Introduction
Трансмиссивных губчатых энцефалопатий (ТГЭ, прионные болезни) являются группа фатальных нейродегенеративных заболеваний с длительный инкубационный период, которые влияют на разные виды животных и людей. Предполагаемый этиологический агент ЦЭС состоит из неправильно свернутых изомера хост прионного белка (PrP), который способен самораспространения по шаблону приводом конверсии нормального клеточного виде PrP (PrP C) в инфекционное, болезни, связанные Форма (PRP TSE), который накапливается в центральной нервной системе тканях инфицированного хозяина 1. Инфекционные прионы млекопитающих обычно передают от хоста к хосту в видоспецифического образом, что привело к концепции "TSE видовой барьер», который ограничивает события передачи межвидовой 2. Биологические детерминанты прионов видовой барьер не очень хорошо понял. Сходство аминокислотной последовательности между инфекционной PrP TSE и принимающей PrP C Cсильно влияют принимает ли преобразование разместить 3-5, но остается недостаточным для объяснения всех событий передачи прионов, наблюдаемые в естественных условиях 6,7.
Таким образом, характеристика TSE видов барьеров в значительной степени полагаться на животное призов исследований: подвергая наивные животных от данного вида прионов от другого и измерения результирующего время инкубации до начала заболевания и скорости атаки в качестве показателей эффективности передачи. Мыши, экспрессирующие PrP C от гетерологичных видов также используются для этого типа исследования 8. Расходы, связанные с трансгенных мышей и затяжных прионов биопробы, а также этических соображений использования животных, являются препятствием для экспериментального исследования TSE видов барьеров. Оценка видовой барьер человеческого ТГЭ опирается на мышах, чтобы выразить человеческую PrP C. Эти мыши требуют длительных периодов инкубации поддаваться человека ТГЭ или модификации Т-он человек молекула PrP C для быстрого начала болезни 9. Инкубационный период для не-человеческого ТГЭ у этих мышей может выходить за пределы нормального срока службы мыши делает интерпретацию отрицательных результатов сложных. Номера для человека приматов также используется в качестве прокси для изучения барьеров видов человека, но эти исследования чревато теми же проблемами, как и другие виды экспериментов на животных и приматов, возможно, не точно воспроизводят болезнь, как это происходит в организме человека.
Биопробы на животных остаются метод "золотым стандартом" для измерения восприимчивости видов на TSE, но препятствия, расходы и этика этих живых исследованиях на животных заставили расследование альтернатив. Количество анализов в пробирке, основанных на оценке превращение PrP C хозяина в протеиназы K (PK) резистентные состояние (PRP разрешением), когда засевали PrP TSE, были разработаны и использованы для исследования TSE Species барьеры 10-12. Примеры анализов в пробирке включают бесклеточных анализов преобразования, белок неправильного сворачивания циклической амплификации (PMCA), а коэффициент эффективности преобразования (CER) анализа 10-14. Хотя ни один из этих методов анализа не учитывают периферийных факторов, участвующих в видовых барьеров после естественной инфекции, все может быть полезно для выявления потенциально восприимчивых хозяев за ТГЭ.
Здесь мы представляем протокол для ССВ анализа, в котором два денатурированные субстраты PrP C, полученные из нормальных гомогенатах головного мозга используется в настольной реакций конверсии прионов (рис 1) 13. PrP C в субстрате денатурированный при рН 7,4 может быть преобразован только PrP разрешении по PrP TSE высевали в реакции в отсутствие какого-либо вида барьера 14. В отличие от этого, денатурация PrP C в другую подложку при рН 3,5 позволяет ему быть преобразованы в PRP Рез После инкубациис PrP TSE от любого вида и служит в качестве контроля для преобразования. Отношение конверсии PrP C в PrP разрешении в рН 7,4 по отношению к подложке, что рН 3,5 подложки обеспечивает меру видовой барьер. Мы обнаружили, что CER анализ предсказывает известных видов барьеров лабораторных мышей различных ТГЭ и использовали пробу в усилиях предсказать видовой барьер многочисленных видов млекопитающих, в том числе снежного барана, к хронической изнуряющая болезнь (УХО) и других ТГЭ 14, 15. Следователи заинтересованные в инструмент, позволяющий оперативно провести проверку TSE видов барьеров или оценки конверсии PRP ĉ -Чтобы-ПРП ВИЭ найти эту методологию полезной.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Животное работ, проводимых на USGS Национальный центр здравоохранения дикой природы был проведен в соответствии с NIH Управления принципов Лаборатория здоровья животных, и под институциональной ухода за животными и использование комитета протокол № EP080716. Ткани из охотников-добытых животных были подарки от Висконсина или Мичиган департаментов природных ресурсов.
1. Решение Подготовка
ПРИМЕЧАНИЕ: Приведенные ниже решения, необходимые для подготовки CER анализа субстрата в разделе 2 ниже. Подготовка каждого из этих растворов от более высокой концентрации исходных растворов; Рекомендуемые концентрации для маточных растворов будут даны в скобках после каждого соответствующего химического названия в списке. Подготовка всех решений свежие при подготовке субстрата и хранят при 4 ° С до использования.
