Summary
מאמר זה מתאר את המתודולוגיה לניהול תקופות קצרות של היפוקסיה לסירוגין לגורי עכבר או עכברוש לאחר לידה היום 1-8. גישה זו ביעילות מעוררת רמה חזקה רקמה "תחול השפעה" על תאים עצביים בתרבית שנקצרים בתוך 30 דקות של חשיפת היפוקסיה.
Introduction
מטרתה של שיטה זו היא reproducibly וביעילות כדי לספק התקפים לסירוגין של חמצן סביבה הורידה מערכתי למכרסמים בילוד. הרציונל לשימוש בהיפוקסיה לסירוגין (IH) כדי לתפעל ביולוגיה של תא גזע מקורו בניסויים בתרביות תאים במבחנה שבי O 2 תוכן של תקשורת הצמיחה משתנה. באופן ספציפי, בהשוואה לתנאים "רגילים" של 20% O 2, תרבות המורחבת של תאי אוכלוסיות תאי גזע / אב ב2 תוצאות O 3% בהתפשטות מוגברת, ירידה באפופטוזיס וגדל 1,2 תשואה עצבי.
קבוצה זו יש לו ניסיון משמעותי עם הממשל של IH המערכתי, ובצעה מחקרים מקיפים על עצם את התפקיד של IH בפלסטיות הנשימה 3-7. עבודה זו, והממצא האחרון שIH הכרוני מוגבר neurogenesis במכרסמים במערכת העצבים המרכזית 8-10, מהווים את הבסיס לחקירה של חריף in vivoהיפוקסיה כגירוי נפשית מראש (כלומר., לפני קציר רקמות) על התרבות הבאה של תאי גזע עצביים / אב (NPCs) 11. למרבה הפלא, כאשר גורי עכבר נחשפו לתקופה (<1 שעה) של היפוקסיה לסירוגין חריפה (AIH) קצרה, תאים שנקצרו מאזור subventricular (SVZ) שגדלו באופן משמעותי את היכולת להרחבה כneurospheres או תאי monolayer חסיד. פרוטוקול AIH היה קשור גם עם ביטוי מוגבר של גורם "גורל עצבי" שעתוק (Pax6).
בהתאם לכך, בvivo פרוטוקולי AIH עשויים לספק אמצעים לNPCs לפני "ראש" התרבות. לדוגמא, יישומים לגישה זו יכולים לכלול הרחבת אוכלוסיות תאים לפני ההשתלה לתוך מערכת העצבים המרכזית נפצעה, או פשוט להגדיל את הבידול העצבי של תאים בתרבית לפני ניסויים במבחנה. יתר על כן, בגלל זה הוא משלוח מערכתי, כלאיבר, רקמה או תא הוא מועמד למחקר דומה. לכן, כפי שנכתב בפרוטוקול הוא פוטנציאל ישים למגוון רחב של מחקרים על מניפולציה חמצן לסירוגין ביונקים קטנים.
ישנם יתרונות מסוימים לגישה זו. בעבודה שפורסמה אחרת, טופלו ילודים כהמלטה עם הסכר בתאי hypobaric, המאפשר למינון כרוני, פחות טיפול לפני הטיפול, ושמרו על קשר אימהי במהלך טיפול 9. הגישה הנוכחית עוקפת טיפולים חוזרים ונשנים לנקבת רבייה, או שימוש בסכר שונה עבור כל ניסוי. פרוטוקול זה גם מאפשר מחקר של ילודים בהתאמה המלטה וגיל בהתאמה מדויקים. נציגי נתונים להפגין את כוח עיקרי נוסף של פרוטוקול זה, כלומר המהירות שבה AIH, כפי שנמסר, מעורר תגובה ביולוגית חזקה ועקבית בביולוגיה של תא גזע עצבי. זה קובע תקדים לפרוטוקול זה כדי לעורר Biologi הדקיק וברמה-הסלולריתשינויי קאל שמשנים ביולוגיה של תא.
דו"ח זה מתאר את הנהלים מפורטים המשמשים לחשיפת גורי מכרסמים לAIH כמו גם ניתוח האוכלוסייה של תאי SVZ גדל כמו neurospheres.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
הערה: כל נהלי בעלי החיים בפרוטוקול זה מתבצע באישור אוניברסיטת פלורידה המוסדי הטיפול בבעלי חי ועדת שימוש (IACUC) ועומדת ב'המדריך לטיפול והשימוש בחי מעבדה ".
