Summary
Hier beschrijven we een werkwijze voor het remmen van genfunctie in ziektedragers muggen door het gebruik van chitosan / interfererende RNA nanodeeltjes die worden opgenomen door larven.
Abstract
Vector muggen toebrengen meer menselijk lijden dan enig ander organisme - en doodt elk jaar meer dan een miljoen mensen. De mug genoom projecten gefaciliteerd onderzoek naar nieuwe facetten van mosquito biologie, met inbegrip van functionele genetische studies in de primaire Afrikaanse malaria vector Anopheles gambiae en de dengue en gele koorts vector Aedes aegypti. RNA-interferentie (RNAi-) gemedieerde gene silencing is gebruikt om genen van belang te richten in deze beide ziekteoverbrenger muggensoorten. Hier beschrijven we een werkwijze voor het bereiden van chitosan / interfererende RNA nanodeeltjes die gecombineerd met voedsel en ingenomen door larven. Deze technisch eenvoudige, high-throughput en relatief goedkope methode, die verenigbaar met lange dubbelstrengs RNA (dsRNA) of kleine interfererende RNA (siRNA) moleculen, is gebruikt voor de succesvolle knock-down van verschillende genen in A. gambiae en A. aegyptilarven. Na larvale voedingen, knock-down, dat wordt gecontroleerd door middel van qRT-PCR of in situ hybridisatie, kunnen aanhouden op zijn minst door de late popstadium. Deze methodologie kan voor allerlei muggen en andere insecten, waaronder landbouwongedierte, evenals andere niet-model organismen. Naast zijn bruikbaarheid bij het onderzoekslaboratorium, in de toekomst, chitosan, een goedkope, niet-toxisch en biologisch afbreekbaar polymeer, zou kunnen worden gebruikt in het veld.
Introduction
Bloed voeden vector muggen van de Anophelinen en Aedine geslachten overbrengen ziekteverwekkers verantwoordelijk voor enkele van de ergste bedreigingen van de mensheid. Naar schatting 3,4 miljard mensen het risico voor het oplopen van malaria, die verantwoordelijk is voor meer dan een half miljoen doden per jaar wereldwijd. Malaria resultaat van infectie door Plasmodium sp. Parasieten, die door beten van geïnfecteerde muggen van het geslacht Anopheles, inclusief de belangrijkste Afrikaanse vector Anopheles gambiae (mensen worden doorgegeven http://www.who.int/topics/malaria/en/ , 2014) 1. Aedes aegypti mug de primaire vector voor dengue virus dat dengue koorts, een niet-specifieke koorts die de meest voorkomende en belangrijke arboviral ziekte in de wereld veroorzaakt. Dengue-virus is op dit moment een bedreiging voor> 2,5 miljard mensen in de tropen, met een jaarlijkse incidence van ongeveer 50 miljoen gevallen resulterend in ~ 24.000 sterfgevallen per jaar ( http://www.cdc.gov/dengue/ , 2014) 2. Ondanks de verwoestende wereldwijde impact van door muggen overgebrachte ziekten op de menselijke gezondheid, doeltreffende middelen ter voorkoming en behandeling van deze ziekten ontbreken. Mosquito controle is op dit moment de beste methode van ziektepreventie.
Het potentieel voor het regelen van geleedpotigen overgedragen ziekten door de genetische manipulatie van de vectoren is erkend voor meer dan vier decennia 3. Transgene stammen van A. aegypti ontworpen om een onderdrukbaar vrouwelijke-specifieke vliegende fenotype hebben onlangs het potentieel voor het gebruik van transgene vector controle strategieën een realiteit 4-6. Deze ontwikkelingen hebben de onderzoekers uitgedaagd om nieuwe genetische targets te identificeren voor vector controle en extra middel om het manipuleren van gen-functie in vector muggen. Wijziging van genexpressie dijdens de ontwikkeling, zoals het geval was bij vrouwelijke-vliegende muggen 4 was, kan de opheldering van nieuwe vector controle strategieën te bevorderen. Echter grotendeels door technische problemen, de functies van zeer weinig genen gekarakteriseerd tijdens de ontwikkeling van A. gambiae, A. aegypti, of andere muggensoorten.
Sinds zijn ontdekking in C. elegans 7, RNA interferentie (RNAi), die wordt bewaard in dieren, planten en micro-organismen, is uitgebreid gebruikt voor functionele genetische studies in diverse organismen, waaronder insecten 8,9. De RNAi route wordt geïnitieerd door Dicer, die splitst lange dsRNA in korte 20-25 nucleotide-lange siRNA's die functioneren als sequentie-specifieke interfererende RNA. siRNA stilte genen die complementair zijn in de juiste volgorde zijn door het bevorderen van transcript omzet, splitsing, en verstoring van de vertaling 9. Lange dsRNA moleculen (meestal 300-600 bp) of aangepaste siRNA gericht op een particular sequentie kan worden gebruikt in het onderzoekslaboratorium voor silencing elk gen van interesse. Door het beheer wanneer interfererende RNA is uitgebracht, kunnen onderzoekers de tijd te controleren op welk gen silencing ingewijden. Dit voordeel is nuttig als het kan worden gebruikt om problemen zoals ontwikkelingsstoornissen letaliteit of steriliteit, die de productie en het onderhoud van stammen dragende erfelijke mutaties, een duur en arbeidsintensief proces dat nog niet in alle insectensoorten kunnen belemmeren overwinnen. Hoewel de mate van gen silencing door RNAi varieert van gen tot gen, weefsel weefsel en dier tot dier, wordt RNAi veel gebruikt voor functionele analyse van genen in muggen en andere insecten 8,9.
