Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Chitosan / השתקת הגנים RNA Nanoparticle המתווכת להתערב במחלת וקטור כילה נגד זחלים

Published: March 25, 2015 doi: 10.3791/52523
Automatic Translation
*1, *2,3, 3,4, 1, 3,4, 5, 2,3,4
1Division of Biology, Kansas State University, 2Department of Medical and Molecular Genetics, Indiana University School of Medicine, 3Eck Institute for Global Health, University of Notre Dame, 4Department of Biological Sciences, University of Notre Dame, 5Department of Entomology, Kansas State University
* These authors contributed equally

Summary

כאן אנו מתארים הליך לעיכוב תפקוד גן ביתושי וקטור מחלה באמצעות chitosan / מפריע חלקיקי RNA המעובדים על ידי זחלים.

Abstract

יתושי וקטור לגרום יותר סבל אנושי מכל אורגניזם אחר - ולהרוג יותר ממיליון אנשים בכל שנה. פרויקטי הגנום היתוש הקלו מחקר בהיבטים חדשים של ביולוגיה יתושים, כוללים מחקרים גנטיים תפקודיים בווקטור העיקרי אפריקה המלריה אנופלס gambiae ודנגי וקדחת צהובה וקטור Aedes aegypti. השתקת interference- RNA (RNAi-) בתיווך הגן נעשתה שימוש כדי למקד את הגנים של עניין בשני מיני יתושים וקטור מחלה אלה. כאן אנו מתארים הליך להכנת chitosan / מפריעים חלקיקי RNA שמשולבים עם אוכל ומעובדים על ידי זחלים. זה תפוקה גבוהה מבחינה טכנית פשוטה, ומתודולוגיה זולה יחסית, אשר תואם עם RNA הארוך גדילים הכפול (dsRNA) או מולקולות קטנות מפריעות RNA (siRNA), היו בשימוש כבר מציאה המוצלחת של מספר גנים השונים בא gambiae וא ' aegyptiזחלים. בעקבות האכלות זחל, מציאה, אשר מאומת באמצעות qRT-PCR או הכלאה באתר, יכולים להימשך, לפחות עד השלב מאוחר גלמים. מתודולוגיה זו עשויה להיות ישימה למגוון רחב של יתושים ומיני חרקים אחרים, כוללים מזיקים בחקלאות, כמו גם אורגניזמים שאינם מודל אחרים. בנוסף לשירות שלה במעבדת המחקר, בעתיד, chitosan, פולימר זול, שאינו רעיל ומתכלה, עלול להיות מנוצל בתחום.

Introduction

יתושי וקטור האכלת דם של genera Anopheline וAedine לשדר גורמי המחלות אחראים לכמה מהמכות הגרועות ביותר של המין האנושי. 3.4 מליארד אנשים מוערכים הם בסיכון להידבקות במלריה, שהוא אחראי למוות למעלה מחצי מ'מדי שנה ברחבי העולם. תוצאות מלריה מזיהום על ידי sp Plasmodium. טפילים, אשר מועברים לאנשים דרך העקיצות של יתושים נגועים מסוג אנופלס, כוללים הווקטור העיקרי האפריקאי אנופלס gambiae (http://www.who.int/topics/malaria/en/ , 2014) 1. Aedes aegypti הוא וקטור היתושים העיקרי לוירוס דנגה, מה שגורם לקדחת דנגה, מחלה המלווה בחום ספציפי שהיא המחלה הנפוצה arboviral והמשמעותית ביותר בעולם. וירוס דנגה הוא כיום איום ל> 2.5 מליארד בני אדם באזורים הטרופיים, עם inciden שנתיce של כ -50 מיליון מקרים וכתוצאה מכך ~ 24,000 מקרי מוות בשנה (http://www.cdc.gov/dengue/, 2014) 2. למרות ההשפעה הגלובלית ההרסנית של מחלות שמקורן יתושים על בריאות אדם, אמצעי יעיל למניעה וטיפול במחלות אלה חסרים. הדברת יתושים היא כיום השיטה הטובה ביותר למניעת מחלה.

הפוטנציאל לשליטה במחלות שמקורן בפרוקים-רגליים על ידי המניפולציה הגנטית של חרקים וקטור הוכר במשך ארבעה עשורים 3. זנים מהונדסים של א ' aegypti שתוכנן להיות בפנוטיפ לעוף נשי ספציפי repressible עשה בתקופה האחרונה את הפוטנציאל לשימוש באסטרטגיות בקרת וקטור מהונדסים מציאות 4-6. התקדמות אלה אתגרה חוקרים לזהות מטרות גנטיות חדשניות לבקרת וקטור ואמצעים נוספים של המניפולציה תפקוד גן ביתושי וקטור. שינוי של d ביטוי גניםפיתוח uring, כפי שהיה במקרה ביתושי נקבה-לעוף 4, עשוי לקדם את ההבהרה של אסטרטגיות בקרת וקטור רומן. עם זאת, במידה רבה בשל אתגרים טכניים, הפונקציות של מעט מאוד גנים מתאפיינות בפיתוח של א ' gambiae, א aegypti, או מיני יתושים אחרים.

מאז גילויו בג 7 elegans, התערבות RNA (RNAi), שנשמרת בבעלי חיים, צמחים, ומיקרואורגניזמים, כבר בשימוש נרחב למחקרים גנטיים פונקציונליים במגוון רחב של אורגניזמים, כולל חרקים 8,9. מסלול RNAi הוא ביוזמת דייסר, שדבק dsRNA הארוך לתוך siRNAs ארוך נוקלאוטיד 20-25 קצר המתפקדים כRNA להתערב רצף ספציפי. גני שתיקה siRNAs כי הם משלימים ברצף על ידי קידום מחזור תמליל, מחשוף, ושיבוש התרגום 9. מולקולות ארוכות dsRNA (בדרך כלל 300-600 נקודות בסיס) או siRNAs מיקוד המותאם אישית particulaרצף r ניתן להשתמש במעבדת המחקר להשתקה כל גן של עניין. על ידי ניהול כאשר מפריע מועבר RNA, חוקרים יכולים לקבוע את הזמן שבו גן השתקה יוזמת. יתרון זה הוא שימושי כפי שהוא יכול להשתמש בו כדי להתגבר על אתגרים כגון קטלני או עקרות התפתחותית, אשר יכול לעכב את הייצור ותחזוקה של זני נושאות מוטציות תורשתיות, תהליך יקר ועתירת עבודה שאינו זמין עדיין בכל מיני החרקים. למרות התואר של השתקת גנים על ידי RNAi יכול להשתנות מגן לגן, רקמה לרקמה, ובעלי חי בעלי חיים, RNAi הוא בשימוש נרחב לניתוח פונקציונלי של גנים ביתושים וחרקים אחרים 8,9.

