Summary
Aqui, descrevemos um processo para a inibição da função do gene em vectores mosquitos doença através do uso de quitosano / interferindo nanopartículas de RNA que são ingeridos pelas larvas.
Abstract
Mosquitos vetores infligir sofrimento mais humano do que qualquer outro organismo - e matar mais de um milhão de pessoas a cada ano. Os projetos mosquito genoma facilitou a pesquisa em novas facetas da biologia do mosquito, incluindo estudos genéticos funcionais no principal vetor Africano malária Anopheles gambiae eo dengue e amarelo vetor da febre Aedes aegypti. ARN de interferência (RNAi-) silenciamento de genes mediado foi usado para genes alvo de interesse em ambas as espécies de mosquito vector doença. Aqui, descrevemos um procedimento para a preparação de quitosana / interferindo nanopartículas de RNA que são combinados com alimentos e ingeridos pelas larvas. Este, de alto rendimento tecnicamente simples, relativamente barato e metodologia, que é compatível com o RNA de cadeia dupla de comprimento (dsRNA) ou pequenos ARN interferentes (siRNA) moléculas, tem sido utilizado para o knockdown bem sucedida de um número de diferentes genes em A. gambiae e A. aegyptilarvas. Após as mamadas larvais, knockdown, o que é verificado através de qRT-PCR ou hibridação in situ, podem persistir pelo menos até a fase de pupa tarde. Esta metodologia pode ser aplicada a uma grande variedade de espécies de mosquitos e outros insectos, incluindo pragas agrícolas, bem como outros organismos não-modelo. Para além da sua utilidade no laboratório de investigação, no futuro, o quitosano, um polímero barato, não-tóxicos e biodegradáveis, podem ser potencialmente utilizados no campo.
Introduction
Mosquitos sanguíneos que alimentam vetor dos gêneros de anofelinos e aedine transmitir agentes causadores de doenças responsáveis por vários dos piores flagelos da humanidade. Estima-se que 3,4 bilhões de pessoas estão em risco de contrair a malária, que é responsável por mais de meio milhão de mortes por ano em todo o mundo. Resultados da malária de infecção por Plasmodium sp., Que parasita, que são transmitidos às pessoas através da picada de mosquitos infectados do gênero Anopheles, incluindo o principal vector Africano Anopheles gambiae ( http://www.who.int/topics/malaria/en/ , 2014) 1. Aedes aegypti é o mosquito vector primário para o vírus da dengue, o que provoca a febre de dengue, uma doença febril não específica que é a doença mais comum e arbovírus significativa no mundo. O vírus da dengue é, actualmente, uma ameaça para a> 2,5 bilhões de pessoas nos trópicos, com uma inciden anualce de cerca de 50 milhões de casos, resultando em ~ 24 mil mortes por ano ( http://www.cdc.gov/dengue/ , 2014) 2. Apesar do impacto mundial devastador de doenças transmitidas por mosquitos na saúde humana, meio eficaz de prevenir e tratar essas doenças estão faltando. Controle do mosquito é atualmente o melhor método de prevenção da doença.
O potencial para o controle de doenças transmitidas por artrópodes pela manipulação genética de insetos vetores tem sido reconhecida por mais de quatro décadas 3. Estirpes transgénicas de A. aegypti projetado para ter um específico feminino repressible flightless fenótipo fizeram recentemente o potencial para o uso de estratégias de controle de vetores transgênicos uma realidade 4-6. Estes avanços têm desafiado os pesquisadores a identificar alvos genéticos novos para controle do vetor e meios adicionais de manipular a função do gene em mosquitos vetores. A alteração da expressão gênica durante desenvolvimento, como foi o caso em mosquitos fêmeas flightless-4, pode promover a elucidação de novas estratégias de controle do vetor. No entanto, em grande parte devido a dificuldades técnicas, as funções de muito poucos genes foram caracterizadas durante o desenvolvimento de A. gambiae, A. aegypti, ou outras espécies de mosquitos.
Desde a sua descoberta em C. elegans 7, a interferência de RNA (RNAi), que é conservado em animais, plantas e microrganismos, tem sido amplamente utilizada para estudos genéticos funcionais em uma ampla variedade de organismos, incluindo insectos 8,9. A via de RNAi é iniciada por Dicer, que cliva o ARNcd longos em curtos siRNAs de 20-25 nucleótidos de comprimento, que funcionam como ARN de interferência específica da sequência. silenciar genes siRNAs que são complementares em sequência através da promoção de mudança de transcritos, segmentação, e rompimento de tradução 9. Longas moléculas de dsRNA (tipicamente 300-600 pb) ou siRNAs segmentação personalizada uma particulasequência r pode ser utilizado no laboratório de pesquisa para silenciar qualquer gene de interesse. Ao gerir quando interferência RNA é entregue, os pesquisadores podem controlar o tempo no qual gene silenciar iniciados. Esta vantagem é útil como ele pode ser usado para superar desafios como a letalidade de desenvolvimento ou esterilidade, que pode dificultar a produção e manutenção de cepas de rolamento mutações hereditárias, um processo caro e trabalhoso, que ainda não está disponível em todas as espécies de insetos. Embora o grau de silenciamento de genes por RNAi pode variar de gene para gene, tecido para tecido e animal para animal, RNAi é amplamente utilizado para a análise funcional de genes em mosquitos e outros insectos 8,9.