1. יסוד הניסיון להגדיר לפני המינהל לסירוגין היפוקסיה
- לחשוף גורים 12 לתערובות גז השונות באמצעות תאי plethysmograph עכבר כל גוף באותה הצורה כמו מכרסמים מבוגרים למטרות ניסיוניות אחרות 5,13,14. יש התאים בקוטר 4 אינץ '(נפח = 450 מיליליטר), אשר הוא בגודל מספיק כדי להכיל 3-4 גורי עכבר או 1-2 גורי חולדה. הנה, פרוטוקולי AIH מועברים לילודים בגילים 1-8 יום הלידה (P1-P8).
- השתמש במכלי גז באוויר דחוס כדי לספק 21% גז "בסיס", ששומר על תא חמצון על 21%. כדי להשיג "היפוקסיה יחסית", להשתמש ב/ 90% טנק 10% חמצן גז חנקן.
לאE: צינורות פלסטיק (קוטר 3/16 ") מחברת את מיכלי גז לזרימת מטר. לפיכך, קלט מד הזרימה מורכב מצינור אחד לכל בסיס וזרימת אוויר היפוקסיה. - הגדר את צינורות הגז כדלקמן.
- הפעל צינורות פלסטיק (קוטר 1/8 ") ממד הזרימה לזרימת הטיה רגולטור, המאפשר תזרים של 1 ליטר / דקה לכל תא (כלומר, 4 L / min אם 4 תאים משמשים).
- הפעל צינורות פלסטיק (קוטר 1/8 ") מזרימת ההטיה הרגולטור לתאי plethysmography. זרימת אוויר בL 1 / דקה לכל תא הוא קצב זרימה קבוע מראש שבחילוף גזים נחשב להיות לבעלי החיים המבוססים על תצפיות פיסיולוגיות והתנהגותיות שאינו-גרימת לחץ.
- לאטום את כל חיבורים שאינם בשימוש ומן זרימת ההטיה היחידה וכל פתחים שאינם בשימוש לתאי עם כובעים כדי שלא זרימת גז בורחת לתאי אחרים שאינו בשימוש, או מחוץ לתאי plethysmography במהלך הפרוטוקול.
- מניחים את החדר (ים) לחממה לפני לשים בעלי חיים בתא כדי לאפשר איזון עד 37 מעלות צלזיוס, או טמפרטורת גוף.
2. כיול של המחזור טיימס ללסירוגין היפוקסיה
- בדוק את כל צינורות, בין מיכלי אוויר ומד זרימה, זרימת יחידת מטר וזרימת ההטיה יחידה, וזרימת הטיה וקאמרית plethysmography (ים) לחיבורים נכונים. החיבורים מוגדרים כמתואר בשלב 1. בדוק את החיבור על ידי בדיקת צעד חכם של כל הקווים והסגרים תיארו: למשל, בדיקת קווים שאינם בשימוש מחוץ לזרם ההטיה היחידה וכל פתחי תא אינו בשימוש.
- חבר חיישן O 2 סביבה עם מד O 2 שנערך ביד ולאחר מכן לצרף את החיישן למכסה תא plethysmography.
- לפתוח את שני מיכלי הגז ולצרף זוג אחד של hemostats כירורגית, ידית ארוכה מבודד עם צינורות פלסטיק כדי לצבוט את הזרימה מחוץ למעגל הגז. בדרך זו, מיכל הדלק רק אחד בכל פעם הוא מספק L 1 / זרימת גז דקות לקאמרית. הצמד את התערובת "קו הבסיס" גז תוך שילוב "חוסר חמצן" הגז מועבר לתא, ולהיפך.
- רשום את הזמן הנדרש לתא O 2 כדי להגיע לרמות היעד של 10% ולחזור ל -21%. לנצל את הזמנים שנרשמו למסירת פרוטוקול שלאחר מכן.
3. מינהל אקוטי לסירוגין היפוקסיה
- בדוק את כל צינורות וחיבורים כמתואר בשלב 2.1.
- הנח ילודים בתא plethysmography (ים) ולשכן את המכסים קאמריים plethysmography לבסיס קאמרי. לאשר חותם ראוי לחותם O-הטבעת היא כמו גם סגירת כל חיבורי תא שאינו בשימוש. צעדים אלה הם קריטיים על מנת להבטיח ההספקה המתאימה של תערובות גז.
- מניחים את התאים מחזיקים את הגורים שיתייחסו אל 37 ° C החממה וסגור את הדלת. לאפשר קאמרי לאזן ל -37 מעלות צלזיוס לפני תחילת הפרוטוקול. לשמור על חיות שליטה על 37 מעלות צלזיוס בincubatאו בחמצון אוויר חדר.
