Summary
यह लेख प्रसव के बाद दिन 1-8 माउस या चूहा पिल्ले को रुक-रुक कर हाइपोक्सिया का संक्षिप्त अवधि के प्रशासन के लिए कार्यप्रणाली का वर्णन है। इस दृष्टिकोण को प्रभावी ढंग से हाइपोक्सिया जोखिम के 30 मिनट के भीतर काटा जाता है कि सुसंस्कृत तंत्रिका पूर्वज कोशिकाओं पर एक मजबूत ऊतक स्तर "प्रभाव भड़काना" elicits।
Introduction
इस पद्धति का लक्ष्य reproducibly और प्रभावी ढंग से नवजात कृन्तकों के लिए प्रणालीगत उतारा परिवेश ऑक्सीजन की रुक-रुक कर मुकाबलों देने के लिए है। स्टेम कोशिका जीव विज्ञान में हेरफेर करने के लिए रुक-रुक कर हाइपोक्सिया (आईएच) का उपयोग करने के लिए तर्क विकास मीडिया के ओ 2 सामग्री को बदल दिया है जो इन विट्रो सेल संस्कृति प्रयोगों में से निकलती है। 20% की 'मानक' की स्थिति हे 2, बढ़ प्रसार में 3% 2 हे परिणामों में स्टेम / पूर्वज सेल आबादी कोशिकाओं की विस्तारित संस्कृति की तुलना में जब विशेष रूप से, एपोप्टोसिस की कमी हुई और न्यूरोनल उपज 1,2 वृद्धि हुई है।
इस समूह में प्रणालीगत आईएच के प्रशासन के साथ महत्वपूर्ण अनुभव है, और सांस की प्लास्टिसिटी 3-7 में आईएच की भूमिका पर व्यापक अध्ययन का आयोजन किया गया। इस काम है, और पुरानी आईएच कृंतक सीएनएस 8-10 में न्यूरोजेनेसिस वृद्धि हुई है कि हाल ही में एक खोज, विवो में तीव्र के अन्वेषण के लिए आधार बनाता हैएक शर्त प्रोत्साहन के रूप में हाइपोक्सिया (यानी।, ऊतक फसल से पूर्व) तंत्रिका स्टेम / पूर्वपुस्र्ष कोशिकाओं (NPCs) 11 के बाद के संस्कृति पर। माउस पिल्ले तीव्र रुक-रुक कर हाइपोक्सिया (AIH) का एक संक्षिप्त (<1 घंटा) की अवधि के लिए खुल गए थे जब उल्लेखनीय है, subventricular क्षेत्र (SVZ) से काटा गया है कि कोशिकाओं को काफी neurospheres या पक्षपाती monolayer कोशिकाओं के रूप में विस्तार के लिए क्षमता में वृद्धि हुई थी। AIH प्रोटोकॉल भी एक "न्यूरोनल भाग्य" प्रतिलेखन कारक (Pax6) की वृद्धि की अभिव्यक्ति के साथ जुड़े थे।
तदनुसार, विवो में AIH प्रोटोकॉल के लिए "प्रधानमंत्री" NPCs से पहले संस्कृति के लिए एक साधन उपलब्ध करा सकता है। उदाहरण के लिए, इस दृष्टिकोण के लिए आवेदन पत्र घायल केंद्रीय तंत्रिका तंत्र में पहले प्रत्यारोपण के लिए सेल आबादी के विस्तार, या बस से पहले इन विट्रो प्रयोगों के लिए संवर्धित कोशिकाओं के neuronal भेदभाव को बढ़ाने के शामिल हो सकते हैं। इसके अलावा, यह एक प्रणालीगत प्रसव है, क्योंकि किसी भीअंग, ऊतक या सेल इसी तरह के अध्ययन के लिए एक उम्मीदवार है। इसलिए, के रूप में लिखा प्रोटोकॉल छोटे स्तनपायी में रुक-रुक कर ऑक्सीजन हेरफेर पर अध्ययन की एक विस्तृत श्रृंखला के लिए संभावित लागू है।