Três estratégias que interferem entrega ARN têm sido usados em mosquitos: microinjecção, aplicação de imersão / tópica, e ingestão. Para uma história detalhada e comparação da utilização destas três técnicas de insectos, por favor, referir-se a Yu et al 8. We foram utilizados com sucesso microinjecção 10 como um meio de entrega de siRNAs para alvejar genes de desenvolvimento em A. embriões aegypti, larvas, pupas e 11-14. No entanto, esta estratégia de entrega de trabalho intensivo requer tanto uma configuração de microinjeção e uma mão hábil. Além disso, a microinjeção é estressante para o organismo, um fator de confusão, especialmente quando fenótipos comportamentais serão avaliados. Por fim, a entrega microinjeção não pode ser estendida para o campo para o controle de vetores. Como alternativa, a imersão do organismo em interferir solução RNA também tornou-se um meio popular de induzir o silenciamento de genes, como é conveniente e requer pouco equipamento ou de trabalho. De imersão tem sido principalmente aplicado na linha celular de insecto estuda 8, mas num estudo recente, foi conseguida em knockdown A. aegypti imerso numa solução de ARNcd de 15, o que os animais pareceram ser ingestão. No entanto, para os estudos que envolvem a análise de múltiplos experimentagrupos l ou fenótipos, imersão é bastante dispendioso. Lopez-Martinez et al., 16 descrito reidratação impulsionada RNAi, uma nova abordagem para entrega de RNA interferente que envolve a desidratação em solução salina e de re-hidratação com uma única gota de água contendo ARN interferente. Esta abordagem não reduzir os custos associados com a imersão dos animais todo, mas é mais caro do que a microinjecção e pode ser limitado na sua aplicação a espécies que podem tolerar elevadas pressões osmóticas. Além disso, é difícil imaginar como a imersão ou desidratação / reidratação metodologia de imersão poderia ser adaptado para o controle do vetor no campo. Por estas razões, para estudos de pós-embrionárias, a entrega de RNA de interferência com os alimentos ingeridos é uma estratégia alternativa viável.
Embora estratégias baseadas ingestão não funcionam em todas as espécies de insetos, talvez mais notavelmente Drosophila melanogaster, a administração oral de RNA de interferência misturado com alimentos promoveu si genelencing em uma variedade de insectos 8,17, incluindo A. adultos aegypti 18. Descrevemos quitosano mediada por ARNi de nanopartículas em A. larvas gambiae 19 e têm aplicado com sucesso esta abordagem para a redução da expressão do gene em A. aegypti 20,21. Aqui, a metodologia para este processo de RNAi, que envolve o aprisionamento de ARN interferente por o polímero de quitosano, é detalhado. Quitosano / ARN interferentes nanopartículas são formadas por auto-montagem de policatiões com ARN interferente através das forças electrostáticas entre cargas positivas dos grupos amino na quitosana e as cargas negativas transportadas por os grupos fosfato na espinha dorsal de ARN de interferência 19. O procedimento descrito é compatível com ambas as moléculas de dsRNA longos (a seguir denominados dsRNA) ou dupla siRNA (doravante referida como siRNA). Após a síntese, o quitosano / interferentes nanopartículas de ARN são misturados com comida de larvas e entregue aolarvas através da ingestão oral. Esta metodologia é relativamente barato, requer pouco equipamento e mão de obra 19, e facilita a análise de alto rendimento de vários fenótipos, incluindo a análise de comportamentos 20,21. Esta metodologia, que pode ser adaptado para estudos de silenciamento de genes em outros insectos, incluindo outros vectores de doenças e pragas de insectos agrícolas, poderia potencialmente ser usada para o silenciamento do gene numa variedade de outras espécies animais. Além disso, o quitosano, um polímero barato, não-tóxica e biodegradável 22, poderia potencialmente ser utilizada no campo de controlo de mosquitos específica da espécie.
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Protocol
1. Mosquito Espécies e Empinar
- Manter A. gambiae G3 e A. estirpes aegypti Liverpool IB12 (utilizadas nos estudos representativos abaixo) ou outras estirpes de interesse de acordo com a prática padrão do laboratório ou como descrito anteriormente 23,24.
2. dsRNA e siRNA Design e Produção
- Iniciadores de design para a construção de modelos de ARNcd longos específicos para o gene de interesse. Use a ferramenta E-RNAi 25. Produzir ARNcd de acordo com o método de escolha ou como previamente descrito 19.
- Para um controlo negativo, sintetizar dsRNA 19 que corresponde à sequência de proteína fluorescente verde (GFP), β-galactosidase (β-gal), ou algum outro gene não expresso em mosquitos. Se assim for desejado, o dsRNA 19 utilizados para gerar os resultados representativos resumidos abaixo pode ser utilizada como um controlo positivo. Loja dsRNA dissolvido em água livre de RNAse a -80 °; C até ser necessário.