- לפתוח את שני מיכלי הגז ולהשתמש בזוג אחד של hemostats כירורגית, ידית ארוכה מבודד עם צינורות פלסטיק כדי לצבוט את הזרימה מחוץ למעגל הגז. בדרך זו, מיכל הדלק רק אחד בכל פעם הוא מספק L 1 / זרימת גז דקות לתא.
- השתמש בטיימר כף יד למחזורים בדיוק זמן וכדי לציין את הזמן לעבור hemostats בין צינורות, ובכך וכתוצאה מכך לסירוגין של זרימת גז לתאי.
- רשום את השלמת כל מחזור באמצעות יומן טיפול כמו זה הניתן באיור 1 כדי לסמן את כל השלבים ב2-הצעד, 20 פרוטוקול המחזור.
- לנטר את הטמפרטורה בחממה בכל שינוי מחזור כדי להבטיח בעלי חיים נשמרים בטווח המיועד (33-35 מעלות צלזיוס, המהווה את ההגדרה בחממה שגורמת 37 מעלות צלזיוס).
- מקרוב לעקוב אחר פעילות גור בכל הפרוטוקול, כדי להבטיח שבעלי חיים סובלים מחזורים ללא מצוקה גלויה כגון קולות, רמת שינה שלפעילות איבר או מתגלגל.
4. בידוד ותרבות של גזע / תאי אב מאזור Subventricular
הערה: השינוי במבנה neurosphere הבא AIH השוואה לקבוצת ביקורת היא דוגמא לנקודת סיום שמדגים את היעילות של פרוטוקול זה כדי לעורר שינויים דקיקים וברמה-תאית.
- כדי לבודד neurospheres להרכיב תאים, להסיר גורי עכבר או עכברוש מהתא מייד לאחר AIH הושלם. להקריב בעלי החיים על פי פרוטוקולי IACUC בתוך 30 דקות של סיום פרוטוקול.
- לקצור את רקמת SVZ, מקום לתרבות neurosphere ולנהל מעבר והרחבת neurospheres הנגזר סטנדרטיים, כפי שפורסם בעבר בפרקי 15,16 ושיטות פרוטוקול וידאו נפרד 8.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
הניסויים הראשוניים, המבוססים על נתונים היסטוריים, נערכו באמצעות אורכי מחזור 1 דקות. בהתבסס על הכיולים הבאים מבוצעים בשלב 2 לעיל, נקבע כי O 2 הרמה בתא הייתה 13% בשטיפה לאחר היפוקסיה 1 דקות ו, שזה לקח זמן דומה כדי לחזור לנקודת ההתחלה של 21%. עם זאת, מחזור 2 דקות היה מספיק לשני חמצן ותמורה ל -21% במחזור "הבסיס" להשיג 10%. בהמשך לכך, באורכי מחזור 2 דקות היו בשימוש. משך הפרוטוקול כלל 20 מחזורים לסירוגין בין תחילת המחקר והיפוקסיה (זמן טיפול הכולל של 80 דקות). משך 20 מחזור נבחר בשל העבודה קודמת שהראתה כי משך מחזור כזה הוא מספיק כדי לעורר שינויים בתוצאת נשימה מודד 11. שימוש בתאר להגדיר (איור 2), ילודים נתון AIH לא היו תופעות לוואי נראות לעין ולא הציגו התנהגויות המרמזות על כאב ואי נוחות במהלך 80פרוטוקול דקות. באופן ספציפי, אין דום נשימה גלויה נצפתה, תנועות מוגזמות איבר או ראש, או קולות. בעקבות AIH, אוכלוסיות subventricular נגזר אזור גזע עצביים / אב תאים בתרבית כneurospheres במשך 14 ימים (ואוכלוסיות monolayer גם חסיד כ, מידע לא מוצג) להפגין גידול כמעט כפול בקוטר, מדגימה הרחבה גדלה בתוך כל תחום יצירה (איור 3). תאים שהם מצופים הבאים בתנאי יתר (כלומר, היעדר גורמי mitogenic) יניבו יותר באופן משמעותי בתאי ביתא-3-חיובי (עלייה מ <10% ל> 45%) המצביע על בידול עצבי נרחב יותר בהשוואה לתאים שנקטפו מן normoxic גורי מטופלים (שליטה) (איור 4).
איור 1. גיליון שיא זה חריף IH משמש לתעד בעלי חיים ופרטים ניסיוניים, לספק רשימת המחאה על לפני שמתחיל ולאחר השלמת פרוטוקול IH, וישמשו כמסמך מעקב למניין מדויק של כל המחזורים הושלמו.
