Summary
Questo articolo descrive la metodologia per la somministrazione di brevi periodi di ipossia intermittente per postnatali giorno 1-8 di topo o ratto cuccioli. Questo approccio suscita effettivamente un livello del tessuto robusto "effetto priming" su colture di cellule progenitrici neurali che vengono raccolte entro 30 minuti dall'esposizione ipossia.
Introduction
L'obiettivo di questo metodo è quello di fornire riproducibile ed efficace periodi intermittenti di sistemica di ossigeno ambiente abbassata a roditori neonatali. Il razionale per l'utilizzo di ipossia intermittente (IH) per manipolare biologia delle cellule staminali in vitro proviene da esperimenti di coltura cellulare in cui tenore di O 2 i mezzi di crescita è alterata. In particolare, rispetto alle condizioni "standard" del 20% O 2, cultura estesa staminali / progenitrici delle cellule popolazioni cellulari in 3% O 2 risultati in un aumento della proliferazione, diminuita apoptosi neuronale e una maggiore resa 1,2.
Questo gruppo ha una significativa esperienza con la somministrazione di IH sistemica, e ha condotto studi approfonditi sul ruolo della IH nella plasticità respiratoria 3-7. Questo lavoro, e la recente scoperta che IH cronica aumentata neurogenesi nei roditori CNS 8-10, costituisce la base per l'esplorazione di acuta in vivoipossia come stimolo precondizionamento (es., prima del raccolto tessuti) sulla successiva coltura di cellule neurali staminali / progenitrici (NPC) 11. Sorprendentemente, quando cuccioli di topo sono stati esposti a un breve periodo di acuta ipossia intermittente (IAC) (<1 ora), cellule che sono state raccolte dalla zona subventricolare (SVZ) era significativo aumento di capacità di espansione come neurosfere o cellule monostrato aderenti. Il protocollo AIH è stato anche associato con una maggiore espressione di un "destino neuronale" fattore di trascrizione (Pax6).
Di conseguenza, in vivo protocolli AIH possono fornire un mezzo di "prime" NPC prima cultura. Ad esempio, applicazioni di questo approccio possono includere espansione popolazioni di cellule prima del trapianto nel sistema nervoso centrale feriti, o semplicemente aumentando la differenziazione neuronale di cellule coltivate prima esperimenti in vitro. Inoltre, perché questa è una consegna sistemica, qualsiasiorgano, tessuto o cellula è un candidato per studio simile. Pertanto, il protocollo come scritto è potenzialmente applicabile ad una vasta gamma di studi sulla manipolazione ossigeno intermittente in piccoli mammiferi.
Ci sono alcuni vantaggi di questo approccio. In un altro lavoro pubblicato, i neonati sono stati trattati come una cucciolata con la diga in camere ipobariche, che consente la somministrazione cronica, meno manipolazione prima del trattamento, e mantenuto il contatto materno durante il trattamento 9. L'attuale approccio bypassa trattamenti ripetuti ad una femmina di allevamento, o l'uso di una diga differente per ciascun esperimento. Questo protocollo permette anche lo studio di precisi neonati lettiere corrispondenza e di pari età. Dati rappresentativi dimostrano un altro punto di forza di questo protocollo, vale a dire la rapidità con cui epatite autoimmune, come consegnato, provoca una risposta biologica potente e costante in biologia delle cellule staminali neurali. Questo stabilisce un precedente per questo protocollo di suscitare biologi tessutale e-livello cellularemodifiche CAL che alterano biologia cellulare.
La relazione illustrerà le procedure dettagliate utilizzate per esporre cuccioli roditori per EAI, nonché l'analisi della popolazione di cellule SVZ cresciuto come neurosfere.
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Protocol
NOTA: Tutte le procedure animali in questo protocollo sono condotte con l'approvazione della University of Florida Istituzionale Animal Care and Use Committee (IACUC) e sono in conformità con la 'Guida per la cura e l'uso di animali da laboratorio'.
1. Impostare sperimentale di base in funzione Prima Amministrazione intermittente ipossia
- Esporre cuccioli 12 alle diverse miscele di gas che utilizzano un corpo intero camere del mouse pletismografo più o meno allo stesso modo di roditori adulti per altri scopi sperimentali 5,13,14. Le camere hanno un diametro di 4 pollici (volume = 450 ml), che è di ampie dimensioni per ospitare 3-4 cuccioli del mouse o 1-2 cuccioli di ratto. Qui, i protocolli di AIH sono consegnati a neonati di età compresa tra 1-8 giorni post-natale (P1-P8).
- Utilizzare serbatoi di gas compresso l'aria di consegnare il gas 21% "di base", che mantiene l'ossigenazione camera al 21%. Per raggiungere "ipossia relativa", utilizzare un / 90% serbatoio di gas di azoto 10% di ossigeno.
NONE: Tubi flessibili ("diametro 3/16) collega i serbatoi di gas a un flussometro. Pertanto, l'ingresso del flussometro è costituito da un tubo per ciascuna linea di base e ipossia flusso d'aria. - Configurare il tubo del gas come segue.
- Eseguire tubazione di plastica ("diametro 1/8) dal flussometro di un regolatore di flusso di polarizzazione, che consente flussi di 1 L / min per ciascuna camera (cioè, 4 L / min se si utilizzano 4 alloggiamenti).
- Eseguire tubazione di plastica ("diametro 1/8) dal regolatore di flusso polarizzazione alle camere pletismografia. Flusso d'aria a 1 L / min per ciascuna camera è una portata predeterminata in cui lo scambio di gas è considerata non-stressanti agli animali basate su osservazioni fisiologiche e comportamentali.
- Chiudere tutte le connessioni inutilizzate da e per l'unità di flusso pregiudizi e tutte le aperture non utilizzate alle camere con tappi in modo che nessun flusso di gas sfugge ad altre stanze non in uso, o fuori delle camere pletismografia durante il protocollo.
- Posizionare la camera (s) In un incubatore prima di mettere animali nella camera per raggiungere l'equilibrio a 37 ° C, o della temperatura corporea.
2. Taratura di tempi di ciclo per ipossia intermittente
- Controllare tutti i tubi, tra bombole e flussometro, flussometro e unità di flusso pregiudizi, e il flusso di pregiudizi unità e la camera pletismografia (s) per le connessioni appropriate. I collegamenti sono impostati come descritto al punto 1. Verificare la connessione da un controllo graduale di tutte le linee descritte e chiusure: ad esempio, il controllo linee usate fuori dalla unità di flusso di polarizzazione e le aperture di camera non è in uso.
- Collegare un sensore ambientale O 2 con una O 2 metri portatile e quindi collegare il sensore al coperchio della camera pletismografia.
- Aprire entrambi i serbatoi del gas e collegare un paio di chirurgia, emostatici manico lungo isolati con tubi di plastica per bloccare il flusso di fuori-ciclo del gas. In questo modo, un solo serbatoio alla volta è fornire il / flusso del gas min 1 L per ogni camera. Bloccare la miscela di gas "di base", mentre la miscela di gas "ipossia", è consegnato alla camera, e viceversa.
- Registrare il tempo necessario per la camera 2 O per raggiungere i livelli obiettivo di 10% e tornare al 21%. Utilizzare i tempi di consegna per il successivo protocollo.
3. La somministrazione di ipossia acuta intermittente
- Controllare tutti i tubi e le connessioni come descritto al punto 2.1.
- Posizionare neonati nella camera pletismografia (s) e ospitare le palpebre camera pletismografia nella base della camera. Confermare una corretta tenuta della guarnizione O-ring è così come la chiusura di tutti i collegamenti da camera inutilizzate. Questi passaggi sono fondamentali per assicurare la consegna adeguata di miscele di gas.
- Posizionare le camere che tengono i cuccioli da trattare nel 37 ° C incubatore e chiudono la porta. Lasciare camera di equilibrare a 37 ° C prima di iniziare il protocollo. Mantenere animali di controllo a 37 ° C nel incubato in camera d'aria ossigenazione.
- Aprire entrambi i serbatoi di gas e utilizzare una coppia di chirurgia, emostatici manico lungo isolati con tubi di plastica per bloccare il flusso di fuori-ciclo del gas. In questo modo, un solo serbatoio alla volta è fornire il / flusso del gas min 1 L per ogni camera.
- Utilizzare un timer manuale a proprio cicli di tempo e per indicare il momento di cambiare le hemostats tra tubi, con conseguente l'alternanza del flusso di gas verso le camere.
- Registrare il completamento di ogni ciclo utilizzando un registro trattamento come quello fornito in Figura 1 per delimitare tutte le fasi del 2-step, 20 protocollo ciclo.
- Monitorare la temperatura dell'incubatrice ad ogni cambio ciclo per assicurare gli animali sono mantenuti al raggio designato (33-35 ° C, che è l'impostazione sull'incubatrice che si traduce in 37 ° C).
- Seguire da vicino l'attività cucciolo tutto il protocollo per garantire che gli animali tollerano cicli senza angoscia visibile come vocalizzi, alterato livello diattività arto o di rotolamento.
4. Isolamento e la coltura di cellule staminali / progenitrici dalla zona subventricolare
NOTA: Il cambiamento di formazione neurosfere seguito EAI rispetto ai controlli è un esempio di un endpoint che dimostra l'efficacia di questo protocollo per suscitare cambiamenti tessutale e a livello cellulare.
- Per isolare neurosfere formano cellule, rimuovere topo o ratto cuccioli dalla camera subito dopo EAI è completata. Sacrificare gli animali secondo protocolli IACUC entro 30 minuti dal termine del protocollo.
- Raccolto il tessuto SVZ, inserire nella cultura neurosfere e condurre iter standard e l'espansione delle neurosfere derivate, come precedentemente pubblicato su metodi capitoli 15,16 e un protocollo video separata 8.
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Representative Results
Gli esperimenti iniziali, basate su dati storici, sono stati condotti utilizzando durata del ciclo 1 min. Sulla base delle successive calibrazioni eseguite nella Fase 2, si è stabilito che il livello di O 2 nella camera era 13% a 1 min lavaggio post-ipossia e, che ha un tempo simile al ritorno alla linea di base 21%. Tuttavia, un ciclo di 2 minuti era sufficiente per realizzare sia il 10% di ossigeno e un ritorno al 21% durante il ciclo di "base". Successivamente, sono stati utilizzati durata del ciclo 2 min. La durata del protocollo consisteva di 20 cicli alternati tra il basale e ipossia (80 min tempo di trattamento complessiva). La durata del ciclo 20 è stato scelto a causa di lavori precedenti dimostrando che tale durata del ciclo è sufficiente per indurre cambiamenti di risultato respiratorie Misure 11. Utilizzando il descritto istituito (figura 2), i neonati sottoposti a epatite autoimmune non hanno avuto eventi avversi apparenti e non presentano comportamenti indicativi di dolore e disagio durante la 80min protocollo. In particolare, nessuna apnea visibile è stato osservato, movimenti degli arti o della testa eccessivi, o vocalizzazioni. A seguito di epatite autoimmune, neurali popolazioni di cellule staminali / progenitrici zona di derivazione subventricular coltivate come neurosfere per 14 giorni (e delle popolazioni monostrato anche come aderenti, dati non illustrati) mostrano una quasi due volte maggiore di diametro, dimostrando una maggiore espansione all'interno di ogni ambito di formatura (Figura 3). Cellule che sono il prossimo placcati in condizioni permissive (ad esempio, l'assenza di fattori mitogeni) resa significativamente più cellule beta-3-positivi (un aumento dal <10% a> 45%), che indica una più ampia differenziazione neuronale rispetto alle cellule raccolte da normossiche trattati (controllo) cuccioli (Figura 4).
Figura 1. Questo foglio di registrazione IH acuta è utilizzato per documentare animale e dettagli sperimentali, forniscono una lista di controllo per la prima di iniziare e dopo il completamento del protocollo IH, e servire come un documento di monitoraggio per conteggio accurato di tutti i cicli completati.
Figura 2. ipossia intermittente impostato per roditori neonatali. (A) incubatore per mantenere ambiente a 37 ° C. Camera pletismografia viene mostrato all'interno dell'incubatore, e ancora una volta con la porta socchiusa della camera (B). (C) Diritto, misuratore di portata regolata a 1 L / min per ogni camera. Il flusso di gas è diretto attraverso l'unità di unità splitter flusso bias (centro) per ogni camera collegato (a sinistra, in incubatrice). (D) il controllo Hemostat del valore basale (la burocrazia) e ipossia (nastro giallo) linee di ingresso. ank "> Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 3. neurosfere di controllo (A) mostrano un diametro inferiore AIH neurosfere (B). Immagini prese a 10X obiettivo, barra della scala = 100 micron. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 4. neurosfere di controllo (A) dimostrano un minor numero di neuroblasti beta-3-tubulina-positivo rispetto neurosfere AIH (B). Immagini prese a 20X obiettivo, barra della scala = 50 micron.g "target =" _ blank "> Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mouse plethysmography chambers | Buxco | PLY4211 | |
| Flow meter | Porter | F150 | |
| Bias flow unit | AFPS | ||
| Baseline Gas Mix | Airgas | AIZ300 | Compressed Air |
| Hypoxic Gas Mix | Airgas | X03NI72C2000189 | 10% Oxygen, balance nitrogen |
| Oxygen Meter | Teledyne | AX-300 |
References
- Studer, L., et al. Enhanced proliferation, survival, and dopaminergic differentiation of CNS precursors in lowered oxygen. J Neurosci. 20 (19), 7377-7383 (2000).
- Chen, H. L., et al. Oxygen tension regulates survival and fate of mouse central nervous system precursors at multiple levels. Stem Cells. 25 (9), 2291-2301 (2007).
- Ling, L., et al. Chronic intermittent hypoxia elicits serotonin-dependent plasticity in the central neural control of breathing. J Neurosci. 21 (14), 5381-5388 (2001).
- Mitchell, G. S., et al. Invited review: Intermittent hypoxia and respiratory plasticity. J Appl Physiol. 90 (6), 2466-2475 (2001).
- Fuller, D. D., Zabka, A. G., Baker, T. L., Mitchell, G. S. Phrenic long-term facilitation requires 5-HT receptor activation during but not following episodic hypoxia. J Appl Physiol. 90 (5), 2001-2006 (2001).
- Fuller, D. D., Johnson, S. M., Olson, E. B., Mitchell, G. S. Synaptic pathways to phrenic motoneurons are enhanced by chronic intermittent hypoxia after cervical spinal cord injury. J Neurosci. 23 (7), 2993-3000 (2003).
- Baker-Herman, T. L., et al. BDNF is necessary and sufficient for spinal respiratory plasticity following intermittent hypoxia. Nat Neurosci. 7 (1), 48-55 (2004).
- Zhu, L. L., et al. Neurogenesis in the adult rat brain after intermittent hypoxia. Brain Res. 1055, 1-6 (2005).
- Zhang, J. X., Chen, X. Q., Du, J. Z., Chen, Q. M., Zhu, C. Y. Neonatal exposure to intermittent hypoxia enhances mice performance in water maze and 8-arm radial maze tasks. Journal of neurobiology. 65 (1), 72-84 (2005).
- Zhu, L. L., Wu, L. Y., Yew, D. T., Fan, M. Effects of hypoxia on the proliferation and differentiation of NSCs. Mol Neurobiol. 31 (1-3), 231-242 (2005).
- Ross, H. H., et al. In vivo intermittent hypoxia elicits enhanced expansion and neuronal differentiation in cultured neural progenitors. Exp Neurol. 235 (1), 238-245 (2012).
- Fuller, D. D., et al. Induced recovery of hypoxic phrenic responses in adult rats exposed to hyperoxia for the first month of life. J Physiol. 536 (Pt 3), 917-926 (2001).
- Fuller, D. D., Fregosi, R. F. Fatiguing contractions of tongue protrudor and retractor muscles: influence of systemic hypoxia. J Appl Physiol. 88 (6), 2123-2130 (2000).
- Baker, T. L., Fuller, D. D., Zabka, A. G., Mitchell, G. S. Respiratory plasticity: differential actions of continuous and episodic hypoxia and hypercapnia. Respir Physiol. 129 (1-2), 25-35 (2001).
- Marshall, G. P. 2nd, et al. Production of neurospheres from CNS tissue. Methods Mol Biol. 438, 135-150 (2008).
- Azari, H., Rahman, M., Sharififar, S., Reynolds, B. A. Isolation and expansion of the adult mouse neural stem cells using the neurosphere assay. J Vis Exp. (45), (2010).
