Introduction
Nåværende ettlagskulturer eller suspensjon cellekultur analyser for legemiddelutvikling er ikke å etterligne den menneskelige mobilmikromiljøet, og derfor føre til en rask dedifferentiation og tap av funksjon i primære humane cellekulturer. Vevsmodeller med høyere fysiologiske relevans for å forutsi effekt og sikkerhet av forbindelser før innrømme dem til kliniske studier. Nylig, standard in vitro cellekultur teknikker har utviklet seg fra to-dimensjonale monolagkulturer mot tredimensjonale flercellede modeller, med formål å etterligne in vivo vev mikromiljøet. Disse systemene har allerede vist store forbedringer mot mer nøyaktig forutsigelse av virkemåten av forbindelsene 1,2. Videre tilpasse in vitro kultur forhold til de svært spesielle behov av cellene er av spesiell interesse.
Under standard in vitro forhold, en rekke viktige Culratur parametere, slik som næringsstoff og oksygentilførsel, fjerning av akkumulerende produkter, og mekaniske kraft som virker på cellene ofte ikke kan kontrolleres nøye i de fleste tilfeller. Mange organer besitter fysiologisk relevante konsentrasjonsgradienter av stoffer og oppløst oksygen. Men de strengt regulerte og optimaliserte forhold er i klar opposisjon til de ukontrollerbare diffusjon gradienter rundt vev under in vitro forhold, som fører til en svært ustabil miljø og begrense cellulær utvikling 3. Således, jevnere og mer spesielt kvantifiserbar in vitro-betingelser er nødvendig for å holde levedyktige celler og differensiert over lengre tidsperioder. Perfuserte systemer, hvor mellom komponenter blir regelmessig fjernet og erstattet, er ofte bedre karakterisert og kontrollerbar enn statiske kulturer knyttet direkte rundt av vev. Under statiske forhold, diffusjon gradienter av celle sekreter og kultur mellom næringsstofferkan omgi dyrkede celler tre. Innføring velkarakteriserte mellomstrømningshastigheter i området rundt vevet tillate celle sekret å blandes med rikt medium gjennom perfusjon. Dette muliggjør generering av definerte cellulære microenvironments, noe som sikrer en stabil celle fenotype og metabolizing enzymet uttrykk gjennom hele analysen varighet 4.
Den siste utviklingen i multi-organ chip (MOC) -baserte systemer kombinerer fordelene ved en kontrollert medium strømmen rundt utviklet vev med de små mellomstore og celle masse kravene til mikroskala bioreaktorer, som fører til en redusert mengde av stoffet som trengs under testing. Flere microfluidic systemer for vevskultur, er blitt beskrevet hittil 5,6. Tissue-til-væske forholdstall mellom disse systemene spiller en spesielt viktig rolle i å simulere fysiologisk relevante mobilcrosstalk. Men på grunn av tekniske begrensninger, for eksempel bruk av eksterne pumper og medie reservoarer, the samlede sirkulerende medievolumet i de fleste systemer er for stor i forhold til vevet volumer. Gruppen av Shuler et al. Var de første til å utvikle et system som sikrer forsvarlig oppholdstider av stoffer innenfor cellekultur avdelinger og in vivo relevant vev-til-væske forholdstall 7,8. Dette ble oppnådd ved å skalere det ytre reservoaret ned til en 96-brønns plate, som også representerer den "andre vev" rommet. For å minimalisere den sirkulerende medievolumet innenfor MOC plattform, integrert vi en peristaltisk on-chip mikropumpe, noe som eliminerer behovet for eksterne media kretser. Denne mikropumpe er i stand til å betjene systemet på en valgbar antall mediestrømhastigheter og skjærspenning priser ni. En mikrofluidkanalsystem på 500 um bredde og høyde 100 jim forbinder to standardiserte vevskultur områder, som hver har en størrelse på en enkelt brønn av en 96-brønns plate. Hvis man følger de størrelser av bransjestandarden godt plates tillater integrering av allerede eksisterende vevsmodeller produsert i transwell-format. Videre er den vertikale posisjonen av Transwell cellekulturinnsatser justerbar, slik at dyrking av vev modeller som ikke bare er direkte utsatt for fluidstrømmen, men kan også løftes opp og skjermet fra den underliggende strøm. Tilsvarende luft-væske-grenseflaten kulturer er mulig ved hjelp av dette systemet.
MOC plattformen er fremstilt av en polydimetylsiloksan (PDMS) lag 2 mm høye og et mikroskop-objektglass med en grunnflate på 75 x 25 mm 2, som er permanent bundet ved lavtrykksplasmapålegging oksydasjon for å danne fluidtett mikrofluidkrets. PDMS lag som inneholder de respektive kanaler og cellekultur avdelinger er produsert av standard myk litografi og kopi støping 9. Microfluidic utformingen av MOC brukt under denne studien besto av to separate microfluidic kretser per brikke, hver med to celle cruk avdelinger sammenkoblet med et kanalsystem 100 mikrometer høy. Dette tillot avspilling av to individuelle to dels cocultures ved hjelp av en multi-organ chip. Pumping frekvensene ble justert for å gi mellomstrømningshastigheter på 40 mL / min.
Denne to-vev MOC design gir muligheten til å coculture en lever spheroid og en hud punsj biopsi i egne kultur mellomrom, om enn i en kombinert media krets under fysiologiske strømningsforhold. Differensiert HepaRG celler ble samlet sammen med humane hepatiske stel celler (HHSteC) ved et forhold på 24: 1 for å danne homogene kuler. Dette forholdet ble funnet å være optimal, som observert i tidligere eksperimenter 10, selv om, nesten det dobbelte av antallet av hepatocytter ble anvendt i forhold til in vivo-situasjonen. Huden ble dyrket på en luft-væske-grensesnittet inne i en transwell cellekulturinnsats, og dermed gjør aktuell substans eksponering. Disse vevsmodeller ble cocultivated for 28 days i MOC å demonstrere helheten av dette systemet. Videre er mikrofluidkanal krets av flisen ble fullstendig dekket med human dermal mikrovaskulære endotelceller (HDMEC) å nærmere simulere det vaskulære system.
