Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Хитозан / интерферирующих РНК наночастиц опосредованного молчания генов в развитии болезни Векторный личинки комаров

Published: March 25, 2015 doi: 10.3791/52523
Automatic Translation
*1, *2,3, 3,4, 1, 3,4, 5, 2,3,4
1Division of Biology, Kansas State University, 2Department of Medical and Molecular Genetics, Indiana University School of Medicine, 3Eck Institute for Global Health, University of Notre Dame, 4Department of Biological Sciences, University of Notre Dame, 5Department of Entomology, Kansas State University
* These authors contributed equally

Summary

Здесь мы описываем процедуру для ингибирования функции генов в вектор болезнь комаров посредством использования хитозана / интерферирующих РНК наночастиц, которые проглатывании личинками.

Abstract

Комарами-переносчиками нанести больший человеческие страдания, чем любой другой организм, - и убивают более одного миллиона человек каждый год. Комар генома проекты способствовали развитию исследований в новых гранях комаров биологии, в том числе функциональных генетических исследований на первичном африканского вектора малярии Anopheles gambiae и денге и желтая вектора лихорадка Комар желтолихорадочный. РНК РАДИОПОМЕХ (RNAi-) опосредованного молчание генов была использована для генов-мишеней, представляющих интерес в обоих этих переносчиков болезней видов комаров. Здесь мы опишем процедуру подготовки хитозана / интерферирующих РНК наночастиц, которые в сочетании с пищей и попадает в организм личинок. Это технически прост, высокая пропускная способность и относительно недорогой методики, который совместим с длинной двухцепочечной РНК (дцРНК) или малых интерферирующих РНК (киРНК) молекул, была использована для успешного нокдауна ряда различных генов в A. gambiae и А. AegyptiЛичинки. После личинок кормления, нокдаун, который проверяется с помощью Qrt-PCR или гибридизация, могут сохраняться по крайней мере до конца стадии куколки. Эта методика может быть применимо к широкому разнообразию комаров и других видов насекомых, в том числе вредителей сельского хозяйства, а также других не-модельных организмов. В дополнение к его полезности в научно-исследовательской лаборатории, в будущем, хитозан, недорогой, нетоксичного и биоразлагаемого полимера, потенциально может быть использована в поле.

Introduction

Кровь векторные кормления комаров родов малярийного и Aedine передачи болезнетворных агентов, ответственных за некоторые из худших бедствий человечества. По оценкам, 3,4 млрд человек находятся под угрозой заражения малярией, которая отвечает за более половины миллиона случаев смерти в год по всему миру. Результаты борьбы с малярией от инфекции Plasmodium Sp. Паразиты, которые передаются людям через укусы инфицированных комаров рода Anopheles, в том числе основной африканского вектора Anopheles gambiae ( http://www.who.int/topics/malaria/en/ , 2014) 1. Комар желтолихорадочный является основным вектором комаров для вируса денге, которая вызывает лихорадку денге, неспецифический лихорадочного заболевания, которое наиболее широко распространенным и значимым arboviral заболеванием в мире. Вирус денге в настоящее время угроза> 2,5 миллиарда человек в тропиках, с годовой incidenCE примерно 50 миллионов случаев, в результате ~ 24000 смертей в год ( http://www.cdc.gov/dengue/ , 2014) 2. Несмотря на разрушительное глобальное воздействие комарами заболеваний на здоровье человека, эффективные средства профилактики и лечения этих заболеваний не хватает. Борьба с комарами в настоящее время лучший способ профилактики заболеваний.

Потенциал для борьбы с членистоногими заболеваний, передающихся от генетического манипулирования векторных насекомых была признана на протяжении более четырех десятилетий 3. Трансгенные штаммы A. Aegypti инженерии, чтобы иметь репрессируемый женский конкретных фенотип нелетающих недавно сделали потенциал для использования трансгенных стратегий борьбы с переносчиками реальность 4-6. Эти достижения были оспорены исследователям в выявлении новых генетических задач по борьбе с переносчиками и дополнительных средств манипулирования функции гена в вектор комаров. Изменение экспрессии генов Dразвитие тором, как это было в случае с женщинами нелетающих комаров 4, может способствовать выяснению новых стратегий по борьбе с переносчиками. Тем не менее, в значительной степени из-за технических проблем, функции немногих генов, были охарактеризованы в процессе развития А. gambiae, А. Aegypti, или другие виды комаров.

С момента своего открытия в С. Elegans 7, РНК-интерференция (RNAi), которая сохраняется у животных, растений и микроорганизмов, широко используется для функциональных генетических исследований в самых разнообразных организмов, в том числе насекомых 8,9. РНК-интерференция путь инициируется Dicer, который расщепляет долгое дсРНК в короткие 20-25 нуклеотидных длиной миРНК, которые функционируют как последовательности конкретных интерферирующих РНК. siРНК, гены тишина, которые дополняют друг друга в последовательности, способствующие ускорению транскриптов, декольте, и нарушение перевод 9. Длинные молекулы дцРНК (обычно 300-600 б.п.) или пользовательские миРНК, направленные на particulaг последовательность может быть использована в научно-исследовательской лаборатории по глушителей любой интересующий ген. Управляя когда интерферирующих РНК доставлен, исследователи могут контролировать время, в которое ген глушителей посвященных. Это преимущество полезен, поскольку он может быть использован для преодоления проблем, таких как летальность развития или бесплодие, которые могут препятствовать производство и техническое обслуживание штаммов, несущих наследственные мутации, дорогой и трудоемкий процесс, который пока не имеется у всех видов насекомых. Хотя степень молчания генов путем РНК-интерференции может варьироваться от гена с геном, ткани к ткани, и животного к животному, RNAi широко используется для функционального анализа генов в комаров и других насекомых 8,9.

