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Bioengineering

बहु अंग चिप - लंबी अवधि के बहु-ऊतक Coculture के लिए एक microfluidic प्लेटफार्म

Published: April 28, 2015 doi: 10.3791/52526
Automatic Translation
*1, *1,2, 1, 1,2, 1, 3, 3, 1, 1,2
1Medical Biotechnology, Technische Universität Berlin, 2TissUse GmbH, 3Fraunhofer IWS
* These authors contributed equally

Introduction

नशीली दवाओं के विकास के लिए वर्तमान monolayer या निलंबन सेल संस्कृति assays के मानव सेलुलर microenvironment का अनुकरण और इसलिए, एक तेजी से dedifferentiation और प्राथमिक मानव सेल संस्कृतियों में समारोह के नुकसान के लिए नेतृत्व करने में विफल रहे हैं। उच्च शारीरिक प्रासंगिकता के साथ ऊतक मॉडल क्लिनिकल परीक्षण करने के लिए उन्हें स्वीकार करने से पहले यौगिकों की प्रभावकारिता और सुरक्षा की भविष्यवाणी करने की जरूरत है। हाल ही में, इन विट्रो सेल संस्कृति तकनीक में मानक में विवो ऊतक microenvironment की नकल करने के लिए लक्ष्य तीन आयामी बहु सेलुलर मॉडल की ओर दो आयामी monolayer संस्कृतियों से विकसित किया है। इन प्रणालियों को पहले से ही यौगिकों 1,2 की कार्रवाई की विधा का अधिक सटीक भविष्यवाणी की दिशा में प्रमुख सुधार दिखाया है। इसके अलावा, कोशिकाओं के अति विशिष्ट जरूरतों के लिए इन विट्रो संस्कृति की स्थिति अनुकूल ढालने विशेष रुचि है।

इन विट्रो परिस्थितियों में के तहत मानक, महत्वपूर्ण संस्कृति की एक किस्मअक्सर कोशिकाओं पर अभिनय में इस तरह के पोषक तत्व और ऑक्सीजन की आपूर्ति, जमते उत्पादों के हटाने, और यांत्रिक शक्ति के रूप में संरचना मापदंडों, ज्यादातर मामलों में अच्छी तरह से नियंत्रित नहीं किया जा सकता है। कई अंगों पदार्थों और भंग ऑक्सीजन की physiologically प्रासंगिक एकाग्रता ढ़ाल के पास है। हालांकि, उन उच्च विनियमित और अनुकूलित शर्तों एक अत्यधिक अस्थिर वातावरण के लिए अग्रणी और सेलुलर विकास 3 सीमित, इन विट्रो शर्तों के तहत ऊतकों के आसपास बेकाबू प्रसार ढ़ाल के लिए स्पष्ट विपक्ष में हैं। इस प्रकार, steadier और इन विट्रो की स्थिति में विशेष रूप से अधिक मात्रात्मक समय की लंबी अवधि से अधिक व्यवहार्य और विभेदित कोशिकाओं को रखने के लिए आवश्यक हैं। मध्यम घटकों नियमित रूप से हटा दिया है और प्रतिस्थापित कर रहे हैं, जहां perfused प्रणाली, अक्सर ऊतकों के प्रत्यक्ष आसपास के विषय में स्थिर संस्कृतियों की तुलना में बेहतर विशेषता है और चलाया हुआ है। स्थिर स्थिति, सेल के स्राव का प्रसार gradients और संस्कृति के माध्यम से पोषक तत्वों के तहतसंवर्धित कोशिकाओं तीन चारों ओर हो सकता है। ऊतकों के आसपास का परिचय अच्छी तरह से विशेषता मध्यम प्रवाह दरों सेल स्राव छिड़काव के माध्यम से अमीर मध्यम के साथ मिश्रण करने के लिए अनुमति देते हैं। यह एक स्थिर सेलुलर फेनोटाइप सुनिश्चित करने और पूरे परख अवधि 4 भर एंजाइम अभिव्यक्ति metabolizing, परिभाषित सेलुलर microenvironments की पीढ़ी के लिए सक्षम बनाता है।

बहु अंग चिप (एमओसी) में हाल के घटनाक्रम प्रणालियों का परीक्षण के दौरान आवश्यक पदार्थ की एक कम राशि के लिए अग्रणी, चारों ओर microscale बायोरिएक्टर के छोटे, मध्यम और सेल जन आवश्यकताओं के साथ ऊतकों इंजीनियर एक नियंत्रित मध्यम प्रवाह का लाभ गठबंधन आधारित। टिशू कल्चर के लिए कई microfluidic प्रणालियों अब तक 5,6 वर्णित किया गया है। इन प्रणालियों के भीतर ऊतक करने वाली तरल पदार्थ अनुपात physiologically प्रासंगिक सेलुलर crosstalk के अनुकरण में एक विशेष रूप से महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं। हालांकि, इस तरह के बाहरी पंपों और मीडिया जलाशयों के उपयोग के रूप में तकनीकी सीमाओं करने के लिए, वेंसबसे प्रणालियों में ई समग्र परिसंचारी मीडिया मात्रा ऊतक संस्करणों की तुलना में बहुत बड़ा है। Shuler एट अल। के समूह सेल संस्कृति डिब्बों के भीतर और इन विवो प्रासंगिक ऊतक करने वाली तरल पदार्थ अनुपात 7,8 में पदार्थों के उचित निवास टाइम्स सुनिश्चित करने के लिए एक प्रणाली विकसित करने के लिए पहले किए गए। यह भी "अन्य ऊतकों" कम्पार्टमेंट का प्रतिनिधित्व, एक 96 अच्छी तरह से थाली करने के लिए नीचे बाहरी जलाशय स्केलिंग द्वारा हासिल की थी। हमारे एमओसी मंच के भीतर परिसंचारी मीडिया की मात्रा को कम करने के क्रम में, हम विदेशी मीडिया सर्किट के लिए दूर करने की जरूरत है, एक क्रमिक वृत्तों में सिकुड़नेवाला पर चिप micropump एकीकृत। इस micropump मीडिया प्रवाह वेग और कतरनी तनाव दरों नौ की एक चयन नंबर पर प्रणाली को संचालित करने में सक्षम है। 500 माइक्रोन चौड़ाई और 100 माइक्रोन ऊंचाई का एक microfluidic चैनल प्रणाली प्रत्येक एक 96 अच्छी तरह से थाली का एक भी अच्छी तरह के आकार वाले, दो मानकीकृत टिशू कल्चर रिक्त स्थान interconnects। उद्योग मानक अच्छी तरह से थाली के आकार का पालन करएस transwell प्रारूप में उत्पादन पहले से ही विद्यमान ऊतक मॉडल के एकीकरण की अनुमति देता है। इसके अलावा, transwell सेल संस्कृति आवेषण के ऊर्ध्वाधर स्थिति केवल सीधे द्रव का प्रवाह को उजागर नहीं कर रहे हैं, जो ऊतक मॉडल की खेती को सक्षम करने, समायोज्य है, लेकिन यह भी ऊपर उठा लिया और अंतर्निहित वर्तमान से परिरक्षित किया जा सकता है। इसी तरह, हवा तरल इंटरफ़ेस संस्कृतियों इस प्रणाली का उपयोग संभव है।

एमओसी मंच एक polydimethylsiloxane (PDMS) परत 2 मिमी उच्च और स्थायी रूप से तरल पदार्थ से तंग microfluidic सर्किट के लिए फार्म का कम दबाव प्लाज्मा ऑक्सीकरण द्वारा बंधुआ रहे हैं जो 75 X 25 मिमी 2 का एक निशान, के साथ एक गिलास खुर्दबीन स्लाइड से निर्मित है। संबंधित चैनल और सेल संस्कृति डिब्बों युक्त PDMS परत मानक नरम लिथोग्राफी और प्रतिकृति 9 मोल्डिंग द्वारा निर्मित है। इस अध्ययन के दौरान इस्तेमाल किया एमओसी की microfluidic डिजाइन प्रत्येक दो सेल सी पकड़े, चिप प्रति दो अलग-अलग microfluidic सर्किट के शामिल100 माइक्रोन उच्च एक चैनल प्रणाली से जुड़े ulture डिब्बों। यह एक बहु अंग चिप का इस्तेमाल कर दो अलग-अलग दो-ऊतक cocultures के प्रदर्शन की अनुमति दी। पंप आवृत्तियों 40 μl / मिनट की मध्यम प्रवाह दरों उपज के लिए समायोजित किया गया।