- Alternativamente, siRNA específico do gene de criação de acordo com a prática padrão do laboratório ou como previamente descrito 10. Codificar a sequência de um siRNA knockdown para conceber siRNA controlo negativo que não corresponde a qualquer gene de mosquito. Compre os siRNAs personalizados, que estão disponíveis através de um número de fornecedores de confiança.
- Se assim for desejado, os siRNAs 20,21 utilizado para obter os resultados representativos resumidos abaixo podem ser utilizados como controlos positivos. Loja siRNA dissolvido em água isenta de RNase à temperatura de -80 ° C até ser necessário.
3. Preparação de quitosano / ARN interferente Nanopartículas
- Reunir RT sulfato de sódio pré-fabricados 100 mM (100 mM de Na 2 SO 4 em H2O desionizada) e acetato de sódio 0,1 M (0,1 M de NaC 2 H 3 O 2 -0,1 M de ácido acético, pH 4,5 em água desionizada H2O) tampões.
- Dissolver quitosana (≥75%desacetilada) em tampão de acetato de sódio 0,1 M para tornar a 0,02% (w / v) de solução de trabalho e manter a solução à temperatura ambiente antes da sua utilização.
- Dissolve-se ou siRNA dsRNA em 50 ul de H2O desionizada e adicioná-lo ao tampão de sulfato de sódio 100 mM a fazer uma solução de 100 ul de 32 mg de dsRNA / siRNA por 100 ul de sulfato de sódio 50 mM.
- Adicionar 100 ul de solução de quitosano à solução de dsRNA / siRNA e, em seguida, aquecer a mistura num banho de água a 55 ° C durante 1 min. Defina-se um controlo por adição de 100 ul de sulfato de sódio 50 mM a 100 ul de solução de quitosano e seguem o mesmo procedimento.
- Misturar as soluções imediatamente durante 30 seg por vórtice de alta velocidade à TA para facilitar a formação de nanopartículas.
- Centrifuga-se a mistura a 13.000 xg durante 10 min à temperatura ambiente, tempo após o qual uma pastilha deve ser visível. Transferir o sobrenadante para um novo tubo de 1,5 ml. Secar o pellet para ≈10 min à temperatura ambiente antes de usá-lo para preparar a comida mosquito.
- Medir a concentração de ARNcd / siARN no sobrenadante, utilizando o sobrenadante de controlo (ver 3.5), um espaço em branco para calcular a quantidade total de dsRNA / siRNA que permaneceu no sobrenadante. Use a diferença entre os valores de partida de dsRNA / siRNA e valores remanescentes nos sobrenadantes para calcular a porcentagem de dsRNA / siRNA aprisionado nas nanopartículas. Esta eficiência de carga é normalmente superior a 90%.
- Repita o mesmo procedimento se são necessários mais nanopartículas. Use as nanopartículas secas imediatamente. O impacto do armazenamento a frio de partículas antes do uso não foi avaliado.
4. Preparando Mosquito Alimentos que contém quitosana / interferência RNA Nanopartículas
- Preparar 1 mL de uma solução de agarose a 2% (w / v) em água desionizada, derreter a agarose, e manter a solução de agarose fundida em um banho de água 55 C antes da utilização.
- Misture os flocos de comida de peixe (proteína bruta de 47%, min. Gordura bruta de 10%, no máximo. Fibra bruta 3%) e levedura seca em umproporção de 2: 1 (w / w). Moer a mistura de pequenas partículas com um almofariz e pilão (passável através No. 50 EUA peneiro standard). Use a comida solo, que deve ser de cor acastanhada, imediatamente ou armazená-lo em um recipiente fechado a 4 ° C durante várias semanas.
- Em um tubo de 1,5 mL, 6 mg de misturar alimentos chão com as nanopartículas secas a partir da Secção 3.7 com um palito.
- Adicionar 30 ul de solução de gel de agarose a 2% pré-fundido para a mistura de alimentos-nanopartícula; agitar imediata e cuidadosamente usando um palito ou pipeta de ponta.
- Use o gel contendo alimentos e nanopartículas para alimentar as larvas do mosquito imediatamente. Alternativamente, uma vez que o gel é solidificado completamente à TA, armazenar o gel a 4 ° C e usar no dia seguinte, ou a -80 ° C para uso posterior.
5. Alimentação larvas do mosquito com alimentos que contenham Quitosana / interferência RNA Nanopartículas
- Alimentação A. gambiae larvas de mosquito:
- Retirar a sipellet gel ngle do tubo de 1,5 ml usando um palito e corte-o em 6 fatias iguais, usando uma lâmina de barbear limpa ou palito de dentes.
- Transferência de 20 larvas de terceiro instar de um prato Petri de 500 ml contendo 100 ml de água desionizada.
- Alimentar as larvas do mosquito, adicionando uma fatia do pellet gel (finamente picado em pedaços menores) por placa de Petri, uma vez por dia durante quatro dias. Certifique-se de observar a alimentação das larvas no sedimento, que deve ser significativamente reduzida ou completamente ausente no dia seguinte. Depois de um tempo, os mosquitos irá desenvolver em larvas de quarto instar tarde.
