Introduction
传染性海绵状脑病（传染性海绵状脑病，朊病毒病）是一组的致命的神经变性疾病与影响各种动物和人的延长潜伏期。的TSE的推定病原体包括主机朊病毒蛋白（PRP）的错误折叠的异构体，其能够自我繁殖由朊病毒（PrP的C）的正常细胞形式的模板驱动转换成感染性的，疾病相关的形式（PRP TSE）积聚在受感染的主机1的中枢神经系统组织。传染性朊病毒哺乳动物一般从主机到主机传输的物种特异性的方式，这已经引起了“TSE物种屏障”限间传播的事件2的概念。朊病毒物种屏障的生物因素没有得到很好地理解。传染性的PrP TSE和主机的PrP C C之间的氨基酸序列相似性一个强烈影响是否发生转换3-5，但仍不足以解释在体内 6,7观察到的所有朊病毒传播事件。
因此，TSE物种屏障特性在很大程度上依赖于动物攻击研究：曝光从给定的物种幼稚动物朊病毒从另一个并测量产生的温育时间，疾病发作和发作率的传输效率的指标。小鼠表达的PrP C来自异源物种也可用于这种类型的研究8。用转基因小鼠生产和长期朊病毒生物测定，以及使用动物的伦理方面的考虑相关的成本，是阻碍了TSE物种界限的实验研究。人类物种屏障传染性海绵状脑病的评估依赖于设计，以表达人类的PrP C小鼠。这些小鼠需要很长的潜伏期屈从于人类的传染性海绵状脑病或修改吨他的人朊蛋白C分子迅速发病9。对非人类的TSE在这些小鼠中的潜伏期可能超出正常小鼠寿命使得有挑战性阴性结果的解释。非人灵长类动物也已被用于作为代理为研究人类物种的障碍，但这些研究是充满其他类型的动物实验和非人类灵长类动物的相同的挑战可能无法精确地概括疾病，因为它进入在人类宿主。
动物生物测定仍是“金标准”方法测量物种一个TSE的易感性，但障碍，成本和这些活的动物研究的伦理学已迫使调查的替代品。许多在体外实验的基础上，评估主机的PrP C中的转换蛋白酶K（PK）耐药状态（PRP 水库 ）时，由朊病毒TSE的种子，已经开发并用于研究TSE SPECIES障碍10-12。 在体外测定法的实例包括无细胞转化测定法，蛋白质错误折叠环扩增（PMCA），以及转换效率比率（CER）测定10-14。而没有这些测定的考虑涉及自然感染后的物种障碍帐户外围因素的影响，均可能是有用的，以确定潜在易感宿主为传染性海绵状脑病。
这里，我们提出的协议的CER测定，其中从正常脑匀浆衍生2变性的PrP C底物在台式朊转化反应中使用（ 图1）13。朊病毒下在变性在pH7.4基板只能被转换为朊病毒水库由朊病毒龄接种到在没有一个物种屏障14进行反应。与此相反，朊病毒C在另一基底变性，在pH 3.5允许它被转换为朊病毒水库以下孵化与朊病毒TSE来自任何物种，并作为转换的控制。到朊病毒水库 pH 7.4的衬底相在该pH值3.5底物转化的PrP 的C的比率提供了物种屏障的量度。我们已发现，CER测定所预言的已知的实验室小鼠的物种障碍，各种传染性海绵状脑病，并已用于测定在努力预测众多哺乳动物种，包括大角羊，慢性消耗性疾病（CWD）和其他的TSE 14的物种障碍， 15。研究者感兴趣的一个工具，允许TSE物种界限或PrP的Ç-to-RES朊病毒转化评估快速筛选会发现这种方法非常有用。
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Protocol
在美国地质调查局国家野生动物健康中心进行的动物工作是按照实验动物福利准则NIH办公室和体制下的动物护理和使用委员会的协议＃EP080716执行。从狩猎采集动物组织来自威斯康星州或自然资源密歇根部门礼物。
1.溶液制备
注意：下面列出的解决方案都需要准备以下第2的CER检测基材。制备各从较高浓度的储备溶液，这些解决方案;推荐浓度原液将括号中所列各有关化学名后给出。准备好所有的解决方案在基板制备和储存新鲜的在4°C，直到使用。
- 为裂解缓冲液，制备下列在10mM Tris，pH值7.5（的1M Tris，pH值7.5原液推荐）中的溶液：100mM的s裂果氯化物（氯化钠，1M储备溶液），10毫乙二胺四乙酸（EDTA，500毫摩尔EDTA，pH 8.0的储备溶液），0.5％NP-40（10％储备液），0.5％脱氧胆酸盐（DOC，10％原液）。
- 对转换缓冲，制备0.05％的十二烷基硫酸钠（SDS，10％储备液）和0.5％的Triton X-100（10％储备液）在1磷酸盐缓冲盐水（PBS，10，pH 7.4的储备液）的溶液中。
- 对于离液的解决方案，准备盐酸胍（盐酸胍，8M的股票）在1X PBS（10X原液）两个3米的解决方案。用浓盐酸（HCl）调节的解决方案之一的pH至3.5±0.05。检查第二溶液的pH值保持在pH 7.4±0.05和调整用浓盐酸或氢氧化钠（NaOH）中，如果必要的。