שלוש אסטרטגיות משלוח RNA להתערב כבר בשימוש ביתושים: microinjection, יישום שריה / אקטואלי, ובליעה. להיסטוריה והשוואה של השימוש בשלוש הטכניקות הללו בחרקים מפורטים, עיין באל יו et 8. Wדואר השתמש בהצלחה microinjection 10 כאמצעי לאספקת siRNAs למקד גני התפתחותיים בא עוברי aegypti, זחלים, גלמים ו11-14. עם זאת, אסטרטגית משלוח עתירת עבודה זו דורשת גם התקנת microinjection ומיומנת יד. יתר על כן, microinjection מלחיץ את האורגניזם, גורם מבלבל, במיוחד כאשר פנוטיפים התנהגותיים יוערכו. לבסוף, משלוח microinjection לא ניתן להרחיב לתחום עבור בקרת וקטור. כחלופה, שריה האורגניזם להתערב פתרון RNA הפכה גם אמצעי פופולרי של גרימת השתקת גנים, כפי שהוא נוח ודורש ציוד או עבודה קטן. שריה יש בעיקר יושמה בשורת תאי חרקים לומד 8, אך במחקר שנערך לאחרונה, מציאה הושגה בא זחלי aegypti שקועים בפתרון של 15 dsRNA, שבעלי החיים הופיעו לבליעה. עם זאת, למחקרים שכלל ניתוח של experimenta מרובהקבוצות l או פנוטיפים, שריה היא די יקרה. לופז-מרטינז et al. 16 תיארו להחזרת נוזלים מונעים RNAi, גישה חדשנית להתערבות משלוח RNA שכרוכה התייבשות בתמיסת מלח והחזרת נוזלים עם טיפה אחת של מים המכילים RNA להתערב. גישה זו אין לחתוך את העלויות כרוכות בטבילת בעלי חיים שלמה, אבל הוא יקר יותר מאשר microinjection ועשויה להיות מוגבלת בבקשתו למינים שיכולים לסבול לחצים האוסמוטי גבוהים. יתר על כן, קשה לדמיין איך טבילה או מתודולוגיה טבילה / התייבשות התייבשות יכולה להיות מותאמת לבקרת וקטור בתחום. מסיבות אלה, ללימודי פוסט-עובריים, לידה בהתערבות RNA עם אוכל לבלוע היא אסטרטגיה חלופית בת קיימא.

למרות שאסטרטגיות מבוססות בליעה לא עובדות בכל מיני החרקים, אולי בעיקר melanogaster דרוזופילה, משלוח אוראלי של התערבות RNA מעורבב עם מזון קידם si הגןlencing במגוון רחב של חרקים 8,17 א כולל, מבוגרים aegypti 18. שתארנו RNAi בתיווך ננו-חלקיקי chitosan בא זחלי gambiae 19 ויישם גישה זו של הפחתה של ביטוי גנים בא בהצלחה זחלי aegypti 20,21. כאן, מתודולוגיה להליך RNAi זה, הכולל כולא בהתערבות RNA על ידי chitosan הפולימר, היא מפורטת. Chitosan / חלקיקי RNA להתערב נוצרים על ידי הרכבה עצמית של polycations עם התערבות RNA באמצעות הכוחות אלקטרוסטטיים בין מטענים החיוביים של קבוצות אמינו בchitosan ומטענים שליליים המבוצעים על ידי קבוצות פוספט בעמוד השדרה של התערבות RNA 19. ההליך המתואר תואם עם שתי מולקולות ארוכות dsRNA (להלן כפי dsRNA) או גדילים כפולים siRNA (להלן כפי siRNA). סינתזה, chitosan / חלקיקי RNA להתערב הבאים מעורבבים עם מזון זחל ונמסרו לזחלים באמצעות בליעה דרך הפה. מתודולוגיה זו היא זולה יחסית, דורשת ציוד ועבודה 19 קטנים, ומאפשרת ניתוח תפוקה גבוהה של פנוטיפים מרובים, כוללים ניתוח של התנהגויות 20,21. מתודולוגיה זו, אשר יכולה להיות מותאמת ללימודי השתקת גנים בחרקים אחרים, כוללים וקטורי מחלה אחרים ומזיקים בחקלאות חרקים, העלול לשמש להשתקת גנים במגוון רחב של בעלי חיים אחרים. יתר על כן, chitosan, פולימר זול, שאינו רעיל ומתכלה 22, עלול להיות מנוצל בתחום של בקרת מינים ספציפי יתושים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. מינים יתושים וגידול

  1. לשמור על A. G3 gambiae וא ' זני aegypti ליברפול IB12 (המשמשים במחקרי הנציג להלן) או זנים אחרים של עניין על פי נוהג מעבדה סטנדרטי או כפי שתואר לעיל 23,24.

2. dsRNA וsiRNA עיצוב והפקה

  1. פריימרים עיצוב לבניית תבניות dsRNA ארוכות ספציפיות לגן של עניין. השתמש בכלי E-RNAi 25. לייצר dsRNA לפי השיטה של בחירה או כפי שתואר לעיל 19.
    1. לביקורת שלילית, לסנתז dsRNA 19 מתאים לרצף של חלבון ירוק ניאון, β-galactosidase (β-gal) (GFP), או כמה גנים אחרים לא באו לידי ביטוי ביתושים. אם כך רצוי, dsRNA 19 מנוצלים כדי ליצור את תוצאות הנציג מסוכמות להלן יכולים לשמש כביקורת חיובית. חנות dsRNA מומס במי RNase ללא ב -80 °; C עד צורך.
  2. לחלופין, siRNA גן ספציפי עיצוב על פי נוהג מעבדה סטנדרטי או כפי שתואר לעיל 10. לטרוף את הרצף של siRNA מציאה לעצב siRNA שליטה השלילי שאינו מתאים לכל גן יתושים. לרכוש siRNAs המותאמת אישית, אשר זמינות באמצעות מספר ספקים בעלי מוניטין.
    1. אם כך רצוי, siRNAs 20,21 המנוצל כדי להשיג את תוצאות הנציג מסוכמות להלן יכול לשמש כביקורת חיובית. חנות siRNA מומס במי RNAse חינם ב -80 ° C עד צורך.