Protocol
MERK: Human juvenil forhuden ble oppnådd med informert samtykke og etikk godkjenning (Ethic Committee Charité Universitetet Medicine, Berlin, Tyskland), i samsvar med relevante lover, fra en pediatrisk kirurgi etter rutine circumcisions.
1. Produksjon av vevsekvivalenter for Dyrking i MOC
- Aggregere HepaRG og HHSteC i hengende slippe plater for å generere lever kuler.
- For å oppnå den trypsinisering av HepaRG celler dyrket i cellekulturflasker (75 cm 2), fjernes mediet fra sammenflytende, differensierte monolagskulturer, vaskes to ganger med PBS, og tilsett 3 ml av 0,05% trypsin / EDTA. Inkuber i 3 til 5 minutter ved 37 ° C og stoppe reaksjonen ved tilsetning av 6 ml av trypsin-inhibitor.
- Sentrifuger HepaRG celler ved 150 xg i 5 minutter, fjern supernatanten, cellepelleten suspenderes i 1 ml HepaRG cellekulturmedium, og telle celler. Celleviabilitet bør være> 90%.
- IFor å oppnå den trypsinisering av HHSteC celler, fjernes mediet fra monolagskulturer, vaskes to ganger med PBS, og tilsett 3 ml av 0,05% trypsin / EDTA. Inkuber i 5 min ved 37 ° C og stoppe reaksjonen ved tilsetning av 6 ml av trypsin-inhibitor.
- Sentrifuger HHSteC celler ved 150 xg i 5 minutter, fjern supernatanten, cellepelleten suspenderes i 1 ml HepaRG cellekulturmedium, og telle celler.
- Kombiner HepaRG og HHSteC i et forhold på 24: 1 i HepaRG cellekulturmedium. For å gjøre dette, justere celle tall ved å fortynne cellesuspensjoner i HepaRG celledyrkingsmedium og legge til 1 x 10 5 celler / ml HHSteC til 4,8 x 10 6 celler / ml HepaRG celler. Bland forsiktig.
- Forberede en hengende dråpe plate ved å legge 2 ml PBS til hengende dråpe og mottaker plate.
- Pipetter 20 ul cellesuspensjon til hver brønn i den hengende dråpe plate. Forberede alltid ca 10% mer hengende dråper enn du trenger å hente aggregater, som noen aggregater er tapt during prosedyren. Plassere platen forsiktig i en 37 ° C inkubator. Vent i 48 timer for å danne sfæroider.
- For å hente sfæroidene, sørg for å bruke pipettespisser med brede tippe avslutninger eller klippe tuppene av 1 ml pipette tips med en steril kniv for å utvide åpningen til ca 2 til 3 mm. Bruk disse pipettespissene å håndtere sfæroidene uten å forstyrre dem.
- Vask av kuler nøye fra den hengende dråpe platen ved gjentatte ganger å tilsette 1 ml av media til toppen av brønnene på hengende dråpe plate ved hjelp av en pipette. Vask platen før alle kulene har falt av. Sfæroidene er svakt skiveformet med en middels diameter på 300 til 400 pm og en høyde på 200 til 300 pm på dette punktet.
- Samle sfæroidene i mottakeren plate og overføre dem til 24-brønns ultra-lave festeplater med maksimalt 20 kuler per brønn med oppkjørte pipetter. Juster papir volumene i hver brønn til 0,5 ml. Bruk 20 aggregater i Inoformet, MOC en krets for å oppnå en miniatyrisering hastighet på 1 / 100.000 av in vivo-celleantall.
- Inkuber sfæroidene ved 37 ° C og 5% CO2 inntil videre bruk i MOC. Ikke oppbevar sfæroidene lenger enn tre dager før bruk for å sikre sammenlignbarhet. Dyrke aggregatene i minst én dag i ultra-lave festeplater for å hente de homogene kuler.
- Forfølge en av to tilnærminger til å generere hud vevsekvivalenter: bruk av punsj biopsier (1.2.1) eller bruk av ferdiglagde in vitro vevsmodeller (1.3.1).
- Skjær Transwells med en gløde kniv under braketten for å forberede 96-brønners cellekultur inserts og butikk under sterile forhold frem til videre bruk.
- Sterilisere prepuset prøver i 80% etanol i 30 sek og kutte ringen åpen. Prøvene skal ha en gjennomsnittlig høyde på 2 mm.
- Bruk en biopsi punsj å kutte biopsier av 4,5 mm diameter for å få jevn miniaturizasjon ratio for både lever og hud. Laste biopsier i forberedt 96-brønnen transwell setter inn med pinsett. Vær nøye med å plassere biopsier med epidermal siden vendt oppover.
- Sted cellekultur innsatser med biopsier i en mottaker plate inneholdende HepaRG cellekulturmedium og oppbevar ved 37 ° C og 5% CO2 inntil videre bruk i MOC. Ikke oppbevar prøver lenger enn 2 til 3 timer.
- Integrere ferdige in vitro hud modeller, kjøpt fra ulike leverandører, inn i MOC, og pass på at de er i 96-vel transwell format. Bruk cellekulturmedium levert av leverandøren, eller hvis en coculture med et annet vev er forutsatt i et steg videre, kan du bruke en minimal medium støtte både vev. Test respektive minimalt medium i tidligere statiske forsøk for sin evne til å understøtte vev.
- Hente hud modeller fra holderen plate og kuttet 96-brønners innsatser under braketten med en gløde kniv. Plasser innsatsene tilbake til mottakeren platen og oppbevar ved 37 ° C og 5% CO2 inntil videre bruk i MOC. Ikke oppbevar prøver lengre enn en dag.