- Registre quaisquer alterações fenotípicas visíveis durante o experimento. Examinar os níveis de transcrição e outras alterações fenotípicas como discutido na secção 6, no final do período de quatro dias.
- Alimentação A. aegypti larvas de mosquito:
- Corte o pellet gel em 6 fatias iguais usando uma lâmina de barbear limpa ou palito.
- Coloque 50 sincronizado-idade de 24 horas após a eclosão do ovo filarvas primeiro numa placa de petri em ≈40 mL de água desionizada.
- As larvas alimentam uma fatia por placa de Petri, durante 4 h / dia, em seguida, transferir as larvas de volta para a dieta larval regular de 2: 1 Terra peixes flocos de alimentos e de fermento seco para o resto do dia. Repita o procedimento diariamente ao longo dos quatro estágios larvais.
- Examinar os níveis de transcrição e outras alterações fenotípicas como discutido na seção 6 aos desejados pontos de tempo de desenvolvimento.
6. Confirmação de Gene Knockdown
- Relativa quantificação transcrição por qRT-PCR em A. aegypti e A. larvas gambiae.
- Executar e analisar os ensaios de qRT-PCR com três repetições biológicos em, pelo menos, 10 vs. controlo pool larvas experimental tal como descrito 11,19,20, ou de acordo com procedimento padrão do laboratório. Os resultados representativos estão incluídas a seguir.
- Para a análise de uma determinada parte do tipo de tecido / body (ie., Cérebro ou antena), perform qRT-PCR como descrito em 6.1.1 seguinte dissecção para recuperar o tecido de interesse (por exemplo, ver Mysore et ai. 21).
- Confirmação de knockdown por hibridação in situ
- Sintetizar antisense marcado com digoxigenina e sentir riboprobes de controle de acordo com a prática do laboratório padrão ou como descrito 26.
- Executar a hibridação in situ por o protocolo Haugen et al. 27, para confirmação de knockdown como descrito anteriormente e 11,20 discutido na secção de resultados representativos abaixo.
- Confirmação de knockdown por imuno-histoquímica
- Se os anticorpos contra o produto de proteína do gene alvo estão disponíveis, realizar imunohistoquímica tal como anteriormente descrito 28, o que facilita a identificação de indivíduos com os níveis mais elevados de knockdown para análise de fenótipo 20, como exemplificado no representative seção de resultados abaixo.
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Representative Results
A. gambiae:
Nanopartículas de quitosano / dsRNA são formados devido à interacção electrostática entre os grupos amino de quitosano e os grupos fosfato de ARNdc. A eficiência de incorporação em nanopartículas ARNcd é geralmente superior a 90% tal como medido pela depleção de ARNcd a partir da solução. Atomic imagens de microscopia de força mostra que as médias de tamanhos de partículas de quitosano-dsRNA de 140 nm de diâmetro, que varia 100-200 nm (Figura 1).
Figura 1. formação de nanopartículas de quitosano e ARN interferente. Imagem de microscopia de força atómica de nanopartículas de quitosano / dsRNA (A) ou solução de quitosano sem a adição de ARNcd (B). O tamanho das imagens foi de 1,0 mm × 1,0 mm. Barra de escala = 250 nm."target =" _ e.com/files/ftp_upload/52523/52523fig1large.jpg blank "> Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Alimentando dessas partículas que são combinados com alimentos larval padrão e incorporados agarose apóia o desenvolvimento larval normal. Importante, knockdown específica de derivados de ectoderme transcritos AgCHS1 bem como AgCHS2 específicos de intestino (Figura 2) é possível a 19, demonstrando que o dsRNA absorvido através da ingestão de nanopartículas inicia ARNi para além do intestino médio. Foram observadas eficiências knockdown ≈40-60% (por exemplo., A Figura 2) e variam entre transcritos.
Figura 2. níveis de transcrição de quitina-sintase 2 (AgCHS2) após a ingestão dsRNA em <em> A. larvas gambiae. níveis de mRNA relativos de AgCHS2 em larvas alimentadas com nanopartículas com ds AgCHS2 ou ds controle GFP. Os dados são apresentados como média ± SD de três repetições biológicas independentes. Letras diferentes sobre as barras indicam diferenças significativas com base em testes t pareado (p = 0,003).
Knockdown de AgCHS1 reduziu significativamente o teor total de quitina de larvas de quarto estádio e aumentou a susceptibilidade ao inseticida inibidor da síntese de quitina, Diflubenzuron 19, Knockdown de AgCHS2 aumentou significativamente o efeito de calcofluor branco e ditiotreitol que interrompeu a matriz peritrófica (PM) no quarto estádio larvas (Figura 3), resultando no aumento da mortalidade 17.