3. הכנת Chitosan / מפריעים RNA חלקיקים

  1. לאסוף נתרן גופרתי שהוכן מראש, RT 100 מ"מ (100 מ"מ Na 2 SO 4 בH 2 O deionized) ו -0.1 M נתרן אצטט (0.1 מ 'NAC 2 H 3 O 2 -0.1 M חומצה אצטית, pH 4.5 בH 2 O deionized) מאגרים.
  2. לפזר chitosan (≥75%deacetylated) ב 0.1 חיץ אצטט M נתרן לעשות 0.02% (w / v) פתרון עובד ולשמור על הפתרון בRT לפני השימוש.
  3. לפזר dsRNA או siRNA ב -50 μl deionized H 2 O ולהוסיף אותו למאגר נתרן גופרתי 100 מ"מ לעשות פתרון 100 μl של 32 מיקרוגרם של dsRNA / siRNA לשל נתרן גופרתי 50 מ"מ 100 μl.
  4. הוספה של פתרון chitosan לפתרון dsRNA / siRNA 100 μl ולאחר מכן לחמם את התערובת באמבט מים ב 55 מעלות צלזיוס במשך 1 דקות. הגדר את שליטה על ידי הוספה של נתרן גופרתי 50 מ"מ לפתרון chitosan 100 μl 100 μl ולפי אותו הנוהל.
  5. מערבבים את הפתרונות באופן מיידי למשך 30 שניות על ידי vortexing במהירות גבוהה ב RT כדי להקל על ההיווצרות של חלקיקים.
  6. צנטריפוגה את התערובת על 13,000 XG במשך 10 דקות ב RT, לאחר שהזמן גלולה צריכה להיות גלויה. מעביר את supernatant לצינור 1.5 מיליליטר חדש. אוויר יבש גלולה ל≈10 דקות ב RT לפני השימוש בו כדי להכין אוכל יתושים.
  7. Measure הריכוז של dsRNA / siRNA בsupernatant באמצעות supernatant מהשליטה (ראה 3.5) כריק כדי לחשב את הסכום הכולל של dsRNA / siRNA שנותר בsupernatant. השתמש בהבדל בין כמויות התחלה של dsRNA / siRNA וסכומים שנותרו בsupernatants כדי לחשב את אחוז dsRNA / siRNA הממולכד בחלקיקים. יעילות טעינה זה היא בדרך כלל מעל 90%.
  8. חזור על אותו ההליך, אם יש צורך יותר חלקיקים. השתמש בחלקיקים היבשים באופן מיידי. ההשפעה של קירור של חלקיקים לפני השימוש לא נבדקה.

4. הכנת מזון המכיל Chitosan יתוש / מפריע RNA חלקיקים

  1. הכן 1 מיליליטר של פתרון agarose 2% (w / v) במים ללא יונים, להמס את agarose, ולשמור על פתרון agarose נמס באמבט 55 מעלות צלסיוס מים לפני השימוש.
  2. לערבב פתיתי מזון לדגים (47% חלבון גולמי, דקות. שומן גולמי 10%, מקסימום. סיבים גולמיים 3%) ושמרים יבשים ביחס של 2: 1 (w / w). טוחנים את התערובת לחלקיקים קטנים עם מכתש ועלי (סביר דרך מס '50 מסננת בדיקה סטנדרטית ארה"ב). השתמש במזון הקרקע, שאמורה להיות חום בצבע, מייד או לאחסן אותו במכל אטום על 4 מעלות למשך מספר שבועות.
  3. בתוך צינור 1.5 מיליליטר, לערבב 6 מ"ג מזון קרקע עם חלקיקים המיובשים מסעיף 3.7 עם קיסם.
  4. הוסף 30 μl של פתרון agarose ג'ל 2% מראש מומס לתערובת מזון-ננו-החלקיקים; מערבב מייד וביסודיות על ידי שימוש בקצה קיסם או pipet.
  5. השתמש בג'ל המכיל מזון וחלקיקים כדי להאכיל את זחלי היתושים באופן מיידי. לחלופין, פעם ג'ל הוא התגבש לגמרי בRT, לאחסן את הג'ל על 4 ° C ולהשתמש ביום שלמחרת, או ב -80 ° C לשימוש מאוחר יותר.

5. האכלת זחלי יתוש עם מזון המכיל Chitosan / מפריע RNA חלקיקים

  1. א האכלה זחלי יתושים gambiae:
    1. הסר siגלולה ngle ג'ל מצינור 1.5 מיליליטר באמצעות קיסם ולחתוך אותו לפרוסות שווים 6 באמצעות סכין גילוח נקי או איסוף שן.
    2. העברה 20 זחלי instar שלישיים לצלחת פטרי המכילה 500 מיליליטר של מים deionized 100 מיליליטר.
    3. להאכיל את זחלי יתושים על ידי הוספת פרוסה אחת של גלולה ג'ל (קצוצה דק לחתיכות קטנות יותר) לכל צלחת פטרי פעם ביום למשך ארבעה ימים. הקפדתי למלא האכלת זחלים על גלולה, שאמור להיות מופחת באופן משמעותי בגודל או נעדרת לחלוטין על ידי ביום שלמחרת. לאחר הזמן, יתושים יתפתחו זחלי instar רביעי מאוחר.
    4. להקליט כל שינוי פנוטיפי גלוי במהלך הניסוי. בדוק את רמות התמליל ושינויי פנוטיפי אחרים כאמור בסעיף 6 בתום התקופה של ארבעה ימים.
  2. א האכלה זחלי יתושים aegypti:
    1. חותך את גלולה ג'ל ל6 פרוסות שווים באמצעות סכין גילוח נקי או קיסם.
    2. מניחים 50 שעות 24 מסונכרנות גיל לאחר fi ביצת בקיעהזחלי instar הראשונים לצלחת פטרי ב≈40 מיליליטר מים deionized.
    3. להאכיל את זחלי פרוסה אחת לכל צלחת פטרי במשך 4 שעות / יום, ולאחר מכן להעביר זחלים חזרה לתזונה הרגילה זחל של 2: פתיתי מזון 1 קרקע דגים ושמרים יבשים לשארית היום. חזור על הליך יומי לאורך ארבעת instars הזחל.
    4. בדוק את רמות התמליל ושינויי פנוטיפי אחרים כאמור בסעיף 6 בנקודות הזמן התפתחותי הרצויות.

6. אישור של ג'ין מציאה

  1. כימות תמליל יחסית על ידי qRT-PCR בא aegypti וא ' זחלי gambiae.
    1. לבצע ולנתח מבחני qRT-PCR עם שלושה משכפל ביולוגי על לפחות 10 שליטה במאגר לעומת זחלים ניסיוניים כפי שתואר 11,19,20, או על פי נוהל מעבדה סטנדרטי. תוצאות נציגים כלולות להלן.
    2. לניתוח של חלק סוג רקמה מסוים / גוף (כלומר., מוח או אנטנה), perform qRT-PCR, כמתואר ב6.1.1 לנתיחה הבאה כדי לשחזר את הרקמות של עניין (למשל, לראות Mysore et al. 21).
  2. אישור למציאה על ידי הכלאה באתר
    1. לסנתז antisense שכותרת digoxygenin ולחוש על פי נוהג מעבדה סטנדרטי או כפי שתואר 26 riboprobes שליטה.
    2. לבצע הכלאה באתר לפרוטוקול Haugen et al. 27 לאישור של מציאה כפי שתואר לעיל 11,20 ודנו בסעיף תוצאות הנציג להלן.
  3. אישור למציאה ידי אימונוהיסטוכימיה
    1. אם נוגדנים כנגד מוצר החלבון של הגן הממוקד זמינים, לבצע אימונוהיסטוכימיה כפי שתואר בעבר 28, המאפשר זיהוי של אנשים עם הרמות הגבוהים ביותר של מציאה לניתוח פנוטיפ 20 כפי שהודגם בrepresentative סעיף תוצאות בהמשך.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

א gambiae:

חלקיקי Chitosan / dsRNA נוצרים כתוצאה מהאינטראקציה אלקטרוסטטית בין קבוצות אמינו של chitosan וקבוצות פוספט של dsRNA. היעילות של שילוב dsRNA לתוך חלקיקים היא בדרך כלל מעל 90%, כפי שנמדד על ידי דלדול של dsRNA מהפתרון. תמונות במיקרוסקופ כוח אטומית עולות כי ממוצעי גודל חלקיקי chitosan-dsRNA nm 140 בקוטר, הנע 100-200 ננומטר (איור 1).

