Summary
Burada larvaları tarafından sindirilen RNA nano-tanecikleri / kitosan kullanımı yoluyla hastalık taşıyıcıları sivrisinek gen fonksiyonunun inhibe edilmesine müdahale için bir prosedür tarif eder.
Abstract
Vektör Sivrisinek başka bir organizma daha çok insan acı indirebilmek - ve bir milyondan fazla insanı her yıl öldürmek. Sivrisinek genom projeleri birincil Afrika sıtma vektörü Anopheles gambiae ve dang ve sarı humma vektör Aedes aegypti fonksiyonel genetik çalışmalar da dahil olmak üzere sivrisinek biyoloji yeni yönleriyle, araştırma kolaylaştırdı. RNA parazitsiz (RNAi-) aracılık ettiği gen susması, bu hastalık taşıyıcıları sivrisinek türlerinin her ikisi de ilgi genleri hedef olarak kullanılmaktadır. Burada, gıda ile birlikte ve larvaları tarafından sindirilen RNA nano-tanecikleri müdahale / çitosan hazırlanması için bir prosedür tarif eder. Uzun çift kollu RNA (dsRNA), ya da küçük müdahale edici RNA (siRNA) molekülleri ile uyumlu olan bu teknik basit, yüksek hacimli, ve nispeten pahalı olmayan bir yöntem, A. farklı geninin başarılı bir şekilde demonte kullanılmaktadır gambiae ve A. aegyptiMah-PCR ile veya in situ hibridizasyon doğrulandı larva. larva beslenmeye ardından, demonte, en azından geç pupa aşamasından devam edebilirsiniz. Bu yöntem, bir sivrisinek ve tarımsal zararlıların da dahil olmak üzere diğer böcek türleri, çok çeşitli, hem de diğer olmayan modeli organizmalar için de geçerli olabilir. Araştırma laboratuarında de yararlı ek olarak, gelecekte, çitosan, ucuz, toksik olmayan ve biyolojik olarak parçalanabilir bir polimer içinde, potansiyel alanında kullanılabilir.
Introduction
Anopheline türü ve aedine cins Kan besleme vektör sivrisinek insanlığın en kötü bela birkaç sorumlu hastalığa neden olan ajanlar iletir. Tahminen 3,4 milyar insan yılda dünya çapında üzerinden bir buçuk milyon kişinin ölümünden sorumlu olan sıtma, sözleşme için risk altındadır. Plasmodium sp enfeksiyonundan Sıtma sonuçları. Başlıca Afrika vektörü Anopheles gambiae (dahil Anopheles cinsi sivrisineklerin enfekte, ısırıkları ile insanlara iletilir parazitler, http://www.who.int/topics/malaria/en/ , 2014) 1. Aedes aegypti dang ateşi, dünyanın en yaygın ve önemli arboviral hastalıktır nonspesifik ateşli hastalığa neden dang virüsü, birincil sivrisinek vektör. Dang virüsü yıllık inciden ile, halen tropik> 2,5 milyar kişiye bir tehdittir24.000 ölüm yıl ~ sonuçlanan yaklaşık 50 milyon olgunun ce ( http://www.cdc.gov/dengue/ , 2014) 2. Insan sağlığı üzerindeki sivrisinek yoluyla bulaşan hastalıkların yıkıcı küresel etkilerine rağmen, önlenmesi ve bu hastalıkların tedavisinde etkili aracı eksiktir. Sivrisinek kontrolü halen hastalığın önlenmesi en iyi yöntemdir.
Vektör böceklerin genetik manipülasyon yoluyla Artropod kaynaklı hastalıkların kontrolü için potansiyeli dört yılı aşkın bir süredir 3 için kabul edilmiştir. A. Transgenik soylar Son zamanlarda transgenik vektör kontrol stratejileri gerçeğe 4-6 kullanarak potansiyelini yaptık aegypti bir bastırılabilir kadın-özel uçamayan fenotip sahip tasarlanmış. Bu gelişmeler vektör kontrolü ve vektör sivrisinek gen fonksiyonunu manipüle ek araçları için yeni genetik hedefler belirlemek için araştırmacılar meydan var. Gen ifadesi d Tadilatınakadın-uçamayan sivrisinekler 4 yılında olduğu gibi uring geliştirme, yeni vektör kontrol stratejilerinin açıklanmasını teşvik edebilir. Ancak, büyük ölçüde teknik zorluklar, çok az genlerin fonksiyonları A. geliştirilmesi sırasında karakterize edilmiştir gambiae, A. aegypti veya diğer sivrisinek türleridir.
C yılında keşfedilmesinden bu yana elegans 7, hayvanlar, bitkiler ve mikroorganizmalar muhafaza edilir, RNA interferans (RNAi), yaygın olarak böcekler 8,9 dahil olmak üzere, geniş bir organizma, çeşitli işlevsel genetik çalışmalar için kullanılmıştır. RNAi yolu diziye özgü müdahale RNA olarak işlev kısa 20-25 nükleotid uzunluğundaki siRNA'lar içine Dicer bölünen uzun dsRNA ile başlatılır. transkript ciro, bölünme ve çeviri 9 bozulması teşvik ederek sırayla tamamlayıcı siRNA'lar sessizlik genler. Bir Particula hedefleme uzun dsRNA molekülleri (tipik olarak 300-600 bp) ya da özel siRNA'larR dizisi, ilgi konusu herhangi bir gen susturma araştırma laboratuarda kullanılabilir. RNA teslim edilir müdahale sırasında yöneterek, araştırmacılar hangi gen de inisiyelere susturulması zaman kontrol edebilirsiniz. Bu üretim ve kalıtsal mutasyonlar, henüz tüm böcek türlerinin mevcut değildir pahalı ve emek-yoğun bir süreç taşıyan suşların bakım engelleyebilir gibi gelişimsel öldürücülüğü veya kısırlık gibi zorlukların üstesinden gelmek için kullanılabildiği gibi bu avantaj yararlıdır. RNAi, gen susturma derecesi hayvana geni, dokuya doku ve hayvan geninin arasında değişebilir, ancak, RNAi yaygın sivrisinek ve diğer böcekler 8,9 genlerin işlevsel analiz için kullanılmaktadır.
