Introduction
Aktuella monolayer och upphängningscellodlingsanalyser för läkemedelsutveckling misslyckas med att efterlikna den mänskliga cellulära mikro och därmed leda till en snabb dedifferentiering och funktionsförlust i primära humana cellkulturer. Vävnads modeller med högre fysiologisk relevans behövs för att förutsäga effekten och säkerheten hos föreningar innan erkänna dem till kliniska prövningar. Nyligen har standard i cellodlings vitro tekniker utvecklats från tvådimensionella encellslagsodlingar mot tredimensionella flercelliga modeller, som syftar till att efterlikna in vivo vävnadsmikromiljö. Dessa system har redan visat stora förbättringar mot mer exakt förutsägelse av verkningsmekanism föreningar 1,2. Vidare anpassning av in vitro odlingsbetingelser till de högt specialiserade behov celler är av särskilt intresse.
Enligt standard in vitro förhållanden, en mängd viktiga cultida parametrar, såsom syre- och näringstillförseln, avlägsnande av ackumulerande produkter, och mekanisk kraft som verkar på cellerna ofta inte kan kontrolleras grundligt i de flesta fall. Många organ besitter fysiologiskt relevanta koncentrationsgradienter av ämnen och löst syre. Men dessa starkt reglerade och optimerade förhållanden är i klar opposition till de okontrollerbara diffusion gradienter runt vävnader under in vitro förhållanden, vilket leder till en mycket instabil miljö och begränsa cellulär utveckling 3. Således stadigare och speciellt mer kvantifierbara in vitro villkor krävs för att hålla celler livskraftig och differentierad under längre tidsperioder. Perfunderade system, där medel komponenter regelbundet avlägsnas och substituerade, ofta är bättre karakteriserade och kontrollerbar än statiska kulturer rörande den direkta omgivningen av vävnader. Under statiska förhållanden, diffusion gradienter av cell sekret och kulturmedel näringsämnenkanske omge odlade celler 3. Introducing välkarakteriserade medelflödeshastigheter runt vävnaderna tillåter cellsekret för att blandas med rikt medium genom perfusion. Detta möjliggör generering av definierade cellulära mikromiljöer, vilket garanterar en stabil cellulär fenotyp och metaboliserande enzym uttryck genom hela analystiden 4.
Den senaste utvecklingen i flerorgan chip (MOC) -baserade system kombinerar fördelarna med ett kontrollerat medieflödet runt manipulerade vävnader med små medelstora och cellmass krav på mikroskala bioreaktorer, vilket leder till en minskad mängd ämne som behövs under testningen. Flera mikroflödessystem för vävnadsodling har beskrivits hittills 5,6. Tissue-to-vätska förhållanden inom dessa system spelar en särskilt viktig roll i att simulera fysiologiskt relevant cellulär överhörning. På grund av tekniska begränsningar, till exempel användningen av externa pumpar och medie reservoarer, the övergripande cirkulerande medievolymen i de flesta system är alltför stor i förhållande till de vävnadsvolymer. Den grupp av Shuler et al. Var först med att utveckla ett system som säkerställer korrekt uppehållstider av ämnen inom cellodlingsutrymmena och in vivo relevant vävnad till vätska nyckeltal 7,8. Detta uppnåddes genom att skala den externa reservoaren ner till en 96-brunnars platta, även representerar den "andra vävnader" fack. För att minimera den cirkulerande medievolymen inom vår MOC plattform, integrerade vi en peristaltisk on-chip mikro, vilket eliminerar behovet av externa mediekretsar. Denna mikro kan driva systemet på ett valbart antal medieflödeshastigheter och skjuvspänning hastigheter 9. Ett mikroflödessystem kanal system med 500 ^ m bredd och 100 um höjd sammanbinder två standardiserade vävnadsodlingsutrymmen, som vardera har storleken av en enda brunn i en 96-brunnsplatta. Håll dig till de storlekar av branschstandard brunnars möjliggör integration av redan existerande vävnadsmodeller som produceras i transwell-format. Dessutom är den vertikala positionen för Transwell cellodlingsinlägg justerbara, vilket möjliggör odling av vävnadsmodeller som inte bara direkt utsatta för vätskeflöde, men kan också lyftas upp och avskärmade från den underliggande strömmen. Likaså gränssnitt kulturer luft vätska är genomförbara med detta system.
MOC plattformen är tillverkad av ett polydimetylsiloxan (PDMS) skikt 2 mm hög och en glasmikroskopskiva med ett fotavtryck av 75 x 25 mm 2, som är permanent är bundna med lågtrycksplasma oxidation för att bilda den fluidtäta mikroflödeskrets. PDMS lagret som innehåller de respektive kanaler och cellodlings fack är producerad av standard mjuk litografi och replik gjutning 9. Den mikroflödes utformningen av MOC användes under denna studie bestod av två separata mikroflödeskretsar per chip, var och en med två cell culture fack sammankopplade med ett kanalsystem 100 nm hög. Detta tillät prestanda två individuella två vävnads samodlingar använder en multiorgan chip. Pump frekvenser justerades för att ge medelflödeshastigheter av 40 ul / min.
Denna två-vävnad MOC designen förutsatt förmågan att Coculture en lever sfäroid och en hud punch biopsi i separata kulturutrymmen, om än i en kombinerad mediakrets under fysiologiska flödesförhållanden. Differentierade HepaRG celler aggregeras tillsammans med humana lever stellatceller (HHSteC) i förhållandet 24: 1 för att bilda homogena sfäroider. Detta förhållande befanns vara optimal, såsom observerats i tidigare experiment 10, även om, nästan dubbla antalet hepatocyter användes jämfört med in vivo-situationen. Huden odlades vid en luft-vätska gränssnitt inuti en transwell cellodling insats, vilket möjliggör lokal ämne exponering. Dessa vävnadsmodeller samkultiverades för 28 days i MOC att demonstrera omfånget av detta system. Vidare, mikroflödeskanalkrets av flisen var helt täckt med humana dermala mikrovaskulära endotelceller (HDMEC) för att närmare simulera det vaskulära systemet.
