Summary
Dit artikel beschrijft de methode voor het toedienen van een korte periode van intermitterende hypoxie tot postnatale dag 1-8 muis of rat pups. Deze aanpak effectief ontlokt een robuust weefsel niveau "priming effect" op gekweekte neurale stamcellen die binnen 30 minuten van de blootstelling hypoxie worden geoogst.
Introduction
Het doel van deze methode is reproduceerbaar en effectief op intermitterende aanvallen van systemische verlaagd ambient zuurstof neonatale knaagdieren. De reden voor het gebruik van intermitterende hypoxie (IH) tot stamcelbiologie manipuleren is afkomstig van in vitro celkweek experimenten waarbij O 2 -gehalte van de groei media is veranderd. Specifiek in vergelijking met "standaard" condities van 20% O 2, verlengde kweek van stam / voorlopercellen cel populaties cellen in 3% O 2 leidt tot verhoogde proliferatie, apoptose verlaagde en verhoogde neuronale opbrengst 1,2.
Deze groep heeft veel ervaring met de toediening van systemische IH, en heeft uitgebreide studies over de rol van IH uitgevoerd in de luchtwegen plasticiteit 3-7. Dit werk, en de recente bevinding dat chronische IH verhoogde neurogenese in het knaagdier CNS 10/08, vormt de basis voor de exploratie van acute in vivohypoxie als preconditionering stimulus (bijv. vóór weefsel oogsten) op de daaropvolgende kweek van neurale stam / voorlopercellen (NPC) 11. Opmerkelijk, wanneer de muis pups werden blootgesteld aan een korte (<1 uur) periode van acute intermitterende hypoxie (AIH), cellen die uit de subventriculaire zone (SVZ) werden geoogst waren aanzienlijk verhoogde capaciteit voor expansie neurospheres of hechtende monolaag cellen. De AIH protocol werd ook geassocieerd met verhoogde expressie van een "neuronale lot" transcriptiefactor (Pax6).
Dienovereenkomstig, in vivo AIH protocollen kan een middel tot "prime" NPC's voorafgaand aan de cultuur. Zo kan toepassingen hiervan zijn de groeiende celpopulaties vóór transplantatie in de gewonden centrale zenuwstelsel of simpelweg verhogen van de neuronale differentiatie van gekweekte cellen vóór in vitro experimenten. Verder, omdat een systemische afgifte, welkeorgaan, weefsel of cel een kandidaat voor soortgelijke studie. Daarom is het protocol zoals geschreven is potentieel van toepassing is op een breed scala van studies over intermitterende zuurstof manipulatie in kleine zoogdieren.
Er zijn bepaalde voordelen aan deze aanpak. In andere gepubliceerde werk, werden pasgeborenen behandeld als een nestje met de dam in hypobaric kamers, die vóór het mogelijk maakt voor chronische toediening, minder handling op de behandeling, en onderhouden van de moeder contact tijdens de behandeling 9. De huidige benadering omzeilt herhaalde behandelingen voedingsbodem vrouwelijke, of het gebruik van een andere dam voor elk experiment. Dit protocol maakt het ook onderzoek naar precieze-nest op elkaar afgestemd en leeftijd gematchte pasgeborenen. Representatieve gegevens tonen een andere belangrijke kracht van dit protocol, namelijk de snelheid waarmee AIH, zoals geleverd, lokt een krachtige en consistente biologische respons in neurale stamcellen biologie. Dit wordt een precedent voor dit protocol om weefsel- en cellulaire niveau Biologisch wekkensche veranderingen die celbiologie veranderen.
Dit verslag zal de gedetailleerde procedures voor het belichten knaagdieren pups AIH evenals de populatie analyse van SVZ cellen gekweekt als neurospheres schetsen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
LET OP: Alle dierlijke procedures in dit protocol worden uitgevoerd met toestemming van de Universiteit van Florida Institutional Animal Care en gebruik Comite (IACUC) en zijn in overeenstemming met de "Gids voor de Zorg en gebruik van proefdieren.