Üç müdahale RNA teslim stratejileri sivrisinekler kullanılmıştır: mikroenjeksiyon, iliklerine / topikal uygulama, ve yenmesi. Detaylı bir tarih ve böcekler bu üç teknikler kullanılarak Karşılaştırma için, Yu ve arkadaşları 8 bakınız. WE başarılı bir şekilde A. gelişim hedef genlere siRNA'lar vermek için bir araç olarak mikroenjeksiyon 10 kullandık aegypti embriyolar, larva, pupa ve 11-14. Ancak, bu emek-yoğun teslimat strateji mikroenjeksiyon kurulum ve yetenekli bir el hem de gerektirir. Ayrıca, mikroenjeksiyon davranışsal fenotipleri değerlendirilecek, özellikle organizma, bir karıştırıcı faktör streslidir. Son olarak, mikro-enjeksiyon aktarım vektörü kontrol alanına uzatılamaz. Bu uygundur ve küçük ekipman veya emek gerektirir bir alternatif olarak, RNA çözümü müdahale organizmayı iliklerine de, gen susturulması tetikleme popüler bir araç haline gelmiştir. Islatma öncelikle böcek hücre hattında uygulanmaktadır 8 çalışmaları, ancak son çalışmada, Knockdown A'da elde edildi aegypti larva hayvanlar sindirerek ortaya çıktı dsRNA 15, ihtiva eden bir çözeltiye batırılır. Bununla birlikte, birden fazla experimenta analizini kapsayan çalışmalar içinL grubu veya fenotipleri, ıslatma oldukça maliyetlidir. Lopez-Martinez ve diğ. 16 RNAi, engelleyen RNA ihtiva eden tek bir su damlası ile tuzlu su çözeltisi ve rehidrasyon dehidratasyon içeren RNA teslim müdahale için yeni bir yaklaşım tahrik rehidrasyon tarif. Bu yaklaşım, tüm hayvan daldırma ile ilişkili maliyetlerini düşürmek, ancak mikroenjeksiyon daha pahalı ve yüksek ozmotik basınçları tolere edebilir türlere uygulanması sınırlı edilebilir değildir. Ayrıca, daldırma ya da dehidrasyon / rehidrasyon daldırma yöntemi alanında vektör kontrolü için uyarlanabilir nasıl tasavvur etmek zordur. Bu nedenlerden dolayı, post-embriyonik çalışmalar için alınan gıda ile müdahaleci RNA teslim uygun bir alternatif bir stratejidir.
Yenmesi-tabanlı stratejiler, tüm böcek türleri, belki de en önemlisi Drosophila melanogaster çalışmıyor rağmen, gıda ile karışık RNA müdahale oral teslim gen si terfi ettiBöceklerin 8,17 çeşitli lencing, aşağıdakileri içeren A. aegypti yetişkin 18. Bu A'da kitosan nanopartikül aracılı RNAi tarif gambiae larva 19 ve başarılı bir şekilde A. gen ekspresyonunun azaltılması için, bu yaklaşım uyguladık aegypti larvaları 20,21. Burada, polimer kitosan ile RNA müdahale sürüklenmemesine içerir bu RNAi prosedürü, metodolojisi, ayrıntılı. Kitosan / müdahale edici RNA nanopartiküller çitosan amino gruplarının pozitif yüklerin ve RNA 19 müdahale omurgasında fosfat grupları tarafından taşınan negatif yük arasındaki elektrostatik kuvvetler aracılığıyla müdahaleci RNA ile polikatyonlar kendini düzenlemesinden oluşur. açıklanan prosedür uzun dsRNA moleküllerinin (bundan sonra siRNA olarak anılacaktır) siRNA şeritli (bundan sonra dsRNA olarak anılacaktır) ya da çift ile uyumludur. Aşağıdaki sentez, çitosan / müdahale edici RNA nanopartiküller Konukçu ile karıştırıldı ve teslim edilirOral yoldan alım yoluyla larva. Bu metodoloji, nispeten ucuz küçük ekipman ve emek gerektirir 19, ve davranışların 20,21 analizi de dahil olmak üzere çok sayıda fenotip, yüksek verimlilik analizini kolaylaştırır. Diğer hastalık vektörleri ve böcek tarım haşere de dahil olmak üzere diğer böcekler, gen susturma çalışmaları için adapte edilebilir Bu metodoloji, potansiyel olarak diğer hayvan türlerinin çeşitli gen susturma için kullanılabilir. Ayrıca, çitosan, ucuz, toksik olmayan ve biyolojik olarak parçalanabilir bir polimer 22, potansiyel olarak türe özgü sivrisinek kontrolü için alanda kullanılabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Sivrisinek Türlerinin ve Yetiştirme
- A. koruyun gambiae G3 ve A. aegypti Liverpool IB12 (aşağıda temsili çalışmalarda kullanılan) suşları veya standart laboratuar uygulamaları ya da daha önce 23,24 açıklandığı gibi uygun diğer ilgi suşları.
2. dsRNA'nın ve siRNA Tasarım ve Üretimi
- Tasarım primerler ilgi konusu gen için özel uzun dsRNA şablonlar oluşturmak için yerleştirildi. E-RNAi aracını 25 kullanın. Gibi bir seçim ya da yöntemine göre dsRNA üretmek önce 19 tanımladı.
- Negatif bir kontrol olarak, yeşil flüoresan proteini (GFP), β-galaktosidaz (β-gal) veya sivrisinek ifade edilmeyen başka bir gen sekansına karşılık gelen dsRNA 19 sentezler. Bu şekilde istenmesi halinde, aşağıda temsil sonuçları üretmek için kullanılan dsRNA 19, bir pozitif kontrol olarak kullanılabilir. Mağaza dsRNA'nın -80 ° 'de RNAse içermeyen su içinde çözüldüC kadar gerekli.
- Seçenek olarak ise, tasarım gene özel siRNA standart laboratuar uygulamaya göre ya da daha önce tarif edilen, 10. Sivrisinek genine karşılık negatif kontrol siRNA tasarımı için portatif siRNA dizisini karıştırmak. Saygın satıcıları bir numara ile mevcut özel siRNA'ları, satın alın.
- Bu şekilde istenmesi halinde, aşağıda temsil sonuçları elde etmek için kullanılan siRNA'lar 20,21 pozitif kontrol olarak da kullanılabilir. Gerekli olana kadar mağazası siRNA -80 ° C RNAse içermeyen su içinde çözülmüştür.
3. RNA Nanopartiküller müdahale / Chitosan Hazırlama
- Önceden yapılan RT 100 mM sodyum sülfat toplamak (deiyonize H 2 O 100 mM Na 2SO 4) ve 0.1 M sodyum asetat (deiyonize H 2 O 0.1 M, NAC 2H 3 O 2 -0.1 M asetik asit, pH 4.5) tamponlar.