A. aegypti:
Quitosano / nanopartículas siRNA foram usadas para direcionar o gene orientação axônio semaphorin-1a (sema1a) durante A. desenvolvimento larval aegypti 20. Knockdown de sema1a foi confirmada através de hibridação in situ, no qual se detectou níveis de sema1a reduzida em ≈60% dos cérebros burro larvaisEssed e não conseguiu detectar a expressão sema1a em ≈40% dos cérebros de animais knockdown (Figura 4C vs. B; seta amarela indica o lóbulo da antena). ensaios de qRT-PCR realizados em animais inteiros reunidas revelou que esta técnica resultou na redução de 32 ± 10% nos transcritos sema1a como comparado com o controlo, os animais alimentados com nanopartículas (Figura 4A; P <0,01 com base no teste t emparelhado, N = 5, onde N é o número de réplicas biológicas). Knockdown no cérebro persistiu durante pelo menos 24 h de desenvolvimento da pupa, como evidenciado pela perda de expressão anti-Sema1a anticorpo (Figura 4E1 vs. D1), que foi utilizado para identificar os animais com knockdown significativa durante analisa fenótipo olfactivo larvar e pupas. Defeitos do lobo antenal de larva e pupa (quantificados na Tabela 1) foram detectados em sema1a knockdown larvas e pupas (Figura 4E2, E3 vs.
Figura 4. A quitosana / siRNA induzida knockdown de sema1a no sistema olfativo desenvolvimento de A. aegypti. QRT-PCR (A) e a hibridização in situ (B, C) ensaios confirmaram knockdown de sema1a em larvas alimentadas com uma mistura de sema1a siRNA alvejando 890 e 1198 siRNA de quitosano / interferentes nanopartículas de ARN comparada nanopartículas de controlo. A perda da expressão Sema1a resultou em glomérulos que são deformados (E1-3 vs D1-3). Veja o texto para mais detalhes. Dorsal é em todos os painéis. Escala da barra = 25 m. Este número foi publicado originalmente em Mysore et al 20. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Larvas | As pupas | |||||
| siRNA | n | <strong> tipo selvagem | Defeitos AL | n | Wildtype | Defeitos AL |
| Controle | 69 | 69 (100%) | 0 (0%) | 68 | 68 (100%) | 0 (0%) |
| sema1a KD | 77 | 42 (54,5%) | 35 (44%) * | 75 | 51 (68%) | 24 (32%) * |
Tabela 1. Quantificação dos defeitos do lobo antenal seguintes knockdown sema1a. Um resumo dos resultados obtidos, compilados para ARNsi de controlo vs. sema1a knockdown (KD) 890 + siRNA siRNA animais alimentados com nanopartículas de quitosano a partir de 1198 um total de oito experiências duplicadas efectuadas em ambas as larvas ( esquerda) e pupas (à direita) é mostrado. O totalsão indicados número de indivíduos avaliados (n) e aos números / percentagens de animais que apresentam morfologia tipo selvagem vs. lobo antenal (AL) defeitos (defeitos de segmentação do neurônio receptor olfativo, neuropil defeituoso e formação de glomérulos). Knockdown foi verificado de forma imunohistoquímica com anti-Sema1a coloração do anticorpo em um subconjunto de animais (15 larvas e pupas 10) que apresentam os defeitos mais graves (indicado com *). Todos os animais avaliados neste knockdown maneira foram encontrados a ter níveis reduzidos de Sema1a, enquanto que os níveis Sema1a em animais alimentados com controlo não foram visivelmente alterada. Esta tabela foi publicada originalmente em Mysore et al 20.
Em uma segunda investigação foram utilizados 21, o quitosano / nanopartículas de siRNA para atingir o fator de transcrição single-minded (Sim) durante o desenvolvimento do sistema olfativo. ensaios de qRT-PCR com cérebros dissecados em pool de animais inteiros indicaram que os cérebros knockdown sim tinham, em média, um reducti 47%em em transcrições sim em relação ao controle de animais alimentados com nanopartículas (p = 0,005 com base em teste t pareado). Ensaios comparáveis com antenas revelados em uma redução média de 77% nos níveis do sim no que diz respeito aos animais (p = 0,002 com base em teste t pareado) controlar-alimentados. Apesar de alguma variabilidade nos níveis de knockdown entre tecidos e animais, transcritos sim não foram detectados através de hibridação in situ em ≈50% do knockdown cérebros de animais / antenas após o tratamento com qualquer um dos dois siRNAs knockdown diferentes (Figura 5B2, B3, C2, C3 vs. B1, C1, Tabela 2). Em levedura ensaios comportamentais durante o qual os indivíduos que foram atraídos para levedura foram adjudicados uma pontuação de 1, enquanto que os animais que não foram atraídos foi dada uma pontuação de 0, as médias para sim 430 ou SIM 718 animais foram knockdown significantly menor que o dos animais de controlo alimentados com experiências duplicadas nas duas (Figura 5A; P <0,001 baseado no teste t emparelhado). Comportamento rastreamento odor-defeituoso (Figura 5A) correlacionados com níveis reduzidos de SIM no antenas (Figura 5B2, B3 vs. B1) e cérebros (Figura 5C2, C3 vs. C1, pontos amarelos marcar o perímetro do lóbulo das antenas; ver Tabela 2, para a quantificação de resultados). Vários defeitos foram identificados nas antenas e lobos antenais de animais knockdown sim (veja Mysore et al. 21 para mais detalhes). Por exemplo, larvas e pupas knockdown sim faltava expressão de orco, o co-receptor obrigatório para todos os receptores olfactivos em neurónios de receptores olfactivos (Figura 6). Níveis de transcrição Orco reduzidos foram detectados em indivíduos alimentados com sim 430 ( Figura 6A3, B3) ou SIM 718 (Figura 6A4, B4) knockdown (KD) quitosana / nanopartículas siRNA (compare com os animais do tipo selvagem na Figura 6A1, B1 e controlar quitosana / siRNA animais alimentados com nanopartículas em Figura 6A2, B2). A perda de expressão orco fenótipo observado nas larvas L4 (Figura 6A1-A4) persistiu durante pelo menos 24 horas após a formação de pupa (Figura 6B1-B4).