2. היפוקסיה לסירוגין איור להגדיר מכרסמים בילוד. חממה () כדי לשמור על סביבה על 37 מעלות צלזיוס. תא Plethysmography מוצג בתוך החממה, ושוב עם את דלת התא פתוח (B). (ג) ימין, מד הזרימה המותאם לL 1 / דקה לכל תא. זרימת גז מופנה באמצעות יחידת זרימת ההטיה מפצל יחידה (במרכז) לכל תא מחובר (משמאל, בתוך חממה). (ד) שליטת hemostat של בסיס (בירוקרטיה) וקווי קלט היפוקסיה (סרט צהוב). ANK "> לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
3. neurospheres איור הבקרה () להפגין בקוטר קטן יותר מAIH neurospheres (B). תמונות שצולמו ב10X אובייקטיבי, סרגל קנה מידה = 100 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
4. neurospheres איור הבקרה () להפגין neuroblasts פחות בטא-3-טובולין-חיובי מאשר neurospheres AIH (B). תמונות שצולמו ב20X אובייקטיבי, סרגל קנה מידה = 50 מיקרומטר.ז "target =" _ blank "> לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mouse plethysmography chambers | Buxco | PLY4211 | |
| Flow meter | Porter | F150 | |
| Bias flow unit | AFPS | ||
| Baseline Gas Mix | Airgas | AIZ300 | Compressed Air |
| Hypoxic Gas Mix | Airgas | X03NI72C2000189 | 10% Oxygen, balance nitrogen |
| Oxygen Meter | Teledyne | AX-300 |
References
- Studer, L., et al. Enhanced proliferation, survival, and dopaminergic differentiation of CNS precursors in lowered oxygen. J Neurosci. 20 (19), 7377-7383 (2000).
- Chen, H. L., et al. Oxygen tension regulates survival and fate of mouse central nervous system precursors at multiple levels. Stem Cells. 25 (9), 2291-2301 (2007).
- Ling, L., et al. Chronic intermittent hypoxia elicits serotonin-dependent plasticity in the central neural control of breathing. J Neurosci. 21 (14), 5381-5388 (2001).
- Mitchell, G. S., et al. Invited review: Intermittent hypoxia and respiratory plasticity. J Appl Physiol. 90 (6), 2466-2475 (2001).
- Fuller, D. D., Zabka, A. G., Baker, T. L., Mitchell, G. S. Phrenic long-term facilitation requires 5-HT receptor activation during but not following episodic hypoxia. J Appl Physiol. 90 (5), 2001-2006 (2001).
- Fuller, D. D., Johnson, S. M., Olson, E. B., Mitchell, G. S. Synaptic pathways to phrenic motoneurons are enhanced by chronic intermittent hypoxia after cervical spinal cord injury. J Neurosci. 23 (7), 2993-3000 (2003).
- Baker-Herman, T. L., et al. BDNF is necessary and sufficient for spinal respiratory plasticity following intermittent hypoxia. Nat Neurosci. 7 (1), 48-55 (2004).
- Zhu, L. L., et al. Neurogenesis in the adult rat brain after intermittent hypoxia. Brain Res. 1055, 1-6 (2005).
- Zhang, J. X., Chen, X. Q., Du, J. Z., Chen, Q. M., Zhu, C. Y. Neonatal exposure to intermittent hypoxia enhances mice performance in water maze and 8-arm radial maze tasks. Journal of neurobiology. 65 (1), 72-84 (2005).
- Zhu, L. L., Wu, L. Y., Yew, D. T., Fan, M. Effects of hypoxia on the proliferation and differentiation of NSCs. Mol Neurobiol. 31 (1-3), 231-242 (2005).
- Ross, H. H., et al. In vivo intermittent hypoxia elicits enhanced expansion and neuronal differentiation in cultured neural progenitors. Exp Neurol. 235 (1), 238-245 (2012).
- Fuller, D. D., et al. Induced recovery of hypoxic phrenic responses in adult rats exposed to hyperoxia for the first month of life. J Physiol. 536 (Pt 3), 917-926 (2001).
- Fuller, D. D., Fregosi, R. F. Fatiguing contractions of tongue protrudor and retractor muscles: influence of systemic hypoxia. J Appl Physiol. 88 (6), 2123-2130 (2000).
- Baker, T. L., Fuller, D. D., Zabka, A. G., Mitchell, G. S. Respiratory plasticity: differential actions of continuous and episodic hypoxia and hypercapnia. Respir Physiol. 129 (1-2), 25-35 (2001).
- Marshall, G. P. 2nd, et al. Production of neurospheres from CNS tissue. Methods Mol Biol. 438, 135-150 (2008).
- Azari, H., Rahman, M., Sharififar, S., Reynolds, B. A. Isolation and expansion of the adult mouse neural stem cells using the neurosphere assay. J Vis Exp. (45), (2010).