איור 1
איור 1. היווצרות Nanoparticle ידי chitosan וRNA להתערב. תמונת מיקרוסקופ כוח האטומי של חלקיקי chitosan / dsRNA (א) או פתרון chitosan ללא התוספת של dsRNA (B). הגודל של התמונות היה 1.0 × 1.0 מיקרומטר מיקרומטר. בר סולם = 250 nm."Target =" e.com/files/ftp_upload/52523/52523fig1large.jpg _ blank "> לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

האכלה של חלקיקים אלה אשר בשילוב עם אוכל זחל סטנדרטי ושולבו agarose תומכת בפיתוח זחל נורמלי. חשוב לציין, מציאה ספציפית של תמלילי AgCHS1-נגזר האאקטודרם כמו גם AgCHS2 midgut הספציפית (איור 2) היא אפשרית 19, הוכחה כי dsRNA נלקח דרך בליעה של חלקיקים יוזמת RNAi מעבר midgut. יעילות מציאה ≈40-60% נצפתה (למשל., איור 2) ולהשתנות בין תמלילים.

איור 2
רמות איור 2. תמלול של synthase כיטין 2 (AgCHS2) לאחר בליעת dsRNA ב<em> א זחלי gambiae. רמות יחסית mRNA של AgCHS2 בזחלים תיזונה חלקיקים עם ds AgCHS2 או ds השליטה GFP. הנתונים מוצגים כממוצע ± SD משלושה משכפל ביולוגי עצמאי. אותיות שונות בברים מצביעות על הבדלים משמעותיים המבוססות על בדיקות לזווג t (P = 0.003).

מציאה של AgCHS1 צמצמה באופן משמעותי את תוכן כיטין הכולל של זחלי instar הרביעי והגדילה את הרגישות לחומרי ההדברה מעכב סינתזת כיטין, diflubenzuron 19, מציאה של AgCHS2 גדלה באופן משמעותי את ההשפעה של calcofluor הלבן וdithiothreitol ששבש את מטריצת peritrophic (PM) בinstar הרביעית זחלים (איור 3) וכתוצאה מכך התמותה מוגברת 17.

איור 3
AgCHS2 לבלוע חלקיקים על א חדירות gambiae מטריצת peritrophic (PM). טיפול לבן או DTT Calcofluor משבש PM של א ' זחלי gambiae שexuberated עוד יותר על ידי מציאה AgCHS2 דרך ההכנסה של chitosan / dsRNA חלקיקי 19. יתוש () עם ראש הממשלה ללא פגע. יתוש (B) עם ראש הממשלה שיבש, dextran הכחול דולף לתוך ceacae הקיבה.

א aegypti:

Chitosan / חלקיקי siRNA שמשו למקד semaphorin-1a גן הדרכת האקסון (sema1a) במהלך A. התפתחות זחל aegypti 20. מציאה של sema1a אושרה באמצעות הכלאה באתר, אשר זוהה רמות מופחתות של sema1a ב≈60% מתחת מוח הזחלessed ולא הצליח לזהות ביטוי sema1a ב≈40% מהמוח של חיה מציאה (איור 4C לעומת B; ראש החץ צהוב מצביע על אונת המחושים). מבחני qRT-PCR בוצעו על כל בעלי חיים אספו עולים כי טכניקה זו הביאה לירידה של 32 ± 10% בתמלילי sema1a בהשוואה לבעלי חיים האכילו השליטה ננו-חלקיקים (איור 4 א; P <0.01 מבוסס על מבחן t מזווג, N = 5, כאשר N הוא מספר החזרות ביולוגיות). מציאה במוח נמשכה לפחות עד 24 שעות של פיתוח גלמים, כפי שמעיד על ידי אובדן של ביטוי אנטי-Sema1a נוגדן (איור 4E1 לעומת D1), ששימש לזיהוי בעלי חיים עם מציאה משמעותית במהלך פנוטיפ חוש הריח זחל וגולם ניתוחים. פגמי הזחל וגולם מחושים אונה (לכמת בטבלה 1) התגלו בזחלים וגלמי sema1a מציאה (איור 4E2, E3 לעומת (איור 4E2 לעומת D2, דמיינו עם mAbnc82; שכבות של שני האותות מוצגות באיור 4D3, E3). פנוטיפים דומים היו שנוצרו עם siRNAs שתי sema1a נפרד מציאה, שסייע להבטיח שהליקויים שנצפו לא היו התוצאה של מחוץ לאתר מיקוד או על ידי siRNA. הרמות הגבוהות ביותר של מציאה נוצרו כאשר siRNAs אוחדו, אסטרטגיה שיכול לשמש כדי להגביר את יעילות מציאה (ראה Mysore et al. 20 לפרטים נוספים).

איור 4
איור 4. Chitosan / siRNA מושרה מציאה של sema1a במערכת חוש הריח מתפתחת של א ' aegypti. QRT-PCR () וכלאה באתר (B, C) ​​מבחני אישרו מציאה של sema1a בזחלים האכיל תערובת של sema1a מיקוד siRNA 890 וsiRNA 1,198 chitosan / חלקיקי RNA להתערב לעומת חלקיקי שליטה. אובדן ביטוי Sema1a הביא glomeruli שהם מעוותים (E1-3 לעומת D1-3). ראה טקסט לקבלת פרטים. הגב הוא בכל הלוחות. בר סולם = 25 מיקרומטר. נתון זה הופיע במקור בMysore et al 20. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

זחלים גלמים
siRNA n <strong> wildtype פגמי AL n Wildtype פגמי AL
בקרה 69 69 (100%) 0 (0%) 68 68 (100%) 0 (0%)
sema1a KD 77 42 (54.5%) 35 (44%) * 75 51 (68%) 24 (32%) *

