant un. disponibles dans le commerce et 100% naturelle abondante 89 cible Y 14,15. Le métal radioactif a un rendement de 23% de positron, se désintègre avec une demi-vie de 78,4 heures, et émet des positons avec l'énergie relativement faible de 395,5 keV (figure 1). 13,16,17 Il est important de noter que 89 Zr émet également une grande énergie, 909 keV γ-ray avec 99% d'efficacité. Bien que cette émission ne interfère pas énergiquement avec les photons émis 511 keV, il ne nécessite examen supplémentaire en matière de transport, de manutention, et la dosimétrie. Malgré cette réserve, ces caractéristiques de désintégration définitive signifie que 89 Zr a non seulement une plus favorable half-vie pour l'imagerie avec des anticorps de 86 Y et 64 Cu, mais peuvent aussi produire des images haute résolution de 124 I, qui émet des positons avec des énergies plus élevées de 687 et 975 keV ainsi que d'un nombre de photons avec des énergies au sein de 100-150 keV de les photons de positons créé 511 keV. 13 En outre, 89 Zr est aussi plus sûr à manipuler, moins cher à produire, et esidualise dans les tumeurs plus efficacement que son homologue de l'iode radioactif. 18,19 Une limitation potentielle de 89 Zr, ce est qu'il n'a pas un isotopologue thérapeutique, par exemple, 86 Y (PET) contre 90 Y (thérapie). Cela empêche la construction de chimiquement identiques, agents d'imagerie de substitution qui peuvent être utilisés comme éclaireurs dosimétriques pour leurs homologues thérapeutiques. Cela dit, les enquêtes suggèrent que 89 Zr anticorps marqués ont un potentiel comme substituts d'imagerie pour 90 Y et 177 Lu-immunoconjugués marqués.20,21

Du point de vue chimique, comme un métal du groupe IV, 89 Zr existe en tant que cation 4 en solution aqueuse. L'ion Zr est fortement chargée, relativement importante (rayon ionique efficace = 0,84 Å), et peut être classé comme un cation "dur". En tant que tel, il présente une préférence pour les ligands portant jusqu'à huit disques, les donateurs anioniques d'oxygène. Facilement le chélateur le plus couramment utilisé dans 89 radioimmunoconjugués Zr-étiquetés est desferrioxamine (MPO), un sidérophore dérivés, chélateur acyclique portant trois groupes hydroxamate. Le ligand coordonne de manière stable le cation Zr 4+ rapidement et proprement à la température ambiante à des niveaux de pH biologiquement pertinentes, et le complexe Zr-MPO résultant reste stable au cours de plusieurs jours dans une solution saline, le sérum sanguin, et le sang total. 22 études computationnelles suggèrent fortement que le MPO forme un complexe hexacoordiné de Zr 4+ dans laquelle le centre métallique est coordiné à trois neutral et trois donneurs d'oxygène anioniques du ligand ainsi que les deux ligands exogènes d'eau (Figure 2). 23,24 Le comportement in vivo des radioimmunoconjugués employant la conjugaison échafaudage 89 Zr-MPO a généralement été excellente. Cependant, dans certains cas, l'imagerie et les études de biodistribution aiguës ont révélé des niveaux d'activité élevés dans les os des souris injectées avec 89 des anticorps Zr-marquées, des données qui suggèrent que la ostéophile 89 Zr 4+ cation est libéré de l'agent chélatant in vivo et ensuite minéralise dans l'os. 25 Récemment, un certain nombre d'enquêtes sur le développement de nouveaux 89 Zr 4+ chélateurs ligands particulièrement avec huit donneurs d'oxygène ont été publiés dans la littérature. 24,26,27 Néanmoins, à l'heure actuelle, le MPO est le chélateur la plus largement utilisée dans 89 radioimmunoconjugués Zr marqué par une large marge. Une grande variété destratégies de bioconjugaison ont été utilisées pour attacher le MPO à des anticorps, y compris bioorthogonal chimie clic, la réaction d'un thiol réactif MPO construit avec cysteines dans l'anticorps, et la réaction de l'ester activé portant MPO construit avec lysines dans l'anticorps. 4,28- 30 Facilement la stratégie la plus courante, cependant, a été l'utilisation d'un dérivé de l'isothiocyanate portante du MPO, le MPO-NCS (Figure 2). 22 Ce chélateur bifonctionnel disponible dans le commerce robuste et fiable des formes stables, des liaisons covalentes de thiourée avec les lysines de la anticorps (figure 3).