Drie interfererende RNA levering strategieën zijn gebruikt muggen: micro-injectie, inweken / topische toediening, en inslikken. Voor een gedetailleerde geschiedenis en vergelijking van het gebruik van deze drie technieken bij insecten, verwijzen wij u naar Yu et al 8. We hebben met succes gebruik microinjectie 10 als een middel om siRNAs ontwikkelingsstoornissen genen in A. targeten aegypti embryo's, larven en poppen 11-14. Echter, dit arbeidsintensieve levering strategie vereist zowel een micro-injectie setup en een bedreven hand. Bovendien microinjectie is belastend het organisme, een verstorende factor, vooral wanneer gedrags fenotypen worden beoordeeld. Tenslotte kan microinjectie levering niet worden uitgebreid tot het veld vectorcontrole. Als alternatief, onderdompelen het organisme interfererende RNA oplossing ook een populaire manier induceren gene silencing, aangezien het gemakkelijk en vergt weinig of arbeid. Doorwekende heeft hoofdzakelijk insectencellijn toegepast bestudeert 8, maar in een recente studie werd knockdown in A. bereikt aegypti larven ondergedompeld in een oplossing van dsRNA 15, die de dieren leek te inname. Voor studies met analyse van veelvoudige experimental groepen of fenotypes, inweken is nogal kostbaar. Lopez-Martinez et al. 16 beschreven rehydratie gedreven RNAi, een nieuwe benadering voor interfererende RNA aflevering dat uitdroging in zoutoplossing en rehydratie gaat met een enkele druppel water met interfererende RNA. Deze benadering knipt de kosten geheel dier onderdompeling, maar is duurder dan micro-injectie en kan de toepassing ervan soorten die hoge osmotische druk kan verdragen beperkt. Bovendien is het moeilijk voor te stellen hoe onderdompeling of dehydratatie / rehydratatie onderdompeling methode kan worden aangepast voor vectorcontrole in het veld. Daarom, voor post-embryonale studies, levering van interfererende RNA met voedsel ingenomen een levensvatbare alternatieve strategie.
Alhoewel-inname gebaseerde strategieën werken niet in alle insectensoorten, misschien wel het meest bijzonder Drosophila melanogaster, is orale toediening van interfererende RNA gemengd met voedsel gen si bevorderdlencing in verschillende insecten 8,17, waaronder A. aegypti volwassenen 18. We beschreven chitosan-nanodeeltjes gemedieerde RNAi in A. gambiae larven 19 en hebben met succes toegepast deze aanpak voor de vermindering van de genexpressie in A. aegypti larven 20,21. Hier, methodologie voor deze RNAi procedure, wat inhoudt dat het insluiten van interfererende RNA door het polymeer chitosan, is gedetailleerd. Chitosan / interfererende RNA nanodeeltjes worden gevormd door zelf-assemblage van polykationen met interfererende RNA via elektrostatische krachten tussen de positieve ladingen van de aminogroepen van chitosan en negatieve ladingen op de hoofdketen van interfererende RNA 19 van het fosfaat groepen. De beschreven werkwijze is geschikt voor zowel lange dsRNA moleculen (hierna dsRNA) of dubbelstrengs siRNA (hierna siRNA). Na synthese, chitosan / interfererende RNA nanodeeltjes gemengd met larven eten en afgeleverdlarven bij inslikken. Deze methode is relatief goedkoop, vereist weinig apparatuur en arbeid 19, en faciliteert high-throughput analyse van meerdere fenotypes, met inbegrip van de analyse van het gedrag 20,21. Deze methode, die kan worden aangepast voor gen-silencing studies in andere insecten, waaronder andere vectoren ziekte en insecten landbouwongedierte, zou kunnen worden gebruikt voor gen-silencing in een verscheidenheid van andere diersoorten. Bovendien, chitosan, een goedkope, niet-toxisch en biologisch afbreekbaar polymeer 22, zou kunnen worden gebruikt in het veld soortspecifieke muggen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. muggensoorten en Grootbrengende
- Onderhouden A. gambiae G3 en A. aegypti Liverpool IB12 stammen (voor de representatieve studies hieronder) of andere stammen plaats volgens standaard laboratorium praktijk of zoals eerder beschreven 23,24.
2. dsRNA en siRNA Ontwerp en Productie
- Ontwerp primers voor lange dsRNA sjablonen specifiek voor het gen van belang te construeren. Gebruik de E-RNAi hulpmiddel 25. Opbrengst dsRNA volgens de werkwijze van keuze of zoals eerder beschreven 19.
- Voor een negatieve controle, synthetiseren dsRNA 19 overeenkomt met de sequentie van groen fluorescerend eiwit (GFP), β-galactosidase (β-gal) of een ander gen niet tot expressie gebracht in muggen. Indien gewenst, kan dsRNA 19 gebruikt om de representatieve resultaten hieronder samengevat genereren worden gebruikt als een positieve controle. Store dsRNA opgelost in-RNAse vrij water bij -80 °; C totdat het nodig is.
- Als alternatief ontwerp-gen-specifieke siRNA volgens standaard lab praktijk of zoals eerder 10 beschreven. Versleutelen van de sequentie van een knock-down siRNA om negatieve controle siRNA die niet overeenkomt met een mug gen te ontwerpen. Koop de aangepaste siRNA's, die beschikbaar zijn via een aantal gerenommeerde leveranciers.
- Desgewenst kan siRNAs 20,21 benut de representatieve resultaten hieronder samengevat verkregen worden als positieve controles. WINKEL siRNA opgelost in RNAse-vrij water bij -80 ° C totdat het nodig is.
3. Voorbereiden Chitosan / interfererende RNA Nanodeeltjes
- Verzamel pre RT 100 mM natriumsulfaat (100 mM Na 2 SO 4 in gedeïoniseerd H2O) en 0,1 M natriumacetaat (0,1 M NaCl 2 H 3 O 2 -0,1 M azijnzuur, pH 4,5 in gedeïoniseerd H2O) buffers.
- Ontbinden chitosan (≥75%gedeacetyleerd) in 0,1 M natriumacetaatbuffer 0,02% (w / v) werkoplossing maken en houden van de oplossing op kamertemperatuur vóór gebruik.
- Los dsRNA of siRNA in 50 pl gedeïoniseerd H2O toevoegen aan 100 mM natriumsulfaat buffer 100 pi oplossing van 32 ug dsRNA / siRNA per 100 ul 50 mM natriumsulfaat maken.
- Voeg 100 ul van chitosan oplossing van het dsRNA / siRNA oplossing en verwarm het mengsel in een waterbad bij 55 ° C gedurende 1 min. Stel een controle door toevoeging van 100 ui 50 mM natriumsulfaat 100 gl chitosanoplossing en volgt dezelfde procedure.