यह दो-ऊतक एमओसी डिजाइन शारीरिक प्रवाह शर्तों के तहत एक संयुक्त मीडिया सर्किट में हालांकि, अलग संस्कृति रिक्त स्थान में एक जिगर अंडाकार आकृति और एक त्वचा पंच बायोप्सी coculture करने की क्षमता प्रदान की है। समरूप spheroids फार्म करने के लिए 1: विभेदित HepaRG कोशिकाओं 24 के अनुपात में मानव यकृत तारामय कोशिकाओं (HHSteC) के साथ एक साथ एकत्रित किया गया। भले ही हेपाटोसाइट्स के लगभग दो बार संख्या में विवो स्थिति की तुलना में इस्तेमाल किया गया, पिछले प्रयोगों 10 में मनाया के रूप में यह अनुपात, इष्टतम हो पाया था। त्वचा इस प्रकार सामयिक पदार्थ लोगों तक पहुंचाने के लिए सक्षम करने, एक transwell सेल संस्कृति डालने के अंदर एक हवा तरल इंटरफेस में खेती की गई थी। ये ऊतक मॉडल 28 डी के लिए cocultivated गयाएमओसी में ays इस प्रणाली की व्यापकता का प्रदर्शन करने के लिए। इसके अलावा, चिप्स के microfluidic चैनल सर्किट पूरी तरह से और अधिक बारीकी से नाड़ी तंत्र अनुकरण करने के लिए मानव त्वचीय microvascular endothelial कोशिकाओं (HDMEC) के साथ कवर किया गया था।

Protocol

नोट: मानव किशोर शिशन के मुख पर खुली त्वचा दिनचर्या खतना के बाद एक बाल चिकित्सा सर्जरी से, प्रासंगिक कानूनों के अनुपालन में, सूचित सहमति और नैतिकता के अनुमोदन (नैतिक समिति Charité विश्वविद्यालय चिकित्सा, बर्लिन, जर्मनी) के साथ प्राप्त हुई थी।

एमओसी में खेती के लिए ऊतक समकक्ष 1. उत्पादन

  1. जिगर spheroids उत्पन्न करने के लिए ड्रॉप प्लेटों फांसी में HepaRG और HHSteC कुल।
    1. , मिला हुआ से मध्यम, विभेदित monolayer संस्कृतियों को हटाने (2 75 सेमी) सेल संस्कृति बोतल में उगाई HepaRG कोशिकाओं के trypsinization के लक्ष्य को हासिल करने के लिए, दो बार पीबीएस के साथ धोने, और 0.05% trypsin / EDTA के 3 मिलीलीटर जोड़ें। 37 डिग्री सेल्सियस पर 3 मिनट से 5 के लिए सेते हैं और trypsin अवरोध करनेवाला के 6 मिलीलीटर जोड़कर प्रतिक्रिया बंद करो।
    2. 5 मिनट के लिए 150 XG, सतह पर तैरनेवाला हटाने HepaRG सेल संस्कृति के माध्यम से 1 मिलीलीटर में सेल गोली resuspend, और कोशिकाओं की गिनती पर अपकेंद्रित्र HepaRG कोशिकाओं। सेल व्यवहार्यता> 90% होना चाहिए।
    3. में, HHSteC कोशिकाओं के trypsinization हासिल monolayer संस्कृतियों से मध्यम हटाने, दो बार पीबीएस के साथ धोने, और 0.05% trypsin / EDTA के 3 मिलीलीटर जोड़ने के लिए। 37 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए सेते हैं और trypsin अवरोध करनेवाला के 6 मिलीलीटर जोड़कर प्रतिक्रिया बंद करो।
    4. अपकेंद्रित्र 5 मिनट के लिए 150 XG, सतह पर तैरनेवाला हटाने HepaRG सेल संस्कृति के माध्यम से 1 मिलीलीटर में सेल गोली resuspend, और कोशिकाओं की गिनती में HHSteC कोशिकाओं।
    5. 24 के अनुपात में HepaRG और HHSteC गठबंधन: 1 HepaRG सेल संस्कृति माध्यम में। ऐसा करने के लिए HepaRG सेल संस्कृति माध्यम में सेल निलंबन गिराए द्वारा सेल नंबर को समायोजित करने और 4.8 x 10 6 कोशिकाओं / एमएल HepaRG कोशिकाओं के लिए 1 एक्स 10 5 कोशिकाओं / एमएल HHSteC जोड़ने के लिए। ध्यान से मिलाएं।
    6. फांसी ड्रॉप और रिसीवर थाली पीबीएस के 2 मिलीलीटर जोड़कर एक फांसी ड्रॉप थाली तैयार है।
    7. पिपेट फांसी ड्रॉप थाली के प्रत्येक कुएं में सेल निलंबन के 20 μl। हमेशा के बारे में 10% अधिक फांसी कुछ समुच्चय duri खो रहे हैं, जैसा कि आप समुच्चय को पुनः प्राप्त करने की आवश्यकता की तुलना में बूंदों को तैयारप्रक्रिया एनजी। ध्यान से एक 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में थाली जगह है। Spheroids फार्म करने के लिए 48 घंटे तक प्रतीक्षा करें।
    8. Spheroids पुनः प्राप्त करने के लिए, व्यापक टिप अंत के साथ पिपेट सुझावों का उपयोग करें या के बारे में 2 से 3 मिमी के लिए खोलने को चौड़ा करने के क्रम में एक बाँझ चाकू के साथ एक एमएल पिपेट सुझावों के सुझावों में कटौती करने के लिए सुनिश्चित हो। उन्हें बाधा पहुँचा के बिना spheroids संभाल करने के लिए इन पिपेट युक्तियों का उपयोग करें।
    9. बार-बार एक पिपेट का उपयोग कर फांसी ड्रॉप थाली के कुओं के शीर्ष करने के लिए मीडिया के 1 मिलीलीटर जोड़कर फांसी ड्रॉप थाली से ध्यान से spheroids बंद धो लें। सभी spheroids गिर गए जब तक थाली धो लें। Spheroids थोड़ा डिस्क के आकार 300 माइक्रोन 400 के मध्यम व्यास और इस बिंदु पर 200 माइक्रोन से 300 की ऊंचाई के साथ कर रहे हैं।
    10. रिसीवर थाली में spheroids लीजिए और अच्छी तरह से तैयार पिपेट युक्तियों का उपयोग प्रति 20 spheroids की एक अधिकतम के साथ 24 अच्छी तरह से अल्ट्रा कम लगाव प्लेटों को हस्तांतरण। 0.5 मिलीलीटर अच्छी तरह से प्रत्येक में मीडिया संस्करणों को समायोजित करें। आईएनओ के लिए 20 समुच्चय का प्रयोग करेंविवो सेल नंबर में के बारे में 1/100000 के एक miniaturization की दर प्राप्त करने के लिए एक एमओसी सर्किट culate।
    11. एमओसी में आगे उपयोग करें जब तक सीओ 2 37 डिग्री सेल्सियस पर spheroids सेते हैं और 5%। तुलनीयता आश्वस्त करने के लिए उपयोग से पहले spheroids अब से तीन दिन की दुकान नहीं है। समरूप spheroids पुनः प्राप्त करने के लिए अल्ट्रा कम लगाव प्लेटों में कम से कम एक दिन के लिए समुच्चय खेती।
  2. त्वचा के ऊतकों समकक्ष उत्पन्न करने के लिए दो तरीकों से किसी को आगे बढ़ाने: पंच बायोप्सी (1.2.1) या तैयार किया विट्रो ऊतक मॉडल (1.3.1) में के उपयोग का उपयोग करें।
    1. आगे उपयोग करें जब तक बाँझ शर्तों के तहत 96 अच्छी तरह से सेल संस्कृति सम्मिलित करता है और दुकान को तैयार करने के ब्रैकेट नीचे एक गरमागरम चाकू के साथ transwells काटें।
    2. 30 सेकंड के लिए 80% इथेनॉल में शिशन के मुख पर खुली त्वचा के नमूने जीवाणुरहित और खुले अंगूठी काटा। नमूने 2 मिमी की एक औसत ऊंचाई होना चाहिए।
    3. एक समान miniaturiza प्राप्त करने के लिए 4.5 एमएम व्यास की बायोप्सी कटौती करने के लिए एक बायोप्सी पंच का प्रयोग करेंजिगर और त्वचा दोनों के लिए tion के अनुपात। संदंश के साथ सम्मिलित transwell तैयार 96 कुएं में बायोप्सी लोड करें। एपिडर्मल ओर ऊपर की तरफ का सामना करना पड़ के साथ बायोप्सी की स्थिति के लिए ध्यान रखना।
    4. जगह सेल संस्कृति एमओसी में आगे उपयोग करें जब तक HepaRG सेल संस्कृति के माध्यम से और दुकान में 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ 2 से युक्त एक रिसीवर थाली में बायोप्सी के साथ सम्मिलित करता है। 3 घंटा करने के लिए 2 से नहीं की दुकान के नमूने अब नहीं।
  3. , एमओसी में, विभिन्न आपूर्तिकर्ताओं से खरीदा वे 96 अच्छी तरह से transwell प्रारूप में हैं सुनिश्चित करते हुए कि, तैयार किया विट्रो त्वचा मॉडल में एकीकृत। विक्रेता या किसी अन्य ऊतक के साथ एक coculture एक कदम और आगे में परिकल्पना की गई है, तो दोनों के ऊतकों का समर्थन करने के लिए एक न्यूनतम माध्यम का उपयोग आपूर्ति सेल संस्कृति माध्यम का प्रयोग करें। ऊतकों का समर्थन करने की क्षमता के लिए पूर्व स्थिर प्रयोगों में संबंधित कम से कम मध्यम टेस्ट।
    1. धारक थाली से त्वचा मॉडल निकालें और एक गरमागरम चाकू के साथ ब्रैकेट नीचे 96 अच्छी तरह से सम्मिलित करता काटा। एमओसी में आगे उपयोग करें जब तक सीओ 2 37 डिग्री सेल्सियस पर वापस रिसीवर थाली और दुकान में सम्मिलित प्लेस और 5%। एक दिन से अधिक समय तक नहीं की दुकान नमूने करो।