- Для буфера для лизиса, приготовить раствор, следующих в 10 мМ Трис, рН 7,5 (1 M Трис, pH 7,5 раствор рекомендуется): 100 мм · сOdium хлорида (NaCl, 1 М раствор), 10 мМ этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА, 500 мМ ЭДТА, рН 8,0 раствор), 0,5% NP-40 (10% раствор), 0,5% дезоксихолат (DOC, 10% раствор ).
- Для буфера преобразования, приготовить раствор 0,05% додецилсульфата натрия (SDS, 10% основного раствора) и 0,5% Triton X-100 (10% основного раствора) в 1 фосфатным буферным раствором (PBS, 10, рН 7,4 раствор).
- Для хаотропных решений, подготовить два 3 М раствора гидрохлорида гуанидина (GdnHCl, 8 М акций) в 1x PBS (10x маточного раствора). Доводят рН одного из растворов до 3,5 ± 0,05 при помощи концентрированной соляной кислоты (HCl). Убедитесь, что рН раствора во втором остается при рН 7,4 ± 0,05 и регулировать с помощью концентрированной HCl и гидроокись натрия (NaOH), если необходимо.
2. Подготовьте ССВ Анализ подложки Пары
- Получить здоровых, не TSE-инфицированных тканей головного мозга от видов, представляющих интерес и подготовить 10% веса каждого тома(Масса / объем) гомогената в буфере для лизиса, используя любой из следующих методов: Даунса, шарик-стана или ступку и пестик гомогенизации. Уточнить результате гомогенаты, подвергая их, шприц-и-игл гомогенизации, используя иглы увеличением калибра, пока субстрат не может быть атмосферный и изгнали с легкостью через 27 G иглу шприца.
- Для подложках от грызунов и других мелких млекопитающих, гомогенизации весь мозг (ы); для субстратов, полученных из более крупных млекопитающих, использовать задвижки (ствола мозга) тканей для подготовки гомогенаты. При выборе количества гомогената мозга, не подготовить не более 50% от емкости центрифуги, используемой для осаждения белка на этапе 2.6.
- Если качество приобретенной ткани головного мозга под вопросом, оценки уровня PrP C помощью SDS-PAGE 16 и иммуноблот 17 до ПОДГОТОВКА ПОВЕРХНОСТИ.
- Разделить гомогената мозга на две равные объемы в отдельных меченых пластиковых конических пробирках. Добавить GdnHCl (3 М растворов в 1 PBS) в любом рН 3,5 или 7,4 в каждую пробирку в соотношении 1: 1 объема к гомогената мозга.
- Проверьте значения рН двух решений. Доводят рН рН 3,5 до рН субстрата ± 0,05 при помощи концентрированной HCl. Обеспечить рН другой подложке остается при рН 7,4 ± 0,05 и регулировать рН в случае необходимости с HCl или NaOH при необходимости. Во избежание превышения значения рН путем разумного добавлени кислоты или основания.
- Поверните решения на смеситель конец-по-конце при комнатной температуре (RT) в течение 5 часов.
- Осадок белка путем добавления четыре объемов метанола к подложке растворов в каждой конической трубе вихревые смешать хорошо, и инкубировать при 20 ° С в течение 16-18 ч.
- Образцы осадка центрифугированием при 13000 х г в течение 30 мин при 4 ° С. Тщательно слейте и отбросить супернатанты и позволяют метанола испаряться из гранул. Использование хлопка наконечником аппликатора, чтобы помочь в поглощении метанол прижалась к внутренней части трубки. Не позволяйте гранулы до более-DRу и как только метанол больше не видна, не переходите к следующему шагу.
- Ресуспендируйте белка гранулы в буфер преобразования. Использование количество буфера преобразования, равной сумме гомогената мозга исходного материала разливали в каждую пробирку на этапе 2.2.
ПРИМЕЧАНИЕ: Очень важно, чтобы буфер преобразования используется для ресуспендируйте белка гранул и от рН 3,5 и 7,4, обработанных препаратами подложки является решение, определенное в пункте 1.2 выше (который содержит низкие уровни моющих средств и физиологический рН). - Кратко соникатные решения подложке в cuphorn ультразвуком (10 сек при ~ 30% максимальной мощности), Алиготе в 0,5 - 1,0 мл объемов в маркированных 1,5 мл микропробирок. Выполните контроля качества иммуноблот (шаг 2,9) на аликвоты каждой подложки. Храните другие аликвоты при -80 ° С до готовности выполнять ССВ анализа (раздел 4).
- Осуществлять контроль качества на CER подложки пар перед применением (рисунок 2). Эти шаги гарантировать, что ССВ подложки будет Providе оптимальные результаты в исследованиях преобразования.
- Убедитесь, сравнимые количества PrP C в двух подложек. Сравнение уровней PrP в 10-25 мкл каждого субстрата с помощью SDS-PAGE и иммуноблоттинга 16 17. Если уровень белка в рН 7,4 и 3,5 субстраты в течение ~ 10% друг от друга, пары подложек являются подходящими для использования в ССВ исследований.