Figura 5. sim mostrar larvas knockdown comportamento odor atrativo com defeito. A hibridização in situ revelou redução dos níveis de RNA sim nas antenas (B2, B3) e cérebros (C2, C3) de 430 e sim SIM 718 animais knockdown (compare a controlar-alimentados em B1, C1), que não respondeu ao atrativo levedura odorante (A). Veja o texto para mais detalhes. As extremidades proximais das antenas são orientados para cima em B1-B3. Dorsal está orientado para cima em C1-C3. Escala da barra = 25 m. Este número foi publicado originalmente em Mysore et al 21. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 6. A perda da expressão orco no desenvolvimento A. antena aegypti seguinte knockdown do sim. níveis reduzidos de orco transcrição foram detectados em indivíduos fed sim com 430 (A3, B3) ou SIM 718 (A4, B4) knockdown (KD) de quitosano / nanopartículas siRNA (comparar com animais de tipo selvagem em A1, B1 e controlar de quitosano / siRNA animais alimentados com nanopartículas em A2, B2). Veja o texto para mais detalhes. Escala da barra = 25 m. Este valor foi compilado a partir de imagens publicadas em Mysore et al 21. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Atraídos | Não Atraídos | ||||||||
| siRNA | n | # Animals | Normal | Moderado | Nulo | # Animals | Normal | Moderado | Nulo |
| Controle | 195 | 196 (100%) | 196 (100%) | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| sim 430 KD | 176 | 63 (35%) | 48 (76%) | 15 (24%) | 0 | 113 (64%) | 20 (18%) | 12 (11%) | 81 (71%) |
| sim 718 KD | 177 | 66 (37%) | 44 (66%) | 22 (34%) | 0 | 111 (63%) | 20 (18%) | 9 (8%) | 82 (74%) |
Tabela 2. Nívels sim de correlacionar com a performance larval em um ensaio comportamental de levedura. Um resumo dos resultados obtidos compilados em quatro levedura odorante atractor replicar experiências é mostrado. O número total de animais (n) indica o número de larvas individuais que foram testados nestes ensaios comportamentais. O número de larvas indivíduo (# Animals) que foram atraídos (à esquerda; animais que tocaram o sedimento de levedura e foram premiados com uma pontuação de 1) ou não atraiu (direita; animais que não tocam o pellet fermento e recebeu uma pontuação de 0) em cada condição (Control, sim 430 KD, ou SIM 718 KD quitosana / siRNA alimentados nanopartícula) são mostradas, e as percentagens de animais no total estão incluídas a seguir os números brutos. Knockdown de sim foi avaliada através de hibridização in situ nos cérebros e antenas de animais atraídos (à esquerda) ou não atraiu (à direita) para o fermento. Onúmero bruto / porcentagem de indivíduos com Normal (comparável à estirpe selvagem níveis de transcrição SIM), nulo (sem transcrição sim observável) ou moderada (reduzido, mas não do tipo selvagem) níveis SIM são indicados. Perda de sim correlacionado bem com a falta de atração para o fermento. Esta tabela foi publicada originalmente em Mysore et al 21.
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Discussion
O quitosano / interferindo metodologia de nanopartículas ARN aqui descrita tem sido usada para identificar eficazmente genes durante o desenvolvimento das larvas em A. gambiae (Figuras 2, 3) e A. aegypti (Figuras 4, 5, 6, Tabelas 1, 2). Nanopartículas de quitosano podem ser preparadas com ou longo siRNA dsRNA ou, ambos os quais têm sido utilizados com sucesso em mosquitos como evidenciado pelos resultados representativos aqui descritos. Síntese de dsRNA é menos caro do que comprar siRNA, mas é mais trabalhoso. Se quitosano / siRNA é usado, fenótipos pode ser confirmada com múltiplos siRNAs, permitindo uma melhor garantia de que o fenótipo descoberto não é devido a fora do local de alvo. Além disso, a produção comercial de siRNAs en masse pode facilitar ainda mais a expansão da quitosana / interferência RNA silenciamento para espécies específicas de controle do mosquito para o campo. Isto, claro, exigem superação obstagos, como custo e entrega.