1. Basic Experimentele ingesteld voordat intermitterende hypoxie Administration
- Expose pups 12 de verschillende gasmengsels met een hele lichaam muis plethysmograaf kamers op vrijwel dezelfde manier als volwassen knaagdieren voor andere experimentele doeleinden 5,13,14. De kamers hebben een 4 inch diameter (volume = 450 ml), dat van voldoende grootte om 4/3 of 2/1 muis pups rat pups tegemoet. Hier worden AIH protocollen geleverd aan pasgeborenen postnatale dag 1-8 (P1-P8) jaar.
- Perslucht gastanks op de 21% "basislijn" gas, welke kamer zuurstofvoorziening handhaaft op 21% te leveren. Om "relatieve hypoxie" te bereiken, gebruik dan een 10% zuurstof / 90% stikstof gastank.
NIETE: Plastic buizen (diameter 3/16 ") verbindt de gastanks een stroommeter. Dus de ingang met de stroommeter bestaat uit een buis voor elke basislijn en hypoxie luchtstroom. - Configureren van het gas buis als volgt.
- Run plastic buis (diameter 1/8 ") vanaf de debietmeter een voorspanning debietregelaar, waarbij stromen van 1 l / min mogelijk maakt elke kamer (dat wil zeggen, 4 l / min of 4 kamers worden gebruikt).
- Run plastic buis (diameter 1/8 ") vanaf de voorspanning stroomregelaar om de plethysmografie kamers. Luchtstroom bij 1 l / min voor elke kamer een voorafbepaald debiet waarmee gasuitwisseling wordt geacht niet-stressinducerende de dieren op basis van fysiologische en gedragsmatige observaties.
- Dicht alle ongebruikte verbindingen naar en van de bias stroom apparaat en alle ongebruikte openingen naar de kamers met kappen zodat geen gasstroom ontsnapt naar andere kamers niet gebruikt of uit de plethysmografie kamers tijdens het protocol.
- Plaats de kamer (s) In een incubator voorafgaand aan invoering dieren in de kamer te equilibreren tot 37 ° C of lichaamstemperatuur toestaan.
2. Kalibratie van Cycle Times voor intermitterende hypoxie
- Inspecteer alle slangen, tussen luchtketels en stroommeter, debietmeter en vooringenomenheid stroom unit, en vooringenomenheid stroom unit en plethysmografie kamer (s) voor de juiste verbindingen. De verbindingen worden opgezet zoals beschreven in stap 1. Controleer de aansluiting door een stapsgewijze controle van alle beschreven lijnen en sluitingen: bijvoorbeeld het controleren ongebruikte lijnen van de bias stroom unit en iedere kamer openingen niet in gebruik.
- Sluit een ambient O 2 sensor met een hand-held O 2 meter en de sensor op de plethysmografie kamer deksel bevestigen.
- Open beide gastanks en maak een paar van chirurgische, lange steel hemostats geïsoleerd met plastic slang aan op de off-cyclus gasstroom te klemmen. Op deze manier wordt slechts een gastank tegelijk leveren van de 1 L / min gasstroom per kamer. Klem de "basislijn" gasmengsel terwijl de "hypoxie" gasmengsel wordt geleverd aan de kamer, en vice versa.
- Noteer de tijd die de kamer O 2 de streefwaarden van 10% te bereiken en terug te keren naar 21%. Gebruik maken van de vastgelegde tijden voor volgende protocol levering.
3. Toediening van acute intermitterende hypoxie
- Controleer alle slangen en verbindingen zoals beschreven in stap 2.1.
- Plaats pasgeborenen in de plethysmografie kamer (s) en het huis van de plethysmografie kamer deksels in de kamer basis. Bevestigen van een goede afdichting met de O-ring afdichting en sluiting van ongebruikte ruimte verbindingen. Deze stappen zijn van cruciaal belang voor het waarborgen van de juiste levering van gas mixen.
- Plaats de kamers die de pups te behandelen in de 37 ° C incubator en sluit de deur. Laat kamer equilibreren tot 37 ° C voor het begin van het protocol. Handhaaf controledieren bij 37 ° C in de incubatof bij kamertemperatuur lucht zuurstof.
- Open beide gastanks en gebruik een paar van chirurgische, lange steel hemostats geïsoleerd met plastic slang aan op de off-cyclus gasstroom te klemmen. Op deze manier wordt slechts een gastank tegelijk leveren van de 1 L / min gasstroom per kamer.