Три препятствующие стратегии доставки РНК были использованы в комаров: микроинъекции, впитывая / местного применения и приема внутрь. Для подробной истории и сравнения с использованием этих трех методов в насекомых, пожалуйста, обратитесь к Ю. и др 8. Wе успешно использовали микроинъекции 10 в качестве средства доставки миРНК целевой гены развития в А. Aegypti эмбрионы, личинки, куколки, так и 11-14. Тем не менее, это трудоемкий стратегия доставка требует и настройки микроинъекции и искусной рукой. Кроме того, микроинъекции это стресс для организма, сбивающий фактор, особенно когда поведенческие фенотипы будут оценены. Наконец, поставка микроинъекции не может быть расширено до поля для борьбы с переносчиками. В качестве альтернативы, замачивания в организм интерферирующих РНК решение также стало популярным средством индукции молчание генов, как это удобно и не требует большого оборудования или труда. Замачивание уже в основном применяются в клеточной линии насекомых изучает 8, но в недавнем исследовании, нокдаун был достигнут в А. Aegypti личинки погружают в раствор дцРНК 15, который животные, казалось, глотания. Тем не менее, для исследований, анализ нескольких experimentaл группы или фенотипы, замачивание, а дорого. Лопес-Мартинес и др. 16 описано регидратации приводом RNAi, новый подход к вмешательства доставку РНК, которая включает обезвоживание в солевом растворе и регидратации с одной капли воды, содержащей интерферирующих РНК. Такой подход не сократить затраты, связанные с целого животного погружения, но дороже, чем микроинъекции и может быть ограничено в своем применении к видам, которые могут выдерживать высокие осмотические давления. Кроме того, трудно представить себе, как погружение, или дегидратации / регидратации методики погружения может быть приспособлен для борьбы с переносчиками в этой области. По этим причинам, для пост-эмбриональных исследований, доставка интерферирующих РНК с проглоченной пищи жизнеспособной альтернативой стратегии.

Хотя стратегии приеме внутрь на основе не работать во всех видов насекомых, пожалуй, самое частности дрозофилы, оральный доставка интерферирующих РНК, смешанный с пищей способствовало гена сиlencing в различных насекомых 8,17, в том числе А. Aegypti взрослых 18. Мы описали хитозана наночастиц опосредованного RNAi в А. gambiae личинки 19 и успешно применил этот подход к снижению экспрессии генов в A. Aegypti личинки 20,21. Здесь методика этой процедуры RNAi, который включает в себя улавливания из интерферирующих РНК в полимерной хитозана, подробно. Хитозан / помехи наночастицы РНК образуются путем самосборки поликатионов с интерферирующих РНК с помощью электростатических сил между положительными зарядами аминогрупп в хитозана и отрицательных зарядов, переносимых фосфатных групп от основной цепи интерферирующих РНК 19. Процедура, описанная совместим с длинных молекул дцРНК (далее именуемые дсРНК) или двухцепочечной Серна (далее по тексту миРНК). После синтеза хитозан / помехи наночастицы РНК смешивали с пищей личинок и доставленЛичинки при приеме внутрь. Эта методика является относительно недорогим, не требует большого труда и оборудование 19, и способствует высокой пропускной анализ нескольких фенотипов, в том числе анализа поведения 20,21. Эта методика, которая может быть адаптирована для молчания генов исследований в других насекомых, в том числе других переносчиков болезней и насекомых вредителей сельского хозяйства, потенциально могут быть использованы для молчания генов в различных других видов животных. Кроме того, хитозан, недорогой, нетоксичный и биоразлагаемый полимер 22, потенциально могут быть использованы в области для конкретных видов борьбы с комарами.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Москит Виды и разведение

  1. Поддержание А. gambiae G3 и А. штаммы Aegypti Ливерпуль IB12 (используется в представительных исследований ниже) или другие штаммы проценты в соответствии со стандартной практикой лаборатории или как описано ранее 23,24.

2. дцРНК и миРНК Проектирование и производство

  1. Дизайн праймеров для построения длинных шаблонов дцРНК, специфичные для представляющего интерес гена. Используйте инструмент E-RNAi 25. Производят дцРНК в соответствии со способом выбора или как описано ранее 19.
    1. Для отрицательного контроля, синтезируют дцРНК 19, соответствующий последовательности зеленого флуоресцентного белка (GFP), β-галактозидазы (β-гал), или какой-либо другой ген не экспрессируется в комаров. Если это желательно, дцРНК 19 используется для генерации репрезентативные результаты, представленные ниже, могут быть использованы в качестве положительного контроля. Магазин дсРНК растворяли в РНКазы без воды при температуре -80 °; С до необходимости.
  2. Кроме того, конструкция гена конкретных миРНК соответствии со стандартной практикой лаборатории или, как описано ранее 10. Scramble последовательность бросовой миРНК для разработки негативное Серна управления, не соответствует ни гена комаров. Купите специальные миРНК, которые доступны через ряд авторитетных поставщиков.
    1. Если это желательно, siРНК, 20,21, используемых для получения репрезентативные результаты, представленные ниже, могут быть использованы в качестве положительных контролей. Магазин миРНК растворяли в РНКазы свободной воды при -80 ° С до использования.