ПРИМЕЧАНИЕ: PRP-иммуноблоты не должны показывать свидетельство обширной деградации PrP C. PrP иммунореактивности должны быть в основном> 20 кДа. Полосы меньше этой молекулярной массой может быть продукты распада. ОБЛИЦОВКИ модели должна быть примерно эквивалентны между парами подложки. - Как PrP С в обоих субстратов должны быть чувствительны ПК, лечения 10-25 мкл каждого субстрата с ПК в конечной концентрации 100 мкг / мл и переварить образцов при 1000 оборотов в минуту при 37 ° С в течение 1 ч в термо-качалке. Оценить всю оставшуюся PrP сигнал на SDS-PAGE 16 и иммуноблоттингом 17.Подложки с PrP разрешении не подходят для использования в ССВ исследований.
- Убедитесь, сравнимые количества PrP C в двух подложек. Сравнение уровней PrP в 10-25 мкл каждого субстрата с помощью SDS-PAGE и иммуноблоттинга 16 17. Если уровень белка в рН 7,4 и 3,5 субстраты в течение ~ 10% друг от друга, пары подложек являются подходящими для использования в ССВ исследований.
3. Подготовить Семена TSE агента
- Получение TSE-инфицированных ткани мозга из видов интерес, и подготовить 10% (вес / объем) гомогената в 1X PBS, рН 7,4 с помощью методов, перечисленных в пункте 2.1 выше.
Примечание: Семена могут быть также получены из других TSE-инфицированных тканей за пределами центральной нервной системы, однако, эффективность преобразования мозга происходит субстратов, полученных из семян TSE-инфицированных периферических тканях еще не было экспериментально оценивали в опубликованной литературе. - Алиготе в результате гомогената (ы) в 100 - 300 мкл объемы в 0,5 мл микропробирок и хранить при температуре -80 ° С до готовности выполнять ССВ анализа.
4. CER Анализ
ПРИМЕЧАНИЕ: CER анализ включает добавление относительно небольшого количества PrP TSE (представленной в «семени») от одного видав относительного избытка ПОТ C (представленной в неинфицированных мозга "подложки") от другого вида, который был частично денатурированных в любом рН 3,5 или 7,4. После продолжительного встряхивания инкубационного периода, на основе шаблонов превращение PrP C в PrP TSE в каждой реакции оценивают с помощью денситометрического сигнала разрешения PrP, остающийся после PK пищеварения и обнаружения иммуноблот. Сравнивая PrP в законную уровни в основаниях ранее денатурированные при рН 3,5 по сравнению с 7,4 представляет собой меру видового барьера. Экспериментальный обзор этой процедуры анализа обеспечивается на фиг.1.
- Медленно разморозить неинфицированные пары ССВ субстрата (анализ требует равные объемы подложек ранее денатурируют при рН 3,5 и 7,4, и), и TSE-инфицированных семенных решений, помещая их в верхней части слоя льда (примерно 1 час времени оттаивания).
- После того, как полностью разморозить, аспирация, а затем изгнать каждый раствор субстрата через27 г иглу шприца несколько раз, чтобы вновь гомогенизации его. Кратко разрушать ультразвуком каждый TSE-инфицированных семян решение в течение 10 сек при ~ 30% максимальной мощности. Держите все решения на льду во время подготовки реакций конверсии.
- Этикетка 5 индивидуальных низким связыванием, тонкостенные пробирки ПЦР в TSE агента проходит испытания.
- Подготовка преобразования реакции в этих трубках путем добавления 5 мкл 10% TSE-инфицированного посевного раствора с 95 мкл (а) ССВ подложки, полученных при рН 7,4 и (б) ССВ подложки, полученного при рН 3,5.
- Для каждого опытного образца, подготовки параллельных реакций в ССВ пар подложки ранее денатурированные на обоих рН 3,5 и 7,4.
- Оптимизация соотношения TSE агента семян неинфицированному подложки мозга через эмпирического определения. Общие семян: коэффициенты подложки, используемой поддерживать общий реакционный объем 100 мкл, и включают в себя 1:99 мкл, 2:98 мкл и 5:95 мкл. Для большинства приложений, семя 5:95 мкл: отношение объема субстрата подходит и то, что представлено в гоэто протокол.
- Подготовка три контрольные образцы в TSE агента проходит испытания следующим образом: () добавить 5 мкл 10% TSE-инфицированной решения семян до 95 мкл буфера преобразования в качестве контроля для входных PrP ВИЭ; добавить 5 мкл буфера преобразования до 95 мкл субстрата, подготовленного на (б) рН 3,5 и (С), рН 7,4 в качестве контролей для неспецифической, Номера для шаблонного преобразования.
- Кратко вихрь каждого образца в закрытом ПЦР-пробирку, чтобы смешать семена и субстрат хорошо. Последующие с кратковременного импульса в низкоскоростном Настольные мини-центрифуге, чтобы удалить любой объем реакционной смеси, захваченного в крышке трубки ПЦР.
- Образцы нагрузка в отдельности, меченных ПЦР пробирок в настольной шейкера оборудованной принять ПЦР пробирок. Взболтать образцов при 1000 оборотов в минуту при 37 ° С в течение 24 ч.