2. एमओसी निर्माण

  1. 10 के अनुपात में PDMS और इलाज एजेंट मिक्स: 1 (वी / वी) और हवाई बुलबुले को दूर करने के लिए 15 मिनट के लिए वैक्यूम के तहत मिश्रण रखें।
  2. इस बीच, 20 मिनट के लिए 80 डिग्री सेल्सियस पर सिलिकॉन रबर additive के साथ एक polycarbonate कवर प्लेट का इलाज।
  3. Micropump के, 500 माइक्रोन मोटी चार PDMS मुक्त सेल संस्कृति डिब्बों और छह PDMS झिल्ली, बनाने के लिए कवर प्लेट के संबंधित छेद में Teflon शिकंजा डालें।
  4. दो माइक्रोवैस्कुलर सर्किट के मास्टर मोल्ड करने के लिए तैयार कवर प्लेट प्लग और degassed PDMS इंजेक्षन। प्रणाली में हवा के बुलबुले एकीकृत करने के लिए नहीं ख्याल रखना। बुलबुले उभरने, तो डिवाइस झुकने से उन्हें हटाने के लिए प्रयास करें।
  5. PDMS परत का इलाज करने के लिए 60 मिनट के लिए 80 डिग्री सेल्सियस पर प्रणाली सेते।
  6. मास्टर ढालना और युक्ति से Teflon शिकंजा निकालें और कम दबाव प्लाज्मा ऑक्सीकरण का उपयोग कर एक 75 x 25 मिमी दो निशान के साथ एक गिलास स्लाइड करने के लिए PDMS परत बांड।
  7. कवर प्लेट के सभी चार सेल संस्कृति डिब्बों के लिए विशेष धागा एमओसी एडेप्टर भाड़ में।
  8. महिला Luer एक्स ¼ छोटा-28 पुरुष एडाप्टर के लिए संस्कृति के माध्यम से युक्त सीरिंज कनेक्ट और उन्हें कवर प्लेट की एमओसी एडाप्टर के लिए पेंच।
  9. बार-बार नीचे धक्का और सीरिंज plungers के ऊपर खींच कर microfluidic सर्किट में मध्यम इंजेक्षन।
  10. माइक्रोस्कोप के तहत मध्यम के साथ चैनल के समुचित भरने की जाँच करें।

एमओसी 3. Endothelialization

  1. Endothelial सेल मध्यम विकास के साथ एमओसी, फ्लश प्रत्येक एमओसी सर्किट endothelializing और सीओ 2 37 डिग्री सेल्सियस से कम तीन दिनों के लिए स्थिर रुप से यह सेते हैं और 5% करने से पहले।
    1. एक इथेनॉल का उपयोग MOCs पोंछ जीवाणुरहित और एक लामिना का प्रवाह बेंच के तहत उन्हें जगह है। मैंएन अलावा, संदंश के दो जोड़े और आगे उपयोग के लिए दो हेक्सागोनल चाबियाँ बाँझ।
    2. हेक्सागोनल कुंजियों का उपयोग एमओसी के टिशू कल्चर डिब्बे की टोपियां ढीला और संदंश का उपयोग टोपी को हटा दें। मध्यम डालने के बाद, उसी तरह से MOCs पर वापस टोपियां पेंच।
  2. मानव त्वचीय microvascular endothelial कोशिकाओं (HDMEC) की trypsinization के लक्ष्य को हासिल करने के लिए, पर monolayer संस्कृतियों से मध्यम हटाने दो बार पीबीएस के साथ धोने, और 0.05% trypsin / EDTA के 3 मिलीलीटर जोड़ें। 37 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए सेते हैं और trypsin अवरोध करनेवाला के 6 मिलीलीटर जोड़कर प्रतिक्रिया बंद करो।
  3. अपकेंद्रित्र HDMEC 5 मिनट के लिए 220 XG, हटाने के सतह पर तैरनेवाला में, endothelial सेल मध्यम विकास के 1 मिलीलीटर में सेल गोली resuspend, और कोशिकाओं गिनती। सेल व्यवहार्यता> 90% होना चाहिए।
  4. Endothelial सेल मध्यम विकास के साथ यह गिराए द्वारा 2 10 x 7 कोशिकाओं / एमएल के एक अंतिम एकाग्रता के लिए सेल निलंबन में कोशिकाओं की संख्या को समायोजित करने के लिए और यह के 250 μl हस्तांतरण1 मिलीलीटर सिरिंज। सभी अंगों के लिए 1 / लाख के miniaturization दर रखने के लिए एमओसी के कोशिकाओं के इस एकाग्रता को लागू करें।
  5. एक महिला Luer एक्स ¼ छोटा-28 पुरुष एडाप्टर के लिए सिरिंज कनेक्ट इस फिटिंग के बाहर हवा निष्कासित, और यह एक विशेष धागा एमओसी एडाप्टर के पेंच। प्रत्येक एमओसी सर्किट के दो डिब्बों में से एक को अनुकूलक कनेक्ट।
  6. एमओसी सर्किट के दूसरे डिब्बे में एक ही रास्ते में एक खाली सिरिंज कनेक्ट करें।
  7. एक लगातार रास्ते में कई बार नीचे धक्का और दो सिरिंज plungers के ऊपर खींच द्वारा समान रूप से कोशिकाओं इंजेक्षन। माइक्रोस्कोप के तहत कोशिकाओं का निषेचन नियंत्रित करते हैं।
  8. कोशिकाओं चैनल दीवारों का पालन करने की अनुमति देने के लिए तीन घंटे के लिए स्थिर शर्तों के तहत सीओ 2 37 डिग्री सेल्सियस पर एमओसी सेते हैं और 5%।
  9. इनक्यूबेटर से चिप निकालें एक लामिना का प्रवाह बेंच के तहत यह जगह है, और विशेष धागा एमओसी सेल संस्कृति कक्षों के साथ सीरिंज और एमओसी एडेप्टर जगह।
  10. एक कॉम के लिए ताजा माध्यम के 400 μl जोड़ेंप्रत्येक एमओसी सर्किट के विभाग और यह हीड्रास्टाटिक दबाव से चैनलों के माध्यम से फ्लश करते हैं। बाद में, ताजा माध्यम के 300 μl के साथ दोनों डिब्बों में मध्यम जगह।
  11. 3.1.2 में वर्णित के रूप में, टोपी का उपयोग करते हुए डिब्बों को बंद करें।
  12. पंप नियंत्रण इकाई के लिए चिप से कनेक्ट करें। 0.475 हर्ट्ज की एक आवृत्ति के लिए पम्पिंग वेग को समायोजित करें और सीओ 2 37 डिग्री सेल्सियस पर चिप खेती और 5%।
  13. प्रत्येक एमओसी डिब्बे के मध्यम दो दिनों के लिए हर एक की जगह और प्रकाश माइक्रोस्कोपी द्वारा सेल आकृति विज्ञान की निगरानी।