3. Подготовка Хитозан / интерферирующих РНК наночастиц

  1. Собирают предварительно сделанный RT 100 мМ сульфата натрия (100 мМ Na 2 SO 4 в деионизированной H 2 O) и 0,1 М ацетата натрия (0,1 М NAC 2 H 3 O 2, -0,1 М уксусной кислоты, рН 4,5 в деионизированной H 2 O) буферы.
  2. Растворите хитозан (≥75%деацетилированный) в 0,1 М буфере ацетата натрия, чтобы сделать 0,02% (вес / объем) рабочего раствора и держать раствор при комнатной температуре перед использованием.
  3. Растворите дсРНК или Серна в 50 мкл деионизированной H 2 O и добавить его в 100 мМ сульфата натрия буфера, чтобы сделать 100 мкл раствора 32 мкг дсРНК / миРНК в 100 мкл 50 мМ сульфата натрия.
  4. Добавить 100 мкл раствора хитозана в растворе дцРНК / миРНК, а затем нагревать смесь на водяной бане при 55 ° С в течение 1 мин. Настройка контроль, добавляя 100 мкл 50 мМ сульфата натрия до 100 мкл раствора хитозана и выполните ту же процедуру.
  5. Сразу Смешайте решения в течение 30 сек по высокоскоростным встряхиванием при комнатной температуре, чтобы способствовать формированию наночастиц.
  6. Центрифуга смеси при 13000 х г в течение 10 мин при комнатной температуре, после чего осадок должен быть виден. Передача супернатант в новую пробирку 1,5 мл. Высушите гранул для ≈10 мин при комнатной температуре перед использованием, чтобы подготовить комаров пищу.
  7. Measure концентрацию дсРНК / миРНК в надосадочной жидкости с использованием супернатанта из-под контроля (см 3.5), как пустым, чтобы рассчитать общее количество дсРНК / миРНК, которые остались в надосадочной жидкости. Использование разницу между количествами исходных дцРНК / миРНК и остающихся в надосадочной жидкости, чтобы вычислить процент дцРНК / миРНК захваченный в наночастицах количествах. Эта эффективность загрузки, как правило, более 90%.
  8. Повторите ту же процедуру, если больше наночастицы необходимости. Сразу же использовать сушеные наночастиц. Воздействие холодного хранения частиц до использования не была оценена.

4. Подготовка Москитная пищевые продукты, содержащие хитозан / интерферирующих РНК наночастиц

  1. Подготовка 1 мл 2% раствора агарозы (вес / объем) в деионизированной воде, расплавить агарозу, и держать расплавленного раствора агарозы в 55 ° С на водяной бане в перед использованием.
  2. Смешайте пищевые хлопья рыбы (47% сырого протеина, мин. Сырой жир 10%, макс. Сырой клетчатки 3%) и сухих дрожжей вСоотношение 2: 1 (вес / вес). Измельчите смесь до мелких частиц с помощью ступки и пестика (проходимой через N 50 США стандартной тестовой сито). Используйте заземляющий пищу, которая должна быть коричневого цвета, либо сразу, либо хранить его в плотно закрытой таре при 4 ° С в течение нескольких недель.
  3. В 1,5 мл пробирку, перемешать 6 мг первом пищи с высушенными наночастиц из раздела 3.7 с помощью зубочистки.
  4. Добавить 30 мкл 2% до расплавленного агарозном геле решения пищевой наночастиц смеси; перемешать немедленно и тщательно с помощью зубочистки или пипетки чаевые.
  5. Используйте гель, содержащий продукты питания и наночастицы сразу же кормить личинок комаров. Кроме того, после того, как гель полностью затвердевает при комнатной температуре, хранить гель при 4 ° С и используют на следующий день, или при -80 ° С для последующего использования.

5. Кормление личинок комаров с пищей, содержащей хитозан / интерферирующих РНК наночастиц

  1. Кормление А. gambiae личинки комаров:
    1. Снимите сиngle гель осадок от 1,5 мл трубки с помощью зубочистки и нарезать его на 6 равных кусочков, используя чистую лезвие бритвы или зубной выбор.
    2. Передача 20 третий возрастной стадии личинки в 500 мл чашку Петри, содержащую 100 мл деионизированной воды.
    3. Поток личинки комаров, добавив один кусочек геля гранулы (мелко нарезанный на мелкие кусочки) на чашку Петри один раз в день в течение четырех дней. Обязательно соблюдайте личинки, питающиеся гранулы, которые должны быть значительно уменьшены в размерах или полностью отсутствующего на следующий день. По истечении времени, комары будут развиваться в конце четвертого личинок возрастной стадии.
    4. Запишите каких-либо видимых фенотипических изменений во время эксперимента. Изучить уровни транскриптов и другие фенотипические изменения, как описано в разделе 6 в конце четыре дневного периода.
  2. Кормление А. Aegypti личинки комаров:
    1. Отрежьте гель осадок на 6 равных кусочков, используя чистую лезвие бритвы или зубочистку.
    2. Поместите 50 возрастных синхронизированы 24 часа после яйца инкубационные Fiсначала личинки младших возрастов в чашку Петри в ≈40 мл деионизованной воды.
    3. Личинки один кусочек на чашку Петри в течение 4 часов / день, а затем перенести личинок обратно на обычный личинок рационе 2: 1 Площадь корма для рыб хлопья и сухие дрожжи для остальной части дня. Повторите процедуру ежедневно в течение четырех личиночных возрастов.
    4. Проверьте уровень транскриптов и других фенотипические изменения, как описано в разделе 6 в желаемых развития временных точках.

6. Подтверждение Нокдаун гена

  1. Относительная стенограмма количественного определения Qrt-ПЦР в А. Aegypti и А. gambiae личинки.
    1. Выполнение и анализ Qrt-ПЦР с тремя биологических повторностей по меньшей мере, 10 объединенного контроля против экспериментального личинок, как описано 11,19,20, или в соответствии со стандартной процедурой лабораторной. Представитель результаты приведены ниже.
    2. Для анализа части особый тип ткани / тела (т.е.., Головного мозга или антенны), PERFORM Qrt-ПЦР, как описано в 6.1.1 следующего рассечения восстановить интересующей ткани (например, см Майсур и др. 21).
  2. Подтверждение нокдаун в гибридизация
    1. Синтезируют дигоксигенин-меченого антисмысловых управления рибозонды соответствии со стандартной практикой лаборатории или 26, как описано.
    2. Выполнить в гибридизация в протоколе Хауген и др. 27 для подтверждения парализующим, как описано выше 11,20 и обсуждаются в разделе ниже репрезентативные результаты.
  3. Подтверждение нокдаун иммуногистохимии
    1. Если антитела против белкового продукта гена целевого имеются, выполняют иммуногистохимии, как описано ранее 28, что облегчает идентификацию особей с самых больших уровней нокдауна для анализа фенотипа 20 в качестве примера в representatiве результатов разделе ниже.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

А. gambiae:

Наночастицы хитозана / дцРНК формируются за счет электростатического взаимодействия между аминогруппами хитозана и фосфатными группами дсРНК. Эффективность дцРНК включения в наночастиц, как правило, выше 90%, как измерено с истощением дцРНК из раствора. Силовой микроскопии изображений с атомным показывают, что хитозан-дцРНК в среднем размер частиц 140 нм в диаметре, от 100-200 нм (рис 1).