2.准备CER检测底物双
- 获得健康的，非TSE感染脑组织从感兴趣的物种和制备10％重量每体积（重量/体积）匀浆中使用以下任何一种方法的裂解缓冲液：DOUNCE，珠磨机或研钵和杵均化。进一步细化导致匀浆对他们进行注射器和针头的同质化，利用增加计针，直到基材可以被吸入并通过27G的注射器针头排出自如。
- 从啮齿动物和其他小型哺乳动物准备基板，均质全脑;（二）从大型哺乳动物准备基板，使用OBEX（脑干）组织准备匀浆。当选择脑匀浆的量，准备在步骤2.6用于蛋白质沉淀离心机的容量不超过50％。
- 如果收购了脑组织的质量是有问题的，评估的PrP C水平通过SDS-PAGE 16和免疫17基板事先准备。
- 分割脑匀浆成在分开的标记的塑料锥形管2等体积。加入盐酸胍（的3M溶液中1 PBS）中在任一pH值3.5或7.4至1的每个管：1的体积比向脑匀浆。
- 检查两种溶液的pH值。用浓HCl将pH调节3.5衬底至pH的pH±0.05。确保其他基片的pH值保持在pH7.4±0.05，并根据需要在必要时用HCl或NaOH调节pH。避免通过明智加入酸或碱的过冲的pH值。
- 5小时旋转，在室温（RT）下在最终过端混合器解决方案。
- 通过加入4体积的甲醇中以在每个锥形管的底物溶液中沉淀的蛋白质，涡旋拌匀，孵育在-20℃进行16-18小时。
- 沉积物样品离心以13,000×g离心30分钟，在4℃。小心倒出并丢弃上清液，并且允许甲醇从粒料蒸发。使用棉尖涂药器，以协助吸收甲醇紧贴于管的内部。不要让小球过度博士y和一旦甲醇不再可见，进行到下一个步骤。
- 悬浮颗粒的蛋白质在转换缓冲。使用的转换缓冲等于脑匀浆的起始原料分配到各管中，在步骤2.2的量的量。
注：该转换缓冲用于从两个pH为3.5和7.4，经处理的衬底准备重悬蛋白质粒料在上面的步骤1.2（其中包含洗涤剂的低含量和生理pH）中定义的溶液，这一点至关重要。 - 在cuphorn超声仪简要超声基板解决方案（10秒，约30％的最大功率），分装成0.5 - 1.0毫升卷标记好的1.5 ml离心管。在每一基底的等分试样进行质量控制的免疫印迹（步骤2.9）。存储其他等分在-80°C，直到准备进行CER检测（第4）。
- 执行关于在使用前CER基板对（ 图2）的质量控制。这些措施确保了CER基板将providË最佳效果转化研究。
- 确保在两个基板可比数额的PrP 的C。在10-25微升每个衬底通过SDS-PAGE 16和免疫印迹17比较朊病毒水平。如果蛋白水平在pH为7.4和3.5的基材是彼此的10％之内〜，衬底对适合在CER研究用途。
注：朊蛋白免疫印迹不应该表现出广泛的PrP的Ç降解的证据。对朊蛋白的免疫反应应该是主要> 20 kDa的。频带小于这个分子量可以降解产物。带型应该是基板对之间大致相同。 - 作为朊下在两个基板应的PK敏感，治疗10-25微升每个衬底具有的PK在100微克/毫升的最终浓度和消化的样品以1000rpm在37℃下1小时的热振动筛。评估任何剩余的PrP信号通过SDS-PAGE 16和17的免疫印迹。底材具有朊病毒水库不适合在CER研究中使用。
- 确保在两个基板可比数额的PrP 的C。在10-25微升每个衬底通过SDS-PAGE 16和免疫印迹17比较朊病毒水平。如果蛋白水平在pH为7.4和3.5的基材是彼此的10％之内〜，衬底对适合在CER研究用途。
3.准备TSE代理种子
- 获得来自感兴趣物种TSE感染的脑组织及（重量/体积）匀浆中的1×PBS pH 7.4的使用在上面的步骤2.1中列出的方法制备的10％。
注：种子还可以从中枢神经系统以外的其他TSE感染的组织中产生，但是，通过从TSE感染的末梢组织衍生的种子转换脑源性底物的效率尚未被评估实验中公开的文献。 - 等分所得匀浆（S）为100 - 在-80℃，直到准备300微升体积在0.5ml微量离心管并储存以执行CER测定。
4. CER分析
注：CER测定涉及从一种物种加入相对少量的PrP TSE的（设置在“种子”）成相对过剩的PrP C与另一个物种已经部分变性在任一pH值3.5或7.4（设置在未感染脑“衬底”）。以下扩展晃动潜伏期，朊蛋白的C模板驱动的转换由朊病毒TSE每个反应是由朊病毒水库剩余PK消化和免疫检测后的光密度信号进行评估。在先前在pH 3.5 与 7.4变性基板相比较的PrP 水库水平提供了物种屏障的量度。该测定过程的一个实验性的概述在图1中提供。
- 慢慢解冻未感染的CER基底对通过将它们放置在床上的冰（约1小时解冻时间）的顶部（测定需要预先在两个pH值3.5和7.4变性基板等体积）和TSE感染的种子的解决方案。