2. MOC Fabrication
- Bland PDMS og herdemiddel i et forhold på 10: 1 (v / v), og plassere blandingen under vakuum i 15 minutter for å fjerne luftbobler.
- Imens behandler et polykarbonat dekkplate med silikongummi additiv ved 80 ° C i 20 min.
- Sett Teflon skruene i respektive hull i cover-plate for å lage de fire PDMS frie celledyrknings avdelinger og de seks PDMS membraner, 500 mikrometer tykke, av mikropumpe.
- Plugg forberedt cover-plate til master mold av de to mikrovaskulære kretser og injisere de avgassede PDMS. Pass på å ikke integrere luftbobler inn i systemet. Hvis bobler dukke opp, kan du prøve å fjerne dem ved å vippe enheten.
- Inkuber i systemet ved 80 ° C i 60 minutter for å herde PDMS sjikt.
- Fjern master mold og Teflon skruene fra enheten og binde PDMS lag til et glass lysbilde med en 75 x 25 mm 2 fotavtrykk ved hjelp lavtrykksplasmapålegging oksidasjon.
- Skru spesielle tråd MOC adaptere til alle fire cellekultur avdelinger av cover-plate.
- Koble sprøyter som inneholder kultur medium til kvinnelig Luer x ¼-28 mannlige adaptere og skru dem til MOC adaptere av cover-plate.
- Injiser medium inn i mikrofluidkrets ved gjentatte ganger å trykke ned og trekke opp sprøyter stempler.
- Kontrollere riktig fylling av kanalene med medium under mikroskopet.
3. endotelialisering av MOC
- Før endothelializing MOC, skyll hver MOC krets med endotelial cellevekstmedium og inkuber det statisk i tre dager ved 37 ° C og 5% CO2.
- Sterilisere mocs bruker en etanol tørk og legg dem under en laminær benk. Jegn tillegg sterilisere to par pinsett og to sekskantede nøkler for videre bruk.
- Løsne caps av vevet kultur rommet på MOC hjelp av sekskantede nøkler og fjerne dekslene ved hjelp av pinsett. Etter innsetting av medium, skrulokk på igjen til mocs på samme måte.
- For å oppnå den trypsinisering av humane dermale mikrovaskulære endotelceller (HDMEC), fjernes mediet fra monolagskulturer, vaskes to ganger med PBS, og tilsett 3 ml av 0,05% trypsin / EDTA. Inkuber i 5 min ved 37 ° C og stoppe reaksjonen ved tilsetning av 6 ml av trypsin-inhibitor.
- Sentrifuger HDMEC ved 220 xg i 5 minutter, fjern supernatanten, cellepelleten suspenderes i 1 ml av endotelial cellevekstmedium, og telle celler. Celleviabilitet bør være> 90%.
- Juster celletall i cellesuspensjonen til en endelig konsentrasjon på 2 x 10 7 celler / ml ved å fortynne den med endotelial cellevekstmedium og overføre 250 ul av den tilen 1 ml sprøyte. Påfør denne konsentrasjonen av celler til MOC å holde miniatyrisering hastighet på 1 / 100.000 for alle organer.
- Koble sprøyten til en kvinnelig Luer x ¼-28 hann adapter, utvise luften ut av dette passende, og skru den til en spesiell tråd MOC adapter. Koble adapteren til en av de to rom på hver MOC krets.
- Koble en tom sprøyte på samme måte til det andre kammeret av MOC krets.
- Injisere cellene jevnt ved å trykke ned og trekke opp de to sprøyte stempler flere ganger i en sammenhengende måte. Kontrollere infusjon av celler under mikroskop.
- Inkuber MOC ved 37 ° C og 5% CO2 under statiske betingelser i 3 timer for å la cellene få feste seg til kanalveggene.
- Fjerne brikken fra inkubatoren, plassere den under en laminær benk, og erstatte sprøyter og de MOC adaptere med spesielle gjenger MOC cellekultur kamre.
- Tilsett 400 ul friskt medium til en comAvdelingen hos hver MOC krets og la det skylle gjennom kanalene av hydrostatisk trykk. Etterpå erstatte mediet i begge avdelinger med 300 ul friskt medium.
- Lukke avdelingene bruker caps, som beskrevet i 3.1.2.
- Koble brikken til pumpestyreenheten. Juster pumpehastigheten til en frekvens på 0.475 Hz og dyrke brikken ved 37 ° C og 5% CO2.
- Erstatte mediet for hver MOC rommet hver og en til to dager og overvåke cellemorfologi ved lysmikroskopi.
4. Lasting av Chip
- Plasser MOC under laminære strømningsbenk og åpne den, som beskrevet i trinn 3.1.2.
- Fjern materialet fra vevskulturstudier avdelinger og erstatte den med 300 ul frisk HepaRG cellekulturmedium.
- Overføre 20 prefabrikkerte kuler til en vev kultur rommet hver MOC krets bruker pipettespissene med en bred åpning (se trinn 1.1.8 / 9). Lukk cap bruker pinsett og sekskantede nøkler.
- Overfør 96-brønners cellekulturinnsatser inneholdende hud-ekvivalenter til den gjenværende vevskultur rommet av hver MOC krets ved hjelp av tang. Ta vare å unngå bobledannelse under membranen av huden tilsvarende. For å gjøre dette, setter Transwells på en litt skrå vinkel, og skyv forsiktig ned. Fjern overflødig medium rundt transwell blir presset opp nedenfra med en pipette.
- Lukk hetten ved hjelp av pinsett og sekskantede nøkler.
5. Koble Chip til Pump Control Unit
- Satt driftsparametre i kontrollenhetene til verdiene ønsket. Modifisere lufttrykket fra 0 til 8000 mbar, vakuum 0 til -800 mbar, og pumping frekvens 0,24 til 2,4 Hz. Still pumping retning med eller mot klokken.