- Kitosan çözülür (≥75%deasetillenmiş), 0.1 M sodyum asetat tampon maddesi içinde () ağırlık / hacim çalışma çözeltisi% 0.02 yapmak ve kullanılmadan önce oda sıcaklığında çözelti tutun.
- H2O deiyonize 50 ul dsRNA veya siRNA çözülür ve 50 mM sodyum sülfat, 100 ul başına dsRNA / siRNA 32 ug 100 ul solüsyon yapmak için, 100 mM sodyum sülfat tamponu ekleyin.
- DsRNA'nın / siRNA çözeltisine çitosan solüsyonu, 100 ul ilave edin ve daha sonra 1 dakika boyunca 55 ° C'de bir su banyosunda karışım ısı. Kitosan çözeltisinin 100 ul 50 mM sodyum sülfat 100 ul ekleyerek bir denetim kurmak ve aynı prosedürü izleyin.
- Nanopartiküllerin oluşumunu kolaylaştırmak için oda sıcaklığında yüksek hızlı bir girdaplama ile 30 saniye için hemen çözüm karıştırın.
- Pelet görünür olmalıdır, bu süreden sonra, oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 13,000 x g'de santrifüjleyin karışımı. Yeni 1.5 ml tüp süpernatant aktarın. Sivrisinek yemek hazırlamak için kullanmadan önce oda sıcaklığında ≈10 dakika pelet Hava kurulayın.
- Msüpernatant kaldı DsRNA / siRNA'nın toplam miktarını hesaplamak için boş olarak kontrol (3.5 bakınız) süpernatant kullanarak süpernatanda DsRNA / siRNA'nın konsantrasyonunu gözetim kuruluşunun onayını almıştır. Başlangıç dsRNA'nın / siRNA'nın miktarlarda ve nanopartiküller içinde sıkışıp kalan DsRNA / siRNA'nın yüzdesini hesaplamak için Süpernatantları kalan tutarları arasındaki farkı kullanın. Bu yükleme verimliliği normalde% 90 üzerindedir.
- Daha fazla nanopartiküller gerekirse aynı işlemi tekrarlayın. Hemen kurutuldu nano-tanecikleri kullanın. kullanımdan önce parçacıkların soğuk depolama etkisi değerlendirilmemiştir.
4. Sivrisinek Gıda RNA Nanopartiküller müdahale / Chitosan içeren Hazırlanması
- Iyonu giderilmiş su içinde, agaroz eriyik (ağırlık / hacim),% 2 agaroz çözeltisi 1 ml hazırlayın ve kullanımdan önce bir 55 ° su banyosu içinde eritilmiş agaroz çözüm tutmak.
- Balık gevreği karıştırın (% 47 ham protein, dk. Ham yağ% 10, maks. Ham lif% 3) en ve kuru maya(ağırlık / ağırlık) 1: 2 oranı. Bir havan ve tokmak (No 50 ABD standart test elek boyunca yeterli) küçük parçacıklara mikserden. Ya hemen, kahverengimsi renkte olmalıdır zemin yiyecek, kullanın ya da birkaç hafta boyunca 4 ˚C de kapalı bir kapta saklayın.
- 1.5 ml bir tüp içinde, bir kürdan ile Bölüm 3.7 kurutulmuş nanopartiküller ile yer gıda 6 mg karıştırın.
- Gıda nanopartikül karışımı,% 2, önceden eritilmiş agaroz jel çözeltisi 30 ul ilave et; Bir kürdan veya pipet ucu ile hemen ve iyice karıştırın.
- Hemen sivrisinek larvaları beslemek için yiyecek ve nanopartiküller içeren jel kullanın. Jel tamamen oda sıcaklığında katılaşan bir kez, alternatif olarak, 4 ° C'de jel depolama ve kullanma ertesi gün ya da daha sonra kullanmak için -80 ° C 'de.
5. Gıda RNA Nanopartiküller müdahale / Chitosan İçeren ile Sivrisinek Larva Besleme
- Besleme A. gambiae sivrisinek larvaları:
- Bir si kaldırBir kürdan kullanarak ve temiz bir jilet veya diş çekme kullanarak 6 eşit dilimler halinde kesilmiş 1.5 ml tüp ngle jel pelet.
- Iyonu giderilmiş su, 100 ml içeren 500 ml'lik bir Petri tabağına aktarın 20 üçüncü instar larvaları.
- Petri kabı bir kez, dört gün boyunca, günde jel pellet (ince küçük parçalar halinde kesilmiş) bir dilim ekleyerek sivrisinek larvaları besleyin. Önemli ölçüde küçültülür veya ertesi gün tamamen yok edilmelidir pelet, üzerinde larva besleme gözlemlemek için emin olun. Süre sonra, sivrisinekler geç dördüncü evre larvaları dönüşecek.
- Deney sırasında herhangi bir görünür fenotipik değişiklikleri kaydedin. Dört günlük sürenin sonunda 6. bölümde tartışıldığı gibi transkript düzeyleri ve diğer fenotipik değişiklikleri incelemek.
- Besleme A. aegypti sivrisinek larvaları:
- Temiz bir jilet veya kürdan kullanarak 6 eşit dilimler halinde jel pelet kesin.
- Yumurta kuluçka fi sonra 50 yaş senkronize 24 saat yerleştirindeiyonize su ≈40 ml bir petri çanağı içine ilk instar larvaları.
- Günün geri kalanı için 1 zemin balık yiyecek gevreği ve kuru maya: sonra 2 normal larva diyetine geri larvaları transfer 4 saat / gün petri başına larva bir dilim besleyin. Günde dört larva dönemi boyunca prosedürü tekrarlayın.
- Istenen gelişimsel zaman noktalarında bölüm 6'da anlatıldığı gibi transkript düzeyleri ve diğer fenotipik değişiklikleri incelemek.
Gen demonte 6. Onay
- A. Mah-PCR ile Bağıl transkript ölçümü aegypti ve A. gambiae larvaları.
- Gerçekleştirin ve 11,19,20 tarif, ya da standart laboratuar prosedüre göre deney larva vs en az 10 havuza kontrol üç biyolojik çoğaltır ile Mah-PCR deneyleri analiz. Örnek sonuçlar aşağıda yer almaktadır.
- Özel bir doku tipi / gövde parçası (örn. Beyin veya anten), perfo analizi içinÇevrede bulunan doku kurtarma 6.1.1 aşağıdaki diseksiyon tarif edildiği gibi rm QRT-PCR (örneğin, bakınız Mysore ve ark. 21).
- In situ olarak melezleşme ile demonte teyidi
- Dioksijenin-etiketli antisens sentez ve standart laboratuar uygulamaları ya da 26 anlatıldığı gibi uygun kontrol riboprobes seziyorum.