- 一旦完全解冻，吸，然后驱逐通过每个底物液27G的注射器针头几次重新匀化它。简要超声仪处理10秒，约30％的最大功率每个TSE感染种子的解决方案。保留所有的解决方案在冰同时准备转化反应。
- 标签5个别低结合，薄壁PCR每TSE试剂管被测试。
- 通过加入5微升10％TSE感染种子溶液以95微升（一）CER基板的在pH7.4和（b）的CER基板在pH 3.5制备制备制备在这些管中转化反应。
- 对于每一个实验样品，准备在此前双方在pH为3.5和7.4变性CER基板对平行反应。
- 通过实证确定优化TSE剂种子到未受感染的大脑基底的比率。常见种子：采用基片比率保持100微升的总反应体积，并包括1:99微升，2:98微升和5:95微升。对于大多数应用，该5:95微升种子：基板的体积比是合适的，并且所显示的内容在第是的协议。
- 准备每TSE剂3的对照样品被测试如下：（1）加入5微升10％TSE感染种子溶液以95微升的转换缓冲器作为输入朊病毒水库的控制;添加5μl的转换缓冲到在（B）的pH为3.5和（c）pH为7.4，作为非特异性的，非模板化的转换控制制备95微升底物。
- 短暂涡旋振荡每一样品在其封闭PCR管以混合种子和衬底良好。用瞬时脉冲在低速台式微型离心机遵循以除去反应混合物截留在PCR管盖的任何体积。
- 负载样品中单独标记的PCR管放入台式热振动筛配接受PCR管。摇动样品以1000rpm在37℃下24小时。
- 以下晃动，添加十二烷基肌氨酸钠，以2％的终浓度（重量/体积）和PK为100微克/毫升的最终浓度。消化的样品以1000rpm在37℃下进行1小时的热振动筛。
ñOTE：增加肌氨酸到的朊蛋白的C PK消化样品转换后的辅助工具。非种子选手的样品（步骤4.5）的假阳性信号加入肌氨酸的几乎消除。 - 加入SDS-PAGE样品缓冲液，热样品至95℃5分钟，并解决剩余的PrP 水库通过SDS-PAGE 16随后的免疫印迹17每个样品中。
注：在加入样品缓冲液和加热，样品可以被立即处理或样品可以储存在-20℃或-80℃之前，免疫印迹。使用NOVEX的NuPAGE凝胶和传输系统中生成这里介绍的所有数据。从CER测定各个样品分别用样品缓冲液，并根据制造商的说明还原剂。样品随后被加热到95℃5分钟和30微升各样品装入一个12％的Bis-Tris预制凝胶。 - 计算作为度量的转换效率比（CER）的物种屏障。朊病毒水库的通过光密度17测量水平和由该pH为3.5的样品的划分pH 7.4的样品的总密度。乘以100，以产生一个百分比。
- 从独立的实验重复编译数据，以产生一个平均的CER±标准为一种具有给定TSE剂偏差。
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Representative Results
成功使用CER测定的在很大程度上取决于在转化反应中使用的底物对的质量。出于这个原因，下面的过程以制备CER基板对，一个质量控制免疫应执行（ 图2）。对于两个基板，测定10-25微升通过免疫印迹。的PrP C应该容易检测在每个衬底和朊病毒C水平必须接近两者是相同的。免疫反应性将主要高于20 kDa的可见光，但较小频带也可以是显而易见的。根据我们的经验，更小的条带的存在是物种依赖性。如果较低分子量的产品中观察到，它们的存在应在两个基板对来确认。
确保CER基板不受内源的PrP 水库通过用PK处理基材（ 图2）是重要的。如果朊病毒水库是目前用于SUBST动物准备率可能已经TSE感染或亚临床感染。可替代地，朊病毒下在衬底可能已经在变性或沉淀程序错误折叠到PK-电阻状态。独立于原因，含有朊病毒水库 CER基底是不能接受的，在转化测定使用。
实验室小鼠是最经常使用的实验动物中的研究TSE中的一个;正因为如此，其易感性大多数传染性海绵状脑病是充分表征8，提供了一个在体内的基准，其中，以测试CER测定的保真度。 图3A给出的朊蛋白的C CER测定转化率从小鼠的结果（CD1株）基板朊病毒水库由1）小鼠传代痒病的RML毒株，试剂适于鼠标主机18，2）的国内羊痒病古典，可以传输到小鼠以下冗长潜伏期18的药剂，以及3）WHITE-尾鹿（ 白尾virginianus）来说 CWD和仓鼠传代痒病的263K应变，代理商到小鼠微创或不容易19,20。导致的PrP 水库水平均可变跨鼠标基板变性pH值7.4，接种各种TSE剂，而朊病毒水库被发现在所有基板变性pH值3.5，接种用TSE剂。比较朊病毒水库水平在pH为7.4和3.5基材转化率分别独立地计算的至少3倍，并意味着±标准差示于图3B。对于反应接种由RML，pH值7.4和3.5的基板之间的转换比例分别为约100％。对于那些接种由痒病，转换在pH7.4的底物的大约75％，在pH 3.5的衬底。 CWD或者pH值7.4基板263K诱导转化是最小的。方差单向分析无法区分RML和s的转换率有差别crapie或CWD和263K，RML和痒病但是转换率是显著不同于CWD和263K的。