- Meng de oplossingen onmiddellijk gedurende 30 seconden op hoge snelheid vortexen bij kamertemperatuur om de vorming van nanodeeltjes vergemakkelijken.
- Centrifugeer het mengsel bij 13.000 xg gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur, waarna een pellet zichtbaar zijn. Breng het supernatant naar een nieuwe buis van 1,5 ml. Air-droog de pellet voor ≈10 min bij RT alvorens het te gebruiken om muggen voedsel te bereiden.
- Maatregel de concentratie van dsRNA / siRNA in de supernatant met de supernatant van de controle (zie 3.5) als blanco de totale hoeveelheid dsRNA / siRNA, dat in het supernatant berekenen. Met het verschil tussen starten hoeveelheden dsRNA / siRNA en bedragen nog in de supernatanten het percentage dsRNA / siRNA ingevangen in de nanodeeltjes berekenen. Dit beladingsrendement gewoonlijk meer dan 90%.
- Herhaal deze procedure als meer nanodeeltjes nodig. Gebruik de gedroogde nanodeeltjes onmiddellijk. De impact van koude opslag van deeltjes voorafgaand aan het gebruik is niet onderzocht.
4. Voorbereiden Mosquito Eten met chitosan / interfererende RNA Nanodeeltjes
- Bereid 1 ml van een 2% agarose-oplossing (w / v) in gedeïoniseerd water, smelt de agarose en houd gesmolten agarose-oplossing in een 55 ° C waterbad voor gebruik.
- Meng visvoer vlokken (47% ruw eiwit, min. Ruw vet 10%, max. Ruwe celstof 3%) en droge gist bij eenverhouding van 2: 1 (w / w). Maal het mengsel tot kleine deeltjes met een mortier en een stamper (begaanbaar door No. 50 USA standaard test zeef). Gebruik de grond eten, die bruinachtig van kleur moeten zijn, hetzij onmiddellijk of op te slaan in een afgesloten container bij 4 ° C gedurende enkele weken.
- In een 1,5 ml tube, meng 6 mg gemalen voedsel met de gedroogde nanodeeltjes uit paragraaf 3.7 met een tandenstoker.
- Voeg 30 ul van 2% pre-gesmolten agarosegel oplossing voor de food-nanodeeltjes mengsel; onmiddellijk en grondig te roeren met behulp van een tandenstoker of pipet tip.
- Gebruik de gel met voedsel en nanodeeltjes op de muggenlarven onmiddellijk te voeden. Alternatief, wanneer de gel volledig gestold bij kamertemperatuur, slaan de gel bij 4 ° C en gebruik de volgende dag, of bij -80 ° C voor later gebruik.
5. Het voeden muggenlarven met levensmiddelen die Chitosan / interfererende RNA Nanodeeltjes
- Voeden A. gambiae muggenlarven:
- Verwijderen van een single gel pellet van de 1,5 ml buis met behulp van een tandenstoker en snijd het in 6 gelijke plakjes met een schone scheermesje of tandenstoker.
- Breng 20 derde instar larven in een 500 ml petrischaal met 100 ml gedeïoniseerd water.
- Voer de muggenlarven door één plak van de gel pellet (fijngehakt in kleinere stukken) per petrischaal eenmaal per dag gedurende vier dagen. Zorg ervoor dat de larven voeden observeren op de korrel, die aanzienlijk moeten worden verkleind of geheel afwezig zijn door de volgende dag. Na verloop van tijd, zal muggen ontwikkelen tot larven late vierde instar.
- Noteer elke zichtbare fenotypische veranderingen tijdens het experiment. Onderzoeken het transcript niveaus en andere fenotypische veranderingen zoals besproken in hoofdstuk 6 aan het einde van de periode van vier dagen.
- Voeden A. aegypti muggenlarven:
- Snijd de gel pellet in 6 gelijke plakjes met een schone scheermesje of tandenstoker.
- Plaats 50-jarige leeftijd gesynchroniseerd 24 uur na ei uitbroeden filarven eerste instar in een petrischaaltje in ≈40 ml gedeïoniseerd water.
- Voeden larven één schijfje per petrischaal voor 4 uur / dag, vervolgens transfer larven terug naar de reguliere larvale voeding van 2: 1 begane visvoer vlokken en droge gist voor de rest van de dag. Herhaal de procedure dagelijks gedurende de vier larvale stadia.
- Onderzoeken het transcript niveaus en andere fenotypische veranderingen zoals besproken in hoofdstuk 6 op de gewenste ontwikkelingsstoornissen tijdstippen.
6. Bevestiging van Gene Knockdown
- Relatieve transcript kwantificering door qRT-PCR in A. aegypti en A. gambiae larven.
- Voer en analyseren qRT-PCR assays met drie biologische replicaten op ten minste 10 samengevoegde controle versus experimentele larven beschreven 11,19,20 of volgens standaard laboratorium procedure. Representatieve resultaten zijn hieronder opgenomen.
- Voor de analyse van een bepaald type weefsel / lichaamsdeel (dwz., Hersenen of antenne), perform qRT-PCR zoals beschreven in 6.1.1 na dissectie om het weefsel van belang vorderen (zie bijvoorbeeld Mysore et al. 21).
- Bevestiging van knockdown door in situ hybridisatie
- Synthetiseren-digoxygenine gelabeld antisense en zinsbeheersing riboprobes volgens standaard lab praktijk of zoals beschreven 26.
- Uitvoeren in situ hybridisatie volgens de Haugen et al. 27 protocol bevestiging van knockdown zoals eerder beschreven 11,20 en in het onderdeel representatieve resultaten hieronder.