Рисунок 1
Рисунок 1. Формирование наночастиц хитозаном и интерферирующих РНК. Атомно-силовая микроскопия образ хитозан / дсРНК наночастиц (А) или раствора хитозана без того дтРНК (B). Размер изображений составляет 1,0 мкм × 1,0 мкм. Масштабная линейка = 250 нм.e.com/files/ftp_upload/52523/52523fig1large.jpg "TARGET =" _ пустое "> Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой цифры.

Кормление из этих частиц, которые в сочетании со стандартной личиночного корма и включены в агарозы поддерживает нормальную для развития личинок. Важно отметить, что конкретных нокдаун эктодермы AgCHS1 транскриптов, а также средней кишки конкретных AgCHS2 (фиг.2) можно 19, демонстрируя, что дцРНК обрабатывают при проглатывании наночастиц инициирует RNAi за кишки. Нокдаун эффективность ≈40-60% наблюдались (например, рис. 2) и варьируются от транскриптов.

Фиг.2
Рисунок 2. Уровни транскрипции хитина синтазы 2 (AgCHS2) после дсРНК приема в <EM> А. gambiae личинки. Относительные уровни мРНК AgCHS2 у личинок кормят наночастиц с синдромом Дауна AgCHS2 или управления DS GFP. Данные представлены в виде среднего ± SD из трех независимых биологических повторяет. Различные буквы на брусьях, указывают на значительные различия на основе парных т испытаний (р = 0,003).

Нокдаун AgCHS1 значительно снижается общее содержание хитина четвертого личинок возрастной стадии и увеличение восприимчивости к ингибитор синтеза хитина инсектицида, дифлубензурон 19, Нокдаун AgCHS2 значительно увеличилось влияние calcofluor белого и дитиотреитол который нарушил перитрофической матрицу (ПМ) в четвертом возраста Личинки (Рисунок 3) приводит к увеличению смертности 17.

Рисунок 3
AgCHS2 внутрь наночастиц на А. gambiae перитрофическая матрица (PM) проницаемость. Calcofluor белый или DTT лечение нарушает Премьер-министр А. gambiae личинки, которые в дальнейшем exuberated по AgCHS2 нокдаун при проглатывании хитозана / дсРНК наночастиц 19. () Москитная с исправным PM. (B) Москитная с нарушенной PM, декстран синий протекает в желудочном ceacae.

А. Aegypti:

Хитозан / наночастицы миРНК были использованы для целевой ген аксонов Semaphorin-1a (sema1a) во время А. Aegypti развитие личинок 20. Нокдаун sema1a было подтверждено через гибридизация, который распознается снижения уровня sema1a в ≈60% личиночной мозги задницуessed и не удалось обнаружить sema1a выражение в ≈40% нокдауна головного мозга животных (рис 4C против B, желтый стрелка указывает антенной доле). Qrt-ПЦР, выполненные на объединенных целых животных показали, что этот метод привел к сокращению 32 sema1a транскриптов ± 10% по сравнению с контролем-наночастиц кормили животных (4А; P <0,01 на основе сопряженного т тест, N = 5, где N это количество биологических повторностей). Нокдаун в головном мозге сохраняется по крайней мере 24 ч куколки развития, о чем свидетельствует потере экспрессии антитела анти-Sema1a (фиг 4E1 против D1), который был использован для идентификации животных со значительным нокдаун во личинок и куколок обонятельные фенотип анализ. Личинок и куколок усиковые дефектов доли (количественно в таблице 1), были обнаружены в sema1a нокдаун личинок и куколок (фиг 4e2, Е3 против (рис 4E2 против D2, визуализированы с mAbnc82; накладки обоих сигналов показаны на рис 4D3, E3). Сопоставимые фенотипы были получены с двумя отдельными sema1a нокдаун миРНК, которые помогли обеспечить, что дефекты, наблюдаемые не были результатом за пределы участка таргетирования либо миРНК. Были получены самые высокие уровни нокдауна, когда миРНК были объединены, стратегии, которые могут быть использованы для увеличения нокдаун эффективности (см Майсур и др. 20 для более подробной информации).

Рисунок 4
Рисунок 4. Хитозан / миРНК индуцированной нокдаун sema1a в развивающихся обонятельной системы А. Aegypti. Qrt-ПЦР () и гибридизация (B, C) ​​анализы подтвердили нокдаун sema1a у личинок кормили смесью sema1a таргетирования миРНК 890 и Серна 1198 хитозана / интерферирующих РНК наночастиц против наночастиц управления. Потеря выражения Sema1a в результате клубочков, которые в деформированном состоянии (E1-3 против D1-3). Подробности в тексте. Спинной составляет на всех панелях. Масштабная линейка = 25 мкм. Эта цифра впервые появилась в Майсур и др 20. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой цифры.

Личинки Куколки
миРНК N <STRONG> дикого типа AL дефекты N Дикого типа AL дефекты
Контроль 69 69 (100%) 0 (0%) 68 68 (100%) 0 (0%)
sema1a KD 77 42 (54,5%) 35 (44%) * 75 51 (68%) 24 (32%) *

Таблица 1. Количественное усиков дефектов лепестков следующих sema1a нокдаун. Скомпилирован резюме результатов, полученных для управления миРНК против sema1a нокдаун (KD) миРНК 890 + миРНК 1198 хитозана наночастиц кормили животных из в общей сложности восемь повторных экспериментов, выполненных как в личинок ( слева) и куколки (справа) показан. Общаячисло лиц, начисленных (п), и номера / проценты животных, где отображаются дикого типа морфологию против антенной доле (AL) дефектов (обонятельный нейрон рецептора, направленных дефектов, дефектные нейропиля и клубочки образования) указаны. Нокдаун был проверен иммуногистохимически с анти Sema1a окрашивания антител в подгруппе животных (15 личинок и куколок 10), которые отображены самые тяжелые дефекты (обозначается *). Все нокдаун животные оцениваются таким образом было установлено, что снижение уровня Sema1a, в то время как уровни Sema1a в контрольных кормили животных не заметно изменяется. Эта таблица первоначально появился в Майсур и др 20.