चिप 4. लोड हो रहा है

  1. लामिना का प्रवाह बेंच के तहत एमओसी प्लेस और कदम 3.1.2 में वर्णित के रूप में, यह खुला।
  2. टिशू कल्चर के डिब्बों से मीडिया निकालें और ताजा HepaRG सेल संस्कृति के माध्यम से 300 μl के साथ बदलें।
  3. एक विस्तृत खोलने के साथ पिपेट युक्तियों का उपयोग प्रत्येक एमओसी सर्किट में से एक टिशू कल्चर डिब्बे में 20 preformed spheroids हस्तांतरण (चरण देखें 1.1.8 / 9)। सी बंद करेंएपी संदंश और हेक्सागोनल कुंजियों का उपयोग।
  4. संदंश का उपयोग प्रत्येक एमओसी सर्किट के शेष टिशू कल्चर डिब्बे में त्वचा समकक्ष युक्त स्थानांतरण 96 अच्छी तरह से सेल संस्कृति सम्मिलित करता है। त्वचा बराबर की झिल्ली के नीचे बुलबुला गठन से बचने के लिए ध्यान रखना। ऐसा करने के लिए आदेश में, एक थोड़ा झुका कोण पर transwells डालने और धीरे नीचे धक्का। Transwell के आसपास अतिरिक्त मध्यम निकालें एक विंदुक के साथ नीचे से ऊपर धकेल दिया जा रहा है।
  5. संदंश और हेक्सागोनल कुंजियों का उपयोग टोपी बंद करें।

5. पम्प नियंत्रण इकाई को चिप कनेक्ट हो रहा है

  1. मूल्यों को नियंत्रण इकाइयों में सेट संचालन मानकों वांछित। 0 से 8000 मिलीबार, 0 से -800 एम्बार वैक्यूम करने के लिए, और 0.24 से 2.4 हर्ट्ज आवृत्ति पम्पिंग करने के लिए हवा के दबाव को संशोधित करें। दक्षिणावर्त या वामावर्त पम्पिंग दिशा निर्धारित करें।
  2. लामिना का प्रवाह बेंच के नीचे से एमओसी युक्त ऊतक समकक्ष निकालें और पंप नियंत्रण इकाइयों से कनेक्ट।
  3. Numerat के बादट्यूब पर आयन, एमओसी पर संबंधित फिटिंग के लिए हवा के दबाव टयूबिंग डालें।
  4. 37 डिग्री सेल्सियस के लिए चिप गर्मी और इनक्यूबेटर बाहर चिप खेती करने के लिए एमओसी समर्थन का उपयोग, लाइव ऊतक इमेजिंग के मामले में 37 डिग्री सेल्सियस पर एमओसी खेती और 5% सीओ 2 एक मशीन में या। एक मानक खुर्दबीन के नीचे एमओसी में कोशिकाओं को खेती करने के लिए गर्म समर्थन का प्रयोग करें।

6. पदार्थों के मीडिया एक्सचेंज, सैम्पलिंग मीडिया और एक्सपोजर प्रदर्शन

  1. ऊतक सुसंस्कृत और कोशिकाओं के चयापचय गतिविधि के प्रकार पर विचार, हर दिन या हर दूसरे दिन दिनचर्या मीडिया विनिमय प्रदर्शन करना।
    1. इनक्यूबेटर से एमओसी निकालते हैं और मीडिया के प्रवाह की दर को नियंत्रित करने और संदूषण के लिए जाँच करने के लिए माइक्रोस्कोप के तहत यह निरीक्षण करते हैं।
    2. हवा के दबाव टयूबिंग unplugging द्वारा पंप नियंत्रण इकाई से एमओसी डिस्कनेक्ट। इथेनॉल पोंछे का उपयोग कर एमओसी जीवाणुरहित और लामिना का प्रवाह बेंच के नीचे रख दिया।
    3. टिशू कल्चर कंप्यूटर अनुप्रयोग खोलेंकदम 3.1.2 में वर्णित के रूप में, जिगर spheroids युक्त artment।
    4. Spheroids बाधा पहुँचा के बिना एक पिपेट का उपयोग डिब्बे से 200 μl अप करने के लिए निकालें और एक गहरी अच्छी तरह से थाली की एक खाली कुएं में मध्यम दुकान। सीधे मीडिया नमूना विश्लेषण करें या गहरी अच्छी तरह से थाली को बंद करने और आगे के विश्लेषण के लिए -80 डिग्री सेल्सियस पर मीडिया के नमूने की दुकान।
    5. अप करने के लिए 250 μl ताजा सेल संस्कृति के माध्यम से एमओसी के मध्यम बदलें और टोपी बंद करें। कारण सिस्टम को बंद करने के लिए जब चिप के बाहर लीक छोटी मात्रा में करने के लिए मध्यम हटा दिया है और नुकसान के लिए खातों की जगह की राशि में अंतर है।
    6. ऊतक intactness के लिए जाँच करने के लिए इस बिंदु पर त्वचा समकक्ष पकड़े टिशू कल्चर डिब्बे की टोपी खोलें। प्रणाली में हवा बुलबुले परिचय नहीं ख्याल रखना। टोपी बंद करें।
    7. 5.3 कदम है, और एक मशीन में एमओसी स्थान के अनुसार, एमओसी के पंप नियंत्रण इकाई के ट्यूबिंग कनेक्ट करें।