- Bevestiging van de knock-down door immunohistochemie
- Als antilichamen tegen het eiwitproduct van het gen gerichte beschikbaar, immunohistochemie uitgevoerd zoals eerder beschreven 28 die de identificatie van individuen met de grootste niveaus van knockdown op fenotype analyse 20 vergemakkelijkt zoals geïllustreerd in de representative resultaten hieronder.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
A. gambiae:
Chitosan / dsRNA nanodeeltjes worden gevormd als gevolg van de elektrostatische interactie tussen aminogroepen van chitosan en de fosfaatgroepen van dsRNA. De efficiëntie van dsRNA opname in nanodeeltjes is gewoonlijk meer dan 90% zoals gemeten door uitputting van dsRNA uit de oplossing. Atomic force microscopie beelden tonen dat chitosan-dsRNA gemiddelde deeltjesgrootte 140 nm in diameter, variërend 100-200 nm (Figuur 1).
Figuur 1. Nanodeeltje vorming van chitosan en interfererende RNA. Atomic Force Microscopy beeld van chitosan / dsRNA nanodeeltjes (A) of chitosan oplossing zonder toevoeging van dsRNA (B). De grootte van de beelden was 1,0 um x 1,0 urn. Schaal bar = 250 nm.e.com/files/ftp_upload/52523/52523fig1large.jpg "target =" _ blank "> Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Het voeden van deze deeltjes die worden gecombineerd met standaard larven eten en opgenomen in agarose ondersteunt normale larvale ontwikkeling. Belangrijk specifieke knockdown van ectoderm afgeleide AgCHS1 transcripten en middendarm specifieke AgCHS2 (figuur 2) kan 19 aangetoond dat dsRNA opgenomen door opname van nanodeeltjes initieert RNAi buiten de middendarm. Knockdown efficiëntie ≈40-60% waargenomen (bijv. Figuur 2) en variëren transcripten.
Figuur 2. Transcriptie niveaus van chitinesynthase 2 (AgCHS2) na dsRNA opname in <em> A. gambiae larven. Relatieve mRNA niveaus van AgCHS2 in larven gevoed met nanodeeltjes met ds AgCHS2 of controle ds GFP. Gegevens zijn weergegeven als gemiddelde ± SD van drie onafhankelijke biologische herhalingen. Verschillende letters op de staven geven significante verschillen gebaseerd op gepaarde t testen (P = 0.003).
Knock-down van AgCHS1 significante vermindering van het totale chitine gehalte van larven vierde instar en verhoogde de gevoeligheid voor de chitine synthese remmer insecticide, diflubenzuron 19, Knockdown van AgCHS2 significant het effect van calcofluor witte toegenomen en dithiotreïtol die de peritrophic matrix (PM) in de vierde instar verstoord larven (figuur 3) resulteert in een verhoogde sterfte 17.
A. aegypti:
Chitosan / siRNA nanodeeltjes werden gebruikt om de axon begeleiding gen semaphorines-1a (sema1a) tijdens A. richten aegypti larvale ontwikkeling 20. Knock-down van sema1a werd door bevestigd in situ hybridisatie, die verminderde niveaus van sema1a gedetecteerd in ≈60% van de larvale hersenen kontEssed en nagelaten sema1a expressie te detecteren in ≈40% van de knock-down dier hersenen (Figuur 4C vs. B; gele pijlpunt geeft de antennal kwab). qRT-PCR assays uitgevoerd op samengevoegde gehele dieren gebleken dat deze techniek leidde tot 32 ± 10% vermindering sema1a transcripten in vergelijking met controle-nanodeeltjes gevoede dieren (figuur 4A; p <0,01 op basis van gepaarde t-toets, N = 5, waarbij N is het aantal biologische herhalingen). Knockdown in de hersenen bleef door ten minste 24 uur van popstadium ontwikkeling, zoals blijkt uit verlies van anti-Sema1a antilichaam expressie (figuur 4E1 vs. D1), die werd gebruikt om dieren met aanzienlijke knockdown tijdens de larvale en popstadium olfactorische fenotype analyse gebieden. Larvale en popstadium antennaal kwab defecten (gekwantificeerd in tabel 1) werden in sema1a knockdown larven en poppen gedetecteerd (figuur 4E2, E3 vs.
Figuur 4. Chitosan / siRNA geïnduceerde knockdown van sema1a in de ontwikkelingslanden olfactorische systeem van A. aegypti. QRT-PCR (A) en in situ hybridisatie (B, C) assays bevestigd knockdown van sema1a in larven gevoed met een mengsel van sema1a targeting siRNA 890 en siRNA 1198 chitosan / interfererende RNA nanodeeltjes versus controle nanodeeltjes. Verlies van Sema1a expressie resulteerde in glomeruli die vervormd (E1-3 vs. D1-3). Zie tekst voor details. Dorsal is in alle panelen. Schaal bar = 25 pm. Dit cijfer verscheen oorspronkelijk in Mysore et al 20. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
| Larven | Poppen | |||||
| siRNA | n | <strong> Wildtype | AL gebreken | n | Wildkleur | AL gebreken |
| Controle | 69 | 69 (100%) | 0 (0%) | 68 | 68 (100%) | 0 (0%) |
| sema1a KD | 77 | 42 (54.5%) | 35 (44%) * | 75 | 51 (68%) | 24 (32%) * |
Tabel 1. Kwantificering van antennal kwab gebreken volgende sema1a knockdown. Een samengesteld overzicht van de verkregen resultaten voor de controle siRNA vs. sema1a knockdown (KD) siRNA 890 + siRNA 1198 chitosan-nanodeeltjes gevoede dieren uit een totaal van acht repliceren experimenten uitgevoerd in zowel larven ( links) en poppen (rechts) weergegeven. De totaleaantal individuen beoordeeld (n) en aantallen / percentages dieren waarbij wildtype morfologie versus antennaal kwab (AL) defecten (olfactorische receptor neuron gericht defecten, gebreken neuropil en glomeruli vorming) zijn aangegeven. Knockdown werd immunohistochemisch geverifieerd met anti-Sema1a antilichaam kleuring in een subgroep van dieren (15 larven en poppen 10) de meest ernstige gebreken weergegeven (aangegeven met *). Alle knockdown dieren op deze manier geëvalueerd bleken te hebben verminderd niveaus van Sema1a, terwijl Sema1a niveaus in-control gevoede dieren waren niet noemenswaardig veranderd. Deze tabel verscheen oorspronkelijk in Mysore et al 20.