- Daha önce 11,20 açıklandığı ve aşağıda temsilcisi sonuç bölümünde tartışıldığı gibi demonte teyidi için Haugen ark. 27 protokol başına in situ hibridizasyon yürütün.
- Immünohistokimyasal olarak demonte Onayı
- Hedeflenmiş genin protein ürünü karşı antikorların mevcut ise, daha önce tarif edildiği gibi 28, representati örneklendiği gibi fenotip analizi 20 demonte büyük seviyeleri olan bireylerin belirlenmesi kolaylaştıran, immünohistokimya gerçekleştirmekAşağıdaki sonuçlar bölümünde ettik.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
A. gambiae:
Kitosan / dsRNA'nın nanopartiküller bağlı çitosan amino grupları ve dsRNA'nın fosfat grupları arasındaki elektrostatik etkileşim oluşur. çözeltiden dsRNA'nın azalması ile ölçülen nanopartiküller olarak dsRNA dahil verimliliği genellikle% 90 üzerindedir. Atomik kuvvet mikroskopisi görüntüler şunu gösterir ki, 100-200 nm'de (Şekil 1) arasında değişen çap olarak kitosan-dsRNA parçacık boyutu ortalama 140 nm.
Çitosan ve müdahale RNA Şekil 1. Nano partiküler oluşumu. Çitosan / dsRNA nanopartiküller (A) veya dsRNA (B) ilave edilmeden çitosan solüsyonu atomik kuvvet mikroskopisi görüntüsü. görüntü boyutu 1.0 um x 1.0 um idi. Ölçek çubuğu = 250 nm.e.com/files/ftp_upload/52523/52523fig1large.jpg "target =" _ blank "> bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için burayı tıklayınız.
Standart larva gıda ile birlikte ve agaroz dahil olan bu parçacıkların Besleme, normal larva gelişimini destekler. Daha da önemlisi, ektoderm türetilmiş AgCHS1 transkript özel yok etme hem de orta bağırsak özgü AgCHS2 (Şekil 2) dsRNA'nın nanopartiküller yutulması içine alınır olduğunu gösteren, 19 olası ortabağırsak ötesinde RNAi başlatılır. ≈40-60% knockdown verimleri (örn., Şekil 2) gözlenen ve transkript arasında değişmektedir edildi.
DsRNA alımından sonra kitin sentaz 2 (AgCHS2) Şekil 2. Transkripsiyon seviyeleri <em> A. gambiae larvaları. ds AgCHS2 ya da kontrol ds GFP Nanopartiküllerin beslenen larvalarda AgCHS2 nispi mRNA düzeyleri. Veriler üç bağımsız biyolojik çoğaltır ortalama ± SD olarak sunulmaktadır. Çubuklarında farklı harf eşleştirilmiş t testi (p = 0.003) dayalı anlamlı farklılıklar göstermektedir.
AgCHS1 demonte belirgin dördüncü evre larvaları toplam kitin içeriği azaltılmış ve kitin sentezi inhibitörü insektisit duyarlılık artmış, 19 diflubenzuron, AgCHS2 demonte belirgin beyaz Kalkoflorla etkisi artmış ve dördüncü instar içinde peritrofik matris (PM) kesintiye hangi ditiyotireitol larvaları artmış mortalite 17 sonuçlanan (Şekil 3).
A. aegypti:
Chitosan / siRNA'nın nanopartiküller A. sırasında akson rehberlik gen semaforin-1a (sema1a) hedef kullanıldı aegypti larva gelişimi 20. Sema1a demonte larva beyinleri eşek ≈60% olarak sema1a seviyelerini azaltılmış detected in situ hibridizasyon, yoluyla teyit edilmiştirişlenmesinde ve demonte hayvan beyinleri ≈40% olarak sema1a ifade algılamak için başarısız (B vs Şekil 4C, sarı ok antennal lobu gösterir). (kontrol-nanopartikül beslenen hayvanlara kıyasla toplanmış Bütün hayvanlar üzerinde yapılan QRT-PCR deneyleri, bu teknik sema1a transkript 32 ±% 10 azalma ile sonuçlandı ortaya Şekil 4A, eşleştirilmiş t testine göre p <0.01, n = 5, N Biyolojik kopya sayısı) 'dir. Larva ve pupa koku fenotip analizi sırasında belirgin demonte hayvanlara tanımlamak için kullanılan anti-Sema1a antikor ekspresyonu (D1 genel Şekil 4E1) kaybı ile kanıtlandığı gibi, beyinde demonte, pupa gelişme en az 24 saat boyunca devam etmiştir. (Tablo 1 de nicel) larva ve pupa antennal lob kusurları sema1a demonte larva ve pupa tespit edilmiştir (Şekil 4E2, E3 vs
Şekil 4. Kitosan / SiRNA A. gelişen koku alma sistemindeki sema1a ve demonte bağlı aegypti. QRT-PCR (A) ve in situ hibridizasyon (B, C) deneyler, larvalarda sema1a demonte teyit siRNA 890 ve siRNA kontrol nanopartikülleri genel 1198 sitozan / müdahale edici RNA nanopartiküller hedef sema1a bir karışımı beslenir. Sema1a ifade kaybı (D 1-3 vs E1-3) deforme glomerüllerde sonuçlandı. Ayrıntılar için metne bakınız. Sırt bütün panellerde kadar. Ölçek çubuğu 25 mikron =. Bu rakam aslında Mysore ark 20 çıktı. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
| Larva | Pupa | |||||
| siRNA | n | <strong> Yabani türde | AL kusurları | n | Yabanitip | AL kusurları |
| Kontrol | 69 | 69 (% 100) | 0 (0%) | 68 | 68 (% 100) | 0 (0%) |
| sema1a KD | 77 | 42 (% 54.5) | 35 (% 44) * | 75 | 51 (% 68) | 24 (% 32) * |
Sema1a demonte aşağıdaki anten lob kusurların Tablo 1. miktarının belirlenmesi. Kontrolü için elde edilen sonuçların bir özeti derlenmiştir siRNA genel sema1a yok etme (KD) siRNA 890 + her iki larva yapılan sekiz suret deneylerin bir toplam 1198 kitosan nanopartikül beslenen hayvanların siRNA ( sol) ve pupa (sağ) gösterilir. toplam(n) değerlendirildi bireyler ve antennal lob (AL) kusurları (koku reseptör nöron hedefleyen kusurları, bozuk nöropil ve glomerülün oluşumu) vs vahşi tip morfoloji hayvanların sayısı / yüzdeleri sayısı gösterilir. Nakavt en ağır kusurları görüntülenen hayvanlar (15 larva ve pupa 10) bir alt kümesi anti-Sema1a antikor boyama ile immunohistokimyasal doğrulandı (* ile gösterilir). Kontrol ile beslenen hayvanlarda Sema1a seviyesi dikkate değer şekilde değişmesine değil ise bu şekilde değerlendirilir tüm portatif hayvanlar, Sema1a seviyelerine sahip olduğu bulunmuştur. Bu tablo, başlangıçta Mysore ve arkadaşları 20 ortaya çıktı.