到CER测定可适于与人体组织或动物物种，其中生物测定太有挑战性与否伦理和转基因小鼠生产是不希望使用的。我们一直用这个实验来描述各种野生动物物种CWD的易感性。由于使用该测定的一个例子，我们给出了一些初步结果在图4中。从猎人陷山猫（ 山猫鲁弗斯 ）脑被发现仍然含有朊病毒C和朊病毒降解产物的可检测的水平没有广泛，这表明这些组织可以成为CER基板（ 图4A）的可接受源。从山猫脑产生的基板对显示一个适当的分子量的PrP免疫反应性和不含有内源性的PrP 水库 （ 图4B）。当从两个不同的动物产生山猫CER基板对孵育相同 白尾鹿在图3中描述的小鼠的CER测定CWD剂使用时，我们发现，在pH 7.4制备的基片有朊病毒水库的水平相比，在pH制备的衬底3.5（ 图4C），表明了山猫的PrP 下用CWD最小的物种屏障的转换。的CER对于转换的白尾鹿的PrP 下通过同一CWD分离物用于转换山猫的PrP ^ c此处，作为阳性对照，先前被报告为在莫拉夫斯基等人95.2±18.4％。（2013）15。
图1：在CER测定的实验概要的两个测定衬底由部分变性的PrP 下在非朊病毒感染脑组织瓦特制备第i离液溶液在任一pH值3.5或pH 7.4。衬底从感兴趣朊病毒剂接种的PrP TSE和实验样品经受24小时温育摇动，以允许的PrP C到朊病毒TSE转换在两个pH值3.5和7.4的衬底。孵育后，转化率是通过SDS-PAGE和免疫印迹评估。信号密度由密度读取和CER是由pH为7.4至pH 3.5的信号密度为每一个实验样品的比率计算的。
图2：CER基板质量控制。 （A）中之前它们在CER测定法中使用，鼠标基板在任一pH值7.4或3.5制备的免疫印迹，在1）没有PK治疗评估的PrP C含量每个衬底对的测定（PRP C水平应介于等效pH值7.4和3.5 substra TES用于CER测定法中使用）和2）的PK存在（100微克/毫升）处理，以测试对于预先存在的PrP 水库中用来制备基材（即显示预先存在的PrP 水库不适合于使用的任何基质的组织在CER测定）。（B）的要测试的转化测定中的非特异性的PrP 水库形成，在任一pH值7.4或3.5制备小鼠的PrP C底物接种以转换缓冲，振荡24小时，以1000rpm，37℃下和随后的PK处理（100微克/毫升），并通过免疫印迹（右两个车道）测定朊病毒水库 。非动摇，非PK处理的小鼠基质代表法的反应（左两车道）总的PrP C含量。对于（B）中，不相关的线已经裁剪为清楚起见，但每个免疫板来自同一凝胶，膜和曝光导出。在所有面板使用免疫印迹单克隆抗体SAF 83。
图3：利用实验小鼠基质CER检测（A）鼠标CER检测基板准备在任一pH为7.4或3.5孵育RML鼠标适应痒病，国内羊痒病经典，白尾鹿慢性消耗性疾病（CWD）或263K株在CER检测仓鼠适应痒病。对照样品（标记为“无”）含有感染因子仅等量和没有鼠标衬底。样品进行PK抗性朊病毒蛋白（PrP的水库 ）的免疫印迹显示在每个泳道下面存在下与单克隆抗体的SAF 83.原始密度测量值对每个样品进行分析。（B）的棒图表示平均比率（±标准偏差） pH为7.4和3.5鼠标基板对每个感染因子之间基于至少3个独立的试验运行。小写字母是指统计学上同质的子集（方差与杜克 - 克莱默最小的意义区别的方法分析，P <0.05）。这个数字已经被修改莫拉夫斯基等2013 15。
图4：示例使用CER检测到山猫易感性研究，以CWD山猫脑匀浆（A）和CER检测基板（B）是在PK的缺乏和存在免疫印迹（100微克/毫升），以评估现有的PrP 下测定 。水平和预先存在的PrP 水库的存在下，分别（℃）山猫基材接种转换缓冲，并测定在CER测定以评估非特异性的PrP 水库形成（左泳道2）。非动摇，非PK处理山猫基板代表法的反应（右二车道）总的PrP C含量。无论是在pH为7.4或3.5编写（D）山猫基板培养使用的CER检测白尾鹿CWD。对照样品（标记为“无”）含有等量CWD剂，但没有山猫基板。对于每个样品的原始光密度值显示每个泳道如下。免疫印迹在所有板中使用的单克隆抗体3F4，其与所述猫科动物的朊病 毒蛋白21。