Во втором исследовании 21, хитозан / наночастицы миРНК были использованы для целевой транскрипционный фактор целеустремленной (SIM) при разработке обонятельной системы. Qrt-ПЦР с объединенным мозга вырезали у всех животных показали, что сим нокдаун мозги были в среднем на 47% reducti вна в сим-транскриптов в сравнении с контрольной наночастиц кормили животных (р = 0,005 на основе парного критерия Стьюдента). Сопоставимые пробы с антеннами, выявленные в среднем снижение сим уровнях 77% по отношению к управлять подачей животных (р = 0,002 на основе парного критерия Стьюдента). Несмотря на некоторую изменчивость в уровнях нокдауна между тканями и животных, сим стенограммы не были обнаружены через гибридизация в ≈50% от нокдауна головного мозга животных / антенн после лечения с любым из двух различных миРНК нокдаун (рис 5B2, B3, C2, С3 против B1, C1, Таблица 2). В дрожжевых поведенческих тестах, в течение которого лица, которые были привлечены к дрожжей были награждены 1 балл, в то время как животные, которые не были привлеченные дали оценку 0, средний балл для сима 430 или SIM 718 нокдаун животные сиgnificantly ниже, чем у контрольных животных кормили в два повторных экспериментов (фиг.5А; p <0,001 на основе сопряженного т тест). Дефектные запаха отслеживания поведения (5А) коррелирует с пониженным содержанием SIM в антенн (рис 5B2, В3 по сравнению с B1) и мозга (фиг 5C2, С3 против C1, желтые точки отметить периметр антенной доле; табл 2 для количественной оценки результатов). Несколько дефекты были выявлены в антеннах и усиков долей сим бросовым животных (см Майсур и др 21. Для деталей). Например, сим нокдаун личинки и куколки не хватало экспрессии Орко, облигатным корецептором для всех пахучих рецепторов в обонятельных нейронов рецепторов (рисунок 6). Снижение уровня транскриптов ORCO были обнаружены у лиц, получавших SIM 430 ( Рисунок 6А3, B3) или сим 718 (рис 6A4, B4) нокдаун (KD) хитозан / наночастицы миРНК (по сравнению с животными дикого типа на рисунке 6A1, B1 и контролировать хитозана / миРНК наночастиц кормили животных в рисунке 6A2, B2). Потеря экспрессии Orco фенотипа, наблюдаемого в L4 личинок (рис 6A1-А4) сохраняется по меньшей мере через 24 ч после формирования куколки (рис 6B1-B4).

Рисунок 5
Рисунок 5. сим нокдаун личинки шоу неисправен запах аттрактанта поведение. В гибридизация показали снижение уровня сим РНК в антенн (B2, B3) и мозги (С2, С3) сим 430 и сим 718 нокдаун животные (сравните контролировать кормили в B1, C1), которые не реагируют на дрожжи одоранта приманки (A). Подробности в тексте. Проксимальные концы антенн ориентированы вверх B1-B3. Спинной ориентирован вверх в С1-С3. Масштабная линейка = 25 мкм. Эта цифра впервые появилась в Майсур и др 21. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой цифры.

Рисунок 6
Рисунок 6. Потеря выражения ORCO в развивающихся А. Aegypti антенна после нокдауна SIM-карты. Снижение уровня ORCO стенограммы были обнаружены у лиц Fed с сим 430 (A3, B3) или сим 718 (A4, B4) нокдаун (КД) хитозан / наночастицы миРНК (по сравнению с животными дикого типа в A1, B1 и контролировать хитозана / миРНК наночастиц кормили животных в A2, B2). Подробности в тексте. Масштабная линейка = 25 мкм. Эта цифра была составлена ​​из изображений, опубликованных в Майсур и др 21. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой цифры.

Привлеченные Не привлекает
миРНК N # Животные Нормальный Умеренный Нуль # Животные Нормальный Умеренный Нуль
Контроль 195 196 (100%) 196 (100%) 0 0 0 0 0 0
сим 430 KD 176 63 (35%) 48 (76%) 15 (24%) 0 113 (64%) 20 (18%) 12 (11%) 81 (71%)
сим 718 KD 177 66 (37%) 44 (66%) 22 (34%) 0 111 (63%) 20 (18%) 9 (8%) 82 (74%)

Таблица 2. Уровеньх сим коррелируют с личиночной производительности на дрожжах поведения анализа. скомпилированного сводку результатов, полученных в четырех дрожжей одоранта аттрактанта повторить эксперименты показано. Общее количество животных (N) указывает количество индивидуальных личинок, которые были протестированы в этих поведенческих тестах. Индивидуального личинок номер (# Животные), которые были привлеченные (слева; животные, которые коснулись дрожжи осадок и были награждены 1 балл) или не привлекает (справа; животных, которые не касаются дрожжи осадок и получил оценку 0) при каждом условии (Control, сим 430 KD или сим 718 KD хитозан / миРНК наночастиц кормили) показаны, и проценты от общего числа животных включены следующие исходные числа. Нокдаун сим оценивали через гибридизация в мозге и усики животных привлекает (слева) или не привлекает (справа) на дрожжах.сырой номер / процент людей с нормальной (сравнимо с дикого типа сим уровни транскриптов), Null (не наблюдается сим стенограмма) или умеренной (снижается, но не дикий тип) сим уровни обозначены. Потеря сим хорошо коррелирует с отсутствием влечения к дрожжей. Эта таблица первоначально появился в Майсур и др 21.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Хитозан / вмешательства РНК методики описаны здесь в виде наночастиц был использован эффективно генов-мишеней при развитие личинок в А. gambiae (рис 2, 3) и А. Aegypti (рис 4, 5, 6, Столы 1, 2). Хитозан наночастицы могут быть получены либо с длинной дцРНК или миРНК, оба из которых были успешно использованы в комаров, о чем свидетельствуют представительных результатов, описанных здесь. Синтез дсРНК дешевле, чем при покупке Серна, но более трудоемкий. Если хитозан / миРНК используется, фенотипы могут быть подтверждены с несколькими миРНК, что позволяет лучше уверенности, что фенотип обнаружили не из-за пределы участка таргетинга. Кроме того, промышленное производство миРНК массово может лучше способствовать расширению хитозана / интерферирующих РНК молчание для конкретного вида борьбы с комарами в поле. Это, конечно, потребует преодоления obstaCles такие как стоимость и доставки.