טבלת 1. כימות פגמי אונת מחושים הבאים מציאה sema1a. סיכום הידור של תוצאות שהתקבלו לשליטה siRNA לעומת sema1a מציאה (KD) siRNA 890 + siRNA בעלי החיים הניזונים ננו-חלקיקים 1,198 chitosan בסך הכל שמונה ניסויים לשכפל מבוצעים בשני הזחלים ( משמאל) וגלמים (מימין) מוצגים. סך הכלמספר האנשים שהוערכו (n) ומספרים / אחוזים של בעלי חיים בו מוצגות מורפולוגיה סוג בר לעומת פגמים (AL) באונה מחושים (פגמי נוירון קולטני ריח מיקוד, neuropil הפגומה והיווצרות glomeruli) מצוין. מציאה אומתה immunohistochemically עם אנטי Sema1a מכתים נוגדן בתת-קבוצה של בעלי חיים (15 זחלים וגלמים 10) שמוצגים פגמים החמורים ביותר (מסומן ב- *). כל בעלי החיים מציאה הוערכו באופן זה נמצאו כי רמות נמוכות של Sema1a, בעוד שרמות Sema1a בבעלי חיים הניזונים שליטה לא שינו באופן ניכר. טבלה זו הופיעה במקור בMysore et al 20.

בחקירה שנייה 21, chitosan / חלקיקי siRNA שמשו למקד את גורם שעתוק הנחרץ (Sim) במהלך פיתוח של מערכת חוש הריח. מבחני qRT-PCR עם המוח במאגר גזור מכל בעלי החיים הצביעו על כך שהיה לי מוח מציאה ה- SIM בממוצע reducti 47%בתמלילי sim בהשוואה לשליטה בעלי חיים הניזונים ננו-חלקיקים (P = 0.005 מבוסס על מבחן t מזווג). מבחני דומים עם אנטנות חשפו בממוצע הפחתת 77% ברמות ה- SIM לגבי בקרה-האכילו בעלי חיים (P = 0.002 מבוססים על מבחן t מזווג). למרות כמה השתנות ברמות של מציאה בין רקמות ובעלי חיים, תעתיקי sim לא התגלו באמצעות הכלאה באתר ב≈50% מהמוח של בעלי החיים / אנטנות מציאה בעקבות טיפול באחת משני siRNAs שונה מציאה (איור 5B2, B3, C2, B1 C3 מול, C1, הטבלה 2). במבחני התנהגות שמרים שבמהלכו אנשים שנמשכים לשמרים הוענקו ציון של 1, ואילו בעלי חיים שלא משכו ניתנו ציון של 0, ממוצע ציונים לsim 430 או 718 sim חיות מציאה היו significantly נמוך מזה של בעלי חיים הניזונים שליטה בשני ניסויים לשכפל (איור 5 א '; P <0.001 מבוססים על מבחן t מזווג). פגומה מעקב ריח התנהגות (איור 5 א) בקורלציה עם רמות מופחתות של sim באנטנות (איור 5B2, B3 לעומת B1) ומוח (איור 5C2, C3 מול C1, נקודות צהובות מסמנות את המערכת של אונת המחושים; ראו טבלה 2 לכימות של תוצאות). פגמים מרובים זוהו באנטנות ואונות מחושים של בעלי חיים מציאה ה- SIM (ראה Mysore et al. 21 לפרטים נוספים). לדוגמא, זחלים וגלמי מציאה sim חסרי ביטוי של orco, לחייב שיתוף קולט לכל קולטנים odorant בתאי עצב קולטני ריח (איור 6). רמות תמליל orco מופחתות התגלו אצל אנשים נמאס עם sim 430 ( איור 6A3, B3) או sim 718 (איור 6A4, chitosan מציאה B4) (KD) / חלקיקי siRNA (השוו לבעלי חיים מסוג בר באיור 6A1, B1 ולשלוט chitosan / בעלי חיים siRNA-האכיל ננו-חלקיקים באיור 6A2, B2). הפסד של פנוטיפ ביטוי orco נצפה בזחלי L4 (איור 6A1-A4) נמשכו לפחות עד 24 שעות לאחר היווצרות גלמים (איור 6B1-B4).

איור 5
איור 5. sim תכנית זחלי מציאה התנהגות ריח attractant פגומה. בכלאה באתר גילה רמות מופחתות של RNA sim באנטנות (B2, B3) ומוח (C2, C3) של sim 430 ו- SIM 718 בעלי חיים מציאה (השווה לשלוט הניזונים בB1, C1), שלא הגיבו לattractant השמרים odorant (). ראה טקסט לקבלת פרטים. הקצוות הפרוקסימלי של אנטנות מכוונים כלפי מעלה בB1-B3. גב מכוון כלפי מעלה בC1-C3. בר סולם = 25 מיקרומטר. נתון זה הופיע במקור בMysore et al 21. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 6
הפסד 6. איור ביטוי orco בא הפיתוח אנטנת aegypti הבא מציאה של sim. הרמות נמוכות של תמליל orco התגלו אצל אנשים Feד עם sim 430 (A3, B3) או sim 718 (A4, B4) chitosan מציאה (KD) / חלקיקי siRNA (השוו לבעלי חיים מסוג בר בA1, B1 ולשלוט chitosan / בעלי חיים siRNA-האכיל ננו-חלקיקים בA2, B2). ראה טקסט לקבלת פרטים. בר סולם = 25 מיקרומטר. נתון זה חובר מתמונות שפורסמו בMysore et al 21. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

נמשך לא נמשך
siRNA n # בעלי חיים רגיל מתון Null # בעלי חיים רגיל מתון Null
בקרה 195 196 (100%) 196 (100%) 0 0 0 0 0 0
sim 430 KD 176 63 (35%) 48 (76%) 15 (24%) 0 113 (64%) 20 (18%) 12 (11%) 81 (71%)
sim 718 KD 177 66 (37%) 44 (66%) 22 (34%) 0 111 (63%) 20 (18%) 9 (8%) 82 (74%)