In een tweede onderzoek werden 21, chitosan / siRNA nanodeeltjes gebruikt om de transcriptiefactor Single-minded (Sim) richten tijdens de ontwikkeling van het olfactorische systeem. qRT-PCR-tests met gepoolde hersenen ontleed uit hele dieren gaf aan dat sim knockdown hersenen hadden gemiddeld een 47% reductide in sim transcripten in vergelijking met nanodeeltjes gevoede controledieren (p = 0.005 gebaseerd op gepaarde t test). Vergelijkbaar assays met antennes bleek gemiddeld een daling van 77% sim niveaus met betrekking tot controle-gevoede dieren (P = 0,002 gebaseerd op gepaarde t-test). Ondanks enige variatie in de niveaus van knockdown tussen weefsels en dieren werden sim transcripten gedetecteerd door in situ hybridisatie in ≈50% van de knockdown dierenhersenen / antennes na behandeling met twee verschillende siRNA knockdown (Figuur 5B2, B3, C2, C3 vs. B1, C1, tabel 2). In gist gedrags-assays waarin individuen die werden aangetrokken door gist werden beloond met een score van 1, terwijl de dieren die niet aangetrokken werden kregen een score van 0, de gemiddelde scores voor sim 430 of sim waren 718 knockdown dieren significantly lager dan die van controle gevoede dieren in twee herhaalde experimenten (Figuur 5A; P <0.001 gebaseerd op gepaarde t test). Defecte geur volgen gedrag (Figuur 5A) gecorreleerd met verminderde niveaus van sim in de antennes (Figuur 5B2, B3 vs. B1) en hersenen (figuur 5C2, C3 vs. C1, gele stippen geven de omtrek van de antennaal kwab; zie Tabel 2 voor de kwantificering van de resultaten). Meerdere gebreken werden vastgesteld in de antennes en antennaal lobben van sim knockdown dieren (zie Mysore et al. 21 voor details). Bijvoorbeeld, sim knockdown larven en poppen ontbrak expressie van Orco, de obligate coreceptor voor geurstof receptoren in olfactorische receptor neuronen (Figuur 6). Bij personen gevoed met sim 430 (verlaagd orco transcriptniveaus gedetecteerd Figuur 6A3, B3) of sim 718 (figuur 6A4, B4) knockdown (KD) chitosan / siRNA nanodeeltjes (te vergelijken met wild type dieren in figuur 6A1, B1 en controle chitosan / siRNA-nanodeeltjes gevoede dieren in figuur 6A2, B2). Het verlies van orco expressie fenotype waargenomen in L4 larven (figuur 6A1-A4) bleef door ten minste 24 uur na pupal vorming (Figuur 6B1-B4).
Figuur 5. sim knockdown larven tonen defecte geur-lokstof gedrag. In situ hybridisatie onthuld verminderde niveaus van de sim-RNA in de antennes (B2, B3) en hersenen (C2, C3) van sim 430 en sim 718 knock-down dieren (te vergelijken met controle-gevoed in B1, C1), die niet reageerden op gist geurstof lokstof (A). Zie tekst voor details. De proximale uiteinden van de antennes worden naar boven gericht in B1-B3. Dorsale opwaarts georiënteerd in C1-C3. Schaal bar = 25 pm. Dit cijfer verscheen oorspronkelijk in Mysore et al 21. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 6. Verlies van Orco uitdrukking in het ontwikkelen van A. aegypti antenne volgende knock-down van de sim. Verminderde niveaus van Orco transcript werden bij personen fe gedetecteerdd met sim 430 (A3, B3) of sim 718 (A4, B4) knockdown (KD) chitosan / siRNA nanodeeltjes (te vergelijken met wild type dieren in A1, B1 en controle chitosan / siRNA-nanodeeltjes gevoede dieren in A2, B2). Zie tekst voor details. Schaal bar = 25 pm. Dit cijfer is samengesteld uit beelden gepubliceerd in Mysore et al 21. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
| Aangetrokken | Niet Aangetrokken | ||||||||
| siRNA | n | # Dieren | Normaal | Matig | Nul | # Dieren | Normaal | Matig | Nul |
| Controle | 195 | 196 (100%) | 196 (100%) | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| sim 430 KD | 176 | 63 (35%) | 48 (76%) | 15 (24%) | 0 | 113 (64%) | 20 (18%) | 12 (11%) | 81 (71%) |
| sim 718 KD | 177 | 66 (37%) | 44 (66%) | 22 (34%) | 0 | 111 (63%) | 20 (18%) | 9 (8%) | 82 (74%) |
Tabel 2. Niveaus van sim correleren met larvale prestaties in een gist gedrags-test. Een samengesteld samenvatting van de resultaten verkregen in vier gist geurstof lokstof repliceren experimenten wordt getoond. Het totale aantal dieren (n) geeft het aantal individuele larven die werden getest in deze gedrags assays. Het aantal individuele larven (# Dieren) die werden aangetrokken (links; dieren die de gist pellet geraakt en werden beloond met een score van 1) of niet aangetrokken (rechts; dieren die niet de gist pellet leverde raken en kreeg een score van 0) onder elke conditie (Control, sim 430 KD, of sim 718 KD chitosan / siRNA nanodeeltjes-gevoed) getoond, en de percentages van de totale dieren worden opgenomen naar aanleiding van de ruwe cijfers. Knockdown van sim werd onderzocht door in situ hybridisatie in de hersenen en antennes dieren aangetrokken (links) of niet aangetrokken (rechts) op de gist. Deruwe aantal / percentage van personen met Normaal (vergelijkbaar met sim transcriptniveaus wildkleur), Null (geen waarneembare sim transcript), of Moderate (verminderd, maar niet wild type) sim niveaus worden aangegeven. Verlies van sim correleerde goed met weinig aantrekkingskracht op de gist. Deze tabel verscheen oorspronkelijk in Mysore et al 21.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De chitosan / interfererende RNA nanodeeltjes hierin beschreven methode werd gebruikt om effectief genen richten tijdens de larvale ontwikkeling A. gambiae (figuren 2, 3) en A. aegypti (figuren 4, 5, 6, Tabellen 1, 2). Chitosan nanodeeltjes kunnen worden bereid met ofwel lange dsRNA of siRNA, die beide met succes gebruikt in muggen zoals blijkt uit de representatieve resultaten hierin beschreven. Synthese van dsRNA goedkoper dan de aankoop siRNA, maar is arbeidsintensief. Wanneer chitosan / siRNA wordt gebruikt, kan fenotypes worden bevestigd met verschillende siRNAs, waardoor een betere garantie dat het fenotype onbedekte niet door off-site targeting. Ook kan de commerciële productie van siRNA massaal beter bevorderen van uitbreiding van chitosan / interfererende RNA silencing voor soortspecifieke muggen het veld. Dit zal uiteraard nodig overwinnen obstakelen zoals kosten en levertijd.