Au cours des dernières années, une grande variété de 89 radioimmunoconjugués Zr-DFO-marqués ont été rapportés dans la littérature. Études précliniques ont été particulièrement abondante, avec des anticorps qui vont de la plus connue cetuximab, le bevacizumab et le trastuzumab à des anticorps plus ésotériques comme le CD105 ciblage TRC105 et fPSA ciblage 5A10. 30-36 Plus récemment, un petit nombre d'essais cliniques de phase précoce en utilisant des anticorps 89 Zr-DFO-marquées sont apparues dans la littérature. Essais spécifiquement, les groupes aux Pays-Bas ont publié employant 89 Zr-DFO-CMAb U36, 89 Zr-DFO-ibritumomab tiuxétan, et 89 Zr-DFO-trastuzumab. 21,32,37 En outre, une série d'autres essais cliniques avec 89 radioimmunoconjugués Zr-étiquetés sont actuellement en cours, y compris les enquêtes ici au Memorial Sloan Kettering Cancer Center à l'aide de la LMFP ciblage 89 Zr-DFO-J591 pour l'imagerie du cancer de la prostate et le 89 Zr-DFO-trastuzumab HER2-ciblage pour l'imagerie du cancer du sein. 23, 30 En outre, alors que les anticorps radiomarqués restent les 89 produits radiopharmaceutiques marqués Zr plus courantes, le métal radioactif a également été utilisée de plus en plus avec d'autres vecteurs, y compris des peptides, des protéines, et des nanomatériaux. 38-43

La modularité de ce 89 Zr-MPO méthodologie d'étiquetage est un atout formidable. Le répertoire d'anticorps de ciblage biomarqueurs est en pleine expansion, et de l'intérêt dans l'exécution de l'imagerie PET vivo en utilisant ces constructions est de plus en plus rapidement. En conséquence, nous croyons que le développement de pratiques et de protocoles normalisés plus pourrait bénéficier le domaine. Un excellent protocole expérimental écrite pour le MPO-NCS conjugaison et 89 Zr radiomarquage a déjà été publié par Vosjan, et al. 22 Nous pensons que la démonstration visuelle fournie par ce travail pourrait en outre aider les enquêteurs à ces nouvelles techniques. Dans le protocole à la main, l'antigène de membrane de ciblage J591 d'anticorps spécifique de la prostate est utilisé comme système modèle pour illustrer (1) la bioconjugaison du chélateur bifonctionnel DFO-isothiocyanate à un anticorps, (2) la radiosynthèse et la purification de la 89 Zr-DFO-mAb radioimmunoconjugué,et (3) in vivo l'imagerie TEP avec un 89 Zr-DFO-mAb radioimmunoconjugué dans un modèle murin de cancer. 23,44,45

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Protocol

Toutes les expériences in vivo d'animaux décrits ont été réalisés selon un protocole approuvé et selon les directives éthiques de la Memorial Sloan Kettering Cancer Center Institutional Animal Care et l'utilisation Comité (IACUC).