- Fjern de MOC inneholder vevsekvivalenter fra under laminær benk og koble den til pumpekontroll enheter.
- Etter numeration på rørene, sette lufttrykk slangen til de respektive beslag på MOC.
- Dyrke MOC ved 37 ° C og 5% CO2 i en inkubator eller, i tilfelle av levende vev avbildning, bruker MOC støtte for å oppvarme brikken til 37 ° C og dyrke brikken utenfor inkubatoren. Bruke oppvarmet til støtte for å dyrke celler i MOC under et standard mikroskop.
6. Utføre Media Exchanges, Sampling Media og Eksponering for stoffer
- Utføre rutinemessig medier utveksling hver dag eller hver annen dag, tatt i betraktning den type av vev dyrket og den metabolske aktiviteten til cellene.
- Hente MOC fra inkubatoren og observere den under mikroskop for å styre mediestrømningsrater og sjekk for forurensning.
- Koble fra MOC fra pumpestyreenheten ved å trekke ut lufttrykk slangen. Sterilisere MOC bruker etanol kluter og sette den under laminær benken.
- Åpne vev kultur kompartment inneholder leveren sfæroider, som beskrevet i trinn 3.1.2.
- Fjern opp til 200 pl fra kammeret ved hjelp av en pipette uten å forstyrre sfæroidene og lagre mediet i en tom brønn i en dyp brønn plate. Analyser media prøven direkte eller lukke dyp brønn plate og lagre medieprøver ved -80 ° C for videre analyse.
- Erstatte mediet av MOC med opp til 250 pl friskt cellekulturmedium og lukke lokket. Forskjellen i mengden av mediet fjernet og erstattet regnskap for tap på grunn av små mengder som lekker ut av brikken ved lukking av systemet.
- Åpne lokket av vev kultur rommet holder huden ekvivalenter på dette punktet for å se etter vev intactness. Pass på å ikke innføre luftbobler inn i systemet. Lukk lokket.
- Kople slangen til pumpen kontrollenheten til MOC, ifølge trinn 5.3, og plasser MOC i en inkubator.
7. Analysere Daily Media Prøver og Utfør Online Analyse
- Analysere vev kultur ytelse på linje ved hjelp av levende celle bildebehandling eller offline, ved å analysere den daglige medie prøvene. Utføre sistnevnte ved hjelp av standard rutine enzymatiske analyser (f.eks laktat dehydrogenase (LDH) aktivitet) eller ELISA (f.eks albumin konsentrasjon). En online analyse er beskrevet i det følgende.
- Fjern materialet fra den endothelialized MOC, som beskrevet i trinn 6.1.1 til 6.1.4, og erstatte det i begge vevskulturstudier avdelinger med 200 pl 10 mikrogram / ml fluorophore konjugert acetylert low-density lipoprotein (LDL) løsning (fortynnet i cellekultur media).
- Lukk caps. Koble MOC til pumpestyreenheten, i henhold til trinn 5.3, og pumpe det i 30 minutter ved 0.475 Hz for å fordele oppløsningen jevnt i mikrofluidkretsen.
- Stoppe pumpingen og inkuber MOC statisk i 3,5 timer ved 37 ° C og 5% CO2.
- Lignende to trinn 7.2, fjerner det acetylerte LDL-oppløsningen fra begge kamrene og erstatte den med 400 ul friskt medium i en av de to seksjonene.
- Vent i 3-5 minutter for å la det hydrostatiske trykket drive mediet gjennom mikrofluidkanal krets.
- Sett på medium som har strømmet gjennom med 300 ul friskt medium, og også fylle den andre vevkultur kammer med 300 ul friskt medium.
- Lukk MOC, i henhold til trinn 3.1.2. Setter det under en fluorescens mikroskop og observere cellevekst og levedyktighet.
- Plasser farget MOC tilbake i kuvøse for å fortsette dyrking. Fjerne flekken lekker ut av cellene med hver følgende media erstatning.
8. Hente vevsekvivalenter fra MOC og Utfør End-point Analyser
- Hente vevsekvivalenter fra MOC ved slutten av forsøket for endepunktet analyser.
- For å hente leveren og huden equivalents fra MOC, fjerne media fra hver vev kultur rommet, som beskrevet i trinn 6.1.1 til 6.1.4.
- Fjern de 96-brønn cellekultur inserts inneholder huden fra MOC med tang. Skrelle av membranen nøye fra innsatsen ved å gripe det på den ene siden med pinsett og dra den ned. Pass på ikke å miste huden tilsvarende på dette punktet.
- Fryse membranen holder huden tilsvarende i cryo-embedding sammensatte og lagre det ved -80 ° C inntil videre analyse.
- Fjern leveren ekvivalenter tilsvar fra vevet kultur rommet ved å pipettere dem ved hjelp av cut pipetter (se trinn 1.1.8 / 9).
- Embed leveren kuler i cryo-embedding sammensatte. Pass på ikke å overføre for mye væske og fjerne overflødig væske med en pipette. Etter å ha plassert sfæroidene på innstøping forbindelsen og fjerning av medium, tilsett ytterligere cryo forbindelse på toppen av kulene for å omslutte disse.
- Fryse leveren ekvivalenter og lagre det ved -80 ° C inntil videre analyse.
- Utføre sluttpunktanalyse ved å kutte vevsekvivalenter på en kryo-mikrotom i 8 um seksjoner og farging for vevs-spesifikke markører, som beskrevet i tidligere 10 protokoller.