Protocol
OBS: Human juvenil förhuden erhölls med informerat samtycke och etik godkännande (Ethic kommitté Charité University Medicin, Berlin, Tyskland), i enlighet med relevanta lagar, från en barnkirurgi efter rutin omskärelser.
1. Produktion av vävnadsekvivalenter för Odling i MOC
- Aggregera HepaRG och HHSteC i hängande fallplåtar för att generera lever sfäroider.
- För att uppnå den trypsinisering av HepaRG celler odlas i cellodlingsflaskor (75 cm 2), ta bort mediet från sammanflytande, differentierade encellslagsodlingar, tvätta med PBS två gånger, och tillsätt 3 ml 0,05% trypsin / EDTA. Inkubera under 3-5 minuter vid 37 ° C och stoppa reaktionen genom att tillsätta 6 ml trypsininhibitor.
- Centrifugera HepaRG celler vid 150 xg under 5 min, avlägsna supernatanten, resuspendera cellpelleten i 1 ml HepaRG cellodlingsmedium och räkna celler. Cellviabilitet bör vara> 90%.
- IFör att uppnå trypsinisering av HHSteC celler, ta bort mediet från monolagerkulturer, tvätta med PBS två gånger, och tillsätt 3 ml 0,05% trypsin / EDTA. Inkubera under 5 min vid 37 ° C och stoppa reaktionen genom att tillsätta 6 ml trypsininhibitor.
- Centrifugera HHSteC cellerna vid 150 xg under 5 min, avlägsna supernatanten, resuspendera cellpelleten i 1 ml HepaRG cellodlingsmedium och räkna celler.
- Kombinera HepaRG och HHSteC vid ett förhållande av 24: 1 i HepaRG cellodlingsmedium. För att göra detta, justera cell nummer genom att späda cellsuspensioner i HepaRG cellodlingsmedium och tillsätt 1 x 10 5 celler / ml HHSteC till 4,8 x 10 6 celler / ml HepaRG celler. Blanda noggrant.
- Förbered en hängande droppe platta genom att tillsätta 2 ml PBS till droppe och mottagare platta.
- Pipettera 20 | il av cellsuspensionen i varje brunn i den hängande droppe plattan. Förbereda alltid ca 10% mer hängande droppar än du behöver hämta aggregat, som vissa aggregat förloras during förfarandet. Placera försiktigt plattan i en 37 ° C inkubator. Vänta 48 timmar för sfäroider bildas.
- För att hämta spheroids, se till att använda pipettspetsar med breda spetsändar eller skära tips av 1 ml pipettspetsar med en steril kniv för att vidga öppningen till ca 2 till 3 mm. Använd dessa pipettspetsar att hantera spheroids utan att störa dem.
- Tvätta sfäroider försiktigt från droppe plattan genom att upprepade gånger tillsätta 1 ml media till toppen av brunnarna i droppe plattan med hjälp av en pipett. Tvätta plattan tills alla spheroids har fallit av. Sfäroider är något skivformad med en medeldiameter av 300 till 400 um och en höjd av 200 till 300 | im vid denna punkt.
- Samla spheroids i mottagaren plattan och överföra dem till 24-väl ultralåga fästplattor med högst 20 sfäroider per brunn med hjälp av de förberedda pipettspetsar. Justera pappersvolymerna i varje brunn till 0,5 ml. Använd 20 aggregat för att INOberäkna en MOC krets för att erhålla en miniatyrisering hastighet av 1 / 100,000 angående in vivo cellantal.
- Inkubera spheroids vid 37 ° C och 5% CO2 tills vidare användning i MOC. Förvara inte spheroids längre än tre dagar före användning för att säkerställa jämförbarhet. Odla aggregaten för minst en dag i ultralåga fästplåtar för att hämta de homogena sfäroider.
- Fortsätta endera av två metoder för att generera hudvävnadsekvivalenter: användning av stansbiopsier (1.2.1) eller användning av färdiga och i vitro vävnadsmodeller (1.3.1).
- Skär transwell med en glödlampa kniv under fästet för att förbereda 96 brunnar cellodlingsinlägg och lagra under sterila förhållanden tills vidare användning.
- Sterilisera förhud prover i 80% etanol i 30 sekunder och skär ringen öppen. Prover ska ha en genomsnittlig höjd av 2 mm.
- Använd en biopsi punch att skära biopsier av 4,5 mm diameter för att få en lika miniaturizationsgrad för både lever och hud. Ladda biopsier i den förberedda 96 brunnar transwell skär med pincett. Var noga med att placera biopsier med epidermal sidan uppåt.
- Placera cellodling skär med biopsier i en mottagare platta innehåller HepaRG cellodlingsmedium och förvara vid 37 ° C och 5% CO2 tills vidare användning i MOC. Förvara inte prover längre än 2 till 3 timmar.
- Integrera färdiga och i vitro hud modeller, köpt från olika leverantörer, i MOC, att se till att de är i 96-väl transwell format. Använd cellodlingsmediet levereras av säljaren eller, om en samodling med en annan vävnad planeras i ett ytterligare steg, använd en minimalmedium som stöder båda vävnader. Testa respektive minimalmedium i tidigare statiska experiment för sin förmåga att stödja vävnaderna.
- Hämta hud modeller från innehavaren plattan och skär 96 brunnar inlägg under fästet med en glödande kniv. Placera insatserna tillbaka in mottagaren plattan och förvara vid 37 ° C och 5% CO2 tills vidare användning i MOC. Förvara inte prover längre än en dag.