Embora tenhamos desfrutado bom sucesso com este protocolo, as metodologias devem ser otimizados para cada gene. Por esta razão, nós recomendamos testar múltiplos siRNAs, ou talvez um siRNA dsRNA e uma longa, no início de um novo projecto. Uma vez que os fenótipos são identificados e confirmados com, pelo menos, dois siRNAs distintos correspondentes a um gene de interesse, pode ser útil combinar estes siRNAs para aumentar fenótipo penetrância (Figura 4). A temporização e também a duração de quitosano / interferindo tempo de alimentação de ARN pode ser optimizado para cada estudo. A. gambiae prosperar quando alimentados somente com quitosana / interferindo comida RNA como descrito aqui. No entanto, nas experiências que foram realizadas até à data, A. aegypti não se saíram bem, sem suplementação nutricional, um problema temos que superar, transferindo-os para uma dieta de comida normal após 4 h de quitosana / interferindo alimentação RNA. Experiências com quitosana / interferindoEntrega RNA em um substrato de comida diferente, que ainda não têm tentado, pode contornar este problema. Verificou-se que 4 h alimentação diária ao longo de vários dias resultar num bom equilíbrio entre knockdown e uma nutrição adequada, mas a modificação da duração da alimentação pode ser prosseguida como desejado. Além disso, o estádio larval, em que o quitosano / ARN interferente nanopartículas alimentação é iniciada / contínua podem ser adaptados para cada experiência dependendo do período crítico no desenvolvimento em que a função do gene é examinado, uma grande vantagem do presente protocolo.
Verificação de knockdown é claro crítica, mas pode também exigir solução de problemas. Por esta razão, pode ser útil para verificar se simultaneamente fenótipos de interesse são gerados como eficiência knockdown está a ser avaliado. Para as experiências de validação de qRT-PCR, é essencial que os iniciadores de PCR e as condições são optimizadas. Além disso, é importante que os animais são developmentallysincronizadas no início da experiência, como a expressão de alguns transcritos pode ser muito dinâmico durante o desenvolvimento e devido aos ritmos circadianos 29. Além disso, embora esta técnica gera knockdown claramente para além do intestino, que são apenas começando a avaliar os tecidos para os quais esta técnica seja eficaz, e pode variar entre espécies. Será, portanto, útil para medir knockdown em tecidos específicos, que podem ser alcançados por dissecar tecidos de interesse de animais inteiros para qRT-PCR ensaios ou através de hibridização in situ (Figuras 4-6) 20,21 e imuno-histoquímica (Figura 4) 20 ensaios (ver Haugen et al. 27 e Clemons et al. 28, respectivamente, para solucionar esses protocolos). Desde knockdown varia de indivíduo para indivíduo, é útil para realizar ensaios de rotulagem dupla para avaliar fenótipos em combinação com níveis knockdown (Figure 4) 20, o que facilita grandemente a caracterização fenótipo. Para estudos comportamentais, os níveis de knockdown em animais individuais podem ser correlacionados com os seus desempenhos comportamentais (Tabela 2) 20,21.
Seguindo-quitosano entrega mediada por RNA interferente para A. aegypti, expressão reduzida do gene é detectada às 24 h de desenvolvimento da pupa (Figuras 4, 6) 20,21. Embora os níveis de expressão do gene ainda não foram avaliados de um modo detalhado para além deste ponto de desenvolvimento, reduziu os níveis de expressão de genes têm sido detectados em ambos 48 e 72 h A. pupas aegypti (KM, não publicado). Seria útil para a realização de análises mais detalhadas dos níveis de knockdown em vários estágios de A. desenvolvimento de pupa aegypti e também para avaliar A. gambiae pupas. Além disso, seria interessante determinar se o knockdown persiste em adultos e para explorar nanopartícula-mediada emterfering estratégias de fornecimento de RNA para mosquitos adultos.
Gene nuclease visando abordagens específicas do site foram recentemente introduzidas para A. aegypti e A. gambiae e estão permitindo a geração de alvo, mutações hereditárias em mosquitos e outros organismos modelo não-genéticos 30,31. Embora o uso dessas abordagens permite a perda de mais uniforme da função fenótipo análises, uma vantagem sobre abordagens de RNAi, a triagem para mutações de interesse ainda é bastante demorado e trabalhoso. Além disso, embora a perda de RNAi de estudos da função requer manutenção de apenas estirpes do tipo selvagem, cepas mutantes mosquito devem ser criados individualmente. A manutenção de mutações letais estéreis ou adultos recessivos está atualmente desafiador, dada a actual falta de balanceadores marcados em mosquitos. Assim, enquanto site-specific gene da nuclease visando abordagens estão rapidamente a ganhar popularidade, quitosano / ARN interferente de direccionamento pode ser a óptimaescolha para os laboratórios não equipados para manter estirpes de mosquitos e nos casos em que a perda da função dos genes durante o desenvolvimento é incompatível com a sobrevivência da estirpe.