Representative Results
Standard in vitro vevskulturer er utført under statiske betingelser, noe som begrenser diffusjonen av oksygen og næringstilførsel til vev. Fluidic systemer, som viser bedre forsynings kjennetegn, er ofte hemmet av sine store mellom krav, har ikke-fysiologisk høy medium til vev forholdstall. Således er metabolitter fortynnet og celler er ikke i stand til å kondisjonere sine omgivelser. MOC presentert i denne studien forbinder to separate vevskultur avdelinger, hver av størrelsen av en enkelt brønn av en standard 96-brønns plate ved hjelp av en mikrofluidkanalsystem. Den lille målestokk av systemet og integrering av pumpen på brikken gjør det mulig for systemet å operere ved medie volumer av bare fra 200 til 800 ul. Dette tilsvarer en total systemisk medium til vev-forhold på 8: 1 til 31: 1, henholdsvis for de lever og hud vev cocultures (som har et totalt volum på ca. vev 26 ul). Den totale ekstracellulære væsken volum i en mann som veier 73 kg er 14,6 L, hvorav den intercapillary fluidvolum er 5.1 L, som fører til et fysiologisk ekstracellulær væske til vev-forhold på 1: 4. Derfor er mengden av mediet i hele sirkulasjonssystemet i MOC fremdeles større enn den fysiologiske situasjon; og ennå, representerer det minste media til vev forholdet rapportert så langt for flerorgansystemer 5. Som industristandard vevskultur formater er beholdt, forskere er i stand til å kombinere eksisterende og allerede validerte statisk vevsmodeller innenfor en felles fluidstrøm. Figur 1 viser skjematisk et eksperimentelt oppsett av mulige MOC enkelt vev eller flerdels cocultures. Primære vevsbiopsier og in vitro dannede vevsekvivalenter fra cellelinjer eller primærceller kan dyrkes enten ved hjelp av 96-brønners cellekultur innstikk, eller ved å legge dem direkte inn i vevskultur kamrene. Som kanalsystem som forbinder cellekultur kamre er bare 100 μm høy, vil vevsekvivalenter stiger disse dimensjonene holdes innenfor kultur avdelinger. Den endotelialisering av MOC krets med primære HDMECs muliggjør en ytterligere skritt fremover mot mer fysiologiske dyrkningsforhold ved å tilby en biologisk vaskulær struktur.
Figur 1:. Skjematisk fremstilling av MOC kulturer vevsekvivalenter er utarbeidet under standard in vitro forhold, inokulert i MOC og dyrket som enkelt kulturer eller cocultures under dynamiske forhold. Daglige medie prøver og endepunkt analysene er utført. Lufttrykk for å drive pumpen brukes gjennom de tre blå rør koblet til MOC ovenfra. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Etter endotelialisering protokollen, er en konfluent HDMEC dekning av mikrofluidkanal kretsen oppnådd i løpet av fire dager med dynamisk kultur, som vist i figur 2. Celler som lett holder seg til veggene i MOC kanal, skape et konfluent monolag, og langstrakt langs skjær stress (figur 2B). Videre celler dekker hele omkretsen av kanalene, som rapportert tidligere ni. Ingen ytterligere endring i endothelial morfologi ble observert etter fire dager med dyrking til slutten av kultur.
Figur 2:. Endothelialized MOC kanaler humane dermale mikrovaskulære endotelceller (HDMEC) dannet et sammenflytende monolag i mikrofluidkretsen. Celler ble farget med acetylert LDL etter 23 dager med MOC kultur. (A) Hele microvascular krets var dekket med celler og (b) celler forlenget langs skjærspenningen. Skala barer: (A) 1000 mikrometer og (B) 100 mikrometer.
I et ytterligere eksperiment, er konsistente skiveformede levercelleklumper dannet fra HepaRG og HHSteC løpet av to dager med hengende dråpe kulturen, da dette modellsystem ble tidligere rapportert som å være egnet for legemiddelmetabolisme studies 11 - 13. For demonstrasjonsformål, ble en vevskultur rommet av hver MOC krets podet med 20 kuler i 96-brønners cellekulturinnsatser og vev ble dyrket over 14 dager under dynamiske betingelser ved bruk av ikke-endothelialized mocs. Ethvert antall aggregater eller mengden av primærmaterialet kan være integrert enten direkte inn i kamrene, eller ved hjelp av celledyrkningsinnsatser. Immunofluorescerende farging av kulene etter opphenting fra MOC viser en sterk, ensartet uttrykk for liver-typisk cytokeratin 8/18 og fase I enzymer cytokrom P450 3A4 og 7A1 (figur 3A og 3B). Farging av canalicular transporter multimedikamentresistens protein 2 (MRP-2) viste en polarisert fenotype og eksistensen av rudimentær galle canaliculi lignende nett (figur 3C).
Figur 3 :. Dyrking av menneskelige kunstige leveren mikro vev i MOC. Lever aggregater dyrket i 14 dager i MOC ble farget for (A) cytokeratin 8/18 (rød) og (B) cytokrom P450 3A4 (rød) og 7A1 (grønn). (C) Uttrykk for canalicular transporter MRP-2 (grønn), blå atom farging. Skala barer: 100 mikrometer.
Ettersom produksjonen av albumin er en vesentlig forutsetning for lever vevskulturer, har det bien er valgt for å overvåke lever typisk aktivitet i MOC. Analysere daglige medieprøver for albumin produksjon viser en betydelig økning i produksjonshastigheten i MOC kulturer sammenlignet med statiske kulturer (figur 4) og til verdier som er rapportert i litteraturen 11. Økningen i albumin syntesehastigheten kan tilskrives den økte oksygen og næringstilførsel i MOC kulturer. Derfor er MOC i stand til å opprettholde leveraggregater i løpet av en periode på 14 dager kultur i et metabolsk aktiv tilstand, forbedrer leveren typisk oppførsel, som for eksempel albumin produksjon.
Figur 4: Fjorten dag lever spheroid ytelse i MOC Albumin produksjon av leverenkelt vevkulturer i MOC og i statisk kultur.. Dataene er gjennomsnitt ± SEM (n = 4).