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Discussion
为了顺利完成本协议的，应注意所用的基板准备（步骤2.1.2）和种子底物比对转化反应（步骤4.4.2）未受感染的脑组织付给的PrP C水平。根据我们的经验，大脑可以提取用作CER基板大幅期间验尸后，只要朊病毒C是本通过免疫印迹（ 图4）。事实上，一些自溶观察用于CER研究山猫的大脑。然而，来自这些大脑衍生基板孵育仍然导致朊病毒水库的形成。我们推测，在一部分，CER测定的鲁棒性，从CER基板在1.5M的盐酸胍的变性，这将灭活许多蛋白酶衍生。
种子到衬底的比率可能需要凭经验确定通过免疫印迹，以获得可接受的PrP RES信号。太多或太升基板比例：ittle的PrP 水库为缺乏基材和不一致的转化率都是原因，以优化种子对照样品进行密度，高背景的PrP 水库的水平。变化保持100微升的总反应体积，并包括1:99微升，2:98微升和5:95微升。在几乎所有的情况下，我们已经发现，5:95微升种子：基板的体积比是最佳的。不管是什么比例的情况下，TSE剂等量的使用和检测是内在一致的。然而，用于模板的反应朊病毒感染脑乳剂的种子浓度可能影响该变种子滴度或稀释到CER测定的结果，可能会导致不同的朊病 毒Ç-to-朊病毒水库转化水平。这种效应已被证明在其他体外朊病毒转化测定法22和可能复杂化的不同朊病毒株的比较。为了解决这个问题，在CER检测，种子Ç乌尔德滴定的准备，在pH为3.5和7.4，以确定一个范围，模板的PrP c转换将稀释的每一个的PrP C制的基板。理想的种子稀释避免饱和与过量种子朊病毒的溶液，但提供的洞察转化反应的灵敏度。可替代地，朊病毒Ç-to-朊病毒水库中的CER测定反应转化率可能会在多个，定期的时间点在整个测定法期间被测量并绘制为速率转换的曲线，如同对读数进行实时聚合酶链反应（定量PCR）23和实时发抖诱导转化（RT-通创新中心）24测定。这样的读数可能允许物种界限更全面的解释，而且这种方法未来发展的一个有趣的焦点。
在这里介绍的协议中，我们使用低结合，薄壁PCR管，但我们也使用标准的1.5 ml微量离心管中的热 - 摇床装备这种类型的管子。不需要其他变化的协议，使用较大尺寸的管子。根据我们的经验，但是，我们有更多的PrP 水库的生产，更可重复的结果在低结合PCR管相比，1.5毫升管。而解释在PCR管的测定法的改进的性能是只推测在这个时候，根据结果表明该空气-水界面对于朊病毒纤维化25关键的，我们假设较小的管子提供更优化的表面张力为朊病毒转换。
也许首席限制使用的CER检测的是什么样的理解转换率代表体内的物种障碍因素，如疾病外显率或潜伏期长项。虽然之间的体外和体内的物种障碍的因素目前还不清楚，翻译应该更加明确，在测试ADDIT继续使用的CER检测的已经被建立在体内 ，将有助于物种出线结果，其中生物测定数据不可有理TSE物种界限。相比PMCA的CER测定的一个优点是对朊病毒的转换，即在pH为3.5衬底，其可以通过任何TSE剂被转换内部对照的存在。这种控制是价值的时候，目前还不清楚，如果有的话，TSE代理人应当引起异国情调的主机的朊蛋白错误折叠Ç。一个给定的主机衬底的无力扩增在PMCA特定TSE试剂可以被解释为一个物种屏障的证据或可能是由于技术缺陷。在CER检测的缺点相比，PMCA包括有限的PrP 水库 ，在CER基板准备额外的步骤，由CER反应产生的朊病 毒水库没有已知的感染性放大。但应注意的是，在先前的研究中，但是，我们发现，CER测定导致朊病毒水库的FO类似的模式细则第十五作为PMCA 15。此处呈现的结果还表明，CER测定正确预测的物种障碍，关于各种传染性海绵状脑病的传输到实验小鼠（ 图3），并建议山猫可以具有易感性CWD（ 图4），在与报告协议是家猫（ 猫猫 ）可以获取经过实验CWD挑战26,27朊病毒病。使用CER分析研究可以恭维的PrP测序工作，了解野生动物易感性CWD 28。
在CER检测能够快速，低成本， 体外 TSE物种界限可靠的评估。虽然不是完全替代动物生物检测的“金标准”，对CER检测可以作为一个TSE物种屏障，可能会辩解或避免进一步的研究活体动物的存在进行初步评估。出于这个原因，并且由于在测定仅依赖在其上可以从非实验动物获取脑组织，在CER是符合努力来代替，减少和缩小动物实验程序29。除了 评估物种障碍，所述的CER测定还可以提供与该调查的基本事件限定的朊病 毒疾病生物学机制的简化平台：正常，功能的PrP C的转换为错误折叠的形式。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 12% Bis-Tris SDS-PAGE gels | Life Technologies | NP0342 | |