7। डेली मीडिया नमूनों का विश्लेषण और प्रदर्शन पर लाइन विश्लेषण

  1. ऑन लाइन रहते सेल इमेजिंग या ऑफलाइन का उपयोग कर, दैनिक मीडिया के नमूनों का विश्लेषण करके टिशू कल्चर के प्रदर्शन का विश्लेषण। मानक दिनचर्या एंजाइमी assays के (जैसे लैक्टेट डिहाइड्रोजनेज (LDH) गतिविधि) या एलिसा (जैसे एल्बुमिन एकाग्रता) द्वारा उत्तरार्द्ध प्रदर्शन करते हैं। एक ऑनलाइन विश्लेषण निम्नलिखित में वर्णित है।
  2. (में पतला 6.1.1 6.1.4 करने के लिए कदम के रूप में वर्णित, endothelialized एमओसी के मीडिया निकालें, और 10 माइक्रोग्राम प्रति के 200 μl के साथ दोनों टिशू कल्चर के डिब्बों में / एमएल फ्लोरोफोरे acetylated संयुग्मित कम घनत्व वाले लिपोप्रोटीन (एलडीएल) समाधान के लिए यह जगह सेल संस्कृति मीडिया)।
  3. टोपी बंद करें। 5.3 कदम के अनुसार, पंप नियंत्रण इकाई को एमओसी कनेक्ट करें, और microfluidic सर्किट के भीतर समान रूप से समाधान वितरित करने के लिए 0.475 हर्ट्ज पर 30 मिनट के लिए यह पंप।
  4. पंप बंद करो और 37 डिग्री सेल्सियस पर 3.5 घंटा और 5% सीओ 2 के लिए स्थिर रुप से एमओसी सेते हैं।
  5. इसी प्रकार टीओ, 7.2 कदम दोनों डिब्बों से acetylated एलडीएल समाधान निकालने और दो डिब्बों में से एक में ताजा माध्यम के 400 μl के साथ बदलें।
  6. 3 से 5 मिनट हीड्रास्टाटिक दबाव microfluidic चैनल सर्किट के माध्यम से मध्यम ड्राइव करने के लिए प्रतीक्षा करें।
  7. ताजा माध्यम के 300 μl के साथ के माध्यम से प्रवाहित होती है और यह भी ताजा माध्यम के 300 μl के साथ दूसरे टिशू कल्चर डिब्बे को भरने की है जो मध्यम बदलें।
  8. कदम 3.1.2 के अनुसार, एमओसी बंद करें। एक प्रतिदीप्ति सूक्ष्मदर्शी के नीचे रख दिया और सेल के विकास और व्यवहार्यता निरीक्षण करते हैं।
  9. खेती के लिए जारी करने के लिए वापस इनक्यूबेटर में दाग एमओसी रखें। प्रत्येक निम्नलिखित मीडिया प्रतिस्थापन के साथ कोशिकाओं के बाहर लीक दाग निकालें।

8. एमओसी से ऊतक समकक्ष निकालते हैं और अंत बिंदु विश्लेषण प्रदर्शन करना

  1. समापन बिंदु विश्लेषण के लिए प्रयोग के अंत में एमओसी से ऊतक समकक्ष निकालते हैं।
    1. जिगर और त्वचा ई पुनः प्राप्त करने के क्रम मेंचरणों 6.1.4 के लिए 6.1.1 में वर्णित के रूप में एमओसी से quivalents, प्रत्येक टिशू कल्चर डिब्बे से मीडिया को दूर।
    2. संदंश का उपयोग एमओसी से त्वचा युक्त 96 अच्छी तरह से सेल संस्कृति आवेषण निकालें। संदंश के साथ एक तरफ यह मनोरंजक है और इसे नीचे खींच कर डालने से ध्यान से झिल्ली दूर छील। इस बिंदु पर त्वचा बराबर खोने के लिए नहीं ख्याल रखना।
    3. क्रायो embedding परिसर में त्वचा समकक्ष पकड़े झिल्ली रुक और आगे के विश्लेषण तक -80 डिग्री सेल्सियस पर यह दुकान।
  2. कटौती पिपेट सुझावों का प्रयोग कर उन्हें pipetting द्वारा टिशू कल्चर डिब्बे से इसी तरह जिगर समकक्ष निकालें (कदम 1.1.8 / 9 देखें)।
    1. क्रायो embedding परिसर में जिगर spheroids शामिल करें। बहुत अधिक तरल हस्तांतरण और एक विंदुक के साथ किसी भी अतिरिक्त तरल पदार्थ को हटाने के लिए नहीं ख्याल रखना। Embedding परिसर पर spheroids रखने और मध्यम हटाने के बाद, उन्हें पूरी तरह से बंद करने के लिए spheroids के शीर्ष पर आगे क्रायो यौगिक जोड़ें।
    2. जिगर समकक्ष रुक और आगे के विश्लेषण तक -80 डिग्री सेल्सियस पर यह दुकान।
  3. पिछले प्रोटोकॉल 10 में वर्णित के रूप में, ऊतक विशेष मार्कर के लिए 8 माइक्रोन वर्गों और धुंधला करने के लिए एक क्रायो-सूक्ष्म में ऊतक समकक्ष काटने से समापन बिंदु विश्लेषण करते हैं।

Representative Results

स्टैंडर्ड में इन विट्रो ऊतक संस्कृतियों ऊतकों को ऑक्सीजन और पोषक तत्वों की आपूर्ति के प्रसार को सीमित करने, स्थिर शर्तों के तहत प्रदर्शन कर रहे हैं। में सुधार की आपूर्ति विशेषताओं दिखा fluidic प्रणाली, अक्सर ऊतक अनुपात करने के लिए गैर-physiologically उच्च मध्यम होने, उनके बड़े मध्यम आवश्यकताओं के द्वारा बाधा उत्पन्न कर रहे हैं। इस प्रकार, चयापचयों पतला और कोशिकाओं को अपने परिवेश हालत करने में सक्षम नहीं हैं। इस अध्ययन में प्रस्तुत एमओसी एक microfluidic चैनल सिस्टम के द्वारा, दो अलग-अलग टिशू कल्चर डिब्बों, एक मानक 96 अच्छी तरह से थाली का एक भी अच्छी तरह से प्रत्येक के आकार से जोड़ता है। प्रणाली और चिप पर पंप के एकीकरण के छोटे पैमाने पर सिस्टम केवल 200-800 μl के मीडिया मात्रा में संचालित करने के लिए अनुमति देता है। 1-31: यह 8 के ऊतक के अनुपात में कुल प्रणालीगत मध्यम से मेल खाती है 1, क्रमशः, (लगभग 26 μl की कुल ऊतक मात्रा वाले) जिगर और त्वचा के ऊतकों cocultures के लिए। एक आदमी सात वजन में कुल अतिरिक्त सेलुलर तरल पदार्थ की मात्राIntercapillary तरल पदार्थ की मात्रा 1 के ऊतक अनुपात करने के लिए एक शारीरिक कोशिकी तरल पदार्थ के लिए अग्रणी, 5.1 एल है जिसका 3 किलो, 14.6 एल है: 4। इसलिए, एमओसी में पूरे परिसंचरण तंत्र में मीडिया की राशि शारीरिक स्थिति की तुलना में अभी भी बड़ा है; और फिर भी, यह बहु अंग प्रणालियों 5 के लिए अब तक की सूचना दी ऊतक अनुपात करने के लिए छोटी से छोटी मीडिया का प्रतिनिधित्व करता है। उद्योग मानक टिशू कल्चर स्वरूपों को बरकरार रखा जाता है, शोधकर्ताओं ने एक आम द्रव का प्रवाह भीतर मौजूदा और पहले से ही मान्य स्थिर ऊतक मॉडल गठबंधन करने में सक्षम हैं। एक संभव एमओसी एकल ऊतक या बहु ऊतक cocultures के एक प्रयोगात्मक सेट अप के योजनाबद्ध पता चलता है। प्राथमिक ऊतक बायोप्सी और इन विट्रो में सेल लाइनों या प्राथमिक कोशिकाओं से ऊतक समकक्ष 96 अच्छी तरह से सेल संस्कृति आवेषण का उपयोग कर या तो खेती या टिशू कल्चर डिब्बों में सीधे उन्हें रखने के द्वारा किया जा सकता है -generated। सेल संस्कृति डिब्बों परस्पर चैनल प्रणाली केवल 100 μ है के रूप मेंमीटर ऊंची, इन आयामों से अधिक ऊतक समकक्ष संस्कृति डिब्बों के भीतर रखा जाएगा। प्राथमिक HDMECs साथ एमओसी सर्किट के endothelialization एक जैविक संवहनी संरचना उपलब्ध कराने के द्वारा आगे और अधिक शारीरिक संस्कृति की स्थिति की दिशा में एक कदम और आगे सक्षम बनाता है।