Subsystemic gjentatt dosering testing av chemicals og kosmetikk på dyr krever 21 til 28 dager etter eksponering, som definert av OECD retningslinje no. 410 "Repetert Dose Dermal toksisitet: 21/28 dagers Study." Langsiktig hud-lever cocultures er eksemplifisert her i inntil 28 dager for å takle kravene i regelverket. En luft-væske-grenseflate er anordnet for senere dermal substans eksponering ved å dyrke hud biopsier i 96-brønners cellekulturinnsatser. Den coculture eksperimentet utføres exemplarily i endothelialized mocs å bevise om en tre-vev coculture i en kombinert media krets kan holdes levedyktig og metabolsk aktiv over 28 dager.
Analyse av LDH-aktivitet i medie supernatanter viste en stadig synkende nivå i løpet av de første åtte dager i kultur, som holdt seg konstant ved ca. 80 U / l deretter (figur 5). Dette tyder på en kunstig, men stabil vev omsetning i systemet ved senere tidspunkter. Sammenligning av tre-vev coculture til leveren singel-tissue og lever-endotelial coculture eksperimenter, en betydelig redusert LDH nivå kan bli funnet, spesielt i løpet av de første dagene i kulturer ikke inkludert huden. Celledød i denne første perioden av høy LDH aktivitet skjedde først og fremst i huden kultur rommet, som huden enkelt vev MOC kulturer avslørt (data ikke vist). Dette kan være på grunn av den sårede området rundt biopsi som et resultat av stansing av huden.
Figur 5: Femten dagers vev ytelse i MOC LDH aktivitet i medie supernatantene av leveren enkelt vevkulturer (MOC Li), lever kulturer i endothelialized mocs (MOC Li-VA) og lever-hud cocultures i endothelialized MOC (MOC Li. -Va-Sk). Dataene er gjennomsnitt ± SEM (n = 4).
I løpet av 28-dagers kulturperiode, lever kuler festet til bunnen av en MOCnd cellene vokste ut og danner et flerlags forbindelse mellom tilstøtende kuler. Dette ikke hemme vev funksjonalitet. Endepunkt analyse ved immunfluorescens viste at lever sfæroider ble fortsatt metabolsk aktive etter 28 dager med MOC coculture, som vist ved cytokrom P450 3A4-farging (figur 6A). HHSteC ble fordelt gjennom hele leveren tilsvarende, som vist ved vimentin farging (figur 6B). En økning i vimentin fargeintensitet kunne observeres i områder hvor cellene hadde vokst ut av sfæroider. Farging for von Willebrand-faktor (vWF) viste at endotelceller ikke hadde trengt dypt inn i vevet, men var i direkte celle-celle-kontakt med de ytre hepatocytter (figur 6C).
Immunhistokjemi farging av huden biopsier viste et uttrykk for tenascin C og kollagen IV i basalmembranen (figur 6D), mens farging av den statiske kontroll, viste elevated nivåer av tenascin C (figur 6E). Tenascin C har vist seg å være oppregulert under sårheling, inflammatoriske prosesser og fibrose, noe som tyder indusert fibrotiske prosesser i statisk, men ikke i dynamiske kulturer 14,15.
Stabil cellelevedyktigheten og funksjonen av vev etter en 28 dagers coculture i MOC bevise at systemet er i stand til å opprettholde en kombinasjon av opptil tre vev i en felles krets medier. Primærceller, samt vevsmodeller og biopsier, kan dyrkes samtidig i MOC-systemet.
Fig. 6: Resultater av multi-vevskulturer over 28 dager Lever ekvivalenter og hud biopsier ble dyrket i en endothelialized MOC og celle-funksjonalitet ble vist ved farging av (A) Fase I enzymene cytokrom P4503A4 (rød), (B) vimentin (rød), (C) cytokeratin 8/18 (rød) og vWF (grønn) i leveren vev. Hud biopsier cocultivated for 28 dager (D) i MOC eller (E) under statiske forhold ble farget for tenascin c (rød) og kollagen IV (grønn), blå atom farging. (F) H & E farging av huden etter 28 dager med MOC kultur. Skala barer: 100 mikrometer.
Discussion
MOC plattform beskrevet her representerer en stabil og kraftig verktøy for å dyrke vev av forskjellig opprinnelse på dynamiske mellomstrømningsforhold over lengre kultur perioder 10,16. I dette eksempel ble det brukt til å dyrke primære celler (HDMEC), vevsekvivalenter generert fra en cellelinje (lever aggregater), og en coculture av den ovenfor nevnte med en vevsbiopsi. MOC var i stand til å opprettholde tre-vev coculture i inntil 28 dager i en kombinert medium krets. Til det beste av forfatternes kunnskap, er dette første gang en multi-vev coculture inkludert biopsier, primære celler og cellelinjer har blitt utført over fire uker.
En av de store ulempene ved microfluidic systemer er affiniteten av små molekyler til å følge overflatematerialet av fluidkretsen. Ettersom overflaten til volumforholdet er spesielt høy i microfluidic systemer, blir denne effekten enda mer uttalt 17 in vitro dannede vev er lovende og guider til rette for videre studier 18,19.