Хотя мы наслаждались хорошей успех с этим протоколом, методологии должны быть оптимизированы для каждого гена. По этой причине, мы рекомендуем проверить несколько миРНК, или, возможно, один Серна и длинный дсРНК, в начале нового проекта. После того, как фенотипы определены и подтверждены, по крайней мере, два различных миРНК, соответствующие интересующего гена, может быть полезно объединить эти siРНК, чтобы увеличить фенотип пенетрантностью (фиг.4). Время, а также длительность хитозана / помехи время подачи РНК может быть оптимизирована для каждого исследования. А. gambiae развиваться, когда подается только с хитозаном / интерферирующих РНК пищу, как описано здесь. Тем не менее, в опытах мы провели на сегодняшний день, А. Aegypti не повезло и без дополнительного питания, проблемы мы преодолели путем передачи их в рацион обычную пищу через 4 ч хитозана / интерферирующих РНК питания. Экспериментируя с хитозаном / вмешательстваДоставка РНК в другом пищевой подложки, которые мы еще не пытались, может обойти эту проблему. Мы обнаружили, что 4 ч ежедневно кормление в течение нескольких дней приводит к хорошим балансом между нокдауна и адекватное питание, но модификация длительности подачи могут осуществляться дополнительно по желанию. Кроме того, личиночного возраста, в котором хитозан / вмешательства кормления наночастиц РНК инициируется / продолжение может быть адаптирована для каждого эксперимента в зависимости от критического периода развития, в котором функции гена обследует, одним из основных преимуществ данного протокола.

Проверка нокдаун, конечно, критической, но может также потребовать неисправностей. По этой причине, это может быть полезно, чтобы одновременно проверить, если генерируются как нокдаун эффективность оценивается фенотипы интерес. Для экспериментов проверки Qrt-PCR, очень важно, чтобы праймеры и условия ПЦР оптимизирована. Кроме того, важно, чтобы животные с развитиемсинхронизированы в начале эксперимента, как выражение некоторых транскриптов может быть очень динамична при разработке и вследствие циркадных ритмов 29. Кроме того, в то время как этот метод, очевидно, порождает нокдаун за кишечнике, мы только начинаем оценивать тканей, для которых этот метод является эффективным, и это может меняться в зависимости от вида. Поэтому будет полезно для измерения нокдаун в частности тканей, которые могут быть достигнуты путем вскрытия тканей, представляющих интерес с целых животных для Qrt-ПЦР, либо путем гибридизация (рис 4-6) 20,21 и иммуногистохимии (Рисунок 4) 20 Анализы (см Хауген и др., 27 и др Clemons. 28, соответственно, для устранения этих протоколов). С нокдаун варьируется от человека к человеку, это полезно для выполнения двойной маркировки анализов для оценки фенотипа в сочетании с бросовым уровней (FIGUповторно 4) 20, что значительно облегчает фенотип характеристику. Для поведенческих исследований, нокдаун уровней в отдельных животных могут быть соотнесены с их поведенческих выступления (таблица 2) 20,21.

Вслед за хитозан-опосредованной вмешательства доставку РНК А. Aegypti личинки, снижение экспрессии генов обнаруживается на 24 ч куколки развития (фиг.4, 6) 20,21. Хотя уровни экспрессии генов еще не был оценен в подробнейшим образом за пределами этой точки развития, снижение уровня экспрессии генов были обнаружены и в 48 и 72 ч А. Aegypti куколки (КМ, не опубликовано). Было бы полезно проводить более подробный анализ нокдаун уровней на разных стадиях А. Aegypti развития куколки, а также для оценки А. gambiae куколки. Было бы также интересно определить, сохраняется ли нокдаун у взрослых и изучить наночастиц посредником вместителя интерферирующих стратегии предоставления РНК для взрослых комаров.

Сайт-специфическая ген нуклеазы ориентации подходы были недавно введены А. Aegypti и А. gambiae и позволяет генерировать целевых, наследственных мутаций в комаров и других не-генетических модельных организмов 30,31. Хотя использование этих подходов позволяет более равномерное потери фенотипа функции анализа, преимущество над РНК-интерференции подходов, скрининг мутаций, представляющих интерес еще довольно много времени и трудоемким. Кроме того, хотя RNAi потеря функциональных исследований требуют технического обслуживания только штаммов дикого типа, мутантные штаммы комаров должны быть индивидуально дыбы. Обслуживание рецессивных летальных или взрослых стерильных мутаций в настоящее время сложной задачей, учитывая отсутствие в настоящее время, отмеченных балансировки в комаров. Таким образом, в то время как сайт-специфический ген нуклеазы ориентации подходы быстро набирает популярность, хитозан / интерферирующих РНК таргетирования может быть оптимальнымвыбор для лабораторий, не оборудованных для поддержания напряжения комаров и в тех случаях, для которых потеря функции гена в процессе развития несовместима с выживанием штамма.