चित्र 1
चित्रा 1:। एमओसी संस्कृतियों के योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व ऊतक समकक्ष एमओसी में टीका और गतिशील शर्तों के तहत एकल संस्कृतियों या cocultures के रूप में खेती की जाती है, मानक में इन विट्रो शर्तों के तहत तैयार किए जाते हैं। डेली मीडिया के नमूने और समापन बिंदु विश्लेषण प्रदर्शन कर रहे हैं। पंप ड्राइव करने के लिए हवा के दबाव से ऊपर से एमओसी से जुड़ा तीन नीले ट्यूब के माध्यम से लागू किया जाता है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 2 में दिखाया गया है endothelialization प्रोटोकॉल के बाद, microfluidic चैनल सर्किट का एक मिला हुआ HDMEC कवरेज, गतिशील संस्कृति के चार दिनों के भीतर प्राप्त की है। प्रकोष्ठों आसानी से एमओसी चैनल की दीवारों का पालन करना एक मिला हुआ monolayer बनाते हैं, और कतरनी साथ बढ़ाना तनाव (चित्रा 2B)। पहले से 9 रिपोर्ट के रूप में इसके अलावा, सेल, चैनलों के पूरे परिधि को कवर किया। एन्दोथेलिअल आकृति विज्ञान में आगे कोई परिवर्तन संस्कृति के अंत तक खेती के चार दिन बाद मनाया गया।

चित्र 2
चित्रा 2:। Endothelialized एमओसी चैनलों मानव त्वचीय microvascular endothelial कोशिकाओं (HDMEC) microfluidic सर्किट में एक मिला हुआ monolayer का गठन किया। प्रकोष्ठों एमओसी संस्कृति के 23 दिनों के बाद acetylated एलडीएल के साथ दाग रहे थे। (ए) पूरे मीicrovascular सर्किट कतरनी तनाव के साथ लम्बी कोशिकाओं और (बी) कोशिकाओं के साथ कवर किया गया था। स्केल सलाखों: (ए) 1000 माइक्रोन और (बी) 100 माइक्रोन।

एक और प्रयोग में, लगातार डिस्क के आकार का जिगर सेल spheroids इस मॉडल प्रणाली पहले से दवा चयापचय के लिए उपयुक्त होने के रूप में सूचना मिली थी, के रूप में फांसी बूंद संस्कृति के दो दिनों के दौरान HepaRG और HHSteC से गठित 11 अध्ययन कर रहे हैं - 13। प्रदर्शन प्रयोजनों के लिए, प्रत्येक एमओसी सर्किट में से एक टिशू कल्चर कम्पार्टमेंट 96 अच्छी तरह से सेल संस्कृति आवेषण में 20 spheroids के साथ वरीयता प्राप्त किया गया था और ऊतकों गैर endothelialized MOCs का उपयोग कर गतिशील शर्तों के तहत 14 से अधिक दिनों की खेती कर रहे थे। समुच्चय या प्राथमिक सामग्री की राशि की कोई भी संख्या सीधे डिब्बों में या सेल संस्कृति आवेषण का उपयोग कर या तो एकीकृत किया जा सकता है। एमओसी से पुनः प्राप्ति के बाद spheroids की Immunofluorescent धुंधला ली के लिए एक मजबूत, समरूप अभिव्यक्ति से पता चलता हैदेखें-ठेठ cytokeratin 8/18 और चरण मैं एंजाइमों साइटोक्रोम P450 3A4 और 7A1 metabolizing (चित्रा 3 ए और 3 बी)। Canalicular ट्रांसपोर्टर बहु दवा प्रतिरोध प्रोटीन 2 का धुंधला (एमआरपी-2) एक polarized फेनोटाइप और अल्पविकसित पित्त canaliculi-तरह के नेटवर्क के अस्तित्व (चित्रा -3 सी) का पता चला।

चित्र तीन
चित्र तीन :. एमओसी में 14 दिनों के लिए खेती की एमओसी। लिवर समुच्चय में मानव कृत्रिम जिगर सूक्ष्म ऊतकों की खेती (ए) cytokeratin 8/18 (लाल) और (बी) साइटोक्रोम P450 3A4 (लाल) और 7A1 (हरा) के लिए दाग रहे थे। Canalicular ट्रांसपोर्टर एमआरपी-2 (हरा) (सी) अभिव्यक्ति, नीले परमाणु धुंधला। स्केल सलाखों: 100 माइक्रोन।

एल्बुमिन के उत्पादन जिगर ऊतक संस्कृतियों में से एक आवश्यक शर्त है, यह मधुमक्खी हैएन एमओसी में जिगर-विशिष्ट गतिविधि पर नजर रखने के लिए चुना। एल्बुमिन उत्पादन के लिए दैनिक मीडिया नमूनों का विश्लेषण स्थिर संस्कृतियों (चित्रा 4) के लिए और साहित्य 11 में सूचना दी मूल्यों की तुलना एमओसी संस्कृतियों में उत्पादन की दर में उल्लेखनीय वृद्धि को दर्शाता है। एल्बुमिन संश्लेषण की दर में वृद्धि एमओसी संस्कृतियों में वृद्धि हुई ऑक्सीजन और पोषक तत्वों की आपूर्ति करने के लिए जिम्मेदार ठहराया जा सकता है। इसलिए, एमओसी ऐसे एल्बुमिन उत्पादन के रूप में जिगर-विशिष्ट व्यवहार, बढ़ाने, एक metabolically सक्रिय राज्य में 14 दिनों की संस्कृति अवधि में जिगर समुच्चय को बनाए रखने में सक्षम है।

चित्रा 4
चित्रा 4: एमओसी में चौदह दिन की जिगर अंडाकार आकृति प्रदर्शन एमओसी में और स्थिर संस्कृति में जिगर एकल ऊतक संस्कृतियों के Albumin उत्पादन।। डाटा SEM के ± साधन हैं (एन = 4)।

चे के Subsystemic दोहराया खुराक विषाक्तता परीक्षणओईसीडी के दिशानिर्देश के रूप में परिभाषित द्वारा पशुओं में micals और सौंदर्य प्रसाधन नहीं, जोखिम के 21-28 दिन लगते हैं। 410 "खुराक त्वचीय विषाक्तता दोहराया: 21/28 दिन के अध्ययन।" लंबे समय तक त्वचा-जिगर cocultures नियामक आवश्यकताओं के साथ सामना करने के लिए ऊपर से 28 दिनों के लिए यहाँ उदाहरण हैं। एक हवा तरल इंटरफेस 96 अच्छी तरह से सेल संस्कृति आवेषण में त्वचा बायोप्सी की खेती से बाद में चमड़े का पदार्थ लोगों तक पहुंचाने के लिए प्रदान की जाती है। coculture प्रयोग एक संयुक्त मीडिया सर्किट में एक तीन ऊतक coculture व्यवहार्य और 28 दिनों से अधिक metabolically सक्रिय रखा जा सकता है कि क्या साबित करने के लिए endothelialized MOCs में exemplarily किया जाता है।

मीडिया supernatants में LDH से गतिविधि का विश्लेषण उसके बाद के बारे में 80 यू / एल (चित्रा 5) पर स्थिर रहने लगा जो संस्कृति के पहले आठ दिनों के दौरान एक तेजी से कम स्तर का पता चला। यह बाद में समय बिंदुओं पर प्रणाली में एक कृत्रिम लेकिन स्थिर ऊतक कारोबार इंगित करता है। जिगर एकल के लिए तीन-ऊतक coculture मुकाबले-tissue और जिगर-एन्दोथेलिअल coculture प्रयोगों, एक काफी कमी आई है LDH स्तर विशेष रूप से त्वचा सहित नहीं संस्कृतियों में पहले दिन के दौरान, पाया जा सकता है। त्वचा एकल ऊतक एमओसी संस्कृतियों का पता चला के रूप में उच्च LDH से गतिविधि के इस पहले की अवधि के भीतर कोशिका मृत्यु (नहीं दिखाया डेटा), त्वचा संस्कृति डिब्बे में मुख्य रूप से हुआ। यह त्वचा की छिद्रण का एक परिणाम के रूप में बायोप्सी के आस-पास के लोग घायल हो गए क्षेत्र की वजह से हो सकता है।