इस दृष्टिकोण के लिए कुछ फायदे हैं। अन्य प्रकाशित काम में, नवजात शिशुओं के इलाज के लिए पहले, पुरानी खुराक के लिए कम से निपटने की अनुमति देता है जो HYPOBARIC कक्षों में बांध के साथ एक कूड़े के रूप में इलाज किया, और उपचार 9 के दौरान मातृ संपर्क बनाए रखा गया। वर्तमान दृष्टिकोण प्रजनन योग्य मादा, या एक प्रयोग के लिए एक अलग बांध का उपयोग करने के लिए दोहराया उपचार नजरअंदाज। इस प्रोटोकॉल भी सटीक कूड़े-मेल खाते हैं और उम्र से मिलान नवजात शिशुओं के अध्ययन की अनुमति देता है। प्रतिनिधि डेटा इस प्रोटोकॉल की एक और महत्वपूर्ण शक्ति, AIH, के रूप में दिया, तंत्रिका स्टेम कोशिका जीव विज्ञान में एक शक्तिशाली और संगत जैविक प्रतिक्रिया elicits जिसके साथ अर्थात् तेज़ी के प्रदर्शित करता है। यह ऊतक और सेलुलर स्तर के biologi बटोर इस प्रोटोकॉल के लिए एक मिसाल स्थापितकोशिका जीव विज्ञान में परिवर्तन है कि कैलोरी बदलता है।
इस रिपोर्ट AIH को कृंतक पिल्ले के साथ ही neurospheres के रूप में हो SVZ कोशिकाओं की आबादी के विश्लेषण को प्रकाश में लाने के लिए इस्तेमाल किया विस्तृत प्रक्रिया की रूपरेखा तैयार करेंगे।
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
नोट: इस प्रोटोकॉल में सभी पशु प्रक्रियाओं फ्लोरिडा संस्थागत पशु की देखभाल और उपयोग समिति (IACUC) के विश्वविद्यालय के अनुमोदन के साथ आयोजित किया गया और 'प्रयोगशाला पशु की देखभाल और उपयोग के लिए गाइड' के साथ अनुपालन कर रहे हैं कर रहे हैं।
1. बेसिक प्रयोगात्मक सेट अप हल्की हाइपोक्सिया प्रशासन से पहले
- अन्य प्रयोगात्मक प्रयोजनों 5,13,14 के लिए वयस्क कृन्तकों के रूप में ज्यादा एक ही तरीके से एक पूरे शरीर माउस plethysmograph कक्षों का उपयोग कर विभिन्न गैस घोला जा सकता है पिल्ले 12 बेनकाब। कक्षों 3-4 माउस पिल्ले या 1-2 चूहा पिल्ले को समायोजित करने के लिए पर्याप्त आकार की है, जो एक 4 इंच व्यास (मात्रा = 450 मिलीलीटर), है। इधर, AIH प्रोटोकॉल प्रसव के बाद दिन 1-8 (P1-P8) आयु वर्ग के नवजात शिशुओं के लिए दिया जाता है।
- 21% से कम चैम्बर ऑक्सीजन रखता है जो 21% "आधारभूत" गैस, वितरित करने के लिए संपीड़ित हवा गैस टैंक का प्रयोग करें। "रिश्तेदार हाइपोक्सिया" को प्राप्त करने के लिए, एक 10% ऑक्सीजन / 90% नाइट्रोजन गैस की टंकी का उपयोग करें।
नहींई: प्लास्टिक टयूबिंग (3/16 "व्यास) एक प्रवाह मीटर करने के लिए गैस टैंक से जोड़ता है। इस प्रकार, फ्लो मीटर के लिए इनपुट एक ट्यूब आधारभूत और हाइपोक्सिया airflow के लिए प्रत्येक के होते हैं। - इस प्रकार के रूप में गैस ट्यूबिंग विन्यस्त करें।
- प्रत्येक कक्ष के लिए 1 एल / मिनट के प्रवाह में सक्षम बनाता है जो एक पूर्वाग्रह प्रवाह नियामक, प्रवाह मीटर से प्लास्टिक टयूबिंग (1/8 "व्यास) चलाने के लिए (यानी, 4 एल / मिनट 4 कक्षों का उपयोग किया जाता है)।
- Plethysmography कक्ष में पूर्वाग्रह प्रवाह नियामक से प्लास्टिक टयूबिंग (1/8 "व्यास) चलाएँ। वायु प्रवाह 1 एल / प्रत्येक कक्ष के लिए न्यूनतम गैस विनिमय गैर तनाव उत्प्रेरण शारीरिक और व्यवहार टिप्पणियों के आधार पर पशुओं के लिए माना जाता है, जिस पर एक पूर्व निर्धारित प्रवाह की दर है।