На основании наших исследований, мы ожидаем, что хитозан / вмешательства РНК может широко использоваться для нокдаун многих различных генов в процессе развития А. gambiae, А. Aegypti, а также других насекомых, и, возможно, другие не-генетические модели организмов. Успешное молчание генов с хитозаном / вмешательства РНК было сообщено в других членистоногих, в том числе Penaeus Monodon (креветки) 32. Недавнее исследование показало, что наночастицы облегчить усвоение дсРНК и тем самым повысить нокдаун эффективности по сравнению с прямой подачи дсРНК в Азии cornborer 33, что подчеркивает потенциал для использования этой технологии на цели сельскохозяйственных вредителей. Возможно использование миРНК-наночастиц в качестве терапевтических средств в организме человека привлекает большое OF интерес в медицинском сообществе. Giljohann и др. 34 описывается синтез и характеристику поливалентных РНК-золотых наночастиц конъюгатов, которые имеют в шесть раз больше период полураспада по сравнению освободить дсРНК и легко проникать в клетки. Дэвис и др. 35 описали первый человеческий клинических испытаний с участием системное введение киРНК с использованием системы доставки наночастиц в больных с солидными опухолями, и возможность использования хитозана / миРНК терапевтические был недавно рассмотрел 36. Таким образом, хитозан / вмешательства ген РНК-технология таргетинга является ценным лабораторная методика с потенциалом для более широкого применения. Будущие исследования будут рассмотрены дополнительные приложения для этой техники. Кроме того, химическая модификация хитозана и других полимеров, активного области исследований, может повысить эффективность помехи доставки РНК или разрешать адресную доставку к определенным тканям 37.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.02 ml pipetteman Rainin PR20 for resuspension of interfering RNA
0.2 ml pipetteman Rainin PR200 for resuspension of interfering RNA and preparation of interfering RNA/nanoparticles
0.5 ml graduated tube  Fischer Scientific 05-408-120 for aliquoting resuspended interfering RNA
1 ml pipetteman Rainin PR1000 for resuspension of interfering RNA and preparation of interfering RNA/nanoparticles
1.5 ml graduated tube  Fischer Scientific 05-408-046 for preparation of interfering RNA/nanoparticles
1M Sodium Acetate, pH 4.5 TEKnova S0299 to prepare sodium acetate buffer
Acetic Acid, AIRSTAR. ACS, USP, FCC Grade BDH VWR BDH3092-500MLP to prepare sodium acetate buffer
Agarose Genetic Technology Grade MP Biomedicals LLC. 800668 to coat prepared interfering RNA/nanoparticles
Centrifuge Eppendorf AG 5415D to pellet interfering RNA/nanoparticles
Chitosan, from shrimp shells Sigma-Aldrich C3646-25G to combine with interfering RNA for prepararation of interfering RNA/nanoparticles
Dry Yeast Universal Food Corp NA to prepare mosquito larval food with interfering RNA/nanoparticles
E-RNAi tool German Cancer Research Center NA for design of dsRNA; http://www.dkfz.de/signaling/e-rnai3//
goldfish food Wardley Goldfish FLAKE FOOD to prepare mosquito larval food with interfering RNA/nanoparticles
Heated water bath Thermo Scientific 51221048 to heat the interfering RNA/nanoparticles at 55oC
Ice not applicable not applicable for thawing interfering RNA and preparation of interfering RNA/nanoparticles
Name Company Catalog Number Comments
Ice bucket Fisher Scientific 02-591-44 for storage of ice used during the procedure
liver powder MP Biomedicals LLC. 900396 to feed mosquito larvae post interfering RNA/nanoparticle treatment
Microwave oven A variety of vendors not applicable to prepare 2% agarose solution
petridish (100 x 15 mm) Fischer Scientific 875713 interfering RNA/nanoparticle feeding chamber for larvae
pH meter Mettler Toledo S220 for preparation of buffers
Razor blade Fischer Scientific 12-640 to divide the interfering RNA/nanoparticle pellet for feedings
siRNA Thermo Scientific/Dharmacon custom for preparation of siRNA/nanoparticles
Sodium Sulfate, Anhydrous (Na2SO4) BDH/distributed by VWR VWR BDH0302-500G to prepare 50 mM sodium sulfate solution in which the interfering RNA will be resuspended
Thermometer VWR 61066-046 to measure the water bath temperature
Tooth picks VWR 470146-908 for stirring during interfering RNA/nanoparticle food preparation and cutting gel pellets
Ultralow freezer A variety of vendors not applicable for storage of interfering RNA aliquots and interfering RNA/nanoparticles at -80oC
Vortex mixer Fischer Scientific 02-216-108 for preparation of chitosan/interfering RNA
Weight paper Fischer Scientific NC9798735 to divide the interfering RNA/nanoparticle pellet for feedings