Det er velkjent at hepatocytter har en tendens til å miste sine leverspesifikke funksjoner over tid i henhold til statiske to-dimensjonale in vitro dyrkningsbetingelser 20. Enzymer, så som cytokrom P450-familien, er av spesiell betydning hvis metabolismen av et bestemt medikament som skal studeres. Cytokrom P450 3A4, et enzym som er relatert til biotransformasjon av mange xenobiotika og cytokrom P450 7A, wjør er involvert i gallesyresyntese, ble uttrykt i lever aggregater dyrket i MOC over 14 dager. Dette indikerer bevaring av et metabolsk aktiv fenotype, noe som åpner for narkotika metabolismestudier. Den økte albumin produksjonsrate på aggregater i MOC i forhold til statiske kulturer er en ekstra indikasjon for tilstrekkelige dyrkningsforhold. Albumin produksjonsrater observert i løpet av denne studien var sammenlignbare eller enda høyere enn tidligere rapporterte verdier oppnådd ved microfluidic chips inkludert HepG2 celler 21-23, men verdiene ikke nådde de av primære humane hepatocytter kulturer 24. Videre er MOC-system, i den midlertidige layout, ikke tillater en separat atskillelse av galle. Celler i det samlede polariserte og dannet galle canaliculi-lignende strukturer, som vist av MRP-2-farging. Imidlertid ble de canaliculi ikke koblet til et teknisk kanal samle galle. Dette ufysiologisk mixing av galle med blodet rommet må tas opp i en fremtidig redesign av systemet.
Justeringen av strømningsegenskapene er av stor viktighet 25, særlig med hensyn til vev som er følsomme for skjærspenning, slik som leveren. Mengden av skjærspenning oppfattes av vevet kan modifiseres på to måter: For det første, kan lufttrykket som benyttes til å presse ned membraner av pumpen senkes, reduseres peak skjærspenningsverdier i systemet. For det andre kan vevene være innleiret i en ekstracellulær matriks lagdeling eller dyrket i transwelldyrkningsinnsatser. Sistnevnte skjerme vev fra den underliggende strøm med en porøs membran. Disse justeringene må utføres på individuell basis for hvert organ tilsvarende før du starter MOC eksperiment. Ved en pulserende drift av 2,4 Hz, for eksempel, som svarer til et høyt, men likevel fysiologiske, hjertevirksomhet på 144 slag / min hos mennesker, skjærspenningen målt ikanaler av mikrovaskulær kretsen når omtrent 25 dyn / cm2. Dette tilsvarer en fysiologisk skjærspenning ved den høyere enden av skalaen i mikrovaskulaturen, og er derfor godt anvendelig for eksperimenter, inkludert en endotelialisering av kanalene. Men som den nåværende microfluidic utformingen av MOC system presenteres består av bare én medie krets som forbinder de to organ avdelinger, en pumpehastighet og skjærspenning rate har å bli valgt for hele systemet. Derfor, er en nøyaktig justering av strømningskarakteristikker til behovene i hvert enkelt organ ikke alltid gjennomførbart.
Videre omsorg har å bli tatt i å justere cellene til felles medium. Celler blir dyrket i MOC i en kombinert mediekrets derfor ingen individuell cellekulturmedier kan anvendes for hvert vev modell, som er standard for in vitro cellekultur. En minimal kombinerte medier formuleringen må være definert på forhånd og than celler må justeres trinnvis til denne nye medier. En justering Måten fra 80% / 20% gamle til nye medier i to dager, deretter 50% / 50% fulgt av 20% / 80%, og en fullstendig utveksling alltid ført til en rimelig cellenes levedyktighet og funksjon av kulturer i våre hender.
Den nåværende microfluidic utformingen av MOC systemet tillater coculture på opp til tre vev. En coculture av minst ti viktigste organene i menneskekroppen er nødvendig for å nå homeostase. Derfor er systemet presenteres i stand til å forutsi spesifikke vev-vev interaksjoner, men ikke den sanne systemisk respons til et stoff. En videreutvikling av MOC å inkludere flere organ hulrom er tenkt. Videre er gyldigheten av systemet som skal vises ved hjelp av et sett av referanseforbindelser. Fortrinnsvis forbindelser som har mislyktes i kliniske studier (for eksempel Troglitazone) skal testes for deres prestasjoner i MOC. Mens, er en sann validering av slike komplekse systemer fortsatt hindret by mangelen på standardisering vedrørende biomarkører og endepunkter for en undersøkelse, samle flere data på den toksikologiske utførelsen av dette og lignende systemer vil utvide deres pålitelighet og anvendelsesområde.
Disclosures
Uwe Marx er administrerende direktør i TissUse GmbH som produserer og markedsfører Multi-Organ Chip plattformen som brukes i artikkelen. Denne publikasjonen er finansiert av en pris gitt av Corning Inc.
Acknowledgments
Arbeidet har vært finansiert av det tyske føderale departementet for utdanning og forskning, GO-Bio Grant nr 0315569.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| HepaRG cells | Biopredic International | undifferentiated cells | |
| HHSteC | ScienCell Research Laboratories | cells and all culture supplements | |
| HepaRG Medium | Sigma-Aldrich | William's Medium E 10% FCS 100 U/ml penicillin 100 µg/ml streptomycin 5 µg/ml human insulin 2 mM L-glutamine 5 x 10-5 M hydrocortisone hemisuccinate |
|
| HDMEC Medium | PromoCell | Endothelial Cell Growth Medium MV2 with Supplement-Pack MV2 and 1% penicillin-streptomycin | |
| Dimethyl sulfoxide | Carl Roth | add 2% to HepaRG media | |
| Trypsin/EDTA | Biowest | ||
| Trypsininhibitor | Carl Roth | ||
| MAXYMum Recovery Tips | Corning | 1,000 µl Pipet Tips Wide Bore | |
| 384-Well Hanging Drop Plate | 3D Biomatrix | Perfecta 3D 384-Well Hanging Drop Plate | |
| Tissue culture flasks | Corning | 75 cm2 | |
| Ultra-low attachment plate | Corning | 24-well | |
| Transwell cell culture inserts | Corning | 96-well unit, 0.4 µm pore size | |
| Deep well plates | Corning | 96-well, 1 ml | |
| Biopsy punch | Stusche | 4.5 mm | |
| Glass microscope slide | Menzel | footprint of 75 x 25 mm | |
| Polydimethylsiloxane | Dow Corning | Sylgard 184 | |
| Silicon rubber additive | Wacker Chemie | Wacker Primer G790 | |
| Tubes for air pressure | SMC Pneumatik GmbH | Polyurethan-Schlauch, metrisch | |
| Alumin ELISA | Bethyl Laboratories | Human Albumin ELISA Quantitation Set | |
| Lactate dehydrogenase assay | Stanbio Laboratory | LDH Liqui-UV kit | |
| Alexa Fluor 594 acetylated LDL | Invitrogen | 1 mg/ml |
References
- Kelm, J. M., Fussenegger, M. Microscale tissue engineering using gravity-enforced cell assembly. Trends in biotechnology. 22 (4), 195-202 (2004).