- कोई गैस का प्रवाह प्रोटोकॉल के दौरान उपयोग में नहीं है, या plethysmography कक्षों से बाहर अन्य कक्षों के लिए पलायन इतना है कि टोपी के साथ कक्षों के लिए और पूर्वाग्रह प्रवाह इकाई से सभी अप्रयुक्त कनेक्शन और अप्रयुक्त उद्घाटन सील।
- (चैम्बर जगह है) 37 डिग्री सेल्सियस तक संतुलन, या शरीर के तापमान को अनुमति देने के लिए कक्ष में जानवरों डाल करने से पहले एक मशीन में।
हल्की हाइपोक्सिया के लिए समय चक्र के 2. कैलिब्रेशन
- हवा टैंक और फ्लो मीटर के बीच, सभी ट्यूबिंग का निरीक्षण उचित कनेक्शन के लिए मीटर और पूर्वाग्रह प्रवाह इकाई, और पूर्वाग्रह प्रवाह इकाई और plethysmography कक्ष (एस) प्रवाह। जैसे, उपयोग में नहीं अप्रयुक्त पूर्वाग्रह प्रवाह इकाई के बाहर लाइनों और किसी भी कक्ष के उद्घाटन की जाँच: सभी वर्णित लाइनों और closures के एक कदम के लिहाज से चेक द्वारा कनेक्शन की जाँच करें चरण 1 में वर्णित के रूप में कनेक्शन स्थापित कर रहे हैं।
- एक हाथ से आयोजित ओ 2 मीटर के साथ एक परिवेश हे 2 सेंसर कनेक्ट और फिर plethysmography कक्ष ढकने के लिए सेंसर देते हैं।
- दोनों गैस टैंक खोलें और गैस के बंद-चक्र प्रवाह शिकंजा कसने के लिए प्लास्टिक टयूबिंग के साथ अछूता शल्य चिकित्सा, लंबे समय संभाला hemostats की एक जोड़ी देते हैं। इस तरह, एक समय में केवल एक गैस टैंक चैम्बर प्रति 1 एल / मिनट गैस प्रवाह देते है। "Hypoxic" गैस मिश्रण ठीक इसके विपरीत चैम्बर के लिए दिया जाता है, और जबकि "आधारभूत" गैस मिश्रण दबाना।
- 10% के लक्ष्य के स्तर तक पहुंचने और 21% पर लौटने के लिए चैम्बर ओ 2 के लिए आवश्यक समय रिकॉर्ड। बाद में प्रोटोकॉल वितरण के लिए दर्ज बार उपयोग।
तीव्र आंतरायिक हाइपोक्सिया 3. प्रशासन
- 2.1 चरण में वर्णित के रूप में सभी ट्यूबिंग और कनेक्शन का निरीक्षण किया।
- Plethysmography कक्ष (ओं) में नवजात शिशुओं की जगह और चैम्बर आधार में plethysmography कक्ष पलकों घर। किसी भी अप्रयुक्त चैम्बर कनेक्शन की एक उचित हे अंगूठी सील करने के लिए सील है और साथ ही बंद होने की पुष्टि करें। ये कदम गैस घोला जा सकता है के उचित वितरण सुनिश्चित करने के लिए महत्वपूर्ण हैं।
- पिल्ले पकड़े कक्षों 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में इलाज किया जा रखें और दरवाजा बंद कर दें। चैम्बर से पहले प्रोटोकॉल शुरू करने के लिए 37 डिग्री सेल्सियस को संतुलित करने की अनुमति दें। Incubat में 37 डिग्री सेल्सियस पर नियंत्रण जानवरों को बनाए रखेंया कमरे में हवा ऑक्सीजन पर।
- दोनों गैस टैंक खोलें और गैस के बंद-चक्र प्रवाह शिकंजा कसने के लिए प्लास्टिक टयूबिंग के साथ अछूता शल्य चिकित्सा, लंबे समय संभाला hemostats की एक जोड़ी का उपयोग करें। इस तरह, एक समय में केवल एक गैस टैंक चैम्बर प्रति 1 एल / मिनट गैस प्रवाह देते है।