- После встряхивания, добавление саркозила до конечной концентрации 2% (вес / объем) и ПК до конечной концентрации 100 мкг / мл. Образцы Дайджест в 1000 оборотов в минуту при 37 ° С в течение 1 ч в термо-качалке.
NПРИМЕЧАНИЕ: Добавление саркозила образцы пособий после преобразования в PK переваривания PrP C. Ложные положительные сигналы в раздающих образцов (Шаг 4,5) практически устраняется добавлением саркозила. - Добавить SDS-PAGE образца буфера, образцы тепла до 95 ° С в течение 5 минут и устранить оставшиеся PrP РЭС в каждом образце путем SDS-PAGE с последующим 16 иммуноблоттинга 17.
Примечание: после добавления буфера для образцов и нагрева, образцы могут быть немедленно обработана или образцы можно хранить при -20 ° С или -80 ° С до иммуноблоттинга. Все данные, представленные здесь, были получены с использованием геля и передачи системы Novex NuPAGE. Отдельные образцы из CER анализа были обработаны с буфером для образцов и восстановителя в соответствии с инструкциями изготовителя. Образцы затем нагревают при 95 ° С в течение 5 мин и 30 мкл каждого образца загружали в 12% Bis-Tris гели сборных. - Рассчитайте коэффициент эффективности преобразования (ССВ) в качестве мерывидового барьера. Уровни мера PrP разрешении по денситометрии 17 и разделить общую плотность пробы pH 7,4 с тем, что рН 3,5 образца. Умножьте на 100, чтобы получить процент.
- Компиляция данных из независимых экспериментальных повторов для создания среднего ССВ ± стандартное отклонение для вида с заданной TSE агента.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Успешное использование ССВ анализа во многом зависит от качества пар используемого субстрата в реакциях конверсии. По этой причине, после процедур для подготовки ССВ пары подложек, контроль качества иммуноблот должны быть выполнены (рисунок 2). Для обоих субстратов, анализ 10-25 мкл иммуноблоттингом. PrP C должна быть легко обнаружить в каждой подложки и уровни PrP C должна быть примерно такой же между ними. Иммунореактивность будет в основном видна над 20 кДа, но меньше полосы могут быть также очевидна. По нашему опыту, наличие небольших полос зависят от вида. Если наблюдаются более низкие рные продукты, их присутствие должно быть подтверждено в обоих парах субстрат.
Важно обеспечить, чтобы ССВ субстраты свободны от эндогенных PrP разрешении обработкой подложек ПК (Рисунок 2). Если PrP разрешением присутствует, животное, используемое для SUBSTподготовка ставка может быть TSE-инфицированных или бессимптомно инфицированных. С другой стороны, PrP C в субстрате может быть неправильно свернутых в PK-устойчивые состояния при денатурации или осаждение процедур. Независимо от причины, ССВ субстрат, содержащий PrP ВИЭ не приемлемы для использования в анализе преобразования.
Лабораторные мыши являются одним из наиболее часто используемых экспериментальных животных в научных исследованиях TSE; как таковой, их восприимчивость к большей ТГЭ хорошо характеризуется 8, обеспечивая стандарт в естественных условиях в отношении которых необходимо проверить верность ССВ анализа. 3А представлены результаты преобразования ССВ анализа ПОТ С от мыши (CD1 деформации) подложку PrP разрешением по 1) штамма РМВ мышиного-пассируют скрепи, агент адаптированы к хосту мыши 18, 2) домашние овцы классической скрепи, агент, который может передавать мышей после длительного периода инкубации 18, и 3) беTE-белохвостый олень (Odocoileus virginianus) УХО и 263K штамм хомяка-пассировать скрепи, агенты, к которым у мышей минимально или не восприимчивы 19,20. Полученные PrP в законную уровни были неодинакова субстраты мыши денатурированный при рН 7,4 и высевают с различными агентами TSE в то время как PrP разрешением был найден во всех субстратов денатурированный при рН 3,5 и высевают с агентом TSE. Коэффициенты конвертации сравнения уровней НРП ВИЭ в рН 7,4 и 3,5 подложках вычислили по крайней мере, три раза, и означает ± SD, показаны на рис 3B. Для реакций, посеянных на ОПМ, коэффициенты конвертации между рН 7,4 и 3,5 субстратов были примерно 100%. Для тех, высевают по скрепи, преобразование в рН 7,4 подложки был приблизительно 75%, что в рН 3,5 подложки. CWD или 263K-индуцированной конверсии рН 7,4 подложки была минимальной. Один путь анализа расхождений не мог отличить разницу в соотношениях конверсии ОПМ и сcrapie или УХО и 263K, однако Коэффициенты конвертации из RML и скрепи значительно отличаются от тех, УХО и 263K.