2. MOC Fabrication
- Blanda PDMS och härdare i ett förhållande av 10: 1 (volym / volym) och placera blandningen under vakuum under 15 min för att avlägsna luftbubblor.
- Under tiden, behandla en polykarbonat täckplåt med silikongummitillsats vid 80 ° C i 20 minuter.
- Sätt Teflon skruvar i respektive hål i locket-plattan för att skapa de fyra PDMS-free cellodlings fack och de sex PDMS membran, 500 pm tjocka, av mikro.
- Anslut förberett täckplåten till befälhavaren mögel av de två mikrovaskulära kretsar och injicera de avgasade PDMS. Se till att inte integrera luftbubblor i systemet. Om bubblor uppstår, försök att ta bort dem genom att luta enheten.
- Inkubera systemet vid 80 ° C under 60 min för härdande av PDMS skiktet.
- Ta master mögel och Teflon skruvarna från enheten och binda PDMS skiktet till en glasskiva med en 75 x 25 mm 2 fotavtryck använder lågtrycksplasma oxidation.
- Skruva speciella gäng MOC adaptrar till alla fyra cellodlings fack i locket-plattan.
- Anslut sprutor innehållande odlingsmedium till kvinnliga Luer x ¼-28 manliga adaptrar och skruva dem till MOC adaptrar för täckplåten.
- Injicera medium i mikroflödeskretsen genom att upprepade gånger trycka ned och dra upp de sprutor kolvarna.
- Kontrollera korrekt fyllning av kanalerna med mediet under mikroskop.
3. endotelisering av MOC
- Före endothelializing MOC, spola varje MOC krets med endotelial celltillväxtmedium och inkubera det statiskt för tre dagar vid 37 ° C och 5% CO2.
- Sterilisera Mocs använder en etanol torka och placera dem i dragskåp bänk. Jagn Dessutom sterilisera två par pincett och två sexkantiga knappar för vidare användning.
- Lossa locken i vävnadskultur facket på MOC hjälp av sexkantiga nycklarna och ta bort locken med hjälp av pincetten. Efter insättning av mediet, skruvkapsyler tillbaka på till mocs på samma sätt.
- För att uppnå den trypsinisering av mänskliga dermala mikrovaskulära endotelceller (HDMEC), ta bort mediet från monolagerkulturer, tvätta med PBS två gånger, och tillsätt 3 ml 0,05% trypsin / EDTA. Inkubera under 5 min vid 37 ° C och stoppa reaktionen genom att tillsätta 6 ml trypsininhibitor.
- Centrifugera HDMEC vid 220 xg under 5 min, avlägsna supernatanten, resuspendera cellpelleten i 1 ml endotelial celltillväxtmedium och räkna celler. Cellviabilitet bör vara> 90%.
- Justera cellantalet i cellsuspensionen till en slutlig koncentration av 2 x 10 7 celler / ml genom utspädning med endotelial celltillväxtmedium och överför 250 pl av det tillen 1 ml spruta. Applicera denna koncentration av celler till MOC att hålla miniatyrisering hastighet av 1 / 100.000 för alla organ.
- Anslut sprutan till en kvinnlig Luer x ¼-28 hane adapter, driva ut luften ur denna koppling, och skruva fast den till en speciell tråd MOC adapter. Anslut adaptern till en av de två utrymmena i varje MOC krets.
- Anslut en tom spruta på samma sätt till den andra avdelningen av MOC kretsen.
- Injicera cellerna jämnt genom att trycka ner och dra upp de två sprutkolvama flera gånger i rad sätt. Styr infusion av celler under mikroskop.
- Inkubera MOC vid 37 ° C och 5% CO2 under statiska förhållanden under 3 timmar för att tillåta cellerna att vidhäfta till kanalväggarna.
- Ta bort chipet från inkubatorn, placera den i dragskåp bänk, och ersätta sprutorna och MOC adaptrar med speciella gäng MOC cellodlingskammare.
- Lägg 400 pl färskt medium till en cominstitutionen för varje MOC krets och låt den spola igenom kanalerna med hydrostatiskt tryck. Efteråt, byt mediet i båda fack med 300 | il färskt medium.
- Stäng facken använder lock, som beskrivs i 3.1.2.
- Anslut chipet till pumpstyrenheten. Justera pumphastigheten till en frekvens av 0,475 Hz och odla chipet vid 37 ° C och 5% CO2.
- Ersätt mediet av varje MOC fack var och en till två dagar och övervaka cellmorfologin med ljusmikroskop.
4. Belastning av Chip
- Placera MOC under laminärt flöde bänken och öppna den, som beskrivs i steg 3.1.2.
- Ta bort materialet från vävnadskultur fack och ersätta den med 300 pl färsk HepaRG cellodlingsmedium.
- Överför 20 förformade sfäroider till en vävnadskultur fack för varje MOC krets med hjälp av pipettspetsar med en bred öppning (se steg 1.1.8 / 9). Stäng cap använder pincett och hexagonala nycklar.
- Överför 96 brunnar cellodlingsinlägg innehåller hudekvivalenter till återstående vävnadsodling utrymme för varje MOC krets använder pincett. Var noga med att undvika bubblor bildas under membranet i huden motsvarande. För att göra detta, sätt transwell i en något lutande vinkel och tryck ner försiktigt. Ta bort överflödigt medel runt transwell pressas upp underifrån med en pipett.
- Stäng locket med pincett och hexagonala nycklar.
5. Anslutning av Chip till Enhet pumpstyrning
- Ställ driftsparametrar i styrenheterna till de värden önskas. Ändra lufttrycket från 0 till 8000 mbar, vakuum från 0 till -800 mbar, och pumpa frekvens 0,24-2,4 Hz. Ställ pumpriktningen medurs eller moturs.