İkinci bir araştırmada 21, sitozan / siRNA nanopartiküller koku sisteminin gelişimi sırasında tek kafalı transkripsiyon faktörü (Sim) hedef için kullanılmıştır. Bütün hayvanlar disseke toplanmış beyinleri ile Mah-PCR deneyleri sim demonte beyinleri ortalama% 47 reducti vardı belirttiilgili nanopartikül beslenen kontrol hayvanları ile karşılaştırıldığında, sim transkript (P = 0.005 eşleştirilmiş t testine göre). Saygı ile sim seviyelerinde ortalama% 77 azalma üzerinde ortaya antenler ile karşılaştırılabilir testler hayvanlar (p = 0.002 eşleştirilmiş t testi dayalı) kontrol-beslenen etmek. Doku ve hayvanlar arasındaki demonte düzeylerinde bir değişkenliğe rağmen, sim transkript iki farklı demonte siRNA'lar (Şekil 5B2, B3, C2 ya ile tedavi sonrası portatif hayvan beyin / anten ≈50% in situ hibridizasyon ile saptanmamış, C3-edin B1, C1, Tablo 2). Maya çekti bireyler çekti değil hayvanların 0 puan verildi ise, 1 puan verilir sim 430 için ortalama puanlar veya sim edildiği boyunca maya davranışsal analizlerde 718 demonte hayvanlar si vardıİki tekrarlanan deneylerde kontrol beslenen hayvanların daha gnificantly düşük (Şekil 5A; eşleştirilmiş t testi dayalı p <0.001). Arızalı koku izleme davranışı azaltılmış antenler içinde sim düzeyleri (Şekil 5B2, B1 vs B3) ve beyinleri (Şekil 5C2 ile ilişkili (Şekil 5A), C3 C1 vs, sarı noktalar antennal lob çevresini işaretleyin; Tabloya bakınız 2 sonuçların ölçümü için). Birden kusurları antenleri ve sim demonte hayvanların antennal lobları tespit edilmiştir (bkz Mysore ark. 21 ayrıntılar için). Örneğin, sim yok etme larva ve pupa ORCO, koku verici nöronlar (Şekil 6) her bir koku molekülünün, reseptörleri için ortak alıcı zorunlu ekspresyonunu yoktu. Azaltılmış orco transkript seviyeleri sim 430 (beslenen kişiler tespit edildi Şekil 6A3, B3) ya da (Şekil 6A4, B4), portatif (KD), kitosan / siRNA nanopartiküller (Şekil 6A1, B1 yabani tip hayvanlara karşılaştırarak Şekil 6A2 kitosanın / siRNA nanopartikül beslenen hayvanlar, B2) kontrol 718 sim. L4 larvaları (Şekil 6A1-A4) gözlenen orco ifade fenotip kaybı pupa oluşumu (Şekil 6B1-B4) sonra en az 24 saat boyunca devam etti.
Şekil 5. sim demonte larva gösterisi arızalı koku cezbedici davranış. In situ melezleşme anten içinde sim RNA düşük seviyelerde ortaya (B2, B3) ve sim beyni (C2, C3) 430 ve 7 simMaya Odorant cezbedici (A) yanıt başarısız 18 demonte hayvanlar (karşılaştırmak, B1 kontrol beslenen C1). Ayrıntılar için metne bakınız. anten proksimal uçları B1-B3 yukarı odaklı. Sırt C1-C3 yukarı yönlendirilmiş. Ölçek çubuğu 25 mikron =. Bu rakam aslında Mysore ark 21 çıktı. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Gelişmekte olan A'da orco ifade Şekil 6. kaybı sim ve demonte aşağıdaki aegypti anten. orco transkript İndirimli seviyeleri bireylerin fe tespit edildisim 430 (A3, B3) veya 718 sim d (A4, B4) demonte (KD) kitosan / siRNA'nın nanopartiküller (B1, A1 vahşi tip hayvanlara karşılaştırmak ve A2 kitosan / siRNA'nın nanoparçacık beslenen hayvanlar, B2 kontrol). Ayrıntılar için metne bakınız. Ölçek çubuğu 25 mikron =. Bu rakam Mysore ark 21 yayımlanan görüntülerden derlenmiştir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
| Çekiciliğine | Çekiciliğine değil | ||||||||
| siRNA | n | # Hayvanlar | Normal | Ilımlı | Boş | # Hayvanlar | Normal | Ilımlı | Boş |
| Kontrol | 195 | 196 (% 100) | 196 (% 100) | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| 430 KD sim | 176 | 63 (% 35) | 48 (% 76) | 15 (% 24) | 0 | 113 (% 64) | 20 (% 18) | 12 (% 11) | 81 (% 71) |
| 718 KD sim | 177 | 66 (% 37) | 44 (% 66) | 22 (% 34) | 0 | 111 (% 63) | 20 (% 18) | 9 (% 8) | 82 (% 74) |
Tablo 2. Düzeysim s maya davranış tahlilinde larva performansı ile bağlantılıdır. dört maya koku molekülünün, cezbedici elde edilen sonuçların bir özeti derlenmiştir deneyler çoğaltmak gösterilmiştir. Hayvanlar (n) 'nin toplam sayısı, bu davranış tahlillerde test edilmiştir bireysel larvaların sayısını gösterir. Bireysel larva sayısı çekti (# Hayvanlar) (sol; maya pelet dokundu ve 1 puan verildi hayvanlar) (; maya pelet dokunmadı hayvanlar ve 0 puan aldı sağ) veya çekti Her koşul altında (Kontrol, 430 KD sim veya 718 KD kitosan sim / siRNA'nın nanoparçacık beslenen) gösterilir ve toplam hayvanların yüzdeleri ham numaraları takip dahildir. Sim demonte beyinlerinde in situ hibridizasyon ile değerlendirildi ve hayvanların antenleri (sol) çekti ya maya (sağ) çekti değil.Ham numarası / (sim transkript seviyelerini vahşi tip karşılaştırılabilir) Normal bireylerin yüzdesi, Boş (gözlemlenebilir sim transkript) veya Orta (azaltılmış ama vahşi tip) sim düzeyleri gösterilir. Sim kaybı maya cazibe eksikliği ile de korelasyon. Bu tablo, başlangıçta Mysore et al 21'de ortaya çıktı.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Burada tarif edilen çitosan / müdahale edici RNA nanopartikül yöntem etkili bir şekilde A. larva gelişimi sırasında hedef genlere kullanılmıştır gambiae (Şekil 2, 3) ve A. aegypti (Şekiller 4, 5, 6, Tablolar 1, 2). Kitosan nanopartiküller olarak burada tarif edilen sonuçları ile kanıtlandığı gibi, sivrisinek olarak başarılı bir şekilde kullanılmıştır, her ikisi de uzun dsRNA veya siRNA, ya da hazırlanabilir. DsRNA'nın Sentezi siRNA satın daha az pahalı, ama daha emek yoğundur. Kitosan / siRNA'nın kullanılırsa, fenotipleri ortaya fenotip off-site hedefleme nedeniyle değil daha iyi güvence sağlayan, birden fazla siRNA'lar ile teyit edilebilir. Ayrıca, siRNA'lar topluca ticari üretim daha iyi alanına türe özgü sivrisinek kontrolü için RNA susturulması müdahale / kitosan genişleme kolaylaştırabilir. Elbette bu irade OBSTA üstesinden gerektirirBöyle maliyet ve teslimat gibi ması.