רמת 2. טבלהים של sim לתאם עם ביצועי זחל בassay התנהגות שמרים. סיכום הידור של תוצאות שהושגו בattractant odorant ארבעה שמרים לשכפל ניסויים מוצג. המספר הכולל של בעלי חיים (n) מציין את מספר הזחלים הבודדים שנבדקו במבחני התנהגות אלה. מספר הזחלים הבודדים (# בעלי חיים) שנמשכו (משמאל; בעלי חיים שנגעו בשמרי גלולה והוענקו ציון של 1) או לא נמשך (מימין; בעלי חיים שלא נגעו בשמרי גלולה וקיבל ציון של 0) מתחת לכל מצב (בקרה, sim 430 KD, או sim 718 chitosan KD / siRNA-האכיל ננו-חלקיקים) מוצגים, והאחוזים של בעלי חיים כולל כלולים הבאים מספרי הגלם. מציאה של sim הוערכה באמצעות הכלאה באתר במוחם של בעלי חיים ואנטנות נמשכות (משמאל) או לא נמשכת (מימין) לשמרים.מספר גלם / אחוז של אנשים עם רגיל (בדומה לwildtype רמות תמליל sim), ריק (אין תמליל sim לצפייה), או מתון (מופחת, אך לא מסוג בר) רמות sim מצוינות. אובדן sim קורלציה היטב עם חוסר המשיכה לשמרים. טבלה זו הופיעה במקור בMysore et al 21.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Chitosan / מתודולוגיה ננו-חלקיקי RNA התערבות המתוארות במסמך זה נעשתה שימוש כדי למקד ביעילות גנים במהלך התפתחות זחל בא gambiae (איורים 2, 3) וא ' aegypti (איורים 4, 5, 6, לוחות 1, 2). ניתן להכין חלקיקי Chitosan גם עם dsRNA הארוך או siRNA, אשר שניהם שימשו בהצלחה ביתושים כפי שמעידה תוצאות הנציג המתוארות במסמך זה. סינתזה של dsRNA היא זולה יותר מאשר רכישת siRNA, אבל הוא יותר עבודה אינטנסיבית. אם chitosan / siRNA משמש, ניתן לאשר פנוטיפים עם siRNAs מרובה, המאפשרים להבטחת טובה יותר כי הפנוטיפ חשף הוא לא בשל מיקוד מחוץ לאתר. כמו כן, הייצור המסחרי של siRNAs בהמוניהם עשוי טובים יותר להקל על הרחבת chitosan / מפריע השתקת RNA למינים ספציפי שליטת יתושים לשדה. זה יהיה כמובן דורש התגברות על obstacles כגון עלות משלוח.

אמנם יש לנו זכינו להצלחה טובה עם פרוטוקול זה, מתודולוגיות חייבת להיות מותאמות לכל גן. מסיבה זו, אנו ממליצים שנבדוק את siRNAs מרובה, או אולי siRNA אחד וdsRNA ארוך, בתחילתו של פרויקט חדש. ברגע שפנוטיפים מזוהים ואישרו עם לפחות שני siRNAs השונה מתאים לגן של עניין, זה עשוי להיות שימושי לשלב siRNAs אלה כדי להגדיל את חדירות פנוטיפ (איור 4). העיתוי וגם את משך הזמן של chitosan / להתערב זמן האכלת RNA יכולים להיות מותאם לכל מחקר. א gambiae לשגשג כאשר ניזונים רק עם chitosan / מפריע מזון RNA כמתואר במסמך זה. עם זאת, בניסויים שבוצענו עד לאותו מועד, א ' aegypti לא הסתדר היטב בלי תזונה משלימה, בעיה יש לנו להתגבר בהעברתם לתזונה של מזון רגיל לאחר 4 שעות של chitosan / מפריעה האכלת RNA. ניסוי עם chitosan / מפריעמשלוח RNA במצע מזון שונה, שעדיין לא ניסה, עשוי לעקוף את הבעיה הזו. מצאנו כי האכלות יומיות 4 שעות במהלך מספר ימים יביאו לאיזון טוב בין מציאה ותזונה הולמת, אבל שינוי של משך ההאכלה יכול להיות רדוף נוסף לפי צורך. כמו כן, instar הזחל בי chitosan / האכלת ננו-חלקיקי RNA להתערב היא יזם / המשך יכול להיות מותאם לכל ניסוי בהתאם לתקופת ההתפתחות הקריטית שבו תפקוד גן נבחן, יתרון עיקרי של פרוטוקול זה.

אימות של מציאה היא כמובן קריטי, אך ייתכן גם דורשת פתרון בעיות. מסיבה זו, זה עשוי להיות שימושי כדי לבדוק בו זמנית אם פנוטיפים של ריבית המופקים כיעילות מציאה מוערכת. בניסויים אימות qRT-PCR, זה קריטי, כי פריימרים ותנאי PCR מותאמים. יתר על כן, חשוב שבעלי החיים הם מבחינה התפתחותיתמסונכרן בתחילת הניסוי, כביטוי לכמה תמלילים יכול להיות מאוד דינמי במהלך פיתוח ובשל קצב היממה 29. יתר על כן, בעוד שטכניקה זו בצורה ברורה מייצרת מציאה מעבר למעי, שרק מתחילים להעריך את הרקמות שלטכניקה זו היא יעילה, ועשויה להשתנות בין מינים. לכן זה יהיה שימושי למדידת מציאה ברקמות מסוימות, אשר יכול להיות מושגת על ידי לנתח רקמות של ריבית מבעלי החיים שלמים לqRT-PCR מבחני או באמצעות הכלאה באתר (איורים 4-6) 20,21 ואימונוהיסטוכימיה (איור 4) 20 מבחני (ראה Haugen et al. 27 וClemons et al. 28, בהתאמה, לפתרון בעיות בפרוטוקולים הללו). מאז מציאה משתנה מאדם לאדם, כדאי לבצע מבחני כפול תיוג להעריך פנוטיפים בשילוב עם רמות מציאה (Figuמחדש 4) 20, אשר מאוד מקל אפיון פנוטיפ. למחקרים התנהגותיים, רמות מציאה בבעלי חיים בודדים יכולות להיות מתואמות עם הופעות ההתנהגות שלהם (טבלה 2) 20,21.

המעקב בתיווך chitosan מפריע משלוח RNA לא זחלי aegypti, ביטוי גנים מופחת מזוהה ב 24 שעות של פיתוח גלמים (איורים 4, 6) 20,21. למרות שהרמות של ביטוי גנים טרם הוערכו באופן מפורט מעבר לנקודה של התפתחות זו, רמות נמוכות של ביטוי גנים זוהו בשני א 48 ו -72 שעות גלמי aegypti (KM, לא פורסם). זה יהיה שימושי להמשיך ניתוח מפורט יותר של רמות מציאה בשלבים רבים של א ' פיתוח גלמי aegypti וגם להעריך א גלמי gambiae. זה יהיה גם מעניין כדי לקבוע אם מציאה נמשכת במבוגרים ולחקור ננו-חלקיקים בתיווך בterfering אסטרטגיות משלוח RNA ליתושים בוגרים.

מיקוד גישות ספציפי לאתר גן nuclease הוכנסו לאחרונה לא aegypti וא ' gambiae ומתיר את הדור של מוטציות ממוקדות, תורשתיות ביתושים ואורגניזמים מודל שאינו גנטיים אחרים 30,31. למרות שימוש בגישות אלו מאפשרים אובדן אחיד יותר של פנוטיפ פונקצית הניתוחים, יתרון על פני גישות RNAi, בדיקות סקר לאיתור מוטציות של עניין הוא עדיין די זמן רב ועבודה אינטנסיבית. יתר על כן, למרות שאובדן RNAi של מחקרי פונקציה דורש תחזוקה של זני סוג בר בלבד, זני יתושים מוטציה חייבים להיות שגדלו בנפרד. התחזוקה של מוטציות קטלניות סטרילי או מבוגר רצסיבי היא כיום מאתגרת לנוכח החוסר הנוכחי של balancers המסומן ביתושים. וכך, בעוד ספציפי לאתר גן nuclease מיקוד גישות צובר פופולרי במהירות, chitosan / מפריע RNA מיקוד עשוי להיות אופטימליבחירה למעבדות אינן מצוידים לשמור על זני יתושים ובמקרים שבי אובדן תפקוד גנים במהלך ההתפתחות היא בקנה אחד עם הישרדות של הזן.