- Ta bort MOC innehåller vävnadsekvivalenter från under laminärt flöde bänk och anslut den till pumpstyrenheter.
- Efter numeratjon på rören, sätter lufttryck slangen till respektive beslag på MOC.
- Odla MOC vid 37 ° C och 5% CO2 i en inkubator eller, i fallet med levande vävnad avbildning, använda MOC stöd för att värma chippet till 37 ° C och odla chipet utanför inkubatorn. Använd den uppvärmda stöd för att odla celler i MOC under ett standardmikroskop.
6. Utföra Media Exchanges, Provtagning Media och Exponering för ämnen
- Utför rutin media utbyte varje dag eller varannan dag, med tanke på typen av vävnad odlas och den metaboliska aktiviteten hos cellerna.
- Hämta MOC från kuvösen och observera den under mikroskop för att kontrollera medie flöden och kontrollera förorening.
- Koppla MOC från pumpstyrenheten genom att dra ur lufttrycket slangen. Sterilisera MOC använder etanol våtservetter och lägga den under laminärt flöde bänken.
- Öppna vävnadsodling compArtment innehåller lever sfäroiderna, som beskrivs i steg 3.1.2.
- Ta upp till 200 | il från facket med användning av en pipett utan att störa sfäroiderna och lagra substratet i en tom brunn i en djupbrunnsplatta. Analysera medieprov direkt eller stänga djupbrunnsplatta och lagra mediesamplingar vid -80 ° C för vidare analys.
- Ersätt mediet för MOC med upp till 250 | il färskt cellodlingsmedium och stäng locket. Skillnaden i mängden avlägsnades mediet och ersattes konton för förlusten på grund av små mängder läcker ut av chipet vid stängning av systemet.
- Öppna locket på vävnadsodling facket håller huden medel vid denna punkt att kontrollera om vävnads intactness. Se till att inte införa luftbubblor i systemet. Stäng locket.
- Anslut slangen på pumpen kontrollenheten till MOC, enligt steg 5,3, och placera MOC i en inkubator.
7. Analysera Daily Media Prover och Utför Online Analys
- Analysera vävnadskultur prestanda på nätet med hjälp av levande cell imaging eller offline, genom att analysera de dagliga medieproverna. Utför den senare med standardrutin enzymatiska analyser (t.ex. laktatdehydrogenas (LDH) aktivitet) eller ELISA (t.ex. albumin koncentration). En online analys beskrivs i det följande.
- Ta bort materialet av endothelialized MOC, som beskrivs i steg 6.1.1 till 6.1.4, och ersätta den i både vävnadskultur fack med 200 pl 10 ug / ml fluorofor konjugerad acetylerade low-density lipoprotein (LDL) lösning (utspädd i cellodlingsmedier).
- Stäng locken. Anslut MOC till pumpstyrenhet, enligt steg 5,3, och pumpa det i 30 minuter vid 0,475 Hz att fördela lösningen jämnt inom mikroflödeskretsen.
- Stoppa pumpning och inkubera MOC statiskt under 3,5 timmar vid 37 ° C och 5% CO2.
- Liknande to steg 7,2, ta bort den acetylerade LDL-lösningen från båda avdelningarna och ersätta det med 400 pl färskt medium i en av de två avdelningarna.
- Vänta 3-5 minuter för att låta det hydrostatiska trycket driva mediet genom mikroflödeskanalkrets.
- Byt medium som har strömmat genom med 300 | il färskt medium och även fylla den andra vävnadsodlingsutrymmet med 300 | il färskt medium.
- Stäng MOC, enligt steg 3.1.2. Lägg den under ett fluorescensmikroskop och observera celltillväxt och lönsamhet.
- Placera färgade MOC tillbaka i inkubatorn för att fortsätta odlingen. Ta bort fläcken läcker ut ur cellerna med var följande medie ersättare.
8. Hämta vävnadsekvivalenter från MOC och Utför slutpunkt Analyser
- Hämta vävnadsekvivalenter från MOC i slutet av experimentet för endpoint analyser.
- För att hämta levern och huden equivalents från MOC, ta bort media från varje vävnadskultur fack, som beskrivs i steg 6.1.1 till 6.1.4.
- Ta bort de 96 brunnar cellodlingsinlägg innehåller huden från MOC använder pincett. Skala av membranet försiktigt från insatsen genom att greppa den på ena sidan med pincett och drar den nedåt. Se till att inte tappa huden motsvarande vid denna tidpunkt.
- Frys membranet håller huden motsvarande i Cryo-inbäddning förening och förvara den vid -80 ° C tills vidare analys.
- Ta bort lever motsvarigheter på liknande från vävnadsodling facket genom att pipettera dem med snitt pipettspetsar (se steg 1.1.8 / 9).
- Bädda levern spheroids i Cryo-inbäddning förening. Se till att inte överföra för mycket vätska och ta bort överflödig vätska med en pipett. Efter att ha placerat sfäroiderna på inbäddning föreningen och avlägsnande av mediet, tillsätt ytterligare kryo förening på toppen av sfäroiderna att fullständigt innesluta dem.
- Frys lever motsvarigheter och förvara den vid -80 ° C tills vidare analys.
- Utför endpoint analyser genom att skära av vävnadsekvivalenter i en kryo-mikrotom till 8 um sektioner och färgning för vävnadsspecifika markörer, som beskrivs i tidigare protokoll 10.