Hoewel we hebben genoten van een goede succes met dit protocol, moeten methodologieën worden geoptimaliseerd voor elk gen. Om deze reden adviseren wij het testen van meerdere siRNA, of misschien wel een siRNA en een lange dsRNA, bij het begin van een nieuw project. Zodra fenotypen geïdentificeerd en bevestigd met ten minste twee verschillende siRNA's die overeenkomen met een gen van interesse, kan het nuttig zijn om deze siRNAs fenotype penetrantie verhogen (figuur 4) te combineren. De timing en ook de duur van chitosan / interfererende RNA voedertijd kan worden geoptimaliseerd voor elk onderzoek. A. gambiae gedijen bij toediening alleen chitosan / interfererende RNA voedsel zoals hierin beschreven. In de experimenten die wij hebben uitgevoerd op heden, A. aegypti hebben niet goed verging zonder aanvullende voeding, een probleem dat we hebben overwonnen door ze op een dieet van normale voeding na 4 uur van chitosan / interfererende RNA voeden. Experimenteren met chitosan / storendeRNA levering in een ander voedsel substraat, die we nog niet hebben geprobeerd, kan dit probleem omzeilen. We hebben gevonden dat 4 uur dagelijkse voeding in de loop van enkele dagen tot een goede balans tussen knockdown en voldoende voeding, maar aanpassing van de duur van het voeden kan verder naar wens worden voortgezet. Ook kan het larvale instar waarin chitosan / interfererende RNA nanodeeltjes voeding wordt geïnitieerd / vervolg worden aangepast voor elk experiment afhankelijk van de kritische ontwikkelingsperiode waarin genfunctie onderzocht, een groot voordeel van dit protocol.
Verificatie van knockdown is uiteraard essentieel, maar kan ook problemen vereisen. Om deze reden, kan het nuttig zijn om gelijktijdig te controleren of fenotypes van belang worden gegenereerd als knockdown efficiëntie wordt beoordeeld. Voor qRT-PCR validatie experimenten is het essentieel dat de primers en PCR-omstandigheden geoptimaliseerd. Bovendien is het belangrijk dat dieren ontwikkelingsgebiedgesynchroniseerd bij het begin van het experiment, aangezien de expressie van een aantal transcripten zeer dynamisch tijdens de ontwikkeling en door circadiane ritmes 29 kan zijn. Bovendien, terwijl deze methode levert duidelijk knockdown buiten de darm, we beginnen pas aan de weefsels die deze techniek effectief te evalueren, en kan variëren tussen soorten. Het is daarom nuttig om knockdown in bepaalde weefsels, kan worden bereikt door ontleden weefsels plaats van gehele dieren voor qRT-PCR assays of door in situ hybridisatie (Figuren 4-6) 20,21 en immunohistochemie (figuur 4) 20 meten assays (zie Haugen et al. 27 en Clemons et al. 28, respectievelijk voor het oplossen van deze protocollen). Sinds knock-down varieert van individu tot individu, is het nuttig om dubbel-etikettering testen uit te voeren om fenotypes in combinatie met een knock-down niveaus beoordelen (Figuopnieuw 4) 20, die sterk vergemakkelijkt fenotype karakterisering. Voor gedragsonderzoek, kan knockdown niveaus bij individuele dieren worden gecorreleerd met hun gedragsproblemen optredens (tabel 2) 20,21.
Volgend chitosan-gemedieerde interfererende RNA levering aan A. aegypti larven, verminderd genexpressie gedetecteerd na 24 uur van ontwikkeling popstadium (figuren 4, 6) 20,21. Hoewel het niveau van genexpressie zijn nog niet onderzocht in een gedetailleerde manier voorbij dit punt van ontwikkeling, hebben verminderde niveaus van genexpressie werd in zowel 48 en 72 h A. gedetecteerd aegypti poppen (KM, niet gepubliceerd). Het zou nuttig zijn om meer gedetailleerde analyses van knockdown niveaus op meerdere stadia van A. na te streven aegypti pupal ontwikkeling en ook om A. te beoordelen gambiae poppen. Het zou interessant zijn om te bepalen of knockdown blijft volwassenen en verkennen nanodeeltjes gemedieerde interfering RNA levering strategieën voor volwassen muggen.
Site nuciease gentargeting benaderingen werden onlangs voorgesteld aan A. aegypti en A. gambiae en waardoor het genereren van gerichte, erfelijke mutaties in muggen en andere niet-genetische modelorganismen 30,31. Hoewel het gebruik van deze benaderingen maakt gelijkmatiger functieverlies fenotype analyses voordeel RNAi benaderingen screenen op mutaties plaats nog vrij tijdrovend en arbeidsintensief. Bovendien, hoewel RNAi verlies van functie studies vergen onderhoud van alleen wild-type stammen, gemuteerde muggen stammen moeten worden afzonderlijk gehouden. Het onderhoud van recessieve dodelijke of volwassene steriele mutaties is momenteel een uitdaging gezien het huidige gebrek aan gemarkeerde balancers in muggen. Terwijl dus plaatsspecifiek nuclease-gen targeting benaderingen snel aan populariteit wint, chitosan / interfererende RNA targeting kan optimaal zijnkeuze voor laboratoria niet uitgerust om muggen stammen te behouden en in gevallen waarin het verlies van de functie van genen tijdens de ontwikkeling is onverenigbaar met het voortbestaan van de stam.
Op basis van onze bevindingen, verwachten we dat chitosan / interfererende RNA algemeen kan voor knockdown van verschillende genen tijdens de ontwikkeling van A. gambiae, A. aegypti, evenals andere insecten, en mogelijk andere niet-genetisch model organismen. Succesvolle gene silencing met chitosan / is interfererende RNA gemeld bij andere soorten geleedpotigen, waaronder Penaeus monodon (garnalen) 32. Een recente studie toonde aan dat nanodeeltjes vergemakkelijkt de opname van dsRNA en dus het knock-down efficiëntie in vergelijking met rechtstreekse voeding van dsRNA in de Aziatische cornborer 33, die het potentieel onderstreept voor het gebruik van deze technologie om landbouwongedierte richten. Het mogelijke gebruik van siRNA-nanodeeltjes als therapeutische middelen in mensen trekt veel of interesse in de medische gemeenschap. Giljohann et al. 34 beschrijft de synthese en karakterisering van polyvalente RNA-goud nanodeeltjes conjugaten, die een zesvoudige langere halfwaardetijd dan vrije dsRNA en gemakkelijk in cellen. Davis et al. 35 beschrijft de eerste menselijke klinische studie waarbij systemische toediening van siRNA met een nanodeeltje afgiftesysteem patiënten met solide tumoren, en de mogelijkheid om chitosan / siRNA therapeutica is recentelijk 36. Aldus chitosan / interfererende RNA gen-targeting technologie is een waardevolle laboratoriumtechniek mogelijk breder toepassingen. Toekomstig onderzoek zal verkennen extra toepassingen voor deze techniek. Bovendien, chemische modificatie van chitosan en andere polymeren, een actief gebied van onderzoek, kan de efficiëntie van interfererende RNA levering te verhogen of toestaan gerichte levering aan specifieke weefsels 37.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.02 ml pipetteman | Rainin | PR20 | for resuspension of interfering RNA |
| 0.2 ml pipetteman | Rainin | PR200 | for resuspension of interfering RNA and preparation of interfering RNA/nanoparticles |
| 0.5 ml graduated tube | Fischer Scientific | 05-408-120 | for aliquoting resuspended interfering RNA |
| 1 ml pipetteman | Rainin | PR1000 | for resuspension of interfering RNA and preparation of interfering RNA/nanoparticles |
| 1.5 ml graduated tube | Fischer Scientific | 05-408-046 | for preparation of interfering RNA/nanoparticles |
| 1M Sodium Acetate, pH 4.5 | TEKnova | S0299 | to prepare sodium acetate buffer |
| Acetic Acid, AIRSTAR. ACS, USP, FCC Grade | BDH | VWR BDH3092-500MLP | to prepare sodium acetate buffer |
| Agarose Genetic Technology Grade | MP Biomedicals LLC. | 800668 | to coat prepared interfering RNA/nanoparticles |
| Centrifuge | Eppendorf AG | 5415D | to pellet interfering RNA/nanoparticles |
| Chitosan, from shrimp shells | Sigma-Aldrich | C3646-25G | to combine with interfering RNA for prepararation of interfering RNA/nanoparticles |
| Dry Yeast | Universal Food Corp | NA | to prepare mosquito larval food with interfering RNA/nanoparticles |
| E-RNAi tool | German Cancer Research Center | NA | for design of dsRNA; http://www.dkfz.de/signaling/e-rnai3// |
| goldfish food | Wardley | Goldfish FLAKE FOOD | to prepare mosquito larval food with interfering RNA/nanoparticles |
| Heated water bath | Thermo Scientific | 51221048 | to heat the interfering RNA/nanoparticles at 55oC |
| Ice | not applicable | not applicable | for thawing interfering RNA and preparation of interfering RNA/nanoparticles |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ice bucket | Fisher Scientific | 02-591-44 | for storage of ice used during the procedure |
| liver powder | MP Biomedicals LLC. | 900396 | to feed mosquito larvae post interfering RNA/nanoparticle treatment |
| Microwave oven | A variety of vendors | not applicable | to prepare 2% agarose solution |
| petridish (100 x 15 mm) | Fischer Scientific | 875713 | interfering RNA/nanoparticle feeding chamber for larvae |
| pH meter | Mettler Toledo | S220 | for preparation of buffers |
| Razor blade | Fischer Scientific | 12-640 | to divide the interfering RNA/nanoparticle pellet for feedings |
| siRNA | Thermo Scientific/Dharmacon | custom | for preparation of siRNA/nanoparticles |
| Sodium Sulfate, Anhydrous (Na2SO4) | BDH/distributed by VWR | VWR BDH0302-500G | to prepare 50 mM sodium sulfate solution in which the interfering RNA will be resuspended |
| Thermometer | VWR | 61066-046 | to measure the water bath temperature |
| Tooth picks | VWR | 470146-908 | for stirring during interfering RNA/nanoparticle food preparation and cutting gel pellets |
| Ultralow freezer | A variety of vendors | not applicable | for storage of interfering RNA aliquots and interfering RNA/nanoparticles at -80oC |
| Vortex mixer | Fischer Scientific | 02-216-108 | for preparation of chitosan/interfering RNA |
| Weight paper | Fischer Scientific | NC9798735 | to divide the interfering RNA/nanoparticle pellet for feedings |
References
- Malaria. , World Health Organization. http://www.who.int/topics/malaria/en (2014).
- Dengue. , Malaria Centers for Disease Control and Prevention. http://www.cdc.gov/dengue/ (2014).
- Knipling, E. F., et al. Genetic control of insects of public health importance. Bulletin of the World Health Organization. 38 (3), 421-438 (1968).
- Fu, G., et al. Female-specific flightless phenotype for mosquito control. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (10), 4550-4554 (2010).
- Wise de Valdez, M. R., et al. Genetic elimination of dengue vector mosquitoes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (12), 4772-4775 (2011).
- Harris, A. F., et al. Successful suppression of a field mosquito population by sustained release of engineered male mosquitoes. Nature Biotechnology. 30 (9), 828-830 (2012).
- Fire, A., et al. Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature. 391 (6669), 806-811 (1998).