- ठीक समय चक्र के लिए एक हाथ से आयोजित टाइमर का प्रयोग करें और इस प्रकार कक्षों के लिए गैस के प्रवाह के प्रत्यावर्तन, जिसके परिणामस्वरूप ट्यूबों के बीच hemostats स्विच करने के लिए समय से संकेत मिलता है।
- इस तरह के 2-कदम, 20 चक्र प्रोटोकॉल में सभी चरणों को बंद चिह्नित करने के लिए चित्र 1 में प्रदान की एक के रूप में एक उपचार के लिए लॉग इन का उपयोग कर प्रत्येक चक्र के पूरा रिकार्ड।
- जानवरों नामित सीमा (37 डिग्री सेल्सियस में यह परिणाम है कि इनक्यूबेटर पर सेटिंग है, जो 33-35 डिग्री सेल्सियस) पर रखा जाता है सुनिश्चित करने के लिए हर चक्र परिवर्तन पर इनक्यूबेटर तापमान की निगरानी करें।
- बारीकी से जानवरों में इस तरह के स्वरों के उच्चारण, की बदल स्तर के रूप में दिखाई दे संकट के बिना चक्र बर्दाश्त सुनिश्चित करना है कि प्रोटोकॉल भर पिल्ला गतिविधि पर नजरअंग गतिविधि या रोलिंग।
Subventricular क्षेत्र से स्टेम / पूर्वपुस्र्ष कोशिकाओं की 4. अलगाव और संस्कृति
नोट: नियंत्रण की तुलना में AIH निम्नलिखित neurosphere गठन में परिवर्तन ऊतक और सेलुलर स्तर के परिवर्तन को प्रकाश में लाना करने के लिए इस प्रोटोकॉल की प्रभावकारिता को दर्शाता है कि एक समापन बिंदु का एक उदाहरण है।
- कोशिकाओं के गठन neurospheres को अलग-थलग करने के लिए, AIH पूरा हो गया है के तुरंत बाद कक्ष से माउस या चूहा पिल्ले को हटा दें। प्रोटोकॉल समाप्ति के 30 मिनट के भीतर IACUC प्रोटोकॉल के अनुसार जानवरों बलिदान।
- पहले से तरीकों अध्याय 15,16 और एक अलग वीडियो प्रोटोकॉल 8 में प्रकाशित के रूप में, SVZ ऊतक फसल neurosphere संस्कृति में जगह और मानक पारित होने और व्युत्पन्न neurospheres के विस्तार का संचालन।
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
ऐतिहासिक आंकड़ों के आधार पर प्रारंभिक प्रयोगों, 1 मिनट चक्र लंबाई का उपयोग किया गया। ऊपर चरण 2 में प्रदर्शन बाद में calibrations पर आधारित है, यह है कि यह 21% आधारभूत पर लौटने के लिए इसी तरह की एक समय लगा कि, चैम्बर में ओ 2 स्तर 1 मिनट के बाद हाइपोक्सिया निस्तब्धता में 13% था कि निर्धारित किया गया था। हालांकि, एक 2 मिनट के चक्र में 10% को प्राप्त ऑक्सीजन और "आधारभूत" चक्र के दौरान 21% की वापसी के दोनों के लिए पर्याप्त था। इसके बाद 2 मिनट चक्र लंबाई इस्तेमाल किया गया है। प्रोटोकॉल की अवधि आधारभूत और हाइपोक्सिया (80 मिनट के समग्र उपचार के समय) के बीच बारी 20 चक्र शामिल थे। एक 20 चक्र की अवधि के कारण इस तरह चक्र अवधि श्वसन परिणाम में परिवर्तन 11 उपायों को प्रकाश में लाना करने के लिए पर्याप्त है कि दिखा पिछले काम करने के लिए चुना गया था। सेट अप वर्णित (चित्रा 2) का उपयोग करना, AIH के अधीन नवजात शिशुओं कोई स्पष्ट प्रतिकूल घटनाओं की थी और 80 के दौरान दर्द और बेचैनी की विचारोत्तेजक व्यवहार प्रदर्शन नहीं किया थामिनट प्रोटोकॉल। विशेष रूप से, कोई दिखाई एपनिया, अत्यधिक अंग या सिर आंदोलनों, या स्वरों के उच्चारण मनाया गया। AIH के बाद, subventricular क्षेत्र व्युत्पन्न तंत्रिका स्टेम / पूर्वज सेल आबादी प्रत्येक के गठन के क्षेत्र के भीतर वृद्धि हुई विस्तार का प्रदर्शन, 14 दिनों (और भी रूप में पक्षपाती monolayer आबादी, नहीं दिखाया डेटा) व्यास में एक लगभग दो गुना वृद्धि प्रदर्शनी के लिए neurospheres के रूप में संवर्धित (चित्रा 3)। अगले अनुमोदक की स्थिति में चढ़ाया जाता है कि कोशिकाओं (, mitogenic कारकों के अभाव यानी) normoxic से काटा कोशिकाओं की तुलना में अधिक व्यापक neuronal भेदभाव को इंगित करता है जो काफी अधिक बीटा 3 पॉजिटिव कोशिकाओं (45% <के लिए 10%> से वृद्धि हुई है) उपज इलाज (नियंत्रण) पिल्ले (चित्रा 4)।
चित्रा 1. इस तीव्र आईएच रिकॉर्ड शीट पशु दस्तावेज़ करने के लिए प्रयोग किया जाता है और प्रयोगात्मक विवरण, शुरू करने और आईएच प्रोटोकॉल के पूरा होने के बाद से पहले के लिए एक जांच सूची उपलब्ध कराने, और सब पूरा चक्र का सटीक मिलान के लिए एक ट्रैकिंग दस्तावेज़ के रूप में काम करते हैं।
चित्रा 2. हल्की हाइपोक्सिया नवजात कृन्तकों के लिए निर्धारित किया है। (ए) इनक्यूबेटर 37 डिग्री सेल्सियस पर वातावरण बनाए रखने के लिए। Plethysmography कक्ष कक्ष के दरवाजे अधखुला (बी) के साथ फिर से मशीन के भीतर दिखाया गया है, और है। (सी) सही है, प्रत्येक कक्ष के लिए 1 एल / मिनट के लिए समायोजित प्रवाह मीटर। गैस का प्रवाह किसी भी जुड़ा कक्ष (इनक्यूबेटर के भीतर, बाएं) को पूर्वाग्रह प्रवाह इकाई अलगानेवाला इकाई (बीच में) के माध्यम से निर्देशित है। (डी) आधारभूत (लाल टेप) और हाइपोक्सिया (पीला टेप) इनपुट लाइनों की Hemostat नियंत्रण। Ank "> यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 3. नियंत्रण neurospheres (ए) AIH neurospheres (बी) की तुलना में एक छोटे व्यास प्रदर्शित करता है। छवियाँ 10X उद्देश्य, पैमाने बार = 100 माइक्रोन में ले लिया। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 4. नियंत्रण neurospheres (ए) AIH neurospheres की तुलना में कम बीटा-3-ट्यूबिलिन पॉजिटिव neuroblasts (बी) प्रदर्शित करता है। छवियाँ 20X उद्देश्य, पैमाने बार = 50 माइक्रोन में ले लिया।जी "लक्ष्य =" _blank "> यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mouse plethysmography chambers | Buxco | PLY4211 | |
| Flow meter | Porter | F150 | |
| Bias flow unit | AFPS | ||
| Baseline Gas Mix | Airgas | AIZ300 | Compressed Air |
| Hypoxic Gas Mix | Airgas | X03NI72C2000189 | 10% Oxygen, balance nitrogen |
| Oxygen Meter | Teledyne | AX-300 |
References
- Studer, L., et al. Enhanced proliferation, survival, and dopaminergic differentiation of CNS precursors in lowered oxygen. J Neurosci. 20 (19), 7377-7383 (2000).
- Chen, H. L., et al. Oxygen tension regulates survival and fate of mouse central nervous system precursors at multiple levels. Stem Cells. 25 (9), 2291-2301 (2007).
- Ling, L., et al. Chronic intermittent hypoxia elicits serotonin-dependent plasticity in the central neural control of breathing. J Neurosci. 21 (14), 5381-5388 (2001).
- Mitchell, G. S., et al. Invited review: Intermittent hypoxia and respiratory plasticity. J Appl Physiol. 90 (6), 2466-2475 (2001).
- Fuller, D. D., Zabka, A. G., Baker, T. L., Mitchell, G. S. Phrenic long-term facilitation requires 5-HT receptor activation during but not following episodic hypoxia. J Appl Physiol. 90 (5), 2001-2006 (2001).
- Fuller, D. D., Johnson, S. M., Olson, E. B., Mitchell, G. S. Synaptic pathways to phrenic motoneurons are enhanced by chronic intermittent hypoxia after cervical spinal cord injury. J Neurosci. 23 (7), 2993-3000 (2003).
- Baker-Herman, T. L., et al. BDNF is necessary and sufficient for spinal respiratory plasticity following intermittent hypoxia. Nat Neurosci. 7 (1), 48-55 (2004).
- Zhu, L. L., et al. Neurogenesis in the adult rat brain after intermittent hypoxia. Brain Res. 1055, 1-6 (2005).
- Zhang, J. X., Chen, X. Q., Du, J. Z., Chen, Q. M., Zhu, C. Y. Neonatal exposure to intermittent hypoxia enhances mice performance in water maze and 8-arm radial maze tasks. Journal of neurobiology. 65 (1), 72-84 (2005).
- Zhu, L. L., Wu, L. Y., Yew, D. T., Fan, M. Effects of hypoxia on the proliferation and differentiation of NSCs. Mol Neurobiol. 31 (1-3), 231-242 (2005).
- Ross, H. H., et al. In vivo intermittent hypoxia elicits enhanced expansion and neuronal differentiation in cultured neural progenitors. Exp Neurol. 235 (1), 238-245 (2012).
- Fuller, D. D., et al. Induced recovery of hypoxic phrenic responses in adult rats exposed to hyperoxia for the first month of life. J Physiol. 536 (Pt 3), 917-926 (2001).
- Fuller, D. D., Fregosi, R. F. Fatiguing contractions of tongue protrudor and retractor muscles: influence of systemic hypoxia. J Appl Physiol. 88 (6), 2123-2130 (2000).
- Baker, T. L., Fuller, D. D., Zabka, A. G., Mitchell, G. S. Respiratory plasticity: differential actions of continuous and episodic hypoxia and hypercapnia. Respir Physiol. 129 (1-2), 25-35 (2001).
- Marshall, G. P. 2nd, et al. Production of neurospheres from CNS tissue. Methods Mol Biol. 438, 135-150 (2008).
- Azari, H., Rahman, M., Sharififar, S., Reynolds, B. A. Isolation and expansion of the adult mouse neural stem cells using the neurosphere assay. J Vis Exp. (45), (2010).