Representative Results
Standard in vitro vävnadskulturer utförs under statiska betingelser, vilket begränsar diffusionen av syre och näringstillförseln till vävnaderna. Fluidic system, som visar förbättrade egenskaper försörjnings, hindras ofta av sina stora medel krav, har icke-fysiologiskt höga medium till vävnadsförhållanden. Sålunda är metaboliter späds och cellerna inte kan begränsa deras omgivning. MOC som presenteras i denna studie ansluter två separata vävnadsodlings fack, vart och storleken av en enda brunn i en standard 96-brunnars platta, genom ett mikrofluidkanalsystemet. Den lilla skalan hos systemet och integrationen av pumpen på chipet tillåter systemet att arbeta vid medievolymer av endast 200-800 il. Detta motsvarar en total systemisk medium till vävnadsförhållande på 8: 1 till 31: 1, respektive, för levern och huden vävnad samodlingar (med en total vävnadsvolym på cirka 26 l). Den totala extracellulära vätskevolymen i en man som väger 73 kg är 14,6 L, varav den intercapillary vätskevolym är 5,1 L, vilket leder till en fysiologisk extracellulär fluid till vävnadsförhållande av 1: 4. Därför är mängden av media i hela cirkulationssystemet i MOC ännu större jämfört med den fysiologiska situationen; och ändå utgör det minsta media till vävnadsförhållande hittills rapporterats för system 5 multiorgan. Som branschstandard vävnadskulturformat behålls, forskarna kan kombinera befintliga och redan validerade statisk vävnadsmodeller inom en gemensam vätskeflöde. Figur 1 visar den schematiska av en experimentell uppställning av möjliga MOC enda vävnad eller flera vävnads samodlingarna. Primära vävnadsbiopsier samt in vitro -generated vävnadsekvivalenter från cellinjer eller primära celler kan odlas antingen med användning av 96-brunnars cellodlingsinlägg eller genom att placera dem direkt i vävnadsodlings fack. Som kanalsystemet som sammanbinder de cellodlingsutrymmena ligger bara 100 μm hög, kommer vävnadsekvivalenter överstiger dessa dimensioner hållas inom kultur facken. Den endotelisering av MOC kretsen med primära HDMECs möjliggör ytterligare ett steg framåt mot mer fysiologiska odlingsbetingelser genom att tillhandahålla en biologisk vaskulär struktur.
Figur 1:. Schematisk representation av MOC kulturer vävnadsekvivalenter bereds under standard in vitro förhållanden, ympas in i MOC och odlas som enstaka kulturer eller samodlingar under dynamiska förhållanden. Dagliga media prover och ändpunktsanalyser utförs. Lufttryck att driva pumpen appliceras genom de tre blå rören är anslutna till MOC från ovan. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Efter endotelisering-protokollet, ett sammanflytande HDMEC täckning av mikroflödeskanalkrets erhållas inom fyra dagar efter dynamisk kultur, såsom visas i figur 2. Celler lätt vidhäfta till väggarna i MOC kanal, skapa ett sammanflytande monoskikt, och långsträckt utmed skjuvningen stress (Figur 2B). Vidare celler täcka hela omkretsen av kanalerna, såsom tidigare 9 rapporterats. Ingen ytterligare förändring i endotel morfologi observerades efter fyra dagars odling fram till slutet av kulturen.
Figur 2:. Endothelialized MOC kanaler Human dermala mikrovaskulära endotelceller (HDMEC) bildade en sammanflytande monolager i mikroflödeskretsen. Celler färgades med acetylerade LDL efter 23 dagars MOC kultur. (A) Hela microvascular krets var täckt med celler och (B) celler långsträckt längs skjuvspänningen. Skalstrecken: (A) 1000 | im och (B) 100 | im.
I ett ytterligare experiment, är konsekventa skivformade levercells sfäroider bildas från HepaRG och HHSteC under två dagar av hängande droppe kultur, eftersom detta modellsystem har tidigare redovisats som lämpliga för läkemedelsmetabolism studerar 11-13. För demonstrationsändamål, var en vävnadskultur fack för varje MOC krets ympats med 20 spheroids i 96 brunnar cellodlingsinlägg och vävnader odlades över 14 dagar under dynamiska förhållanden använder icke-endothelialized Mocs. Valfritt antal aggregat eller mängden primärmaterial kan integreras direkt i facken eller använda cellodlingsinlägg. Immunofluorescerande färgning av spheroids efter hämtning från MOC visar en stark, homogen uttryck för liver-typiska cytokeratin 8/18 och fas I enzymer cytokrom P450 3A4 och 7A1 (Figur 3A och 3B). Färgning av canaliculära transportör multidrogresistensprotein 2 (MRP-2) avslöjade en polariserad fenotyp och förekomsten av rudimentära gallcanaliculi liknande nätverk (figur 3C).
Figur 3 :. Odling av humana artificiella levermikro vävnader i MOC. Lever aggregat odlas under 14 dagar i MOC färgades för (A) cytokeratin 8/18 (röd) och (B) cytokrom P450 3A4 (röd) och 7A1 (grön). (C) Redovisning av canaliculära transportör MRP-2 (grön), blå nukleär färgning. Skalstrecken: 100 ^ M.
Eftersom produktionen av albumin är en viktig förutsättning för levervävnadskulturer har det been valt att övervaka lever typisk aktivitet i MOC. Analysera dagliga medieprover för albumin produktion visar en betydande ökning av produktionstakten i MOC kulturer jämfört med statiska kulturer (Figur 4) och värden som rapporterats i litteraturen 11. Ökningen av albuminsynteshastigheten kan hänföras till den ökade syre och näringstillförsel i MOC kulturer. Därför är MOC kunna upprätthålla lever aggregat under en odlingsperiod på 14 dagar i ett metaboliskt aktivt tillstånd, öka lever typiska beteende, såsom albumin produktion.
Figur 4: Fjorton dagars lever sfäroid prestanda i MOC Albumin produktion av lever enstaka vävnadskulturer i MOC och i statisk kultur.. Data är medelvärden ± SEM (n = 4).
Subsystemic upprepad testning av che toxicitetmicals och kosmetika på djur kräver 21 till 28 dagar efter exponeringen, som definieras av OECD riktlinje nr. 410 "vid upprepade doser dermal toxicitet: 21/28 dagars studie." Långsiktiga hud-lever samodlingar exemplifieras här i upp till 28 dagar att klara myndighetskrav. En luft-vätskegränssnittet tillhandahålls för senare dermal substans exponering genom odling hudbiopsier i 96-brunnars cellodlingsinlägg. Den coculture Experimentet utförs som exempel i endothelialized Mocs att bevisa om en tre-vävnad coculture i en kombinerad mediakrets kan hållas livskraftig och metaboliskt aktiva under 28 dagar.
Analys av LDH aktivitet i media supernatanter visade en stadigt sjunkande nivå under de första åtta dagars odling, som stannade konstant på omkring 80 U / därefter l (Figur 5). Detta indikerar en artificiell men stabilt vävnadsomsättning i systemet vid senare tidpunkter. Jämföra tre vävnads coculture till lever singel-tissue och lever-endotel coculture experiment kunde en signifikant minskad LDH nivå hittas, särskilt under de första dagarna i kulturer exklusive huden. Celldöd inom denna första period av hög LDH aktiviteten inträffade främst i huden kulturfacket, som hud enda vävnads MOC kulturer avslöjade (data visas ej). Detta kan bero på det sårade området kring biopsi som ett resultat av stansningen av huden.
Figur 5: Femton dagars vävnadsprestanda i MOC LDH aktiviteten i media supernatanterna av lever enda vävnadskulturer (MOC Li), lever kulturer i endothelialized Mocs (MOC Li-Va) och lever-hud samodlingar i endothelialized MOC (MOC Li. -Va-Sk). Data är medelvärden ± SEM (n = 4).
Under 28-dagars odlingsperioden, lever sfäroider följs botten av MOC and celler växte ut och bildar en flerskiktad koppling mellan närliggande sfäroider. Detta inte hindra vävnads funktionalitet. Endpoint analys genom immunofluorescens visade att lever spheroids fortfarande metaboliskt aktiva efter 28 dagar av MOC samodling, vilket framgår av cytokrom P450 3A4 färgning (Figur 6A). HHSteC var fördelade över hela levern ekvivalent, såsom visas av vimentin färgning (figur 6B). En ökning av vimentin färgningsintensitet kunde observeras i områden där cellerna hade vuxit ur sfäroider. Färgning för von Willebrand-faktor (vWF) visade att endotelceller inte hade trängt djupt in i vävnaden, men var i direkt cell-cellkontakt med de yttre hepatocyter (Figur 6C).
Immunohistokemi färgning av biopsier huden visade ett uttryck för tenascin C och kollagen IV i basalmembranet (figur 6D), medan färgning av den statiska kontrollen visade elevated nivåer tenascin C (figur 6E). Tenascin C har visat sig vara uppreglerad under sårläkning, inflammatoriska processer och fibros, vilket tyder inducerade fibrotiska processer i statiska, men inte i dynamiska kulturer 14,15.
Stabil cellernas livskraft och funktionalitet av vävnader efter en 28 dagars samodling i MOC bevisar att systemet kan upprätthålla en kombination av upp till tre vävnader i en gemensam mediekrets. Primära celler samt vävnadsmodeller och biopsier, kan odlas samtidigt i MOC systemet.
Figur 6:. Utförande av multi-vävnadskulturer över 28 dagar Lever medel och hudbiopsier odlades i ett endothelialized MOC och cellfunktioner visades genom immunfärgning av (A) Fas I enzymer cytokrom P4503A4 (röd), (B) vimentin (röd), (C) cytokeratin 8/18 (röd) och vWF (grön) i levervävnad. Hud biopsier samodlades under 28 dagar (D) i MOC eller (E) under statiska förhållanden färgades för tenascin c (röd) och kollagen IV (grön), blå nukleär färgning. (F) H & E färgning av huden efter 28 dagars MOC kultur. Skalstrecken: 100 ^ M.
Discussion
MOC plattformen beskrivs här utgör ett stabilt och kraftfullt verktyg för att odla vävnader av olika ursprung på dynamiska medelflödesförhållanden över långvarig kulturperioder 10,16. I detta exempel var den plattform som används för att odla primära celler (HDMEC), vävnads ekvivalenter alstrade från en cellinje (lever aggregat), och en samodling av den tidigare nämnda med en vävnadsbiopsi. Den MOC kunde upprätthålla tre vävnads coculture i upp till 28 dagar i en kombinerad medelkrets. Så vitt författarnas kunskap, är detta första gången en multi-vävnads coculture inklusive biopsier, primärceller och cellinjer har utförts under fyra veckor.
En av de stora nackdelarna med mikrofluidiksystem är affiniteten hos små molekyler att vidhäfta till ytan materialet i fluidkrets. Eftersom förhållandet yta till volym är särskilt hög i mikrofluidiska system, blir denna effekt ännu mer uttalad 17 in vitro -generated vävnader är lovande och visar vägen för fortsatta studier 18,19.
Det är väl känt att hepatocyter tenderar att förlora sina leverspecifika funktioner över tiden under statiskt tvådimensionella in vitro odlingsbetingelser 20. Metaboliserande enzymer, såsom cytokrom P450-familjen, är av särskild betydelse om metabolismen av en viss drog är som skall studeras. Cytokrom P450 3A4, ett enzym relaterat till biotransformationen av många xenobiotika, och cytokrom P450 7A, wso m är involverad i gallsyrasyntes, uttrycktes i levern aggregerade uppgifterna odlas i MOC över 14 dagar. Detta indikerar att bevara ett metaboliskt aktiv fenotyp, vilket möjliggör läkemedelsmetabolismstudier. Den ökade albuminproduktionstakten av aggregat i MOC jämfört med statiska kulturer är ytterligare indikation för adekvata odlingsbetingelser. De albuminproduktionstakt som observerats under denna studie var jämförbara eller till och med högre än tidigare rapporterade värden som erhållits genom mikroflödes marker inklusive HepG2 celler 21-23, dock värdena inte når de av primära humana hepatocytkulturer 24. Dessutom MOC systemet i sin tillfälliga layout, inte tillåter en separat segregation av galla. Celler i de aggregerade polarise och bildade gallcanaliculi liknande strukturer, vilket framgår av MRP-2 färgning. Emellertid var dessa canaliculi inte ansluten till en teknisk kanal samla gallan. Denna icke-fysiologiska mixing av galla med blodfacket måste åtgärdas i en framtida omarbetning av systemet.
Justeringen av flödesegenskaper är av stor betydelse 25, särskilt med avseende på vävnader som är känsliga för skjuvspänning, såsom levern. Mängden skjuvspänningen uppfattas av vävnaden kan modifieras på två sätt: För det första, kan lufttrycket som används för att trycka ner membranen i pumpen sänkas, minskande topp skjuvspänning-värden i systemet. För det andra kan vävnaderna bäddas in i en extracellulär matris skiktning eller odlas i transwell kulturinsatser. De senare skydda vävnaderna från det underliggande ström med ett poröst membran. Dessa justeringar måste göras på individuell basis för varje organ motsvarande innan MOC experimentet. Vid en pulserande drift av 2,4 Hz, till exempel, vilket motsvarar en hög, men ändå fysiologiska, hjärtaktivitet av 144 slag / min hos människor, skjuvspänningen mätt ikanaler av den mikrovaskulära kretsen når ca 25 dyn / cm 2. Detta motsvarar en fysiologisk skjuvspänning vid den högre änden av skalan i mikrocirkulation och är därför väl tillämpas för experiment, inklusive en endotelisering av kanalerna. Men eftersom den nuvarande mikroflödes layouten av MOC systemet presenteras består av endast en mediekrets som förbinder de två avdelningarna organ, en pumphastighet och skjuvspänning hastighet måste väljas för hela systemet. Därför är en exakt justering av flödesegenskaper till behoven hos varje enskild organ inte alltid möjligt.
Vidare har man vara noga med att anpassa cellerna till det gemensamma mediet. Celler odlas i MOC i en kombinerad mediakrets, därför ingen enskild cellodlingsmedia kan användas för varje vävnadsmodell, som är standarden för cellodling in vitro. En minimal kombinerad mediaformulering bör definieras i förväg och than celler behöva justeras stegvis till denna nya medier. Ett förfarande justering av 80% / 20% gamla till nya medier i två dagar, sedan 50% / 50%, följt av 20% / 80%, och en full utbyte alltid lett till en rimlig cellviabilitet och funktionalitet av kulturer i våra händer.
Den nuvarande mikroflödes layout MOC systemet tillåter samodling på upp till tre vävnader. Det behövs en samodling av åtminstone de tio viktigaste organ i människokroppen för att nå homeostas. Därför är det system som presenteras kunna förutsäga specifika vävnad-vävnadsinteraktioner, men inte den sanna systemiskt svar på ett ämne. En vidareutveckling av MOC till fler organ håligheter planeras. Dessutom är giltigheten av det system som skall visas med hjälp av en uppsättning av referensföreningar. Lämpligen föreningar som har misslyckats under kliniska prövningar (t.ex. Troglitazon) ska testas för sin prestation i MOC. För en sann validering av sådana komplexa system fortfarande hämmas by bristen på standardisering avseende biomarkörer och slutpunkter för funktionell utvärdering, insamling fler uppgifter om den toxikologiska prestanda detta och liknande system kommer att bredda deras tillförlitlighet och användningsområde.
Disclosures
Uwe Marx är VD för TissUse GmbH som tillverkar och marknadsför Multi-Organ Chip-plattform som används i artikeln. Denna publikation har finansierats av en utmärkelse som beviljats av Corning
Acknowledgments
Arbetet har finansierats av det tyska förbundsministeriet för utbildning och forskning, GO-Bio Grant No. 0.315.569.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| HepaRG cells | Biopredic International | undifferentiated cells | |
| HHSteC | ScienCell Research Laboratories | cells and all culture supplements | |
| HepaRG Medium | Sigma-Aldrich | William's Medium E 10% FCS 100 U/ml penicillin 100 µg/ml streptomycin 5 µg/ml human insulin 2 mM L-glutamine 5 x 10-5 M hydrocortisone hemisuccinate |
|
| HDMEC Medium | PromoCell | Endothelial Cell Growth Medium MV2 with Supplement-Pack MV2 and 1% penicillin-streptomycin | |
| Dimethyl sulfoxide | Carl Roth | add 2% to HepaRG media | |
| Trypsin/EDTA | Biowest | ||
| Trypsininhibitor | Carl Roth | ||
| MAXYMum Recovery Tips | Corning | 1,000 µl Pipet Tips Wide Bore | |
| 384-Well Hanging Drop Plate | 3D Biomatrix | Perfecta 3D 384-Well Hanging Drop Plate | |
| Tissue culture flasks | Corning | 75 cm2 | |
| Ultra-low attachment plate | Corning | 24-well | |
| Transwell cell culture inserts | Corning | 96-well unit, 0.4 µm pore size | |
| Deep well plates | Corning | 96-well, 1 ml | |
| Biopsy punch | Stusche | 4.5 mm | |
| Glass microscope slide | Menzel | footprint of 75 x 25 mm | |
| Polydimethylsiloxane | Dow Corning | Sylgard 184 | |
| Silicon rubber additive | Wacker Chemie | Wacker Primer G790 | |
| Tubes for air pressure | SMC Pneumatik GmbH | Polyurethan-Schlauch, metrisch | |
| Alumin ELISA | Bethyl Laboratories | Human Albumin ELISA Quantitation Set | |
| Lactate dehydrogenase assay | Stanbio Laboratory | LDH Liqui-UV kit | |
| Alexa Fluor 594 acetylated LDL | Invitrogen | 1 mg/ml |
References
- Kelm, J. M., Fussenegger, M. Microscale tissue engineering using gravity-enforced cell assembly. Trends in biotechnology. 22 (4), 195-202 (2004).