ССВ анализ может быть адаптирован для использования с тканями человека или животных с которой биопробы слишком сложным или нет этическим и трансгенные мыши производства не требуется. Мы используем данного анализа для характеристики чувствительности различных видов диких животных УХО. В качестве примера использования данного метода, мы представляем некоторые предварительные результаты на рисунке 4. Мозги из охотников-ловушки рыси (Lynx Руфус) были обнаружены еще содержит обнаруживаемых уровней PrP C и PrP продуктов распада не были обширными, предполагая, что это Ткани могут быть приемлемым источником ССВ подложки (фиг.4А). Субстрат пары, полученные от Bobcat мозга показали PrP иммунореактивности соответствующей молекулярной массой и не содержать эндогенные PrP Res (4В), При Bobcat ССВ пары подложек, полученные из двух отдельных животных инкубировали с тем же белохвостый олень CWD агент, используемый в мыши ССВ анализа, описанного на фиг.3, мы обнаружили, субстраты, полученные при рН 7,4 имели уровни PrP разрешении по сравнению с подложками, полученных при рН 3,5 (рис 4C), что свидетельствует о минимальном видовой барьер от Bobcat PrP C для преобразования по УХО. CER для преобразования белохвостый олень PrP C тем же УХО изолят используется для преобразования Bobcat PrP C здесь, в качестве положительного контроля, ранее сообщалось, как 95,2 ± 18,4% в Моравски и др. (2013) 15.
Рисунок 1:. Экспериментальное обзор ССВ анализа Два анализов субстраты готовят частично денатурации PrP C в не-прионов инфицированных тканей мозга WIth хаотропные решения на любом рН 3,5 или при рН 7,4. Подложки высевают с PrP TSE от прионов агента интерес и экспериментальные образцы подвергали 24 ч инкубации при встряхивании, чтобы PrP C PrP конверсии TSE в обоих рН 3,5 и 7,4 субстратов. После инкубации преобразование оценивали с помощью ДСН-PAGE и иммуноблоттинга. Плотность сигналов считываются с помощью денситометрии и ССВ рассчитывается по соотношению рН 7,4 до рН 3,5 плотностей сигнала для каждого экспериментального образца.
Рисунок 2: Контроль качества ССВ субстратов. (А) до их использования в анализе ССВ, субстраты мыши получают при любом рН 7,4 или 3,5, анализируют с помощью иммуноблоттинга в 1) отсутствие лечения PK оценки PrP C содержание каждой пары субстрата (уровни PrP C, должны быть эквивалентны между рН 7,4 и 3,5 substra TES для использования в ССВ анализа) и 2) наличие ПК (100 мкг / мл) лечение, чтобы проверить на уже существующие PrP ВИЭ в тканях, используемых для подготовки основания (любые субстраты, которые отображают предварительно существующие PrP разрешением не подходят для использования в ССВ анализ). (Б) Для проверки неспецифической формирования PRP Рез во время теста преобразования, мышь PrP C субстраты, полученные на любом рН 7,4 или 3,5 высевают с буфером преобразования, встряхивают в течение 24 ч при 1000 оборотах в минуту, 37 ° С , а затем ПК-обработке (100 мкг / мл) и анализируют на PrP разрешении с помощью иммуноблоттинга (правый две полосы). Номера для потрясен, не-PK обработанные подложки мыши представляют общее содержание PrP C в аналитическом реакций (слева две полосы). Для (В), не относящиеся к делу полосы были обрезаны для ясности, но каждый иммуноблот панели происходит от одной и той же гель, мембраны и воздействия. Иммуноблоты на всех панелях используется моноклональное антитело SAF 83.
Рисунок 3:. CER анализ с использованием лабораторного мыши субстрата () Мышь CER анализ субстрат подготовлен на любом рН 7,4 или 3,5, инкубировали с RML мыши приспособлены скрепи, домашние овцы классической скрепи, белохвостый олень хронический изнуряющая болезнь (УХО) или 263K Штамм хомяка приспособлены скрепи в ССВ анализа. Контрольные образцы (названием "None") содержит только равное количество инфекционного агента и не мыши подложки. Образцы анализировали на присутствие ПК-стойкого прионного белка (PRP Res) при помощи иммуноблота с моноклональное антитело SAF 83. Сырье денситометрических значений для каждого образца, изображенной ниже каждой полосы. (В) Бар график, показывающий средние коэффициенты (± стандартное отклонение) между pH 7,4 и 3,5 субстратов мыши для каждого инфекционного агента на основе по меньшей мере 3 независимых трасс анализа. Строчные буквы обозначают статистическиоднородные подмножества (дисперсионный анализ с методом Тьюки-Крамера различия минимальным значением; р <0,05). Эта цифра была изменена с Моравского и др. 2013 15.