1. Conjugaison du MPO-NCS à J591

  1. Dans un tube de microcentrifugeuse de 1,7 ml, préparer une solution à 2-5 mg / ml de J591 dans 1 ml d'une solution saline 1x tamponnée au phosphate (pH 7,4) ou du tampon HEPES 0,5 M (pH 7,4).
  2. Dissoudre MPO-NCS dans le DMSO sec à une concentration comprise entre 5 à 10 mM (3.8 à 7.6 mg / ml). Soniquer ou vortex soigneusement la solution pour faciliter la dissolution complète.
  3. Ajuster le pH de la solution de J591 à 8,8 à 9,0 en ajoutant de petites portions aliquotes (<10 pi) de 0,1 M de Na 2 CO 3.
  4. Une fois la solution d'anticorps est à la bonne pH, ajouter un volume de la solution DFO-NCS correspondant à un excès molaire de 3 à 4 fois de l'agent chélatant bifonctionnel.
    1. Pour examenple, ajouter 4-5 ul d'un 10 mm (7,6 mg / ml) de la solution MPO-NCS (40,4 nmol MPO-NCS) à 1 ml d'une / ml solution d'anticorps J591 2 mg (13,3 nmol J591). La quantité de DMSO dans le mélange aqueux de réaction finale ne doit pas dépasser 2% v / v.
  5. Incuber le mélange réactionnel pendant 30 min à 37 ° C sur un bloc chauffant agitant à 350 tours par minute.
  6. Après 1 h à 37 ° C, purifier l'immunoconjugué résultant en utilisant une colonne de dessalage exclusion pré-emballé avec une taille jetable 50000 poids moléculaire de coupure en utilisant un tampon HEPES 0,5 M (pH 7,4) comme éluant. Cette étape permettra d'obtenir une solution 2 ml du produit de construction J591-DFO terminé.
  7. Mesurer la concentration de la J591-MPO construire sur un spectrophotomètre UV-Vis.
  8. Si une concentration plus élevée de la construction est souhaitée, concentrer la solution J591-DFO utilisant une unité de filtre centrifuge à 50 000 en poids moléculaire limite.
  9. Conserver la solution de l'immunoconjugué J591-MPO terminé à -20 ° C dans l'obscurité.

2. Radiomarquage J591-MPO avec 89 Zr

ATTENTION: Cette étape du protocole impliquant le traitement et la manipulation de radioactivité. Avant d'effectuer ces étapes ou effectuer d'autres travaux avec des chercheurs de radioactivité devraient consulter avec le Département de la radioprotection de leur établissement d'origine. Toutes les mesures possibles doivent être prises pour réduire l'exposition aux rayonnements ionisants.

NOTE: Dans l'intérêt de la note tenue radiochimique bon, la quantité de radioactivité dans l'échantillon doit être mesurée à l'aide d'un calibrateur de dose et enregistrée avant et après les étapes 2.2 à 2.13 dans le protocole ci-dessous. Cela aidera à la détermination précise des rendements radiochimiques et des activités spécifiques.

  1. Préparer une solution de 0,5 à 2,0 mg de J591-MPO dans 200 pi de tampon HEPES 0,5 M, pH 7,5.
  2. Pipeter le volume de la <sup> 89 Zr 4+ solution stock (généralement fourni dans 1,0 M d'acide oxalique) correspondant à 1,0 à 6,0 mCi (37 à 222 MBq) dans un tube en plastique à centrifuger à bouchon à vis 2 ml. Réglez le volume de cette solution à un total de 300 ul en utilisant l'acide oxalique 1,0 M.
  3. Ajuster le pH de la solution 89 Zr 4+ 6.8 à 7.5 à l'aide de 1,0 M de Na 2 CO 3. Commencer par l'ajout de 250 ul de 1,0 M de Na 2 CO 3 à la solution 89 Zr 4+ et ensuite ajouter plus petit (<10 ul) des aliquotes d'une base pour obtenir le pH désiré.
  4. Ajouter la quantité désirée de pH ajusté 89 Zr 4+ solution à la solution J591-DFO préparé à l'étape 2.1.
  5. Vérifier le pH du mélange de réaction de radiomarquage pour se assurer qu'elle tombe dans la plage souhaitée de 6/8 à 7/5.
  6. Incuber la réaction de radiomarquage de 60 min à température ambiante sur un bloc chauffant agitant à 350 tours par minute.
  7. Après 60 min d'incubation, mesurer la radiolabeling rendement de la réaction utilisant la radio-CCM.
    1. À cette fin, 1 pCi de repérer le mélange de réaction de radiomarquage sur une bande de CCM silice imprégné. Autoriser l'aliquote sécher, exécutez le CCM en utilisant un éluant mM DTPA (pH 5,5) 50 et d'analyser la bande CCM en utilisant un scanner radio TLC. 89 Zr 4+ lié à la construction J591-MPO apparaîtra à l'origine (R f <0,1), tandis que des cations libres 89 Zr 4+ sont chélatés par DTPA et se éluer avec le front de solvant (Rf> 0,9).
    2. Calculer le rendement de radiomarquage de la réaction en intégrant le radiochromatogramme, en divisant l'aire sous la courbe de Rf de 0,0 à 0,1 par l'aire totale sous la courbe, et en multipliant par cent.
  8. Si le rendement de radiomarquage est suffisant (typiquement une activité spécifique théorique de> 2 mCi / mg), de stopper la réaction avec 5 pl de 50 mM de DTPA à pH 5,5.
  9. Purifier l'immunoconjugué usi résultantng une colonne exclusion dessalage pré-emballé taille jetable avec un 50 000 poids moléculaire de coupure en utilisant un éluant soit 0,9% de solution saline stérile avec 5 mg / acide gentisique ml ou 0,25 M d'acétate de sodium (pH 5,5) avec 5 mg / ml d'acide gentisique . Cette étape sera d'obtenir une solution 2 ml de terminé le 89 radioimmunoconjugué Zr-DFO-J591.
  10. Après purification, vérifier la pureté radiochimique du 89 Zr-DFO-J591 utilisant la radio-CCM comme décrit dans l'étape 2.7.
  11. Calculez le rendement de radiomarquage global de la réaction en divisant le montant de l'activité initialement ajouté à la solution d'anticorps par la quantité de radioactivité isolé avec le purifiée radioimmunoconjugué 89 Zr-DFO-J591.
  12. Calculer l'activité spécifique finale en divisant le montant de l'activité isolé avec le purifiée 89 Zr-DFO-J591 radioimmunoconjugué par la masse initiale de MPO-J591 dans la réaction de radiomarquage.
  13. Si une concentration plus élevée est souhaitée, se concentrer ee 89 solution Zr-DFO-J591 utilisant une unité de filtre centrifuge avec un 50,000 poids moléculaire de coupure.
    NOTE: L'acide gentisique utilisé dans l'étape de purification finale est une radio-protecteur employé pour minimiser la dégradation de l'anticorps due à la radiolyse 46 Bien que le stockage de la 89 Zr-DFO-J591 radioimmunoconjugué jusqu'à 48 heures à 4 ° C. est possible, il ne est pas recommandé. Si le radioimmunoconjugué doit être stockée, en utilisant 0,25 M d'acétate de sodium (pH 5,5) avec 5 mg d'acide gentisique / ml en tant que le tampon de stockage, afin de minimiser le risque de la radiolyse de l'hypochlorite à médiation 47.