Com base em nossos resultados, podemos antecipar que a quitosana / interferência RNA pode ser usado amplamente para knockdown de muitos genes diferentes durante o desenvolvimento de A. gambiae, A. aegypti, bem como outros insectos, e potencialmente outros organismos modelo não genéticos. Silenciamento de genes de sucesso com quitosana / RNA interferente tem sido relatada em outras espécies de artrópodes, incluindo Penaeus monodon (camarão) 32. Um estudo recente demonstrou que as nanopartículas de facilitar a captação de dsRNA e, assim, aumentar a eficiência knockdown em comparação com alimentação direta de dsRNA na broca do milho Asian 33, o que reforça o potencial de utilização desta tecnologia para atingir pragas agrícolas. A eventual utilização de siRNA-nanopartículas como terapêutica em humanos está atraindo uma grande quantidade of interesse na comunidade médica. Giljohann et al. 34 descreveu a síntese e caracterização de ARN polivalentes conjugados de nanopartículas de ouro, os quais têm um período de seis vezes mais longa meia-vida, em comparação com ARNdc e libertar prontamente entrar nas células. Davis et al. 35 descrita no primeiro ensaio clínico em humanos, envolvendo a administração sistémica de siRNAs usando um sistema de entrega de nanopartículas para pacientes com tumores sólidos, e a possibilidade de utilização terapêutica de quitosano / siRNA foi recentemente revisto 36. Assim, o quitosano / interferindo gene RNA alvo tecnologia é uma técnica valiosa laboratório com potencial para aplicações mais amplas. Pesquisas futuras irão explorar aplicações adicionais para esta técnica. Além disso, a modificação química de quitosano e outros polímeros, uma área activa de investigação, pode aumentar a eficiência de entrega de RNA interferente ou permitir a administração direccionada a tecidos específicos 37.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.02 ml pipetteman | Rainin | PR20 | for resuspension of interfering RNA |
| 0.2 ml pipetteman | Rainin | PR200 | for resuspension of interfering RNA and preparation of interfering RNA/nanoparticles |
| 0.5 ml graduated tube | Fischer Scientific | 05-408-120 | for aliquoting resuspended interfering RNA |
| 1 ml pipetteman | Rainin | PR1000 | for resuspension of interfering RNA and preparation of interfering RNA/nanoparticles |
| 1.5 ml graduated tube | Fischer Scientific | 05-408-046 | for preparation of interfering RNA/nanoparticles |
| 1M Sodium Acetate, pH 4.5 | TEKnova | S0299 | to prepare sodium acetate buffer |
| Acetic Acid, AIRSTAR. ACS, USP, FCC Grade | BDH | VWR BDH3092-500MLP | to prepare sodium acetate buffer |
| Agarose Genetic Technology Grade | MP Biomedicals LLC. | 800668 | to coat prepared interfering RNA/nanoparticles |
| Centrifuge | Eppendorf AG | 5415D | to pellet interfering RNA/nanoparticles |
| Chitosan, from shrimp shells | Sigma-Aldrich | C3646-25G | to combine with interfering RNA for prepararation of interfering RNA/nanoparticles |
| Dry Yeast | Universal Food Corp | NA | to prepare mosquito larval food with interfering RNA/nanoparticles |
| E-RNAi tool | German Cancer Research Center | NA | for design of dsRNA; http://www.dkfz.de/signaling/e-rnai3// |
| goldfish food | Wardley | Goldfish FLAKE FOOD | to prepare mosquito larval food with interfering RNA/nanoparticles |
| Heated water bath | Thermo Scientific | 51221048 | to heat the interfering RNA/nanoparticles at 55oC |
| Ice | not applicable | not applicable | for thawing interfering RNA and preparation of interfering RNA/nanoparticles |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ice bucket | Fisher Scientific | 02-591-44 | for storage of ice used during the procedure |
| liver powder | MP Biomedicals LLC. | 900396 | to feed mosquito larvae post interfering RNA/nanoparticle treatment |
| Microwave oven | A variety of vendors | not applicable | to prepare 2% agarose solution |
| petridish (100 x 15 mm) | Fischer Scientific | 875713 | interfering RNA/nanoparticle feeding chamber for larvae |
| pH meter | Mettler Toledo | S220 | for preparation of buffers |
| Razor blade | Fischer Scientific | 12-640 | to divide the interfering RNA/nanoparticle pellet for feedings |
| siRNA | Thermo Scientific/Dharmacon | custom | for preparation of siRNA/nanoparticles |
| Sodium Sulfate, Anhydrous (Na2SO4) | BDH/distributed by VWR | VWR BDH0302-500G | to prepare 50 mM sodium sulfate solution in which the interfering RNA will be resuspended |
| Thermometer | VWR | 61066-046 | to measure the water bath temperature |
| Tooth picks | VWR | 470146-908 | for stirring during interfering RNA/nanoparticle food preparation and cutting gel pellets |
| Ultralow freezer | A variety of vendors | not applicable | for storage of interfering RNA aliquots and interfering RNA/nanoparticles at -80oC |
| Vortex mixer | Fischer Scientific | 02-216-108 | for preparation of chitosan/interfering RNA |
| Weight paper | Fischer Scientific | NC9798735 | to divide the interfering RNA/nanoparticle pellet for feedings |
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