בהתבסס על הממצאים שלנו, אנו צופים כי chitosan / RNA להתערב ניתן להשתמש באופן נרחב למציאה של גנים רבים ושונים במהלך התפתחותו של א ' gambiae, א aegypti, כמו גם חרקים אחרים, ואורגניזמים מודל שאינו גנטיים פוטנציאלי אחרים. השתקת גנים מוצלחת עם chitosan / RNA להתערב דווח במינים של פרוקים-רגליים אחרות, כוללים monodon Penaeus (שרימפס) 32. מחקר שנערך לאחרונה הראה כי חלקיקים להקל על הספיגה של dsRNA ובכך לשפר את יעילות מציאה בהשוואה להזנה ישירה של dsRNA בcornborer אסיה 33, אשר מדגיש את הפוטנציאל לשימוש בטכנולוגיה זו כדי למקד את המזיקים בחקלאות. השימוש האפשרי של siRNA-חלקיקים כתרופות בבני האדם מושך o הרבהעניין f בקהילה הרפואית. Giljohann et al. 34 תאר את הסינתזה ואפיון של conjugates הרב הערכי RNA-זהב ננו-חלקיקים, שיש להם שישה-לקפל יותר זמן מחצית חיים בהשוואה לשחרור dsRNA וקלות להיכנס לתאים. דייויס et al. 35 תאר את המשפט הראשון האדם קליני הכולל ניהול מערכתי של siRNAs באמצעות מערכת מסירת ננו-חלקיקים לחולים עם גידולים מוצקים, ואת האפשרות של שימוש chitosan / תרופות siRNA לאחרונה נסקרה 36. לפיכך, chitosan / להתערב גן RNA טכנולוגיית מיקוד הוא טכניקת מעבדה יקרה עם פוטנציאל ליישומים רחבים יותר. מחקר עתידי לחקור יישומים נוספים לטכניקה זו. יתר על כן, שינוי כימי של chitosan ופולימרים אחרים, אזור פעיל של מחקר, עשוי להגביר את היעילות של משלוח RNA להתערב או לאפשר משלוח ממוקד לרקמות ספציפיות 37.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.02 ml pipetteman Rainin PR20 for resuspension of interfering RNA
0.2 ml pipetteman Rainin PR200 for resuspension of interfering RNA and preparation of interfering RNA/nanoparticles
0.5 ml graduated tube  Fischer Scientific 05-408-120 for aliquoting resuspended interfering RNA
1 ml pipetteman Rainin PR1000 for resuspension of interfering RNA and preparation of interfering RNA/nanoparticles
1.5 ml graduated tube  Fischer Scientific 05-408-046 for preparation of interfering RNA/nanoparticles
1M Sodium Acetate, pH 4.5 TEKnova S0299 to prepare sodium acetate buffer
Acetic Acid, AIRSTAR. ACS, USP, FCC Grade BDH VWR BDH3092-500MLP to prepare sodium acetate buffer
Agarose Genetic Technology Grade MP Biomedicals LLC. 800668 to coat prepared interfering RNA/nanoparticles
Centrifuge Eppendorf AG 5415D to pellet interfering RNA/nanoparticles
Chitosan, from shrimp shells Sigma-Aldrich C3646-25G to combine with interfering RNA for prepararation of interfering RNA/nanoparticles
Dry Yeast Universal Food Corp NA to prepare mosquito larval food with interfering RNA/nanoparticles
E-RNAi tool German Cancer Research Center NA for design of dsRNA; http://www.dkfz.de/signaling/e-rnai3//
goldfish food Wardley Goldfish FLAKE FOOD to prepare mosquito larval food with interfering RNA/nanoparticles
Heated water bath Thermo Scientific 51221048 to heat the interfering RNA/nanoparticles at 55oC
Ice not applicable not applicable for thawing interfering RNA and preparation of interfering RNA/nanoparticles
Name Company Catalog Number Comments
Ice bucket Fisher Scientific 02-591-44 for storage of ice used during the procedure
liver powder MP Biomedicals LLC. 900396 to feed mosquito larvae post interfering RNA/nanoparticle treatment
Microwave oven A variety of vendors not applicable to prepare 2% agarose solution
petridish (100 x 15 mm) Fischer Scientific 875713 interfering RNA/nanoparticle feeding chamber for larvae
pH meter Mettler Toledo S220 for preparation of buffers
Razor blade Fischer Scientific 12-640 to divide the interfering RNA/nanoparticle pellet for feedings
siRNA Thermo Scientific/Dharmacon custom for preparation of siRNA/nanoparticles
Sodium Sulfate, Anhydrous (Na2SO4) BDH/distributed by VWR VWR BDH0302-500G to prepare 50 mM sodium sulfate solution in which the interfering RNA will be resuspended
Thermometer VWR 61066-046 to measure the water bath temperature
Tooth picks VWR 470146-908 for stirring during interfering RNA/nanoparticle food preparation and cutting gel pellets
Ultralow freezer A variety of vendors not applicable for storage of interfering RNA aliquots and interfering RNA/nanoparticles at -80oC
Vortex mixer Fischer Scientific 02-216-108 for preparation of chitosan/interfering RNA
Weight paper Fischer Scientific NC9798735 to divide the interfering RNA/nanoparticle pellet for feedings