Bu protokol ile iyi bir başarı kazanmış olmasına rağmen, metodolojiler, her gen için optimize edilmelidir. Bu nedenle, biz yeni bir proje başlangıcında, belki bir siRNA ve uzun dsRNA'yı birden siRNA'ları test, ya öneririz. Fenotipleri belirlendi ve en az iki ayrı siRNA'lar ilgi konusu bir gene tekabül eden teyit edildikten sonra, bu fenotip penetrasyonun arttırılması için, bu siRNA'lar (Şekil 4) birleştirmek yararlı olabilir. zamanlama ve ayrıca RNA besleme süresini müdahale kitosan süresi / her çalışma için optimize edilebilir. A. burada tarif edildiği gibi RNA gıda müdahale / sadece çitosan ile beslenen gambiae gelişirler. Ancak, deneylerde biz tarih, A. gerçekleştirdik aegypti, ek beslenme olmadan iyi RNA besleme müdahale / kitosan 4 saat sonra normal gıda diyet aktararak üstesinden bir sorun sayılırdı değil. / Chitosan deneme müdahaleFarklı gıda substrat RNA teslimat, biz henüz teşebbüs değil, hangi bu sorunu aşmak olabilir. Birkaç gün boyunca 4 saat günlük besleme devirme ve yeterli beslenme arasında iyi bir denge neden olduğunu bulduk, ancak besleme süresinin değiştirilmesi ayrıca arzu edildiği gibi yürütülebilir. Ayrıca, kitosan / müdahale RNA nanoparçacık besleme / devam başlatılan olduğu larva gen fonksiyonu, bu protokolün önemli bir avantaj incelendiğinde hangi kritik gelişimsel döneme bağlı olarak her bir deney için uygun olabilir.
Demonte doğrulanması kritik tabii ki, aynı zamanda sorun gerektirebilir. Bu nedenle, yok etme etkisi değerlendirilmektedir gibi ilgi fenotipleri üretildikten sonra eş zamanlı olarak kontrol etmek için yararlı olabilir. Mah-PCR doğrulama deneyleri için, astar ve PCR koşulları optimize önemlidir. Ayrıca, bu hayvanlar, gelişimsel olarak önemlidirBazı transkript ifadesi çok gelişimi sırasında dinamik ve bağlı sirkadiyen ritimler 29 olabilir gibi, deney başlangıcında senkronize. Bu teknik, açıkça bağırsak ötesinde demonte üretir iken Dahası, biz sadece bu tekniğin etkili olduğu dokuları değerlendirmek başlıyor, ve bu türler arasında değişebilir. Bu nedenle, in situ hibridizasyon ile QRT-PCR tahlilleri ya da için bütün hayvanların ilgi dokuların kesilmesi yoluyla elde edilebilir, özellikle doku, (Şekiller 4-6), 20,21 ve immünohistokimya (Şekil 4) 20 demonte ölçmek için yararlı olacaktır tahlilleri (Bu protokoller giderme için sırasıyla Haugen et al. 27 ve Clemons ve diğ., 28 bakınız). Portatif bireyden bireye farklılık gösterdiğinden, bu (Figu yok etme seviyeleri ile birlikte fenotipleri değerlendirmek için çift etiketleme deneyleri gerçekleştirmek için yararlıbüyük ölçüde fenotip karakterizasyonu kolaylaştırır, 4) 20 tekrar. Davranışsal çalışmalar için, tek tek hayvanlarda demonte seviyelerinin davranışsal performansları (Tablo 2) 20,21 ile ilişkili olabilir.
A RNA teslim müdahale çitosan aracılı takiben aegypti larva, düşük gen ekspresyonu pupa gelişme, 24 saat (Şekil 4, 6) 20,21 saptanır. Gen ekspresyonu seviyesi daha gelişme Bu noktadan sonra ayrıntılı bir şekilde değerlendirilmiş olmasına rağmen, gen ekspresyonunun düşük düzeyleri her iki 48 ve 72 saat sonra A tespit edilmiştir aegypti pupa (KM, yayınlanmamış). Bu A. birden aşamalarında demonte seviyelerinin daha detaylı analizler takip etmek yararlı olacaktır aegypti pupa iyileştirilmesi ve A değerlendirmek gambiae pupa. Aynı zamanda demonte erişkinlerde devam belirlemek için ilginç olacaktır ve nanoparçacık aracılı keşfetmek içinyetişkin sivrisinekler için RNA, dağıtım stratejileri terfering.
Yaklaşımları hedefleyen Site özel nukleaz geni son zamanlarda A tanıtıldı aegypti ve A. gambiae ve sivrisinekler ve diğer non-genetik model organizmaların 30,31 hedeflenen, kalıtsal mutasyonlar nesil izin vardır. Bu yaklaşımların kullanılması fonksiyonu fenotip daha homojen kaybını izin rağmen analizleri, faiz mutasyonları için tarama RNAi yaklaşımlar üzerinde bir avantaj, hala oldukça zaman alıcı ve emek-yoğun. Fonksiyon çalışmalarının RNAi kaybı sadece vahşi tip suşları bakım gerektirmesine rağmen Dahası, mutant suşlar sivrisinek ayrı ayrı yetiştirilen olmalıdır. resesif ölümcül veya yetişkin steril mutasyonların bakımı halen sivrisinekler işaretlenmiş dengeleyici mevcut olmaması zor olmasına. Siteye özgü yaklaşımlar hedefleyen nukleaz geni hızla popülerlik kazanıyor Böylece, kitosan / optimal olabilir hedefleme RNA müdahaleSivrisinek suşları korumak için donanımlı değil laboratuvarlar için ve durumlarda seçim hangi geliştirme sırasında gen fonksiyon kaybı suşu sağkalım ile bağdaşmaz.