- Yu, N., et al. Delivery of dsRNA for RNAi in insects: an overview and future directions. Insect science. 20 (1), 4-14 (2013).
- Zhang, H., Li, H. C., Feasibility Miao, X. X. limitation and possible solutions of RNAi-based technology for insect pest control. Insect science. 20 (1), 15-30 (2013).
- Clemons, A., Haugen, M., Severson, D. W., Duman-Scheel, M. Functional analysis of genes in Aedes aegypti embryos. Cold Spring Harb Protoc. 2010 (10), (2010).
- Clemons, A., et al. siRNA-mediated gene targeting in Aedes aegypti embryos reveals that frazzled regulates vector mosquito CNS development. PLoS One. 6 (1), e16730 (2011).
- Haugen, M., et al. Semaphorin-1a is required for Aedes aegypti embryonic nerve cord development. PLoS One. 6 (6), e21694 (2011).
- Nguyen, C., et al. Functional genetic characterization of salivary gland development in Aedes aegypti. EvoDevo. 4 (1), 9 (2013).
- Sarro, J., et al. Requirement for commissureless2 function during dipteran insect nerve cord development. Developmental dynamics: an official publication of the American Association of Anatomists. 242 (12), 1466-1477 (2013).
- Singh, A. D., Wong, S., Ryan, C. P., Whyard, S. Oral delivery of double-stranded RNA in larvae of the yellow fever mosquito, Aedes aegypti: implications for pest mosquito control. J Insect Sci. 13, 69 (2013).
- Lopez-Martinez, G., Meuti, M., Denlinger, D. L. Rehydration driven RNAi: a novel approach for effectively delivering dsRNA to mosquito larvae. Journal of medical entomology. 49 (1), 215-218 (2012).
- Scott, J. G., et al. Towards the elements of successful insect RNAi. Journal of insect physiology. 59 (12), 1212-1221 (2013).
- Coy, M. R., et al. Gene silencing in adult Aedes aegypti mosquitoes through oral delivery of double-stranded RNA. J Appl Entomol. 136 (10), 741-748 (2012).
- Zhang, X., Zhang, J., Zhu, K. Y. Chitosan/double-stranded RNA nanoparticle-mediated RNA interference to silence chitin synthase genes through larval feeding in the African malaria mosquito (Anopheles gambiae). Insect molecular biology. 19 (5), 683-693 (2010).
- Mysore, K., Flannery, E. M., Tomchaney, M., Severson, D. W., Duman-Scheel, M. Disruption of Aedes aegypti olfactory system development through chitosan/siRNA nanoparticle targeting of semaphorin-1a. PLoS neglected tropical diseases. 7 (5), e2215 (2013).
- Mysore, K., Andrews, E., Li, P., Duman-Scheel, M. Chitosan/siRNA nanoparticle targeting demonstrates a requirement for single-minded during larval and pupal olfactory system development of the vector mosquito Aedes aegypti. BMC developmental biology. 14 (1), 9 (2014).
- Dass, C. R., Choong, P. F. Chitosan-mediated orally delivered nucleic acids: a gutful of gene therapy. Journal of drug targeting. 16 (4), 257-261 (2008).
- An, C., Budd, A., Kanost, M. R., Michel, K. Characterization of a regulatory unit that controls melanization and affects longevity of mosquitoes. Cellular and molecular life sciences : CMLS. 68 (11), 1929-1939 (2011).
- Clemons, A., Mori, A., Haugen, M., Severson, D. W., Duman-Scheel, M. Culturing and egg collection of Aedes aegypti. Cold Spring Harb Protoc. 2010 (10), (2010).
- Horn, T., Boutros, M. E-RNAi: a web application for the multi-species design of RNAi reagents--2010 update. Nucleic acids research. 38, W332-W339 (2010).
- Patel, N. H. Ch. 19. In situ hybridization to whole mount Drosophila embryos. A laboratory guide to RNA: Isolation, Analysis, and Synthesis. PA, K. rieg , Wiley-Liss. (1996).
- Haugen, M., et al. Whole-mount in situ hybridization for analysis of gene expression during Aedes aegypti development. 2010 (10), Cold Spring Harb Protoc. (2010).
- Clemons, A., Flannery, E., Kast, K., Severson, D. W., Duman-Scheel, M. Immunohistochemical analysis of protein expression during Aedes aegypti development. Cold Spring Harb Protoc. 2010 (10), (1101).
- Rund, S. S., Hou, T. Y., Ward, S. M., Collins, F. H., Duffield, G. E. Genome-wide profiling of diel and circadian gene expression in the malaria vector Anopheles gambiae. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (32), E421-E430 (2011).
- Gaj, T., Gersbach, C. A., Barbas, C. F. 3rd ZFN, TALEN, CRISPR/Cas-based methods for genome engineering. Trends in biotechnology. 31 (7), 397-405 (2013).
- Aryan, A., Myles, K. M., Adelman, Z. N. Targeted genome editing in Aedes aegypti using TALENs. Methods. 69 (1), 38-45 (2014).
- Sarathi, M., Simon, M. C., Venkatesan, C., Hameed, A. S. Oral administration of bacterially expressed VP28dsRNA to protect Penaeus monodon from white spot syndrome virus. Mar Biotechnol (NY). 10 (3), 242-249 (2008).
- He, B., et al. Fluorescent nanoparticle delivered dsRNA toward genetic control of insect pests). Adv Mater. 25 (33), 4580-4584 (2013).
- Giljohann, D. A., Seferos, D. S., Prigodich, A. E., Patel, P. C., Mirkin, C. A. Gene regulation with polyvalent siRNA-nanoparticle conjugates. Journal of the American Chemical Society. 131 (6), 2072-2073 (2009).
- Davis, M. E., et al. Evidence of RNAi in humans from systemically administered siRNA via targeted nanoparticles. Nature. 464 (7921), 1067-1070 (2010).
- Molinaro, R., et al. Polyethylenimine and chitosan carriers for the delivery of RNA interference effectors. Expert opinion on drug delivery. 10 (12), 1653-1668 (2013).
- Singha, K., et al. Polymers in small-interfering RNA delivery. Nucleic acid therapeutics. 21 (3), 133-148 (2011).