- Marx, U., Walles, H., et al. Human-on-a-chip Developments: A Translational Cutting-edge Alternative to Systemic Safety Assessment and Efficiency Evaluation of Substances in Laboratory Animals and Man. ATLA. 40 (5), 235-257 (2012).
- Baudoin, R., Griscom, L., Prot, J. M., Legallais, C., Leclerc, E. Behavior of HepG2/C3A cell cultures in a microfluidic bioreactor. Biochemical Engineering Journal. 53 (2), 172-181 (2011).
- Dash, A., Inman, W., et al. Liver tissue engineering in the evaluation of drug safety. Expert opinion on drug metabolism & toxicology. 5 (10), 1159-1174 (2009).
- Materne, E. -M., Tonevitsky, A. G., Marx, U. Chip-based liver equivalents for toxicity testing--organotypicalness versus cost-efficient high throughput. Lab on a chip. 13 (18), 3481-3495 (2013).
- Huh, D., Torisawa, Y., Hamilton, G. a, Kim, H. J., Ingber, D. E. Microengineered physiological biomimicry: organs-on-chips. Lab on a chip. 12 (12), 2156-2164 (2012).
- Sin, A., Chin, K. C., Jamil, M. F., Kostov, Y., Rao, G., Shuler, M. L. The design and fabrication of three-chamber microscale cell culture analog devices with integrated dissolved oxygen sensors. Biotechnology progress. 20 (1), 338-345 (2004).
- Tatosian, D. a, Shuler, M. L. A novel system for evaluation of drug mixtures for potential efficacy in treating multidrug resistant cancers. Biotechnology and bioengineering. 103 (1), 187-198 (2009).
- Schimek, K., Busek, M., et al. Integrating biological vasculature into a multi-organ-chip microsystem. Lab on a chip. 13 (18), 3588-3598 (2013).
- Wagner, I., Materne, E. -M., et al. A dynamic multi-organ-chip for long-term cultivation and substance testing proven by 3D human liver and skin tissue co-culture. Lab on a chip. 13 (18), 3538-3547 (2013).
- Vieira, U., et al. HepaRG human hepatic cell line utility as a surrogate for primary human hepatocytes in drug metabolism assessment in vitro. Journal of pharmacological and toxicological methods. 63 (1), 59-68 (2010).
- Abu-Absi, S. F., Hansen, L. K., Hu, W. -S. Three-dimensional co-culture of hepatocytes and stellate cells. Cytotechnology. 45 (3), 125-140 (2004).
- Leite, S. B., Wilk-Zasadna, I., et al. Three-dimensional HepaRG model as an attractive tool for toxicity testing. Toxicological sciences. 130 (1), 106-116 (2012).
- Chiquet-Ehrismann, R. Tenascins. The international journal of biochemistry & cell biology. 36 (6), 986-990 (2004).
- Sidgwick, G. P., Bayat, A. Extracellular matrix molecules implicated in hypertrophic and keloid scarring. Journal of the European Academy of Dermatology and Venereology JEADV. 26 (2), 141-152 (2012).
- Ataç, B., Wagner, I., et al. Skin and hair on-a-chip: in vitro skin models versus ex vivo tissue maintenance with dynamic perfusion. Lab on a chip. 13 (18), 3555-3561 (2013).
- Wu, M. -H., Huang, S., Lee, G. -B. Microfluidic cell culture systems for drug research. Lab on a chip. 10 (8), 939-956 (2010).
- Schanz, J., Pusch, J., Hansmann, J., Walles, H. Vascularised human tissue models A new approach for the refinement of biomedical research. Journal of Biotechnology. 148 (1), 56-63 (2010).
- Holnthoner, W., Hohenegger, K., et al. Adipose-derived stem cells induce vascular tube formation of outgrowth endothelial cells in a fibrin matrix. J Tissue Eng Regen Med. , (2012).
- Dunn, J. C. Y., Yarmush, M. L., Koebe, H. G., Tompkins, R. G. Hepatocyte function and extracellular matrix geometry: long-term culture in a sandwich configuration. FASEB Journal. 3, 174-177 (1989).
- Leclerc, E., Sakai, Y., Fujii, T. Microfluidic PDMS (polydimethylsiloxane) bioreactor for large-scale culture of hepatocytes. Biotechnology progress. 20 (3), 750-755 (2004).
- Kim, M. S., Yeon, J. H., Park, J. -K. A microfluidic platform for 3-dimensional cell culture and cell-based assays. Biomedical microdevices. 9 (1), 25-34 (2007).
- Prot, J. -M., Aninat, C., et al. Improvement of HepG2/C3A Cell Functions in a Microfluidic Biochip. Biotechnology and bioengineering. 108 (7), 1704-1715 (2011).
- Riccalton-Banks, L., Liew, C., Bhandari, R., Fry, J., Shakesheff, K. Long-term culture of functional liver tissue: three-dimensional coculture of primary hepatocytes and stellate cells. Tissue engineering. 9 (3), 401-410 (2003).
- Powers, M. J., Domansky, K., et al. A Microfabricated Array Bioreactor for Perfused 3D Liver Culture. Biotechnology and Bioengineering. 78 (3), 257-269 (2002).