Рисунок 4: Пример использования ССВ анализа для исследования Bobcat восприимчивость к УХО Bobcat гомогената мозга (А) и CER анализа субстрата (B) была проверена путем иммуноблоттинга в присутствии и отсутствии ПК (100 мкг / мл), чтобы оценить существующие PrP C. уровни и наличие уже существующих PrP РЭС, соответственно. (C) Bobcat субстраты засевали буфер преобразования и проанализированы в ССВ анализа для оценки формирования неспецифической PRP Res (слева две полосы). Номера для потрясен, не-PK обработанные Bobcat субстраты представляют общее содержание PrP C в аналитическом реакций (справа две полосы).(D) Bobcat субстрат подготовлен на обоих рН 7,4 или 3,5, инкубировали с белохвостый олень УХО с использованием ССВ анализа. Контрольный образец (обозначенный "ни") содержится равное количество УХО агента, но не Bobcat субстрата. Сырье денситометрические значения для каждого образца отображается ниже каждого переулка. Иммуноблоты во всех панелей используется моноклональное антитело 3F4, который реагирует с кошачьей прионного белка 21.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Для успешного завершения этого протокола, внимание должно быть уделено уровнях PrP C в неинфицированных тканей мозга, используемого для подготовки поверхности (шаг 2.1.2) и семян в подложку соотношение для преобразования реакций (шаг 4.4.2). По нашему опыту, мозг может быть извлечен для использования в качестве ССВ подложке после значительного периода посмертного тех пор, как PrP C присутствует иммуноблоттингом (рисунок 4). В самом деле, некоторые автолиза наблюдалось в мозгах рыси, используемых для ССВ исследований. Тем не менее, инкубирование субстратов, полученных из этих мозга еще привело к образованию PrP Res. Мы полагаем, что, в частности, устойчивость от ССВ анализа происходит от денатурации ССВ субстратов в 1,5 М GdnHCl, который инактивирует многие протеазы.
Семя к субстрату отношения, возможно, потребуется быть определены эмпирически, чтобы получить сигнал приемлемая PRP Рез иммуноблоттингом. Слишком много или слишком лittle PrP разрешением для выполнения денситометрии, высокий фон PrP в законную уровней в контрольных образцах, не имеющих основания и противоречивые коэффициенты конвертации все основания для оптимизации семян: коэффициенты основания. Вариации поддерживать общий реакционный объем 100 мкл, и включают в себя 1:99 мкл, 2:98 мкл и 5:95 мкл. Практически на все случаи, мы обнаружили, что 5:95 мкл семян: объемное соотношение субстрат является оптимальной. Независимо от того, что коэффициент применяется, равные количества TSE агента не используются, и анализ является внутренне непротиворечивым. Тем не менее, концентрация семя прионов-инфицированных гомогената мозга, используемого для реакции шаблонов, вероятно влияет на исход ССВ анализа в этой или иной семян титров или разведения может привести к различным уровням преобразования PrP C -Для-ПРП РЭС. Этот эффект был продемонстрирован в друга в пробирке анализов 22 преобразования прионов и может осложнить сравнения различных прионов изолирует. Для решения этой проблемы в ССВ анализа, семена сульд титровать в каждом PrP С основы подготовлен при рН 3,5 и 7,4, чтобы определить ряд разведений этого шаблона PrP C преобразование. Идеальное семян разведения избежать насыщения раствора с избытком семян прионов и еще дать представление о чувствительности реакции конверсии. С другой стороны, преобразование PrP C -в-PRP РЭС в реакции анализа ССВ может быть измерено в нескольких временных точках, регулярной в течение всего времени анализа и на графике как скорости из-преобразования кривых, сходных с показаниями для ПЦР в реальном времени ( КПЦР) 23 и в реальном времени трепетом индуцированной конверсии (RT-стро) 24 анализов. Такие показания могут позволить более комплексные интерпретации видов барьеров и интересно центре будущего развития этой методологии.
В протоколе, представленной здесь, мы используем низким связыванием, тонкостенные пробирки для ПЦР, но мы также использовали стандартные 1,5 мл пробирки в шейкера, оборудованной дляЭтот тип трубки. Никакие другие варианты к протоколу не требуется использовать труб большего размера. По нашему опыту, однако, у нас больше PRP Рез производства и более воспроизводимые результаты в условиях низкой связывания труб ПЦР по сравнению с 1,5 мл пробирки. Хотя объяснения улучшенной производительности анализа в ПЦР пробирок являются спекулятивными только в это время, основываясь на результатах, показывающих, что интерфейс воздух-вода имеет решающее значение для PrP fibrillization 25, мы предполагаем, что более мелкие трубки обеспечивают более оптимальную поверхностное натяжение для PrP преобразования.
Возможно, главный ограничение использования ССВ анализа является понимание того, что коэффициенты конвертации представляют с точки зрения IN VIVO видов барьеров детерминант, таких как пенетрантностью болезни или длины инкубационного периода. Хотя в настоящее время неизвестно, перевод между в пробирке и в естественных факторов видовой барьер должна проясниться при продолжении применения ССВ анализа в тестировании допРациональная TSE видов барьеров, которые уже были установлены в естественных условиях и помогут квалифицировать результаты видами, где биопроб данные отсутствуют. Преимущество ССВ анализа по сравнению с PMCA является наличие внутреннего контроля для преобразования PrP, а именно рН 3,5 подложки, который может быть преобразован с помощью любого агента TSE. Этот контроль имеет значение, когда неясно, какие, если таковые имеются, TSE агенты должны вызывать неправильного фолдинга экзотического хозяина PrP C. Неспособность данного хоста подложки для усиления конкретного TSE агента в PMCA может быть истолковано как свидетельство видовой барьер или может быть из-за технических недостатков. Недостатки ССВ анализа по сравнению с PMCA, включают ограниченный усиление PrP РЭС, дополнительных шагов в ССВ подготовки основания и без известной инфекционной в ПНР разрешении, произведенных ССВ реакций. Следует отметить, что в предыдущем исследовании, однако, мы обнаружили, что ССВ анализа привело к аналогичным образцу PrP разрешении FOия, как и PMCA 15. Представленные здесь результаты также показывают, что CER анализ правильно предсказывает барьеры видов, для передачи различных ТГЭ лабораторных мышей (Рисунок 3) и предполагают, что рыси могут иметь склонность к УХО (рисунок 4), в соответствии с сообщениями, что домашние кошки (Felis ЗАТО) может приобрести прионов болезни после экспериментального УХО вызов 26,27. Исследования с использованием ССВ анализа могут хвалить PrP усилия секвенирования, чтобы понять восприимчивость диких животных УХО 28.