- Gebruik een handbediende timer nauwkeurig tijd cycli en de tijd om de hemostaten tussen buizen schakelen geven, hetgeen resulteert in de wisseling van de gasstroom naar de kamers.
- Noteer de voltooiing van elke cyclus een behandeling log zoals die verschaft in Figuur 1 af te bakenen alle stappen in 2 stappen, 20 cyclus protocol.
- Controleer de incubator temperatuur elke cyclus wijziging waarborgen dieren worden gehandhaafd op het ingestelde bereik (33-35 ° C, dat is de instelling van de incubator die resulteert in 37 ° C).
- Nauwlettend toezien pup activiteit gedurende het protocol om ervoor te zorgen dat dieren tolereren cycli zonder zichtbare nood zoals stemgebruik, veranderde niveau vanledematen activiteit of rollen.
4. Isolatie en Cultuur van de stam / voorlopercellen uit de subventriculaire zone
Opmerking: De verandering in neurosphere formatie volgende AIH vergelijking met controles is een voorbeeld van een eindpunt dat toont de werkzaamheid van dit protocol voor weefsel- en cellulaire niveau veranderingen opwekken.
- Om neurospheres vormende cellen te isoleren, te verwijderen muis of rat pups uit de kamer direct na AIH is voltooid. Offeren de dieren volgens IACUC protocollen binnen 30 minuten van het protocol beëindiging.
- Oogst de SVZ weefsel, te plaatsen in neurosphere cultuur en gedrag standaard passage en uitbreiding van afgeleide neurosferen, zoals eerder gepubliceerd in methoden hoofdstukken 15,16 en een aparte video-protocol 8.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De eerste experimenten, gebaseerd op historische gegevens, werden uitgevoerd met 1 min cycluslengten. Op basis van de volgende kalibreringen in stap 2 hierboven werd vastgesteld dat het O-niveau 2 in de kamer was 13% na 1 min na hypoxie spoelen en dat het duurde ongeveer gelijktijdig terugkeren naar de basislijn 21%. Echter, een 2 minuten cyclus was voldoende om zowel te bereiken 10% zuurstof en terugkeer naar 21% in de "basislijn" cyclus. Vervolgens werden 2 min cycluslengtes gebruikt. De duur protocol bestond uit 20 cycli afwisselend tussen de baseline en hypoxie (80 min de totale behandeling tijd). Een 20 cyclusduur werd gekozen vanwege eerdere werk te tonen dat een dergelijke duur van de cyclus is voldoende om te lokken veranderingen in respiratoire uitkomst meet 11. De beschreven opstelling (figuur 2), neonaten onderworpen aan AIH hadden geen duidelijke bijwerkingen en niet suggestief gedrag van pijn en ongemak vertonen tijdens de 80min protocol. Specifiek, werd geen zichtbare apneu waargenomen, overmatig ledematen of het hoofd bewegingen of geluiden. Na AIH, subventriculaire zone afgeleide neurale stamcellen / voorlopercellen cel populaties gekweekt als neurospheres gedurende 14 dagen (en tevens als hechtende monolaag populaties, gegevens niet getoond) vertonen een bijna tweevoudige toename in diameter, tonen toegenomen uitzetting binnen elk vormende gebied (Fig 3). Cellen die vervolgens uitgeplaat in permissie-omstandigheden (dat wil zeggen, afwezigheid van mitogene factoren) werd verkregen significant meer beta-3-positieve cellen (een toename van <10% tot> 45%) die verder neuronale differentiatie geeft in vergelijking met cellen geoogst normoxische behandelde (controle) pups (Figuur 4).
Figuur 1. Deze acute IH fiche wordt gebruikt om dieren te documenteren en experimentele gegevens, zorgen voor een checklist voor voordat u begint en na afloop van de IH-protocol, en dienen als een tracking-document voor een nauwkeurige telling van alle voltooide cycli.