Bizim bulgulara dayanarak, biz kitosan / müdahale RNA A. gelişimi sırasında birçok farklı genlerin demonte için geniş kullanılabileceğini tahmin gambiae, A. aegypti, hem de diğer böcekler ve potansiyel olarak diğer genetik olmayan model organizma. Çitosan ile başarılı gen susturma / müdahale edici RNA Penaeus monodon (karides) 32 dahil olmak üzere diğer artropod türleri, bildirilmiştir. Yakın tarihli bir çalışmada nanopartiküller dsRNA'nın alımını kolaylaştırmak ve böylece tarım zararlıları hedef bu teknolojiyi kullanarak potansiyelini altını Asya mısır delicisi 33, içinde dsRNA'nın doğrudan beslenme ile karşılaştırıldığında demonte verimliliği artırmak olduğunu göstermiştir. İnsanlarda terapötik olarak siRNA nanopartiküllerin olası kullanımı büyük bir o çekiyortıp camiasında f ilgi. Giljohann ve ark. 34 dsRNA serbest bir kıyasla daha uzun bir yarı-ömre altı kat olması ve hali hazırda hücrelere giriş çok-değerli bir RNA-altın nano partıküler konjugatlarının, sentezi ve karakterizasyonu tarif. Davis ve ark. 35 solid tümörleri olan hastalara bir nanopartikül uygulama sistemi kullanılarak siRNA'lar sistemik olarak tatbik edilmesini içeren ilk insan klinik deneme ve son 36 gözden sitozan / siRNA terapötik kullanılması olasılığını tarif. Dolayısıyla, sitozan / teknoloji hedef RNA genini müdahale geniş uygulamalar için potansiyeli olan değerli bir laboratuar tekniğidir. Gelecekteki araştırmalar, bu teknik için ek uygulamalar ele alınacaktır. Ayrıca, kitosan ve diğer polimerler, aktif bir araştırma alanı kimyasal modifikasyonu, müdahale edici RNA taşınmasının etkinliğini arttırmak ya da özel doku 37 hedeflenmiş dağıtım izin verebilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.02 ml pipetteman | Rainin | PR20 | for resuspension of interfering RNA |
| 0.2 ml pipetteman | Rainin | PR200 | for resuspension of interfering RNA and preparation of interfering RNA/nanoparticles |
| 0.5 ml graduated tube | Fischer Scientific | 05-408-120 | for aliquoting resuspended interfering RNA |
| 1 ml pipetteman | Rainin | PR1000 | for resuspension of interfering RNA and preparation of interfering RNA/nanoparticles |
| 1.5 ml graduated tube | Fischer Scientific | 05-408-046 | for preparation of interfering RNA/nanoparticles |
| 1M Sodium Acetate, pH 4.5 | TEKnova | S0299 | to prepare sodium acetate buffer |
| Acetic Acid, AIRSTAR. ACS, USP, FCC Grade | BDH | VWR BDH3092-500MLP | to prepare sodium acetate buffer |
| Agarose Genetic Technology Grade | MP Biomedicals LLC. | 800668 | to coat prepared interfering RNA/nanoparticles |
| Centrifuge | Eppendorf AG | 5415D | to pellet interfering RNA/nanoparticles |
| Chitosan, from shrimp shells | Sigma-Aldrich | C3646-25G | to combine with interfering RNA for prepararation of interfering RNA/nanoparticles |
| Dry Yeast | Universal Food Corp | NA | to prepare mosquito larval food with interfering RNA/nanoparticles |
| E-RNAi tool | German Cancer Research Center | NA | for design of dsRNA; http://www.dkfz.de/signaling/e-rnai3// |
| goldfish food | Wardley | Goldfish FLAKE FOOD | to prepare mosquito larval food with interfering RNA/nanoparticles |
| Heated water bath | Thermo Scientific | 51221048 | to heat the interfering RNA/nanoparticles at 55oC |
| Ice | not applicable | not applicable | for thawing interfering RNA and preparation of interfering RNA/nanoparticles |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ice bucket | Fisher Scientific | 02-591-44 | for storage of ice used during the procedure |
| liver powder | MP Biomedicals LLC. | 900396 | to feed mosquito larvae post interfering RNA/nanoparticle treatment |
| Microwave oven | A variety of vendors | not applicable | to prepare 2% agarose solution |
| petridish (100 x 15 mm) | Fischer Scientific | 875713 | interfering RNA/nanoparticle feeding chamber for larvae |
| pH meter | Mettler Toledo | S220 | for preparation of buffers |
| Razor blade | Fischer Scientific | 12-640 | to divide the interfering RNA/nanoparticle pellet for feedings |
| siRNA | Thermo Scientific/Dharmacon | custom | for preparation of siRNA/nanoparticles |
| Sodium Sulfate, Anhydrous (Na2SO4) | BDH/distributed by VWR | VWR BDH0302-500G | to prepare 50 mM sodium sulfate solution in which the interfering RNA will be resuspended |
| Thermometer | VWR | 61066-046 | to measure the water bath temperature |
| Tooth picks | VWR | 470146-908 | for stirring during interfering RNA/nanoparticle food preparation and cutting gel pellets |
| Ultralow freezer | A variety of vendors | not applicable | for storage of interfering RNA aliquots and interfering RNA/nanoparticles at -80oC |
| Vortex mixer | Fischer Scientific | 02-216-108 | for preparation of chitosan/interfering RNA |
| Weight paper | Fischer Scientific | NC9798735 | to divide the interfering RNA/nanoparticle pellet for feedings |
References
- Malaria. , World Health Organization. http://www.who.int/topics/malaria/en (2014).
- Dengue. , Malaria Centers for Disease Control and Prevention. http://www.cdc.gov/dengue/ (2014).
- Knipling, E. F., et al. Genetic control of insects of public health importance. Bulletin of the World Health Organization. 38 (3), 421-438 (1968).
- Fu, G., et al. Female-specific flightless phenotype for mosquito control. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (10), 4550-4554 (2010).