चित्रा 5
चित्रा 5:। Endothelialized एमओसी में endothelialized MOCs (एमओसी ली-Va) और जिगर-त्वचा cocultures में जिगर एकल ऊतक संस्कृतियों (एमओसी ली), जिगर संस्कृतियों के मीडिया supernatants में एमओसी LDH से गतिविधि में पंद्रह दिन के ऊतक प्रदर्शन (एमओसी ली -Va एस)। डाटा SEM के ± साधन हैं (एन = 4)।

28 दिन संस्कृति अवधि के दौरान, जिगर spheroids एमओसी एक के नीचे का पालनएन डी कोशिकाओं आसन्न spheroids के बीच एक multilayered कनेक्शन बनाने, बाहर हो गया। इस ऊतक कार्यक्षमता में बाधा नहीं था। Immunofluorescence द्वारा समापन बिंदु विश्लेषण साइटोक्रोम P450 3A4 धुंधला (चित्रा 6A) द्वारा दिखाए गए के रूप में जिगर spheroids, एमओसी coculture के 28 दिनों के बाद अभी भी पाचन सक्रिय थे कि पता चला है। Vimentin धुंधला (चित्रा 6B) द्वारा के रूप में दिखाया HHSteC, पूरे जिगर समकक्ष भर में वितरित किए गए। Vimentin धुंधला तीव्रता में वृद्धि हुई कोशिकाओं spheroids से बाहर हो गई थी, जहां क्षेत्रों में मनाया जा सकता है। वॉन Willebrand कारक (vWF) के लिए धुंधला endothelial कोशिकाओं ऊतकों में गहराई से प्रवेश कर नहीं पता चला था कि, लेकिन बाहरी हेपाटोसाइट्स (चित्रा 6C) के साथ सीधे सेल सेल संपर्क में थे।

स्थिर नियंत्रण के धुंधला elevat से पता चला है whilst त्वचा बायोप्सी के immunohistochemistry धुंधला, tenascin सी और बेसल झिल्ली (चित्रा 6D) में कोलेजन चतुर्थ की अभिव्यक्ति से पता चलाtenascin सी (चित्रा 6E) की एड स्तरों। Tenascin सी, घाव भरने, सूजन प्रक्रियाओं और फाइब्रोसिस के दौरान upregulated होने के लिए दिखाया गया है गतिशील संस्कृतियों 14,15 में तंतुमय स्थिर में प्रक्रियाओं, लेकिन नहीं प्रेरित सुझाव दे।

स्थिर सेल व्यवहार्यता और एमओसी में एक 28 दिन coculture के बाद ऊतकों की कार्यक्षमता प्रणाली एक आम मीडिया सर्किट में अप करने के लिए तीन ऊतकों का एक संयोजन बनाए रखने में सक्षम है कि साबित होते हैं। प्राथमिक कोशिकाओं, साथ ही ऊतक मॉडल और बायोप्सी, एमओसी प्रणाली में एक साथ खेती की जा सकती है।

चित्रा 6
चित्रा 6:। बहु ऊतक संस्कृतियों का प्रदर्शन 28 से अधिक दिनों लिवर समकक्ष और त्वचा बायोप्सी एक endothelialized एमओसी और सेल की कार्यक्षमता में खेती कर रहे थे (ए) के पहले चरण के immunostaining द्वारा दिखाया गया था मैं साइटोक्रोम P450 एंजाइमों3A4 जिगर ऊतक में (लाल), (ख) vimentin (लाल), (सी) cytokeratin 8/18 (लाल) और vWF (हरा)। स्थिर शर्तों के तहत एमओसी या (ई) में 28 दिनों (डी) के लिए cocultivated त्वचा बायोप्सी tenascin सी (लाल) और कोलेजन चतुर्थ (हरा), नीले परमाणु धुंधला के लिए दाग रहे थे। एमओसी संस्कृति के 28 दिनों के बाद त्वचा की (एफ) एच एंड ई धुंधला हो जाना। स्केल सलाखों: 100 माइक्रोन।

Discussion

यहाँ वर्णित एमओसी मंच लंबे समय तक संस्कृति अवधि 10,16 से अधिक गतिशील मध्यम प्रवाह की स्थिति में विभिन्न मूल के ऊतकों की खेती के लिए एक स्थिर और शक्तिशाली उपकरण का प्रतिनिधित्व करता है। इस उदाहरण में, मंच प्राथमिक कोशिकाओं (HDMEC), एक सेल लाइन से उत्पन्न ऊतक समकक्ष (जिगर समुच्चय), और एक ऊतक बायोप्सी के साथ aforementioned के coculture खेती करने के लिए इस्तेमाल किया गया था। एमओसी एक संयुक्त मध्यम सर्किट में 28 दिनों के लिए तीन-ऊतक coculture बनाए रखने में सक्षम था। लेखक 'ज्ञान का सबसे अच्छा करने के लिए, इस बायोप्सी, प्राथमिक कोशिकाओं और सेल लाइनों सहित एक बहु-ऊतक coculture चार सप्ताह से अधिक प्रदर्शन किया गया है पहली बार है।

Microfluidic प्रणालियों की प्रमुख कमियां में से एक fluidic सर्किट की सतह सामग्री का पालन करने के लिए छोटे अणुओं की आत्मीयता है। मात्रा के अनुपात में सतह microfluidic प्रणालियों में विशेष रूप से उच्च है, इस आशय भी अधिक 17 स्पष्ट हो जाता है इन विट्रो -generated ऊतकों की vascularization पर काम मौजूदा वादा किया है और आगे के अध्ययन के 18,19 के लिए जिस तरह से गाइड।

यह हेपाटोसाइट्स इन विट्रो स्थिर दो आयामी संस्कृति शर्तों 20 के तहत समय पर अपने जिगर-विशिष्ट कार्यों खो देते हैं कि अच्छी तरह से जाना जाता है। एक खास दवा की चयापचय का अध्ययन किया जा रहा है कि अगर इस तरह के साइटोक्रोम P450 परिवार के रूप में metabolizing एंजाइमों, विशिष्ट महत्व के हैं। साइटोक्रोम P450 3A4, कई xenobiotics के biotransformation से संबंधित एक एंजाइम, और साइटोक्रोम P450 7A, डब्ल्यूhich 14 दिनों से अधिक जिगर में व्यक्त किया गया, पित्त अम्ल संश्लेषण में एमओसी में सुसंस्कृत समुच्चय शामिल है। यह दवा चयापचय के अध्ययन के लिए अनुमति देता है, एक metabolically सक्रिय phenotype के संरक्षण को इंगित करता है। स्थिर संस्कृतियों की तुलना में एमओसी में समुच्चय की वृद्धि की एल्बुमिन उत्पादन की दर पर्याप्त संस्कृति की स्थिति के लिए एक अतिरिक्त संकेत है। 23, तथापि, मूल्यों प्राथमिक मानव hepatocyte संस्कृतियों 24 की उन तक पहुँच नहीं था - इस अध्ययन के दौरान मनाया एल्बुमिन उत्पादन की दर 21 HepG2 कोशिकाओं सहित microfluidic चिप्स द्वारा प्राप्त जैसा कि पहले बताया मूल्यों से तुलनीय या यहां तक कि उच्च स्तर पर थे। इसके अलावा, एमओसी प्रणाली, अपने अस्थायी लेआउट में, पित्त की एक अलग अलगाव के लिए अनुमति नहीं है। एमआरपी-2 धुंधला द्वारा दिखाया के रूप में कुल ध्रुवीकृत और गठन पित्त canaliculi संरचनाओं की तरह में कोशिकाओं। हालांकि, उन canaliculi पित्त का संग्रह एक तकनीकी चैनल से जुड़े नहीं थे। इस गैर-शारीरिक मिश्रणरक्त डिब्बे के साथ पित्त की आईएनजी प्रणाली के भविष्य को नया स्वरूप में संबोधित किया गया है।