Figuur 2. intermitterende hypoxie opgezet voor neonatale knaagdieren. (A) Incubator voor het milieu te handhaven op 37 ° C. Plethysmografie kamer wordt getoond binnen de incubator en opnieuw met de kamer deur op een kier (B). (C) Rechts, stroommeter aangepast tot 1 l / min voor elke kamer. Gasstroom wordt via de bias stroom unit splitter unit (midden) om de aangesloten kamer (links, binnen incubator). (D) Hemostat controle van de basislijn (rode band) en hypoxie (gele tape) ingang lijnen. ank "> Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3. Controle neurospheres (A) tonen een kleinere diameter dan AIH neurospheres (B). Foto genomen op 10x objectief, schaal bar = 100 micrometer. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4. Controle neurospheres (A) tonen minder beta-3-tubuline-positieve neuroblasts dan AIH neurospheres (B). Foto genomen op 20X objectief, schaal bar = 50 pm.g "target =" _ blank "> Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mouse plethysmography chambers | Buxco | PLY4211 | |
| Flow meter | Porter | F150 | |
| Bias flow unit | AFPS | ||
| Baseline Gas Mix | Airgas | AIZ300 | Compressed Air |
| Hypoxic Gas Mix | Airgas | X03NI72C2000189 | 10% Oxygen, balance nitrogen |
| Oxygen Meter | Teledyne | AX-300 |
References
- Studer, L., et al. Enhanced proliferation, survival, and dopaminergic differentiation of CNS precursors in lowered oxygen. J Neurosci. 20 (19), 7377-7383 (2000).
- Chen, H. L., et al. Oxygen tension regulates survival and fate of mouse central nervous system precursors at multiple levels. Stem Cells. 25 (9), 2291-2301 (2007).
- Ling, L., et al. Chronic intermittent hypoxia elicits serotonin-dependent plasticity in the central neural control of breathing. J Neurosci. 21 (14), 5381-5388 (2001).
- Mitchell, G. S., et al. Invited review: Intermittent hypoxia and respiratory plasticity. J Appl Physiol. 90 (6), 2466-2475 (2001).
- Fuller, D. D., Zabka, A. G., Baker, T. L., Mitchell, G. S. Phrenic long-term facilitation requires 5-HT receptor activation during but not following episodic hypoxia. J Appl Physiol. 90 (5), 2001-2006 (2001).
- Fuller, D. D., Johnson, S. M., Olson, E. B., Mitchell, G. S. Synaptic pathways to phrenic motoneurons are enhanced by chronic intermittent hypoxia after cervical spinal cord injury. J Neurosci. 23 (7), 2993-3000 (2003).
- Baker-Herman, T. L., et al. BDNF is necessary and sufficient for spinal respiratory plasticity following intermittent hypoxia. Nat Neurosci. 7 (1), 48-55 (2004).
- Zhu, L. L., et al. Neurogenesis in the adult rat brain after intermittent hypoxia. Brain Res. 1055, 1-6 (2005).
- Zhang, J. X., Chen, X. Q., Du, J. Z., Chen, Q. M., Zhu, C. Y. Neonatal exposure to intermittent hypoxia enhances mice performance in water maze and 8-arm radial maze tasks. Journal of neurobiology. 65 (1), 72-84 (2005).
- Zhu, L. L., Wu, L. Y., Yew, D. T., Fan, M. Effects of hypoxia on the proliferation and differentiation of NSCs. Mol Neurobiol. 31 (1-3), 231-242 (2005).
- Ross, H. H., et al. In vivo intermittent hypoxia elicits enhanced expansion and neuronal differentiation in cultured neural progenitors. Exp Neurol. 235 (1), 238-245 (2012).
- Fuller, D. D., et al. Induced recovery of hypoxic phrenic responses in adult rats exposed to hyperoxia for the first month of life. J Physiol. 536 (Pt 3), 917-926 (2001).
- Fuller, D. D., Fregosi, R. F. Fatiguing contractions of tongue protrudor and retractor muscles: influence of systemic hypoxia. J Appl Physiol. 88 (6), 2123-2130 (2000).
- Baker, T. L., Fuller, D. D., Zabka, A. G., Mitchell, G. S. Respiratory plasticity: differential actions of continuous and episodic hypoxia and hypercapnia. Respir Physiol. 129 (1-2), 25-35 (2001).
- Marshall, G. P. 2nd, et al. Production of neurospheres from CNS tissue. Methods Mol Biol. 438, 135-150 (2008).
- Azari, H., Rahman, M., Sharififar, S., Reynolds, B. A. Isolation and expansion of the adult mouse neural stem cells using the neurosphere assay. J Vis Exp. (45), (2010).