CER анализ позволяет быстро, недорогой, надежной оценки TSE видов барьеров в пробирке. Хотя это и не полная замена для "золотого стандарта" животного биопроб, CER анализ может быть использован в качестве первоначальной оценки существования видовой барьер TSE, которые могут оправдать или устраняют дальнейшие исследования в живых животных. По этой причине, а также потому, что анализ основан толькона ткани головного мозга, которые могут быть приобретены из не-экспериментальных животных, CER в соответствии с усилиями по замене, сокращению и уточнить экспериментальные процедуры животных 29. В дополнение к оценке видов барьеров, CER анализ может также обеспечить упрощенную платформу с которой можно исследовать механизмы главное событие определяющим биологию прионов заболевания: преобразования нормальной, функциональной PrP С до неправильно свернутых формы.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 12% Bis-Tris SDS-PAGE gels | Life Technologies | NP0342 | |
| 0.5 mm Zirconium oxide beads | Next Advance | ZROB05 | Other varieties of beads are also effective |
| Antibodies | various suppliers | Select appropriate primary and secondary antibodies for immunoblot detection of PrPres from species of interest | |
| Bead homogenizer | Next Advance | BBY24M | |
| Centrifuge | Beckman Coulter | 369434 | High speed with temperature control |
| Conical tubes | any brand | ||
| Cotton-tipped applicator | Uline | S-18991 | |
| Cuphorn sonicator | Heat Systems-Ultrasonics | W-380 | Heat Systems-Ultrasonics, Inc. is now Qsonica, LLC |
| Densitometry software program | UVP | Vision Works LS Image Acquisition and Analysis software | Other programs, such as NIH ImageJ, will also work |
| Dounce homogenizer | Kimble Chase | 885300 | |
| End-over-end mixer | Labnet International | H5600 | |
| Ethylenediaminetetra acetic acid | Boston Bioproducts | P-770 | Hazardous chemical: eye irritation |
| Guanidine hydrochloride, 8 M | Thermo Fisher Scientific | 24115 | Hazardous chemical: acute toxicity, skin irritation, eye irritation |
| Heating block | Fisher Scientific | 11-718 | |
| Hydrochloric acid | Sigma-Aldrich | 435570 | Hazardous chemical: strong acid |
| Lithium dodecyl sulfate sample buffer, 4x | Life Technologies | NP0008 | Hazardous chemical: skin & respiratory irritation, serious eye damage, flammable solid |
| Methanol | Fisher Scientific | A454-4 | Hazardous chemical: acute toxicity, flammable liquid |
| Microcentrifuge tubes | any brand | ||
| Mini-centrifuge | Labnet International | C1301 | |
| N-lauroyl-sarcosine (sarkosyl) | Sigma-Aldrich | L-5125 | Hazardous chemical: acute toxicity, skin irritation, eye damage |
| Nonidet P-40 | Amresco | M158 | Hazardous chemical: skin irritation, eye damage |
| SDS-PAGE gel system | Life Technologies | NuPAGE electrophoresis system | Other SDS-PAGE systems will also work |
| PCR tubes (low-binding) | Axygen | PCR-02-L-C | |
| Pestle homogenizer | Fisher Scientific | 03-392-106 | |
| pH meter | Sentron | SI600 | |
| Polyvinyldifluoride membrane | Millipore | IPVH00010 | |
| Proteinase K | Promega | V3021 | Hazardous chemical: skin & eye irritation, respiratory sensitisation, organ toxicity |
| Reducing agent for SDS-PAGE samples, 10x | Life Technologies | NP0009 | |
| Sodium chloride | Fisher Scientific | 7647-14-5 | |
| Sodium deoxycholate | Sigma-Aldrich | D6750 | Hazardous chemical: acute toxicity |
| Sodium dodecyl sulfate | Thermo Fisher Scientific | 28364 | Hazardous chemical: acute toxicity, skin irritation, eye damage, flammable solid |
| Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | S5881 | Hazardous chemical; strong base |
| Syringe | BD Biosciences | various | Use syringe size appropriate to volumes of substrate to be homogenized |
| Syringe needles | BD Biosciences | various | |
| Thermoshaker (PCR tube shaker) | Hangzhou All Sheng Instruments | MS-100 | |
| Tris base | Bio Basic | 77-86-1 | Hazardous chemical: skin, eye, respiratory irritation |
| Triton X-100 | Integra Chemical Company | T756.30.30 | Hazardous chemical: acute toxicity, eye irritation |
| Vortexer | Fisher Scientific | 12-812 |
References
- Colby, D. W., Prions Prusiner, S. B. Cold Spring Harb Perspect Biol. 3 (1), a006833 (2011).