प्रवाह विशेषताओं का समायोजन विशेष रूप से इस तरह के जिगर के रूप में तनाव कतरनी के प्रति संवेदनशील ऊतकों, के संबंध में, उच्च महत्व 25 की है। ऊतक द्वारा कथित कतरनी तनाव की राशि को दो तरह से संशोधित किया जा सकता है: सबसे पहले, पंप की झिल्ली के नीचे पुश करने के लिए प्रयोग किया जाता है हवा का दबाव कम किया जा सकता है, सिस्टम में चोटी कतरनी तनाव मूल्यों कम। दूसरे, ऊतकों एक बाह्य मैट्रिक्स layering में एम्बेडेड या transwell संस्कृति आवेषण में संवर्धित किया जा सकता है। बाद के एक झरझरा झिल्ली के साथ अंतर्निहित वर्तमान से ऊतकों ढाल। ये समायोजन एमओसी प्रयोग शुरू करने से पहले प्रत्येक अंग समकक्ष के लिए एक व्यक्ति के आधार पर निष्पादित किया जा करने की जरूरत है। 144 की धड़कन की एक उच्च, लेकिन अभी भी शारीरिक, हृदय की गतिविधि से मेल खाती है, उदाहरण के लिए 2.4 हर्ट्ज की एक गुणवाला आपरेशन, कम से / मिनट मनुष्यों में, कतरनी तनाव में मापा जाता हैमाइक्रोवैस्कुलर सर्किट के चैनलों लगभग 25 DYN / 2 सेमी तक पहुँचता है। इस चैनल के एक endothelialization सहित प्रयोगों के लिए है, इसलिए अच्छी तरह से लागू microvasculature में बड़े पैमाने के उच्च अंत में एक शारीरिक कतरनी तनाव से मेल खाती है और है। प्रस्तुत एमओसी प्रणाली की वर्तमान microfluidic लेआउट दो अंग डिब्बों को जोड़ने केवल एक मीडिया सर्किट के होते हैं लेकिन, जैसा कि एक पम्पिंग वेग और कतरनी तनाव दर पूरी प्रणाली के लिए चुना जाना चाहिए। इसलिए, प्रत्येक एकल अंग की जरूरतों के लिए प्रवाह विशेषताओं का एक सटीक समायोजन हमेशा संभव नहीं है।

इसके अलावा, देखभाल आम मध्यम करने के लिए कोशिकाओं को एडजस्ट करने में रखा जाना है। इन विट्रो सेल संस्कृति के लिए मानक के रूप में कोशिकाओं को एक संयुक्त मीडिया सर्किट में एमओसी में खेती कर रहे हैं, इसलिए, कोई व्यक्ति सेल संस्कृति मीडिया, प्रत्येक ऊतक मॉडल के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। एक न्यूनतम संयुक्त मीडिया निर्माण पहले से और टी परिभाषित करने की जरूरत हैवह कोशिकाओं को इस नए मीडिया को चरणबद्ध समायोजित करने की जरूरत है। दो दिनों के लिए नए मीडिया के लिए पुराने 80% / 20% की समायोजन प्रक्रिया है, तो 50% / 50% से 20% / 80% के द्वारा पीछा किया, और एक पूर्ण विनिमय हमेशा हमारे हाथ में संस्कृतियों का एक उचित सेल व्यवहार्यता और कार्यक्षमता के लिए नेतृत्व किया।

एमओसी प्रणाली की वर्तमान microfluidic लेआउट अप करने के लिए तीन ऊतकों के coculture अनुमति देता है। मानव शरीर के कम से कम दस सबसे महत्वपूर्ण अंगों के एक coculture समस्थिति तक पहुँचने की जरूरत है। इसलिए, प्रस्तुत प्रणाली विशिष्ट ऊतक ऊतक बातचीत नहीं, बल्कि एक पदार्थ को सच प्रणालीगत प्रतिक्रिया की भविष्यवाणी करने में सक्षम है। अधिक अंग cavities को शामिल करने के लिए एमओसी के आगे विकास की परिकल्पना की गई है। इसके अलावा, प्रणाली की वैधता संदर्भ यौगिकों का एक सेट का उपयोग कर दिखाया जा रहा है। अधिमानतः, (जैसे Troglitazone के रूप में) क्लिनिकल परीक्षण के दौरान विफल रहे हैं कि यौगिकों एमओसी में उनके प्रदर्शन के लिए परीक्षण किया जा करने के लिए कर रहे हैं। जबकि, इस तरह के जटिल प्रणालियों के एक सच्चे सत्यापन अभी भी बी बाधा हैY इस और इसी तरह की प्रणाली की विषाक्तता के प्रदर्शन पर अधिक डेटा एकत्रित कार्यात्मक मूल्यांकन के लिए बायोमार्कर और समापन के विषय में मानकीकरण की कमी है, उनकी विश्वसनीयता और आवेदन के क्षेत्र को व्यापक होगा।

Disclosures

उवे मार्क्स लेख में इस्तेमाल बहु अंग चिप मंच उत्पादन और बाजार कि TissUse GmbH के सीईओ है। इस प्रकाशन की Corning इंक द्वारा दी गई एक पुरस्कार द्वारा वित्त पोषण किया गया था

Acknowledgments

काम जाने-बायो अनुदान संख्या 0315569, शिक्षा और अनुसंधान के लिए जर्मन संघीय मंत्रालय द्वारा वित्त पोषित किया गया है।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
HepaRG cells Biopredic International undifferentiated cells
HHSteC ScienCell Research Laboratories cells and all culture supplements
HepaRG Medium Sigma-Aldrich William's Medium E
10% FCS
100 U/ml penicillin
100 µg/ml streptomycin
5 µg/ml human insulin
2 mM L-glutamine
5 x 10-5 M hydrocortisone hemisuccinate
HDMEC Medium PromoCell Endothelial Cell Growth Medium MV2 with Supplement-Pack MV2 and 1% penicillin-streptomycin
Dimethyl sulfoxide Carl Roth add 2% to HepaRG media
Trypsin/EDTA Biowest
Trypsininhibitor Carl Roth
MAXYMum Recovery Tips Corning 1,000 µl Pipet Tips Wide Bore
384-Well Hanging Drop Plate 3D Biomatrix Perfecta 3D 384-Well Hanging Drop Plate
Tissue culture flasks Corning 75 cm2
Ultra-low attachment plate Corning 24-well
Transwell cell culture inserts Corning 96-well unit, 0.4 µm pore size
Deep well plates Corning 96-well, 1 ml
Biopsy punch Stusche 4.5 mm
Glass microscope slide Menzel footprint of 75 x 25 mm
Polydimethylsiloxane Dow Corning Sylgard 184
Silicon rubber additive Wacker Chemie Wacker Primer G790
Tubes for air pressure SMC Pneumatik GmbH Polyurethan-Schlauch, metrisch
Alumin ELISA Bethyl Laboratories Human Albumin ELISA Quantitation Set
Lactate dehydrogenase assay Stanbio Laboratory LDH Liqui-UV kit
Alexa Fluor 594 acetylated LDL Invitrogen 1 mg/ml

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बायोइन्जिनियरिंग अंक 98 बहु अंग चिप मानव-पर-एक चिप शरीर पर एक चिप अंग-पर-एक चिप microphysiological प्रणाली organoids ऊतक इंजीनियरिंग, विषाक्तता परीक्षण जिगर त्वचा वाहिका
बहु अंग चिप - लंबी अवधि के बहु-ऊतक Coculture के लिए एक microfluidic प्लेटफार्म
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Materne, E. M., Maschmeyer, I.,… More

Materne, E. M., Maschmeyer, I., Lorenz, A. K., Horland, R., Schimek, K. M. S., Busek, M., Sonntag, F., Lauster, R., Marx, U. The Multi-organ Chip - A Microfluidic Platform for Long-term Multi-tissue Coculture. J. Vis. Exp. (98), e52526, doi:10.3791/52526 (2015).

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