| 0.5 mm Zirconium oxide beads | Next Advance | ZROB05 | Other varieties of beads are also effective |
| Antibodies | various suppliers | Select appropriate primary and secondary antibodies for immunoblot detection of PrPres from species of interest | |
| Bead homogenizer | Next Advance | BBY24M | |
| Centrifuge | Beckman Coulter | 369434 | High speed with temperature control |
| Conical tubes | any brand | ||
| Cotton-tipped applicator | Uline | S-18991 | |
| Cuphorn sonicator | Heat Systems-Ultrasonics | W-380 | Heat Systems-Ultrasonics, Inc. is now Qsonica, LLC |
| Densitometry software program | UVP | Vision Works LS Image Acquisition and Analysis software | Other programs, such as NIH ImageJ, will also work |
| Dounce homogenizer | Kimble Chase | 885300 | |
| End-over-end mixer | Labnet International | H5600 | |
| Ethylenediaminetetra acetic acid | Boston Bioproducts | P-770 | Hazardous chemical: eye irritation |
| Guanidine hydrochloride, 8 M | Thermo Fisher Scientific | 24115 | Hazardous chemical: acute toxicity, skin irritation, eye irritation |
| Heating block | Fisher Scientific | 11-718 | |
| Hydrochloric acid | Sigma-Aldrich | 435570 | Hazardous chemical: strong acid |
| Lithium dodecyl sulfate sample buffer, 4x | Life Technologies | NP0008 | Hazardous chemical: skin & respiratory irritation, serious eye damage, flammable solid |
| Methanol | Fisher Scientific | A454-4 | Hazardous chemical: acute toxicity, flammable liquid |
| Microcentrifuge tubes | any brand | ||
| Mini-centrifuge | Labnet International | C1301 | |
| N-lauroyl-sarcosine (sarkosyl) | Sigma-Aldrich | L-5125 | Hazardous chemical: acute toxicity, skin irritation, eye damage |
| Nonidet P-40 | Amresco | M158 | Hazardous chemical: skin irritation, eye damage |
| SDS-PAGE gel system | Life Technologies | NuPAGE electrophoresis system | Other SDS-PAGE systems will also work |