- Hill, A. F., Collinge, J. Prion strains and species barriers. Contrib Microbiol. 11, 33-49 (2004).
- Scott, M., et al. Transgenic mice expressing hamster prion protein produce species-specific scrapie infectivity and amyloid plaques. Cell. 59 (5), 847-857 (1989).
- Prusiner, S. B., et al. Transgenetic Studies Implicate Interactions between Homologous Prp Isoforms in Scrapie Prion Replication. Cell. 63, 673-686 (1990).
- Telling, G. C., et al. Prion Propagation in Mice Expressing Human and Chimeric Prp Transgenes Implicates the Interaction of Cellular Prp with Another Protein. Cell. 83, 79-90 (1995).
- Hill, A. F., et al. The same prion strain causes vCJD and BSE. Nature. 389 (6650), 448-450 (1997).
- Torres, J. M., et al. Elements modulating the prion species barrier and its passage consequences. PLoS One. 9 (3), e89722 (2014).
- Groschup, M. H., Buschmann, A. Rodent models for prion diseases. Vet Res. 39 (4), 32 (2008).
- Korth, C., et al. Abbreviated incubation times for human prions in mice expressing a chimeric mouse-human prion protein transgene. Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (8), 4784-4789 (2003).
- Kocisko, D. A., et al. Species specificity in the cell-free conversion of prion protein to protease-resistant forms: a model for the scrapie species barrier. Proc Natl Acad Sci U S A. 92 (9), 3923-3927 (1995).
- Raymond, G. J., et al. Evidence of a molecular barrier limiting susceptibility of humans, cattle and sheep to chronic wasting disease. EMBO J. 19 (7), 4425-4430 (2000).
- Fernandez-Borges, N., de Castro, J., Castilla, J. In vitro studies of the transmission barrier. Prion. 3 (4), 220-223 (2009).
- Zou, W. Q., Cashman, N. R. Acidic pH and detergents enhance in vitro conversion of human brain PrPC to a PrPSc-like form. J Biol Chem. 277 (46), 43942-43947 (2002).
- Li, L., Coulthart, M. B., Balachandran, A., Chakrabartty, A., Cashman, N. R. Species barriers for chronic wasting disease by in vitro conversion of prion protein. Biochem Biophys Res Commun. 364 (4), 796-800 (2007).
- Morawski, A. R., Carlson, C. M., Chang, H., Johnson, C. J. In vitro prion protein conversion suggests risk of bighorn sheep (Ovis canadensis) to transmissible spongiform encephalopathies. BMC Vet Res. 9, 157 (2013).
- JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Separating Protein with SDS-PAGE. , JoVE. Cambridge, MA. Available from: http://www.jove.com/science-education/5058/separating-protein-with-sds-page (2014).
- JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. The Western Blot. , JoVE. Cambridge, MA. Available from: http://www.jove.com/science-education/5065/the-western-blot (2014).
- Chandler, R. L. Encephalopathy in mice produced by inoculation with scrapie brain material. Lancet. 1 (7191), 1378-1379 (1961).
- Browning, S. R., et al. Transmission of prions from mule deer and elk with chronic wasting disease to transgenic mice expressing cervid PrP. J Virol. 78 (23), 13345-13350 (2004).
- Hadlow, W. J., Race, R. E., Kennedy, R. C. Experimental infection of sheep and goats with transmissible mink encephalopathy virus. Can J Vet Res. 51 (1), 135-144 (1987).
- Rubenstein, R., et al. Immune surveillance and antigen conformation determines humoral immune response to the prion protein immunogen. J Neurovirol. 5 (4), 401-413 (1999).
- Castilla, J., et al. Crossing the species barrier by PrP(Sc) replication in vitro generates unique infectious prions. Cell. 134 (5), 757-768 (2008).
- Kubista, M., et al. The real-time polymerase chain reaction. Mol Aspects Med. 27, 95-125 (2006).
- Atarashi, R., Sano, K., Satoh, K., Nishida, N. Real-time quaking-induced conversion: a highly sensitive assay for prion detection. Prion. 5 (3), 150-153 (2011).
- Ladner-Keay, C. L., Griffith, B. J., Wishart, D. S. Shaking Alone Induces De Novo Conversion of Recombinant Prion Proteins to beta-Sheet Rich Oligomers and Fibrils. PLoS One. 9 (6), e98753 (2014).
- Mathiason, C. K., et al. Susceptibility of domestic cats to chronic wasting disease. J Virol. 87 (4), 1947-1956 (2013).
- Seelig, D. M., et al. Lesion Profiling and Subcellular Prion Localization of Cervid Chronic Wasting Disease in Domestic Cats. Vet Pathol. , (2014).
- Stewart, P., et al. Genetic predictions of prion disease susceptibility in carnivore species based on variability of the prion gene coding region. PLoS One. 7 (12), e50623 (2012).
- Russell, W. M., Burch, R. I. The Principles of Humane Experimental Technique. Metheun. , Methuen. (1959).