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Malaria. , World Health Organization. http://www.who.int/topics/malaria/en (2014).
  2. Dengue. , Malaria Centers for Disease Control and Prevention. http://www.cdc.gov/dengue/ (2014).
  3. Knipling, E. F., et al. Genetic control of insects of public health importance. Bulletin of the World Health Organization. 38 (3), 421-438 (1968).
  4. Fu, G., et al. Female-specific flightless phenotype for mosquito control. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (10), 4550-4554 (2010).
  5. Wise de Valdez, M. R., et al. Genetic elimination of dengue vector mosquitoes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (12), 4772-4775 (2011).
  6. Harris, A. F., et al. Successful suppression of a field mosquito population by sustained release of engineered male mosquitoes. Nature Biotechnology. 30 (9), 828-830 (2012).
  7. Fire, A., et al. Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature. 391 (6669), 806-811 (1998).
  8. Yu, N., et al. Delivery of dsRNA for RNAi in insects: an overview and future directions. Insect science. 20 (1), 4-14 (2013).
  9. Zhang, H., Li, H. C., Feasibility Miao, X. X. limitation and possible solutions of RNAi-based technology for insect pest control. Insect science. 20 (1), 15-30 (2013).
  10. Clemons, A., Haugen, M., Severson, D. W., Duman-Scheel, M. Functional analysis of genes in Aedes aegypti embryos. Cold Spring Harb Protoc. 2010 (10), (2010).
  11. Clemons, A., et al. siRNA-mediated gene targeting in Aedes aegypti embryos reveals that frazzled regulates vector mosquito CNS development. PLoS One. 6 (1), e16730 (2011).
  12. Haugen, M., et al. Semaphorin-1a is required for Aedes aegypti embryonic nerve cord development. PLoS One. 6 (6), e21694 (2011).
  13. Nguyen, C., et al. Functional genetic characterization of salivary gland development in Aedes aegypti. EvoDevo. 4 (1), 9 (2013).
  14. Sarro, J., et al. Requirement for commissureless2 function during dipteran insect nerve cord development. Developmental dynamics: an official publication of the American Association of Anatomists. 242 (12), 1466-1477 (2013).
  15. Singh, A. D., Wong, S., Ryan, C. P., Whyard, S. Oral delivery of double-stranded RNA in larvae of the yellow fever mosquito, Aedes aegypti: implications for pest mosquito control. J Insect Sci. 13, 69 (2013).
  16. Lopez-Martinez, G., Meuti, M., Denlinger, D. L. Rehydration driven RNAi: a novel approach for effectively delivering dsRNA to mosquito larvae. Journal of medical entomology. 49 (1), 215-218 (2012).
  17. Scott, J. G., et al. Towards the elements of successful insect RNAi. Journal of insect physiology. 59 (12), 1212-1221 (2013).
  18. Coy, M. R., et al. Gene silencing in adult Aedes aegypti mosquitoes through oral delivery of double-stranded RNA. J Appl Entomol. 136 (10), 741-748 (2012).
  19. Zhang, X., Zhang, J., Zhu, K. Y. Chitosan/double-stranded RNA nanoparticle-mediated RNA interference to silence chitin synthase genes through larval feeding in the African malaria mosquito (Anopheles gambiae). Insect molecular biology. 19 (5), 683-693 (2010).
  20. Mysore, K., Flannery, E. M., Tomchaney, M., Severson, D. W., Duman-Scheel, M. Disruption of Aedes aegypti olfactory system development through chitosan/siRNA nanoparticle targeting of semaphorin-1a. PLoS neglected tropical diseases. 7 (5), e2215 (2013).
  21. Mysore, K., Andrews, E., Li, P., Duman-Scheel, M. Chitosan/siRNA nanoparticle targeting demonstrates a requirement for single-minded during larval and pupal olfactory system development of the vector mosquito Aedes aegypti. BMC developmental biology. 14 (1), 9 (2014).
  22. Dass, C. R., Choong, P. F. Chitosan-mediated orally delivered nucleic acids: a gutful of gene therapy. Journal of drug targeting. 16 (4), 257-261 (2008).
  23. An, C., Budd, A., Kanost, M. R., Michel, K. Characterization of a regulatory unit that controls melanization and affects longevity of mosquitoes. Cellular and molecular life sciences : CMLS. 68 (11), 1929-1939 (2011).
  24. Clemons, A., Mori, A., Haugen, M., Severson, D. W., Duman-Scheel, M. Culturing and egg collection of Aedes aegypti. Cold Spring Harb Protoc. 2010 (10), (2010).
  25. Horn, T., Boutros, M. E-RNAi: a web application for the multi-species design of RNAi reagents--2010 update. Nucleic acids research. 38, W332-W339 (2010).
  26. Patel, N. H. Ch. 19. In situ hybridization to whole mount Drosophila embryos. A laboratory guide to RNA: Isolation, Analysis, and Synthesis. PA, K. rieg , Wiley-Liss. (1996).
  27. Haugen, M., et al. Whole-mount in situ hybridization for analysis of gene expression during Aedes aegypti development. 2010 (10), Cold Spring Harb Protoc. (2010).
  28. Clemons, A., Flannery, E., Kast, K., Severson, D. W., Duman-Scheel, M. Immunohistochemical analysis of protein expression during Aedes aegypti development. Cold Spring Harb Protoc. 2010 (10), (1101).
  29. Rund, S. S., Hou, T. Y., Ward, S. M., Collins, F. H., Duffield, G. E. Genome-wide profiling of diel and circadian gene expression in the malaria vector Anopheles gambiae. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (32), E421-E430 (2011).
  30. Gaj, T., Gersbach, C. A., Barbas, C. F. 3rd ZFN, TALEN, CRISPR/Cas-based methods for genome engineering. Trends in biotechnology. 31 (7), 397-405 (2013).
  31. Aryan, A., Myles, K. M., Adelman, Z. N. Targeted genome editing in Aedes aegypti using TALENs. Methods. 69 (1), 38-45 (2014).
  32. Sarathi, M., Simon, M. C., Venkatesan, C., Hameed, A. S. Oral administration of bacterially expressed VP28dsRNA to protect Penaeus monodon from white spot syndrome virus. Mar Biotechnol (NY). 10 (3), 242-249 (2008).
  33. He, B., et al. Fluorescent nanoparticle delivered dsRNA toward genetic control of insect pests). Adv Mater. 25 (33), 4580-4584 (2013).
  34. Giljohann, D. A., Seferos, D. S., Prigodich, A. E., Patel, P. C., Mirkin, C. A. Gene regulation with polyvalent siRNA-nanoparticle conjugates. Journal of the American Chemical Society. 131 (6), 2072-2073 (2009).
  35. Davis, M. E., et al. Evidence of RNAi in humans from systemically administered siRNA via targeted nanoparticles. Nature. 464 (7921), 1067-1070 (2010).
  36. Molinaro, R., et al. Polyethylenimine and chitosan carriers for the delivery of RNA interference effectors. Expert opinion on drug delivery. 10 (12), 1653-1668 (2013).
  37. Singha, K., et al. Polymers in small-interfering RNA delivery. Nucleic acid therapeutics. 21 (3), 133-148 (2011).

Tags

Молекулярная биология выпуск 97 вектор биологии РНК-интерференция, миРНК нокдаун прием внутрь комаров личинки развитие болезнь
Хитозан / интерферирующих РНК наночастиц опосредованного молчания генов в развитии болезни Векторный личинки комаров
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Zhang, X., Mysore, K., Flannery, E., … More

Zhang, X., Mysore, K., Flannery, E., Michel, K., Severson, D. W., Zhu, K. Y., Duman-Scheel, M. Chitosan/Interfering RNA Nanoparticle Mediated Gene Silencing in Disease Vector Mosquito Larvae. J. Vis. Exp. (97), e52523, doi:10.3791/52523 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter