Summary
Denne artikel beskriver den metode til administration korte perioder af intermitterende hypoxi til postnatal dag 1-8 mus eller rotteunger. Denne tilgang effektivt fremkalder en robust vævsniveau "priming effekt" på dyrkede neurale stamceller, der er høstet inden for 30 minutter af hypoxi eksponering.
Introduction
Målet med denne metode er at reproducerbart og effektivt levere intermitterende anfald af systemisk sænket omgivende ilt til neonatale gnavere. Begrundelsen for at bruge intermitterende hypoxi (IH) til at manipulere stamcellebiologi stammer fra in vitro-cellekultur forsøg, hvor O 2 indhold vækstmediet ændres. Konkret i forhold til "standard" betingelser for 20% O 2, udvidet kultur af stamceller / stamceller populationer celler i 3% O 2 resultater i øget spredning, nedsat apoptose og øget neuronal udbytte 1,2.
Denne gruppe har betydelig erfaring med administration af systemiske IH, og har gennemført omfattende undersøgelser om betydningen af IH i respiratorisk plasticitet 3-7. Dette arbejde, og den seneste konstatering af, at kronisk IH øget neurogenese i gnaver CNS 8-10, danner grundlag for udforskning af akut in vivohypoxi som forkonditionering stimulus (dvs.., før vævet høst) af den efterfølgende kultur af neurale stamceller / progenitorceller (NPCs) 11. Bemærkelsesværdigt, når musen unger blev udsat for en kort (<1 time) periode med akut intermitterende hypoxi (AIH), celler, der blev høstet fra den subventrikulære zone (SVZ) havde signifikant øget kapacitet til udvidelse som neurosfærer eller omliggende monolag celler. Den AIH protokol blev ligeledes forbundet med forøget ekspression af et "neuronalt" transkriptionsfaktor (Pax6).
Følgelig in vivo AIH protokoller kan tilvejebringe et middel til at "prime" NPC før dyrkning. For eksempel kunne applikationer til denne fremgangsmåde, omfatter ekspanderende cellepopulationer før transplantation ind i såret centralnervesystemet eller blot at øge neuronal differentiering af dyrkede celler før in vitro-forsøg. Endvidere fordi dette er en systemisk levering, enhverorgel, væv eller celle er en kandidat til lignende undersøgelse. Derfor protokollen som skrevet er potentielt anvendelig til en bred vifte af undersøgelser af intermitterende ilt manipulation i små pattedyr.
Der er visse fordele ved denne fremgangsmåde. I andre offentliggjorte arbejde blev nyfødte behandlet som et kuld med dæmningen i lavtryksforhold kamre, som giver mulighed for kronisk dosering, mindre håndtering før behandling, og vedligeholdt mødres kontakt under behandling 9. Den nuværende fremgangsmåde omgår gentagne behandlinger til avlshun, eller anvendelsen af en anden dæmning for hvert forsøg. Denne protokol tillader også undersøgelse af præcise kuld-matchede og aldersmatchede nyfødte. Repræsentative data viser et andet centralt styrken af denne protokol, nemlig den hurtighed, hvormed AIH, som leveret, fremkalder en stærk og sammenhængende biologisk respons i neural stamcelle biologi. Dette etablerer en præcedens for denne protokol til at fremkalde vævs- og cellulært niveau biological ændringer, der ændrer cellebiologi.
Denne rapport vil skitsere de detaljerede procedurer, der anvendes til at udsætte gnaver hvalpe til AIH samt befolkningen analyse af SVZ celler dyrkes som neurosfærer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
BEMÆRK: Alle dyreforsøg i denne protokol udføres med godkendelse fra University of Florida Institutional Animal Care og brug Udvalg (IACUC), og er i overensstemmelse med den »Guide til Pleje og anvendelse af forsøgsdyr.
1. Grundlæggende Eksperimentel oprettet inden Intermitterende Hypoxi Administration
- Expose unger 12 til de forskellige gas blandinger ved hjælp af en hel-krop mus plethysmograph kamre på samme måde som voksne gnavere for andre eksperimentelle formål 5,13,14. Kamrene har en 4 tommer i diameter (volumen = 450 ml), som er af rigelig størrelse til at rumme 3-4 museunger eller 1-2 rotteunger. Her er AIH protokoller leveret til nyfødte alderen postnatal dag 1-8 (P1-P8).
- Brug komprimeret luft gastanke til at levere den 21% "baseline" gas, som opretholder kammer iltning på 21%. For at opnå "relativ iltmangel", skal du bruge en 10% ilt / 90% nitrogen gas tank.
IKKEE: Plastik rør (3/16 "diameter) forbinder gastanke til en flowmåler. Således input til flowmeteret består af et rør hver for baseline og hypoxi luftstrøm. - Konfigurer gas slangen som følger.
- Kør plastslange (1/8 "i diameter) fra flowmåleren til en bias flow regulator, der gør det muligt strømme af 1 L / min til hvert kammer (dvs. 4 L / min, hvis der anvendes 4 kamre).
- Kør plastslange (1/8 "i diameter) fra bias flow regulator til plethysmografi kamre. Luftstrøm på 1 l / min til hvert kammer er en forudbestemt strømningshastighed, ved hvilken gasudveksling anses for at være ikke-stress-inducerende til dyrene baseret på fysiologiske og adfærdsmæssige observationer.
- Forsegl alle ubrugte forbindelser til og fra bias strøm enheden og alle ubrugte åbninger til kamrene med hætter, så ingen gasstrømmen undslipper til andre kamre ikke er i brug, eller ud af de plethysmografi kamre under protokollen.
- Placer kammeret (s) I en inkubator forud for at sætte dyr i kammeret til at tillade ækvilibrering til 37 ° C, eller legemstemperatur.
2. Kalibrering af Cycle Times for intermitterende Hypoxi
- Undersøg alle slanger, mellem lufttanke og flowmåler, flowmåler og partiskhed flow enhed, og partiskhed flow enhed og plethysmografi kammer (er) for ordentlige forbindelser. Tilslutningerne er sat op som beskrevet i trin 1. Kontrollér forbindelsen ved en trinvis kontrol af alle beskrevne linjer og lukninger: fx kontrol ubrugte linjer ud af bias strømmen enhed og eventuelle kammer åbninger ikke er i brug.
- Tilslut en omgivende O 2 sensor med en håndholdt O 2 meter og derefter vedhæfte sensoren til plethysmografi kammer låg.
- Åbn både gas tanke og vedhæfte et par kirurgiske, lange håndteres hemostats isoleret med plastrør til at klemme off-cycle strøm af gas. På denne måde er kun en gastank ad gangen leverer 1 L / min gas flow pr kammeret. Klemme "baseline" gas mix mens "hypoksisk" gas mix leveres til kammeret, og omvendt.
- Registrere den tid der kræves til kammeret O 2 for at nå målet niveauer på 10% og vende tilbage til 21%. Udnyt de registrerede tider for efterfølgende protokol levering.
3. Administration af akut intermitterende Hypoxi
- Undersøg alle slanger og tilslutninger som beskrevet i trin 2.1.
- Placer nyfødte i plethysmografi kammer (r), og huse de plethysmografi kammer låg ind i kammeret base. Bekræft en ordentlig forsegling til O-ringstætning er samt lukning af ubrugte kammer forbindelser. Disse trin er afgørende for at sikre en passende levering af gas blandinger.
- Placer kamrene holder hvalpene skal behandles i 37 ° C inkubator og luk døren. Tillad kammer at ækvilibrere til 37 ° C før start af protokollen. Oprethold kontroldyr ved 37 ° C i incubateller rumluft iltning.
- Åbn både gas tanke og bruge et par kirurgiske, lange håndteres hemostats isoleret med plastrør til at klemme off-cycle strøm af gas. På denne måde er kun en gastank ad gangen leverer 1 L / min gas flow pr kammeret.
- Brug en håndholdt timer til netop tid cykler og at angive tid til at skifte hemostats mellem rørene, hvilket resulterer i vekslen af gasstrømmen til kamrene.
- Optag afslutningen af hver cyklus ved hjælp af en behandling log som den tilvejebragt i figur 1 for at markere off alle trin i 2-trins, 20 cyklus protokol.
- Overvåg inkubatortemperatur ved hver cyklus ændringer for at sikre dyrene holdes på det udpegede område (33-35 ° C, hvilket er indstillingen på inkubator, der resulterer i 37 ° C).
- Nøje overvåge hvalp aktivitet i hele protokollen for at sikre, at dyr tåle cykler uden synlig lidelse såsom vokaliseringer, ændret niveau aflemmer aktivitet eller rullende.
4. Isolering og Kultur Stem / progenitorceller fra subventrikulære Zone
BEMÆRK: Ændringen i neurosfære dannelse efter AIH sammenlignet med kontroller er et eksempel på et endepunkt, der viser effekten af denne protokol til at fremkalde vævs- og cellulære niveau ændringer.
- For at isolere neurosfærer-dannende celler, fjern mus eller rotteunger fra kammeret umiddelbart efter AIH er afsluttet. Ofre dyr i henhold til IACUC protokoller inden for 30 minutter i protokol opsigelse.
- Høst SVZ'en væv, anbringes i neurosfære kultur og gennemføre standard passage og udvidelse af afledte neurosfærer, som tidligere offentliggjort i metoder kapitler 15,16 og en separat video-protokol 8.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De indledende forsøg, baseret på historiske data, blev udført ved hjælp af 1 min cyklus længder. Baseret på de efterfølgende kalibreringer udført i trin 2 ovenfor, blev det bestemt, at O 2-niveau i kammeret var 13% ved 1 min post-hypoksi skylning og, at det tog en lignende tid til at vende tilbage til 21% baseline. Men en 2 min cyklus var tilstrækkelig til både at opnå 10% ilt og en tilbagevenden til 21% i løbet af "baseline" cyklus. Efterfølgende er 2 min cykluslængder blevet anvendt. Protokollen Varigheden bestod af 20 cykler vekslende mellem baseline og hypoxi (80 min samlede behandlingstid). En 20 cyklus varighed blev valgt på grund af tidligere arbejde, som viser, at en sådan cyklus varighed er tilstrækkelig til at fremkalde ændringer i respiratorisk resultat måler 11. Anvendelse af fremgangsmåden beskrevet oprettet (figur 2), nyfødte udsættes for AIH havde ingen synlige bivirkninger og udviste ikke adfærd tyder på smerte og ubehag under 80min protokol. Konkret blev der ikke synlige apnø observeret, overdrevne lemmer eller hoved bevægelser eller vokaliseringer. Efter AIH, subventrikulære zone-afledte neurale stamceller / progenitor cellepopulationer dyrket som neurosfærer i 14 dage (og også som adhærente monolag populationer, data ikke vist) udviser en næsten to gange stigning i diameter, hvilket viser øget udvidelse inden hver danner kugle (figur 3). Celler, der næste forgyldt i tolerante betingelser (dvs. fravær af mitogene faktorer) giver signifikant flere beta-3-positive celler (en stigning fra <10% til> 45%), hvilket indikerer mere omfattende neuronal differentiering i forhold til celler høstet fra normoxiske behandlede (kontrol) hvalpe (figur 4).
Figur 1. Dette akut IH diagramark bruges til at dokumentere dyr og eksperimentelle detaljer, giver en check liste for før start og efter afslutning af IH-protokollen, og tjene som en tracking-dokument til præcis optælling af alle afsluttede cyklusser.
Figur 2. Intermitterende hypoxi sat op til neonatale gnavere. (A) Incubator at opretholde miljø ved 37 ° C. Plethysmografi kammer er vist inden inkubatoren, og igen med kammeret klem (B). (C) Højre, flowmeter justeret til 1 L / min for hvert kammer. Gasstrømmen ledes via bias strøm enheden splitter enhed (midten) til enhver tilsluttet kammer (venstre, inden inkubator). (D) Hemostat kontrol over baseline (bureaukrati) og hypoxi (gul tape) input linjer. ank "> Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3. Kontrol neurosfærer (A) udviser en mindre diameter end AIH neurosfærer (B). Billeder taget på 10X mål, skala bar = 100 um. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4. Kontrol neurosfærer (A) demonstrerer færre beta-3-tubulin-positive neuroblasts end AIH neurosfærer (B). Billeder taget på 20X mål, skala bar = 50 um.g "target =" _ blank "> Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mouse plethysmography chambers | Buxco | PLY4211 | |
| Flow meter | Porter | F150 | |
| Bias flow unit | AFPS | ||
| Baseline Gas Mix | Airgas | AIZ300 | Compressed Air |
| Hypoxic Gas Mix | Airgas | X03NI72C2000189 | 10% Oxygen, balance nitrogen |
| Oxygen Meter | Teledyne | AX-300 |
References
- Studer, L., et al. Enhanced proliferation, survival, and dopaminergic differentiation of CNS precursors in lowered oxygen. J Neurosci. 20 (19), 7377-7383 (2000).
- Chen, H. L., et al. Oxygen tension regulates survival and fate of mouse central nervous system precursors at multiple levels. Stem Cells. 25 (9), 2291-2301 (2007).
- Ling, L., et al. Chronic intermittent hypoxia elicits serotonin-dependent plasticity in the central neural control of breathing. J Neurosci. 21 (14), 5381-5388 (2001).
- Mitchell, G. S., et al. Invited review: Intermittent hypoxia and respiratory plasticity. J Appl Physiol. 90 (6), 2466-2475 (2001).
- Fuller, D. D., Zabka, A. G., Baker, T. L., Mitchell, G. S. Phrenic long-term facilitation requires 5-HT receptor activation during but not following episodic hypoxia. J Appl Physiol. 90 (5), 2001-2006 (2001).
- Fuller, D. D., Johnson, S. M., Olson, E. B., Mitchell, G. S. Synaptic pathways to phrenic motoneurons are enhanced by chronic intermittent hypoxia after cervical spinal cord injury. J Neurosci. 23 (7), 2993-3000 (2003).
- Baker-Herman, T. L., et al. BDNF is necessary and sufficient for spinal respiratory plasticity following intermittent hypoxia. Nat Neurosci. 7 (1), 48-55 (2004).
- Zhu, L. L., et al. Neurogenesis in the adult rat brain after intermittent hypoxia. Brain Res. 1055, 1-6 (2005).
- Zhang, J. X., Chen, X. Q., Du, J. Z., Chen, Q. M., Zhu, C. Y. Neonatal exposure to intermittent hypoxia enhances mice performance in water maze and 8-arm radial maze tasks. Journal of neurobiology. 65 (1), 72-84 (2005).
- Zhu, L. L., Wu, L. Y., Yew, D. T., Fan, M. Effects of hypoxia on the proliferation and differentiation of NSCs. Mol Neurobiol. 31 (1-3), 231-242 (2005).
- Ross, H. H., et al. In vivo intermittent hypoxia elicits enhanced expansion and neuronal differentiation in cultured neural progenitors. Exp Neurol. 235 (1), 238-245 (2012).
- Fuller, D. D., et al. Induced recovery of hypoxic phrenic responses in adult rats exposed to hyperoxia for the first month of life. J Physiol. 536 (Pt 3), 917-926 (2001).
- Fuller, D. D., Fregosi, R. F. Fatiguing contractions of tongue protrudor and retractor muscles: influence of systemic hypoxia. J Appl Physiol. 88 (6), 2123-2130 (2000).
- Baker, T. L., Fuller, D. D., Zabka, A. G., Mitchell, G. S. Respiratory plasticity: differential actions of continuous and episodic hypoxia and hypercapnia. Respir Physiol. 129 (1-2), 25-35 (2001).
- Marshall, G. P. 2nd, et al. Production of neurospheres from CNS tissue. Methods Mol Biol. 438, 135-150 (2008).
- Azari, H., Rahman, M., Sharififar, S., Reynolds, B. A. Isolation and expansion of the adult mouse neural stem cells using the neurosphere assay. J Vis Exp. (45), (2010).