| PCR tubes (low-binding) | Axygen | PCR-02-L-C | |
| Pestle homogenizer | Fisher Scientific | 03-392-106 | |
| pH meter | Sentron | SI600 | |
| Polyvinyldifluoride membrane | Millipore | IPVH00010 | |
| Proteinase K | Promega | V3021 | Hazardous chemical: skin & eye irritation, respiratory sensitisation, organ toxicity |
| Reducing agent for SDS-PAGE samples, 10x | Life Technologies | NP0009 | |
| Sodium chloride | Fisher Scientific | 7647-14-5 | |
| Sodium deoxycholate | Sigma-Aldrich | D6750 | Hazardous chemical: acute toxicity |
| Sodium dodecyl sulfate | Thermo Fisher Scientific | 28364 | Hazardous chemical: acute toxicity, skin irritation, eye damage, flammable solid |
| Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | S5881 | Hazardous chemical; strong base |
| Syringe | BD Biosciences | various | Use syringe size appropriate to volumes of substrate to be homogenized |
| Syringe needles | BD Biosciences | various | |
| Thermoshaker (PCR tube shaker) | Hangzhou All Sheng Instruments | MS-100 | |
| Tris base | Bio Basic | 77-86-1 | Hazardous chemical: skin, eye, respiratory irritation |
| Triton X-100 | Integra Chemical Company | T756.30.30 | Hazardous chemical: acute toxicity, eye irritation |
| Vortexer | Fisher Scientific | 12-812 |
References
- Colby, D. W., Prions Prusiner, S. B. Cold Spring Harb Perspect Biol. 3 (1), a006833 (2011).
- Hill, A. F., Collinge, J. Prion strains and species barriers. Contrib Microbiol. 11, 33-49 (2004).
- Scott, M., et al. Transgenic mice expressing hamster prion protein produce species-specific scrapie infectivity and amyloid plaques. Cell. 59 (5), 847-857 (1989).
- Prusiner, S. B., et al. Transgenetic Studies Implicate Interactions between Homologous Prp Isoforms in Scrapie Prion Replication. Cell. 63, 673-686 (1990).
- Telling, G. C., et al. Prion Propagation in Mice Expressing Human and Chimeric Prp Transgenes Implicates the Interaction of Cellular Prp with Another Protein. Cell. 83, 79-90 (1995).