3. In Vivo imagerie TEP avec 89 Zr-DFO-J591

ATTENTION: Comme dans la section protocole n ° 2, cette étape du protocole impliquant le traitement et la manipulation de radioactivité. Avant d'effectuer ces étapes chercheurs devraient consulter avec le Département de la radioprotection de leur établissement d'origine. Tous possibLe mesures devraient être prises pour minimiser l'exposition aux rayonnements ionisants.

  1. Chez les souris nudes athymiques mâles, implant sous-cutanée 5 x 10 cellules de cancer de la prostate LNCaP et 6 permettent à ceux-ci atteignent une xénogreffe de 100 à 150 mm 3 (3-4 semaines après l'inoculation). 44
  2. Diluer le radioimmunoconjugué 89 Zr-DFO-J591 à une concentration de 1,0 mCi / ml dans 0,9% de solution saline stérile.
  3. Injecter 200 ul de la solution 89 Zr-DFO-J591 (200 uCi; 7,4 MBq). Dans la veine caudale latérale des souris de xénogreffes portant 48
  4. Au point de temps de formation d'image souhaité (par exemple, 12, 24, 48, 72, 96, ou 120 heures après l'injection), anesthésier les souris avec 2% d'isoflurane: mélange de gaz d'oxygène.
  5. Placer la souris sur le lit de la petite scanner TEP animale, et maintenir l'anesthésie pendant l'analyse en utilisant un 1% d'isoflurane: mélange de gaz d'oxygène. Avant de placer l'animal sur la vitre du scanner, vérifiez l'anesthésie en utilisant la méthode et appl toe-pincementpommade ophtalmique y les yeux de la souris pour éviter le dessèchement pendant l'anesthésie. 49
  6. Acquérir les données de PET pour la souris via une analyse statique avec un minimum de 40 millions d'événements coïncidents en utilisant une fenêtre d'énergie de 350-700 keV et une fenêtre de cadencement de coïncidence de 6 nanosecondes. 50
  7. Après avoir complété l'acquisition de l'image, ne laissez pas la souris sans surveillance et ne pas le placer dans une cage avec les autres souris jusqu'à ce qu'il a repris conscience.

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Representative Results

La première étape de ce protocole la conjugaison du MPO-NCS à l'anticorps est généralement assez robuste et fiable. Généralement, le, immunoconjugué chélateur modifié purifié peut être obtenu à un rendement> 90%, et en utilisant trois équivalents molaires de DFO-NCS dans la réaction de conjugaison initiale donnera un degré de marquage de l'agent chélatant d'environ 1,0 à 1,5 MPO / mAb. Les 89 Zr radiomarquage et de purification étapes de la procédure sont également simple. Aux concentrations décrites dans le protocole ci-dessus, les rendements de radiomarquage de> 80% et des activités spécifiques ainsi de> 2,0 mCi / mg sont typiques après 60 min à température ambiante. Le chromatogramme radio TLC du mélange de radiomarquage brut devrait révéler une certaine DTPA liée 89 Zr 4+ qui élue au front de solvant (figure 4A). Cependant, après la trempe de la réaction avec le DTPA et en purifiant le 89 Zr-DFO-mAb construire par Chromatographie d'exclusion de taille, la radiocla pureté de la hemical, isolé conjugué 89 Zr-DFO-mAb purifié doit être> 95% (figure 4B). Dans le cas où la pureté radiochimique du isolé 89 Zr-DFO-mAb conjugué est inférieure à 95%, la procédure de purification doit être répétée avant d'effectuer toute in vitro ou in vivo.

Passant aux expériences in vivo, dans le protocole décrit ci-dessus, des souris nude athymiques portant PSMA exprimant, LNCaP xénogreffes de cancer de la prostate ont été utilisées pour étudier le comportement in vivo de 89 Zr-DFO-J591. Les deux biodistribution aiguë et PET expériences d'imagerie ont révélé que 89 Zr-DFO-J591 délimite clairement les xénogreffes de cancer de la prostate avec un excellent contraste de l'image et des ratios élevés tumeur à-fond activité (Figure 5). L'absorption du radioimmunoconjugué dans la tumeur est évident aussi tôt que 24 heures (20,9% ± 5,6% ID / g), et l'activitéconcentration dans la tumeur augmente à un maximum de 57,5% ± 5,3% ID / g au post-injection 96 h. Comme il est typique de radio-immunoconjugués, une concentration relativement élevée de radiotraceur est présent dans le sang à des points début de temps (9,1% ± 5,3% ID / g à 24 h), suivi par une lente diminution de la quantité de radioactivité dans le sang au cours de la cours de l'expérience. Le tissu non-cible avec la concentration la plus élevée était d'activité de l'os, qui affiche les valeurs absorption d'environ 10% ID / g pendant toute l'expérience, sans doute en raison de la libération in vivo de la 89 ostéophile cation Zr 4+. Tous les autres organes, y compris le cœur, les poumons, le foie, la rate, l'estomac, grande et l'intestin grêle, les reins et le muscle affiché des concentrations d'activité relativement faible, souvent bien en dessous de 5% ID / g. Comme témoin, une cohorte supplémentaire de souris ont reçu une injection co-injecté 300 ug DFO-J591 non marqué afin de saturer l'antigène et ainsi illustrer blocage sélectif. Criti ment, l'expérience de blocage réduit l'absorption de la radioimmunoconjugué dans la tumeur de 48,9% ± 9,3% ID / g à 23,5% ± 11,1% ID / g au post-injection 72 h, en indiquant clairement que 89 Zr-DFO-J591 cible sélectivement son antigène.

Figure 1
Figure 1. (A) Un schéma de désintégration simplifié et (B) des caractéristiques de désintégration saillants de 89 Zr 13,16,17 IT = transition isomérique. EC = capture d'électrons. Modifié et réimprimé avec la permission de Deri, et al. Médecine et Biologie. 40, 3-14 (2013) nucléaire. Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

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Figure 2. (a) la structure du MPO-NCS avec les atomes d'oxygène de coordination de couleur rouge; (B) une structure dérivée de TFD complexe de coordination Zr-MPO. Modifié et réimprimé avec la permission de Deri, et al. Journal of Medicinal Chemistry. 57, 4849-4860 (2014). Droit d'auteur 2014 American Chemical Society. Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 3

Figure 3. Schéma de la bioconjugaison et radiomarquage de 89 Zr-DFO-J591.et = "_ blank"> Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 4
Figure 4. représentatifs chromatogrammes de radio-CCM du mélange de radiomarquage brut (A) et le produit purifié (B) de 89 Zr-DFO-J591. Radio-TLC ont été réalisées sur des bandes de silice en utilisant un éluant d'mM de DTPA, pH 5,0 50. Se il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 5
Figure 5. images coronale PET de 89 Zr-DFO-J591 (11.1 à 12.9 MBq [300-345 uCi] injecté par la veine caudale dans 200 pi de 0,9% de solution saline stérile) chez la souris nude athymiques portant sous-cutanée, exprimant PSMAxénogreffes du cancer de la prostate LNCaP (flèches blanches) entre h post-injection 24 et 120. de modification et réimprimé avec la permission de Zeglis, et al. Bioconjugate Chemistry. 24, 1057-1067 (2013). Droit d'auteur 2013 American Chemical Society. Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

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Discussion

Alors que la construction, radioimmunoconjugués radiomarquage, et l'imagerie de 89 Zr-DFO-étiqueté est généralement une procédure assez simple, il est important de garder quelques considérations clés à l'esprit au cours de chaque étape du processus. Par exemple, peut-être la cause la plus probable de préoccupation lors de l'étape de conjugaison de la procédure est l'agrégation de l'anticorps au cours de la réaction de conjugaison. Ce problème est le plus souvent un produit d'un mauvais mélange de la réaction de conjugaison après l'ajout de la solution mère MPO-NCS. 22 Lorsque cela se produit, la distribution non homogène du MPO-NCS peut causer des niveaux excessivement élevés de réaction locale avec le anticorps, qui peut à son tour conduire à l'agrégation. Ce problème peut être relativement facilement contourné en ajoutant la solution mère de MPO-NCS en petites portions (<5 pi), bien mélanger le mélange de réaction après l'addition du MPO-NCS, et en agitant le mélange réactionnel sur un temperature-agitateur commandé. En outre, après la conjugaison et la purification du produit d'assemblage DFO-mAb, il est important de déterminer avec précision le nombre de MPO conjugué à chaque mAb. La caractérisation complète du nombre de MPO chélates par anticorps peut être réalisé en utilisant radiométriques isotopique dilution des expériences similaires à celles exercées par la Hollande 14,23, et et al., Si MALDI-TOF spectrométrie de masse est une alternative viable al. Et Anderson,. , 30,51,52 Lors de l'étape de radiomarquage, facilement le problème le plus commun est le rendement de radiomarquage plus faible que prévu. Si étonnamment faibles rendements se produisent en dépit assidûment suivant le protocole ci-dessus, trois stratégies de dépannage sont disponibles: (1) l'incubation de la réaction de radiomarquage pour de plus longues périodes de temps (par exemple, 2-3 h); (2) la répétition de la réaction de radiomarquage utilisant une concentration plus élevée de l'anticorps; ou (3) la répétition de la réaction de conjugaison DFO-NCS initial en utilisant un excès molaire plus élevé de the chélateur bifonctionnel.

Alors que la conjugaison MPO-NCS est facile et robuste, une de ses faiblesses indéniables, ce est qu'il ne est pas spécifique au site: MPO-forme NCS liens de thiourée avec lysines disponibles dans l'anticorps, quelle que soit leur position. En conséquence, il est possible que les agents chélatants peuvent être ajoutées à la région de liaison d'antigène de l'anticorps, ce qui affecte défavorablement l'immunoréactivité du conjugué 89 Zr-DFO marqué. Par conséquent, un équilibre délicat doit être trouvé dans la construction de 89 radioimmunoconjugués Zr-étiquetés: augmentation du nombre de chélateurs par anticorps faciliter des activités plus spécifiques, mais de degrés étiquetage plus élevés augmentent également le risque de compromettre la réactivité immunologique de la construction. En fin de compte, l'objectif est simple: fixer autant que chélateurs nécessaires sans compromettre immunoréactivité. Après avoir obtenu l'purifiée radioimmunoconjugué 89 Zr-DFO-mAb, il est essentiel de déterminer la in vivo. À cette fin, nous recommandons d'utiliser les méthodes in vitro publiées par Lindmo, et al. 53,54 Si l'immunoréactivité de la construction est inférieure à 80-90%, il peut être nécessaire de revenir à la réaction de conjugaison et d'ajouter moins de fragments du MPO par anticorps. Alternativement, si l'immunoréactivité de la purifiée 89 Zr-DFO-mAb est élevé (> 90%) et des activités plus spécifiques sont souhaitées, il peut être possible de fixer plusieurs chélateurs à l'anticorps sans diminuer immunoréactivité.

Enfin, le comportement in vivo d'un anticorps 89 Zr-DFO marqué est, bien sûr, dépend fortement de l'identité à la fois de l'anticorps et le modèle de tumeur utilisé. Dans le système de modèle présenté ici, la valeur d'absorption maximale dans la tumeur atteigne environ 60% ID / g; Cependant, les rapports dans la littérature pour la tumeur maximale absorption valeurs vont d'aussi peu que 15 à 20% ID / g à aussi haut que 80 à 90% ID / g 33,44,55-57 De même, la quantité d'absorption dans les tissus non cibles -. en particulier le foie et la rate - peut varier largement en fonction du système anticorps / antigène étudié. L'activité spécifique de l'anticorps Zr-MPO marqué 89 est une considération importante pour les expériences in vivo. valeurs de Littérature pour les activités spécifiques de 89 Zr-DFO-mAb varient généralement 1-6 mCi / mg (37 à 222 mBq / mg). 8,10 générale, les activités plus spécifiques sont préférables, car ils diminuent la probabilité de l'inadvertance la saturation de l'antigène (ce est à dire, l'auto-blocage). Cela devient d'autant plus vrai dans les systèmes avec des niveaux inférieurs expression de l'antigène. Indépendamment du système anticorps / antigène, aucune enquête in vivo d'un agent d'imagerie 89 Zr-DFO-marqué est complet sans une démonstration de sélectivité. Ceci peut être réalisé par des expériences de blocage en utilisantde grandes quantités de biomolécules non marqué ou l'utilisation d'une lignée cellulaire qui ne exprime pas l'antigène en question. Dans le procédé décrit ici, le premier a été utilisé, mais la sélectivité de 89 Zr-DFO-J591 a été également démontrée en utilisant la prostate PC3 xénogreffes de cancer de PSMA négatif. 23

Il est important de noter que malgré ses avantages évidents, cette méthodologie synthétique à base de MPO-NCS ne est pas parfait. Comme nous l'avons discuté, le MPO ne est pas un chélateur idéal pour 89 Zr 4+, et de la nature spécifique de non-lieu de la réaction de conjugaison peut se avérer fastidieux. Pour contourner ces problèmes, les efforts passionnants pour développer de nouveaux chélateurs pour 89 Zr 4+ et les méthodes de radiomarquage spécifiques au site sont actuellement en cours, mais ces nouvelles technologies doivent encore être optimisé et validé à la fois le laboratoire et la clinique. 24,26,27, 29,44 En fin de compte, la méthodologie MPO-NCS pour la construction de89 anticorps Zr-DFO-étiquetés se est avéré être un outil extrêmement puissant pour la synthèse de radioimmunoconjugués et a le potentiel d'être utilisé pour créer une grande variété de produits radiopharmaceutiques cliniquement utiles.

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Disclosures

Les auteurs ne ont rien à divulguer.

Acknowledgments

Les auteurs remercient le Professeur Thomas Reiner, Dr. Jacob Houghton, et le Dr Serge Lyaschenko pour des conversations utiles.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
p-SCN-Bn-DFO Macrocyclics B-705 Store at -80 °C
[89Zr]Zr-oxalate Various, including Perkin-Elmer Caution: Radioactive material
PD-10 Desalting Columns GE Healthcare 17-0851-01  Store at room temperature
Amicon Ultra-4 Centrifugal Filter Units EMD Millipore UFC805024 Store at room temperature
Silica Gel Impregnated RadioTLC Paper Agilent Technologies SGI0001 Cut into strips 0.5 cm wide

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La bioconjugaison et radiosynthèse de<sup&gt; 89</sup&gt; Anticorps Zr-DFO-étiquetés
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Zeglis, B. M., Lewis, J. S. The Bioconjugation and Radiosynthesis of 89Zr-DFO-labeled Antibodies. J. Vis. Exp. (96), e52521, doi:10.3791/52521 (2015).

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