- Wise de Valdez, M. R., et al. Genetic elimination of dengue vector mosquitoes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (12), 4772-4775 (2011).
- Harris, A. F., et al. Successful suppression of a field mosquito population by sustained release of engineered male mosquitoes. Nature Biotechnology. 30 (9), 828-830 (2012).
- Fire, A., et al. Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature. 391 (6669), 806-811 (1998).
- Yu, N., et al. Delivery of dsRNA for RNAi in insects: an overview and future directions. Insect science. 20 (1), 4-14 (2013).
- Zhang, H., Li, H. C., Feasibility Miao, X. X. limitation and possible solutions of RNAi-based technology for insect pest control. Insect science. 20 (1), 15-30 (2013).
- Clemons, A., Haugen, M., Severson, D. W., Duman-Scheel, M. Functional analysis of genes in Aedes aegypti embryos. Cold Spring Harb Protoc. 2010 (10), (2010).
- Clemons, A., et al. siRNA-mediated gene targeting in Aedes aegypti embryos reveals that frazzled regulates vector mosquito CNS development. PLoS One. 6 (1), e16730 (2011).
- Haugen, M., et al. Semaphorin-1a is required for Aedes aegypti embryonic nerve cord development. PLoS One. 6 (6), e21694 (2011).
- Nguyen, C., et al. Functional genetic characterization of salivary gland development in Aedes aegypti. EvoDevo. 4 (1), 9 (2013).
- Sarro, J., et al. Requirement for commissureless2 function during dipteran insect nerve cord development. Developmental dynamics: an official publication of the American Association of Anatomists. 242 (12), 1466-1477 (2013).
- Singh, A. D., Wong, S., Ryan, C. P., Whyard, S. Oral delivery of double-stranded RNA in larvae of the yellow fever mosquito, Aedes aegypti: implications for pest mosquito control. J Insect Sci. 13, 69 (2013).
- Lopez-Martinez, G., Meuti, M., Denlinger, D. L. Rehydration driven RNAi: a novel approach for effectively delivering dsRNA to mosquito larvae. Journal of medical entomology. 49 (1), 215-218 (2012).
- Scott, J. G., et al. Towards the elements of successful insect RNAi. Journal of insect physiology. 59 (12), 1212-1221 (2013).
- Coy, M. R., et al. Gene silencing in adult Aedes aegypti mosquitoes through oral delivery of double-stranded RNA. J Appl Entomol. 136 (10), 741-748 (2012).
- Zhang, X., Zhang, J., Zhu, K. Y. Chitosan/double-stranded RNA nanoparticle-mediated RNA interference to silence chitin synthase genes through larval feeding in the African malaria mosquito (Anopheles gambiae). Insect molecular biology. 19 (5), 683-693 (2010).
- Mysore, K., Flannery, E. M., Tomchaney, M., Severson, D. W., Duman-Scheel, M. Disruption of Aedes aegypti olfactory system development through chitosan/siRNA nanoparticle targeting of semaphorin-1a. PLoS neglected tropical diseases. 7 (5), e2215 (2013).
- Mysore, K., Andrews, E., Li, P., Duman-Scheel, M. Chitosan/siRNA nanoparticle targeting demonstrates a requirement for single-minded during larval and pupal olfactory system development of the vector mosquito Aedes aegypti. BMC developmental biology. 14 (1), 9 (2014).
- Dass, C. R., Choong, P. F. Chitosan-mediated orally delivered nucleic acids: a gutful of gene therapy. Journal of drug targeting. 16 (4), 257-261 (2008).
- An, C., Budd, A., Kanost, M. R., Michel, K. Characterization of a regulatory unit that controls melanization and affects longevity of mosquitoes. Cellular and molecular life sciences : CMLS. 68 (11), 1929-1939 (2011).
- Clemons, A., Mori, A., Haugen, M., Severson, D. W., Duman-Scheel, M. Culturing and egg collection of Aedes aegypti. Cold Spring Harb Protoc. 2010 (10), (2010).
- Horn, T., Boutros, M. E-RNAi: a web application for the multi-species design of RNAi reagents--2010 update. Nucleic acids research. 38, W332-W339 (2010).
- Patel, N. H. Ch. 19. In situ hybridization to whole mount Drosophila embryos. A laboratory guide to RNA: Isolation, Analysis, and Synthesis. PA, K. rieg , Wiley-Liss. (1996).
- Haugen, M., et al. Whole-mount in situ hybridization for analysis of gene expression during Aedes aegypti development. 2010 (10), Cold Spring Harb Protoc. (2010).
- Clemons, A., Flannery, E., Kast, K., Severson, D. W., Duman-Scheel, M. Immunohistochemical analysis of protein expression during Aedes aegypti development. Cold Spring Harb Protoc. 2010 (10), (1101).
- Rund, S. S., Hou, T. Y., Ward, S. M., Collins, F. H., Duffield, G. E. Genome-wide profiling of diel and circadian gene expression in the malaria vector Anopheles gambiae. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (32), E421-E430 (2011).
- Gaj, T., Gersbach, C. A., Barbas, C. F. 3rd ZFN, TALEN, CRISPR/Cas-based methods for genome engineering. Trends in biotechnology. 31 (7), 397-405 (2013).
- Aryan, A., Myles, K. M., Adelman, Z. N. Targeted genome editing in Aedes aegypti using TALENs. Methods. 69 (1), 38-45 (2014).
- Sarathi, M., Simon, M. C., Venkatesan, C., Hameed, A. S. Oral administration of bacterially expressed VP28dsRNA to protect Penaeus monodon from white spot syndrome virus. Mar Biotechnol (NY). 10 (3), 242-249 (2008).
- He, B., et al. Fluorescent nanoparticle delivered dsRNA toward genetic control of insect pests). Adv Mater. 25 (33), 4580-4584 (2013).
- Giljohann, D. A., Seferos, D. S., Prigodich, A. E., Patel, P. C., Mirkin, C. A. Gene regulation with polyvalent siRNA-nanoparticle conjugates. Journal of the American Chemical Society. 131 (6), 2072-2073 (2009).
- Davis, M. E., et al. Evidence of RNAi in humans from systemically administered siRNA via targeted nanoparticles. Nature. 464 (7921), 1067-1070 (2010).
- Molinaro, R., et al. Polyethylenimine and chitosan carriers for the delivery of RNA interference effectors. Expert opinion on drug delivery. 10 (12), 1653-1668 (2013).
- Singha, K., et al. Polymers in small-interfering RNA delivery. Nucleic acid therapeutics. 21 (3), 133-148 (2011).