- Hill, A. F., et al. The same prion strain causes vCJD and BSE. Nature. 389 (6650), 448-450 (1997).
- Torres, J. M., et al. Elements modulating the prion species barrier and its passage consequences. PLoS One. 9 (3), e89722 (2014).
- Groschup, M. H., Buschmann, A. Rodent models for prion diseases. Vet Res. 39 (4), 32 (2008).
- Korth, C., et al. Abbreviated incubation times for human prions in mice expressing a chimeric mouse-human prion protein transgene. Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (8), 4784-4789 (2003).
- Kocisko, D. A., et al. Species specificity in the cell-free conversion of prion protein to protease-resistant forms: a model for the scrapie species barrier. Proc Natl Acad Sci U S A. 92 (9), 3923-3927 (1995).
- Raymond, G. J., et al. Evidence of a molecular barrier limiting susceptibility of humans, cattle and sheep to chronic wasting disease. EMBO J. 19 (7), 4425-4430 (2000).
- Fernandez-Borges, N., de Castro, J., Castilla, J. In vitro studies of the transmission barrier. Prion. 3 (4), 220-223 (2009).
- Zou, W. Q., Cashman, N. R. Acidic pH and detergents enhance in vitro conversion of human brain PrPC to a PrPSc-like form. J Biol Chem. 277 (46), 43942-43947 (2002).
- Li, L., Coulthart, M. B., Balachandran, A., Chakrabartty, A., Cashman, N. R. Species barriers for chronic wasting disease by in vitro conversion of prion protein. Biochem Biophys Res Commun. 364 (4), 796-800 (2007).
- Morawski, A. R., Carlson, C. M., Chang, H., Johnson, C. J. In vitro prion protein conversion suggests risk of bighorn sheep (Ovis canadensis) to transmissible spongiform encephalopathies. BMC Vet Res. 9, 157 (2013).
- JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Separating Protein with SDS-PAGE. , JoVE. Cambridge, MA. Available from: http://www.jove.com/science-education/5058/separating-protein-with-sds-page (2014).
- JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. The Western Blot. , JoVE. Cambridge, MA. Available from: http://www.jove.com/science-education/5065/the-western-blot (2014).
- Chandler, R. L. Encephalopathy in mice produced by inoculation with scrapie brain material. Lancet. 1 (7191), 1378-1379 (1961).
- Browning, S. R., et al. Transmission of prions from mule deer and elk with chronic wasting disease to transgenic mice expressing cervid PrP. J Virol. 78 (23), 13345-13350 (2004).
- Hadlow, W. J., Race, R. E., Kennedy, R. C. Experimental infection of sheep and goats with transmissible mink encephalopathy virus. Can J Vet Res. 51 (1), 135-144 (1987).
- Rubenstein, R., et al. Immune surveillance and antigen conformation determines humoral immune response to the prion protein immunogen. J Neurovirol. 5 (4), 401-413 (1999).
- Castilla, J., et al. Crossing the species barrier by PrP(Sc) replication in vitro generates unique infectious prions. Cell. 134 (5), 757-768 (2008).
- Kubista, M., et al. The real-time polymerase chain reaction. Mol Aspects Med. 27, 95-125 (2006).
- Atarashi, R., Sano, K., Satoh, K., Nishida, N. Real-time quaking-induced conversion: a highly sensitive assay for prion detection. Prion. 5 (3), 150-153 (2011).
- Ladner-Keay, C. L., Griffith, B. J., Wishart, D. S. Shaking Alone Induces De Novo Conversion of Recombinant Prion Proteins to beta-Sheet Rich Oligomers and Fibrils. PLoS One. 9 (6), e98753 (2014).
- Mathiason, C. K., et al. Susceptibility of domestic cats to chronic wasting disease. J Virol. 87 (4), 1947-1956 (2013).
- Seelig, D. M., et al. Lesion Profiling and Subcellular Prion Localization of Cervid Chronic Wasting Disease in Domestic Cats. Vet Pathol. , (2014).
- Stewart, P., et al. Genetic predictions of prion disease susceptibility in carnivore species based on variability of the prion gene coding region. PLoS One. 7 (12), e50623 (2012).
- Russell, W. M., Burch, R. I. The Principles of Humane Experimental Technique. Metheun. , Methuen. (1959).