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Malaria. , World Health Organization. http://www.who.int/topics/malaria/en (2014).
  2. Dengue. , Malaria Centers for Disease Control and Prevention. http://www.cdc.gov/dengue/ (2014).
  3. Knipling, E. F., et al. Genetic control of insects of public health importance. Bulletin of the World Health Organization. 38 (3), 421-438 (1968).
  4. Fu, G., et al. Female-specific flightless phenotype for mosquito control. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (10), 4550-4554 (2010).
  5. Wise de Valdez, M. R., et al. Genetic elimination of dengue vector mosquitoes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (12), 4772-4775 (2011).
  6. Harris, A. F., et al. Successful suppression of a field mosquito population by sustained release of engineered male mosquitoes. Nature Biotechnology. 30 (9), 828-830 (2012).
  7. Fire, A., et al. Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature. 391 (6669), 806-811 (1998).
  8. Yu, N., et al. Delivery of dsRNA for RNAi in insects: an overview and future directions. Insect science. 20 (1), 4-14 (2013).
  9. Zhang, H., Li, H. C., Feasibility Miao, X. X. limitation and possible solutions of RNAi-based technology for insect pest control. Insect science. 20 (1), 15-30 (2013).
  10. Clemons, A., Haugen, M., Severson, D. W., Duman-Scheel, M. Functional analysis of genes in Aedes aegypti embryos. Cold Spring Harb Protoc. 2010 (10), (2010).
  11. Clemons, A., et al. siRNA-mediated gene targeting in Aedes aegypti embryos reveals that frazzled regulates vector mosquito CNS development. PLoS One. 6 (1), e16730 (2011).
  12. Haugen, M., et al. Semaphorin-1a is required for Aedes aegypti embryonic nerve cord development. PLoS One. 6 (6), e21694 (2011).
  13. Nguyen, C., et al. Functional genetic characterization of salivary gland development in Aedes aegypti. EvoDevo. 4 (1), 9 (2013).
  14. Sarro, J., et al. Requirement for commissureless2 function during dipteran insect nerve cord development. Developmental dynamics: an official publication of the American Association of Anatomists. 242 (12), 1466-1477 (2013).
  15. Singh, A. D., Wong, S., Ryan, C. P., Whyard, S. Oral delivery of double-stranded RNA in larvae of the yellow fever mosquito, Aedes aegypti: implications for pest mosquito control. J Insect Sci. 13, 69 (2013).
  16. Lopez-Martinez, G., Meuti, M., Denlinger, D. L. Rehydration driven RNAi: a novel approach for effectively delivering dsRNA to mosquito larvae. Journal of medical entomology. 49 (1), 215-218 (2012).
  17. Scott, J. G., et al. Towards the elements of successful insect RNAi. Journal of insect physiology. 59 (12), 1212-1221 (2013).
  18. Coy, M. R., et al. Gene silencing in adult Aedes aegypti mosquitoes through oral delivery of double-stranded RNA. J Appl Entomol. 136 (10), 741-748 (2012).
  19. Zhang, X., Zhang, J., Zhu, K. Y. Chitosan/double-stranded RNA nanoparticle-mediated RNA interference to silence chitin synthase genes through larval feeding in the African malaria mosquito (Anopheles gambiae). Insect molecular biology. 19 (5), 683-693 (2010).
  20. Mysore, K., Flannery, E. M., Tomchaney, M., Severson, D. W., Duman-Scheel, M. Disruption of Aedes aegypti olfactory system development through chitosan/siRNA nanoparticle targeting of semaphorin-1a. PLoS neglected tropical diseases. 7 (5), e2215 (2013).
  21. Mysore, K., Andrews, E., Li, P., Duman-Scheel, M. Chitosan/siRNA nanoparticle targeting demonstrates a requirement for single-minded during larval and pupal olfactory system development of the vector mosquito Aedes aegypti. BMC developmental biology. 14 (1), 9 (2014).
  22. Dass, C. R., Choong, P. F. Chitosan-mediated orally delivered nucleic acids: a gutful of gene therapy. Journal of drug targeting. 16 (4), 257-261 (2008).
  23. An, C., Budd, A., Kanost, M. R., Michel, K. Characterization of a regulatory unit that controls melanization and affects longevity of mosquitoes. Cellular and molecular life sciences : CMLS. 68 (11), 1929-1939 (2011).
  24. Clemons, A., Mori, A., Haugen, M., Severson, D. W., Duman-Scheel, M. Culturing and egg collection of Aedes aegypti. Cold Spring Harb Protoc. 2010 (10), (2010).
  25. Horn, T., Boutros, M. E-RNAi: a web application for the multi-species design of RNAi reagents--2010 update. Nucleic acids research. 38, W332-W339 (2010).
  26. Patel, N. H. Ch. 19. In situ hybridization to whole mount Drosophila embryos. A laboratory guide to RNA: Isolation, Analysis, and Synthesis. PA, K. rieg , Wiley-Liss. (1996).
  27. Haugen, M., et al. Whole-mount in situ hybridization for analysis of gene expression during Aedes aegypti development. 2010 (10), Cold Spring Harb Protoc. (2010).
  28. Clemons, A., Flannery, E., Kast, K., Severson, D. W., Duman-Scheel, M. Immunohistochemical analysis of protein expression during Aedes aegypti development. Cold Spring Harb Protoc. 2010 (10), (1101).
  29. Rund, S. S., Hou, T. Y., Ward, S. M., Collins, F. H., Duffield, G. E. Genome-wide profiling of diel and circadian gene expression in the malaria vector Anopheles gambiae. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (32), E421-E430 (2011).
  30. Gaj, T., Gersbach, C. A., Barbas, C. F. 3rd ZFN, TALEN, CRISPR/Cas-based methods for genome engineering. Trends in biotechnology. 31 (7), 397-405 (2013).
  31. Aryan, A., Myles, K. M., Adelman, Z. N. Targeted genome editing in Aedes aegypti using TALENs. Methods. 69 (1), 38-45 (2014).
  32. Sarathi, M., Simon, M. C., Venkatesan, C., Hameed, A. S. Oral administration of bacterially expressed VP28dsRNA to protect Penaeus monodon from white spot syndrome virus. Mar Biotechnol (NY). 10 (3), 242-249 (2008).
  33. He, B., et al. Fluorescent nanoparticle delivered dsRNA toward genetic control of insect pests). Adv Mater. 25 (33), 4580-4584 (2013).
  34. Giljohann, D. A., Seferos, D. S., Prigodich, A. E., Patel, P. C., Mirkin, C. A. Gene regulation with polyvalent siRNA-nanoparticle conjugates. Journal of the American Chemical Society. 131 (6), 2072-2073 (2009).
  35. Davis, M. E., et al. Evidence of RNAi in humans from systemically administered siRNA via targeted nanoparticles. Nature. 464 (7921), 1067-1070 (2010).
  36. Molinaro, R., et al. Polyethylenimine and chitosan carriers for the delivery of RNA interference effectors. Expert opinion on drug delivery. 10 (12), 1653-1668 (2013).
  37. Singha, K., et al. Polymers in small-interfering RNA delivery. Nucleic acid therapeutics. 21 (3), 133-148 (2011).

Tags

ביולוגיה מולקולרית גיליון 97 ביולוגיה וקטור התערבות RNA, DsRNA siRNA מציאה בליעה יתושים זחלים פיתוח מחלה
Chitosan / השתקת הגנים RNA Nanoparticle המתווכת להתערב במחלת וקטור כילה נגד זחלים
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Zhang, X., Mysore, K., Flannery, E., … More

Zhang, X., Mysore, K., Flannery, E., Michel, K., Severson, D. W., Zhu, K. Y., Duman-Scheel, M. Chitosan/Interfering RNA Nanoparticle Mediated Gene Silencing in Disease Vector Mosquito Larvae. J. Vis. Exp. (97), e52523, doi:10.3791/52523 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter