Summary
이 문서에서는 출생 후 하루 1-8 마우스 또는 쥐 새끼에 간헐적 저산소증의 짧은 기간을 관리하는 방법을 설명합니다. 이러한 접근은 효과적 저산소증 노출 30 분 이내에 수확 배양 신경 전구 세포에 대한 강력한 조직 수준 "프라이밍 효과"를 도출한다.
Introduction
이 방법의 목적은 재현성과 효과적으로 신생아 설치류에 전신 낮아 주변 산소의 간헐적 인 관찰을 제공하는 것입니다. 줄기 세포 생물학 조작 간헐적 저산소증 (IH)를 사용하는 이론적 근거는 성장 배지 2 O의 함유량이 변경되는 시험 관내 세포 배양 실험에서 유래. 20 %의 "표준"조건 O 2, 증가 확산의 3 % O 2 결과 줄기 / 전구 세포 집단 세포의 확장 된 문화에 비해 특히, 세포 사멸을 감소 신경 수익률 1,2 증가했다.
이 그룹은 전신 IH의 관리에 상당한 경험을 가지고 있으며, 호흡 소성 3-7 IH의 역할에 대한 광범위한 연구를 수행하고있다. 이 작품, 만성 IH은 설치류 CNS 8-10에 신경을 증가하는 최근의 연구 결과는 생체 내에서 급성의 탐사를위한 기초를 형성전처리 자극으로 저산소증 (예., 조직 수확 이전에) 신경 줄기 / 전구 세포 (NPC들) (11)의 연속 문화. 마우스 새끼가 급성 간헐적 저산소증 (AIH)의 개요 (<1 시간) 기간에 노출되었을 때 놀랍게도, 뇌실 영역 (SVZ)에서 수확 된 세포는 크게 neurosphere를 또는 부착 단층 세포와 같은 확장을위한 용량을 증가했다. AIH 프로토콜은 또한 "신경 운명"전사 인자 (PAX6)의 발현 증가와 관련이 있었다.
따라서, 생체 내에서 AIH 프로토콜이 "소수"의 NPC 전에 문화 할 수있는 수단을 제공 할 수있다. 예를 들어,이 방법에 대한 응용 프로그램은 손상된 중추 신경계에 이전에 이식 세포 집단을 확장하거나 이전의 시험 관내 실험에 배양 된 세포의 신경 세포 분화를 증가 포함 할 수있다. 또한,이 전신 전달을하기 때문에, 어떠한기관, 조직 또는 세포는 유사한 연구를위한 후보입니다. 따라서 작성된 프로토콜은 작은 포유류 간헐적 산소 조작에 관한 연구의 다양한 잠재적으로 적용될 수있다.
이 방법의 특정 이점이있다. 게시 된 다른 연구에서 신생아가 치료에 앞서, 만성 투여 덜 처리를 할 수 있습니다 기압 성 챔버의 댐과 쓰레기로 취급하고, 치료 9시 산모의 접촉을 유지 하였다. 현재의 접근법은 사육 여성, 또는 각각의 실험에 대해 다른 댐의 사용을 반복 치료를 무시. 이 프로토콜은 또한 정확한 쓰레기 일치 및 연령대 신생아의 연구를 할 수 있습니다. 대표적인 데이터는이 프로토콜의 또 다른 키 강도, AIH는 전달과 같은 신경 줄기 세포 생물학에서 강력하고 일관된 생물학적 반응을 이끌어있는 즉 신속성을 보여줍니다. 이 조직 - 및 세포 수준 biologi을 유도하기 위해이 프로토콜에 대한 선례를 확립세포 생물학을 변경 CAL 변경됩니다.
이 보고서에 AIH 설치류뿐만 아니라 새끼 neurosphere를 성장 중 SVZ 세포의 집단 분석을 노광에 사용되는 세부 과정을 개설 할 것이다.
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Protocol
참고 :이 프로토콜의 모든 동물 절차는 플로리다 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC)의 대학의 승인을 실시하고 '실험 동물의 관리 및 사용을위한 안내서'을 준수하고 있습니다.
1. 기본 실험 세트까지 간헐적 저산소증 관리하기 전에
- 다른 실험 목적을위한 5,13,14 성인 설치류만큼 동일하게 전신 마우스 plethysmograph 챔버를 사용하여 상이한 가스 혼합물에 새끼 12을 노출. 챔버는 3-4 마우스 새끼 또는 1-2 래트 새끼를 수용하기 충분한 크기 인 4 인치 직경 (부피 = 450 ml)에,이. 여기에, AIH 프로토콜은 출생 후 하루 1-8 (P1 ~ P8) 세 신생아에게 전달됩니다.
- 21 %에서 챔버 산소를 유지 21 % "기준"가스를 제공하기 위해 압축 공기 가스 탱크를 사용합니다. "상대적 저산소증"을 달성하기 위해, 10 % 산소 / 90 %의 질소 가스 탱크를 사용한다.
하지E : 플라스틱 배관 (3/16 "직경)는 유량계 가스 탱크를 연결한다. 따라서, 유량계에 대한 입력은 하나의 튜브 및 저산소증 기준선 기류 각 이루어져있다. - 다음과 같이 가스 배관을 구성합니다.
- 각 챔버에 1 L / 분의 흐름을 가능하게하는 바이어스 유동 조절기로 유량계에서 플라스틱 배관 (1/8 "직경)을 실행 (즉, 4 L / 분 (4) 챔버가 사용되는 경우).
- 혈량 측정법 챔버에 바이어스 유량 조절기에서 플라스틱 튜브 (1/8 "직경)를 실행합니다. 기류는 1에서 L / 분으로 각각의 챔버는 가스 교환이 비 생리적 스트레스 유발 및 행동의 관측에 기초하여 동물에 것으로 간주되는 소정 유량이다.
- 어떠한 가스 유동이 프로토콜 동안 사용되지 않을, 또는 혈량 측정법 챔버 중 다른 챔버로 빠져 나가지 않도록 캡 챔버 및 상기 바이어스 부에서 유동하지 않는 모든 연결 및 모든 미사용 개구부를 밀봉.
- (실을 배치의) 37 ° C로 평형화 또는 체온을 허용하도록 챔버에 동물을 성공시키는 종래 인큐베이터.
간헐적 저산소증에 대한주기 시간 2. 교정
- 공기 탱크 및 유량계 사이, 모든 배관을 검사 적절한 연결 m 바이어스 흐름 부, 그리고 바이어스 흐름 부와 혈량 측정법 챔버 (들)를 흐른다. 예를 들어, 사용하지 않는 미사용 바이어스 유동 부의 아웃 라인 및 챔버 개구를 체크 : 모든 설명 선과 클로저 단계적 수표 접속 확인 단계 1에서 설명한 바와 같이 접속이 설정된다.
- 휴대용 O 2m로 주변 O2 센서를 연결 한 후 혈량 측정법 챔버 뚜껑에 센서를 부착합니다.
- 모두 가스 탱크를 열고 가스의 오프 사이클 흐름을 고정하는 플라스틱 튜브로 절연 수술, 긴 처리 지혈 한 쌍을 연결합니다. 이러한 방식으로, 한 번에 하나의 가스 탱크 챔버 당 1 L / min의 가스 흐름을 제공한다. "저산소증"가스 믹스가 반대로 챔버로 전달되고, 반면 "기준선"가스 믹스 클램프.
- 10 %의 목표 레벨에 도달하고 21 %로 돌아 챔버 O 2에 필요한 시간을 기록한다. 다음 프로토콜 전달을위한 기록 된 시간을 활용합니다.
급성 간헐적 저산소증 3. 관리
- 2.1 단계에 설명 된대로 모든 배관 및 연결을 검사합니다.
- 혈량 측정법 챔버 (들)에서 신생아를 놓고 챔버베이스로 혈량 측정법 챔버 뚜껑을 수용. 사용하지 않는 실 연결의 적절한 O- 링 씰 씰입니다뿐만 아니라 폐쇄를 확인합니다. 이 단계는 가스 혼합물의 적절한 공급을 보장하는 데 중요합니다.
- 새끼를 보유 챔버가 37 ° C 배양기로 처리 할 수 놓고 문을 닫습니다. 챔버는 이전 프로토콜을 시작으로 37 ° C의 평형을 허용합니다. incubat 37 ° C에서 제어 동물을 유지또는 실내 공기의 산소에서.
- 모두 가스 탱크를 열고 가스의 오프 사이클 흐름을 고정하는 플라스틱 튜브로 절연 수술, 긴 처리 지혈 한 쌍을 사용합니다. 이러한 방식으로, 한 번에 하나의 가스 탱크 챔버 당 1 L / min의 가스 흐름을 제공한다.
- 정밀 시간주기에 휴대용 타이머를 사용함으로써 챔버로의 가스 유동의 교호 결과, 튜브 사이에 지혈을 전환하는 시간을 표시.
- 이러한 2 단계, 20 사이클 프로토콜의 모든 단계를 표시하기 위해도 1에 제공된 것과 같은 처리 로그를 이용하여 각주기의 완료를 기록한다.
- 동물이 지정된 범위 (37 ° C 결과 인큐베이터에있는 설정입니다 33 ~ 35 ° C)에서의 유지를 보장하기 위해 모든 사이클 변화에 인큐베이터 온도를 모니터링합니다.
- 밀접하게 동물은 발성의 변경된 수준으로 볼 수 고통없이 사이클을 견딜 수 있도록 프로토콜을 통해 강아지의 활동을 모니터링사지 활동이나 압연.
뇌실 영역에서 줄기 / 전구 세포의 4. 분리 및 문화
주 : 대조군과 비교 AIH 다음 neurosphere 포메이션에 변화는 조직 - 및 세포 수준의 변화를 유발하는이 프로토콜의 효능을 입증 엔드의 일례이다.
- 세포를 형성 neurosphere를 격리하기 위해, AIH가 완료된 직후 챔버에서 마우스 또는 쥐 새끼를 제거합니다. 프로토콜 종료 30 분 이내에 IACUC 프로토콜에 따라 동물을 희생.
- 이전 방법 장 (15, 16)과 별도의 비디오 프로토콜 (8)에 발표 된 바와 같이, SVZ 조직을 수확 neurosphere 문화에 배치하고 표준 통로 파생 neurosphere를의 확장을 실시하고 있습니다.
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Representative Results
기록 데이터에 기초하여 초기의 실험은, 1 분의 사이클 길이를 이용하여 수행 하였다. 상기 단계 2에서 수행되는 후속 캘리브레이션에 기초하여, 그것이 21 % 기준선으로 돌아 유사한 시간 걸렸다, 챔버 내의 O 2 레벨이 1 분 후 저산소증 플러싱에서 13 %라고 결정 하였다. 그러나, 2 분주기의 10 %를 달성 산소 및 "기준"사이클 동안 21 %로 복귀시키기에 충분한 양이었다. 이어서, 2 분주기 길이가 사용되었다. 프로토콜 기간은베이스 라인과 저산소증 (80 분 전체 처리 시간) 사이에 교류 20 사이클 구성되어있다. 20주기 기간으로 인해 이러한 사이클 기간은 호흡기 결과의 변화 (11)를 측정 유도하기에 충분 것을 보여주는 이전의 연구에 선택되었다. 설정 설명 (그림 2)를 사용하여, AIH 대상 신생아는 명백한 부작용이 없었다 및 80시 통증과 불편 함을 암시하는 행동을 나타내지 않았다분 프로토콜입니다. 즉, 가시적 무호흡증 과도한 사지 또는 머리 움직임 또는 발성을 관찰되지 않았다. AIH 이어 뇌실 영역 유래 신경 줄기 / 선조 세포 집단이 각각 형성 구 내에 증가 된 팽창을 보여주는 14 일 (도로서 부착 단층 개체군 미도 데이터) 직경이 약 2 배 증가를 나타내지 위해 neurosphere를 배양 한 (도 3). 다음 허용 조건에서 도금 세포 (분열 촉진 인자의 유무 IE) 정상 산소로부터 수확 된 세포에 비해 더 광범위한 신경 분화를 나타내는 상당히 많은 베타 -3- 양성 세포 (45 % <10 %>에서 증가)을 수득 처리 (제어) 새끼 (그림 4).
그림 1.이 급성 IH 기록 시트는 동물을 기록하는 데 사용됩니다 실험 세부 사항은, 시작과 IH 프로토콜의 완료에 따라 이전에 대한 체크리스트를 제공하고, 완료된 모든주기의 정확한 집계를위한 추적 문서로 제공합니다.
그림 2. 간헐적 저산소증 신생아 설치류에 대한 설정합니다. (A) 보육을 37 ℃에서 환경을 유지 할 수 있습니다. 혈량 측정법 챔버는 챔버 덮개 열려 (B)로 다시 인큐베이터 내에서 도시하고있다. (C) 오른쪽, 각 챔버 1 L / 분으로 조정 유량계. 가스 유동은 연결된 챔버 (인큐베이터 내 왼쪽)에 바이어스 흐름 단위 스플리터 부 (센터)을 통해 지향된다. (D)베이스 라인 (빨간 테이프) 및 저산소증 (노란색 테이프) 입력 라인의 지혈제 제어. ANK ">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 3 제어 neurosphere를 (A)가 AIH를 neurosphere를 (B)보다 더 작은 직경을 보여준다. 이미지는 10 배 목표, 스케일 바 = 100 μm의에서 찍은 사진. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 4 제어 neurosphere를 (A)가 AIH를 neurosphere를보다 적은 베타 - 튜 불린 -3- 양성 neuroblasts (B)를 보여준다. 이미지는 20X 목적, 스케일 바 = 50 μm의에서 찍은 사진.G "대상 ="_ 빈 ">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mouse plethysmography chambers | Buxco | PLY4211 | |
| Flow meter | Porter | F150 | |
| Bias flow unit | AFPS | ||
| Baseline Gas Mix | Airgas | AIZ300 | Compressed Air |
| Hypoxic Gas Mix | Airgas | X03NI72C2000189 | 10% Oxygen, balance nitrogen |
| Oxygen Meter | Teledyne | AX-300 |
References
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