- Marx, U., Walles, H., et al. Human-on-a-chip Developments: A Translational Cutting-edge Alternative to Systemic Safety Assessment and Efficiency Evaluation of Substances in Laboratory Animals and Man. ATLA. 40 (5), 235-257 (2012).
- Baudoin, R., Griscom, L., Prot, J. M., Legallais, C., Leclerc, E. Behavior of HepG2/C3A cell cultures in a microfluidic bioreactor. Biochemical Engineering Journal. 53 (2), 172-181 (2011).
- Dash, A., Inman, W., et al. Liver tissue engineering in the evaluation of drug safety. Expert opinion on drug metabolism & toxicology. 5 (10), 1159-1174 (2009).
- Materne, E. -M., Tonevitsky, A. G., Marx, U. Chip-based liver equivalents for toxicity testing--organotypicalness versus cost-efficient high throughput. Lab on a chip. 13 (18), 3481-3495 (2013).
- Huh, D., Torisawa, Y., Hamilton, G. a, Kim, H. J., Ingber, D. E. Microengineered physiological biomimicry: organs-on-chips. Lab on a chip. 12 (12), 2156-2164 (2012).
- Sin, A., Chin, K. C., Jamil, M. F., Kostov, Y., Rao, G., Shuler, M. L. The design and fabrication of three-chamber microscale cell culture analog devices with integrated dissolved oxygen sensors. Biotechnology progress. 20 (1), 338-345 (2004).
- Tatosian, D. a, Shuler, M. L. A novel system for evaluation of drug mixtures for potential efficacy in treating multidrug resistant cancers. Biotechnology and bioengineering. 103 (1), 187-198 (2009).
- Schimek, K., Busek, M., et al. Integrating biological vasculature into a multi-organ-chip microsystem. Lab on a chip. 13 (18), 3588-3598 (2013).
- Wagner, I., Materne, E. -M., et al. A dynamic multi-organ-chip for long-term cultivation and substance testing proven by 3D human liver and skin tissue co-culture. Lab on a chip. 13 (18), 3538-3547 (2013).
- Vieira, U., et al. HepaRG human hepatic cell line utility as a surrogate for primary human hepatocytes in drug metabolism assessment in vitro. Journal of pharmacological and toxicological methods. 63 (1), 59-68 (2010).
- Abu-Absi, S. F., Hansen, L. K., Hu, W. -S. Three-dimensional co-culture of hepatocytes and stellate cells. Cytotechnology. 45 (3), 125-140 (2004).
- Leite, S. B., Wilk-Zasadna, I., et al. Three-dimensional HepaRG model as an attractive tool for toxicity testing. Toxicological sciences. 130 (1), 106-116 (2012).
- Chiquet-Ehrismann, R. Tenascins. The international journal of biochemistry & cell biology. 36 (6), 986-990 (2004).
- Sidgwick, G. P., Bayat, A. Extracellular matrix molecules implicated in hypertrophic and keloid scarring. Journal of the European Academy of Dermatology and Venereology JEADV. 26 (2), 141-152 (2012).
- Ataç, B., Wagner, I., et al. Skin and hair on-a-chip: in vitro skin models versus ex vivo tissue maintenance with dynamic perfusion. Lab on a chip. 13 (18), 3555-3561 (2013).
- Wu, M. -H., Huang, S., Lee, G. -B. Microfluidic cell culture systems for drug research. Lab on a chip. 10 (8), 939-956 (2010).
- Schanz, J., Pusch, J., Hansmann, J., Walles, H. Vascularised human tissue models A new approach for the refinement of biomedical research. Journal of Biotechnology. 148 (1), 56-63 (2010).
- Holnthoner, W., Hohenegger, K., et al. Adipose-derived stem cells induce vascular tube formation of outgrowth endothelial cells in a fibrin matrix. J Tissue Eng Regen Med. , (2012).
- Dunn, J. C. Y., Yarmush, M. L., Koebe, H. G., Tompkins, R. G. Hepatocyte function and extracellular matrix geometry: long-term culture in a sandwich configuration. FASEB Journal. 3, 174-177 (1989).
- Leclerc, E., Sakai, Y., Fujii, T. Microfluidic PDMS (polydimethylsiloxane) bioreactor for large-scale culture of hepatocytes. Biotechnology progress. 20 (3), 750-755 (2004).
- Kim, M. S., Yeon, J. H., Park, J. -K. A microfluidic platform for 3-dimensional cell culture and cell-based assays. Biomedical microdevices. 9 (1), 25-34 (2007).
- Prot, J. -M., Aninat, C., et al. Improvement of HepG2/C3A Cell Functions in a Microfluidic Biochip. Biotechnology and bioengineering. 108 (7), 1704-1715 (2011).
- Riccalton-Banks, L., Liew, C., Bhandari, R., Fry, J., Shakesheff, K. Long-term culture of functional liver tissue: three-dimensional coculture of primary hepatocytes and stellate cells. Tissue engineering. 9 (3), 401-410 (2003).
- Powers, M. J., Domansky, K., et al. A Microfabricated Array Bioreactor for Perfused 3D Liver Culture. Biotechnology and Bioengineering. 78 (3), 257-269 (2002).
