Summary
Este artigo descreve a metodologia para a administração de curtos períodos de hipóxia intermitente para pós-natal 1-8 dia ratinho ou um rato filhotes. Esta abordagem suscita efectivamente um nível do tecido robusto "efeito priming" sobre as células progenitoras neurais em cultura que são colhidas no prazo de 30 min de exposição hipóxia.
Introduction
O objetivo deste método é entregar reprodutível e eficaz ataques intermitentes de oxigênio sistêmico ambiente reduzido para roedores neonatais. A justificativa para o uso de hipóxia intermitente (IH) para manipular a biologia de células-tronco origina de em experimentos de cultura de células in vitro em que O 2 conteúdo do meio de crescimento é alterada. Especificamente, quando comparadas com as condições "standard" de 20% de O2, cultura prolongada de células estaminais / progenitoras de células em populações de células 3% de O2 resulta num aumento da proliferação, diminuição e aumento da apoptose neuronal 1,2 rendimento.
Este grupo tem uma experiência significativa com a administração de IH sistêmica, e já realizou extensos estudos sobre o papel do IH na plasticidade respiratória 3-7. Este trabalho, ea recente descoberta de que IH crônica aumentou a neurogênese no roedor CNS 10/08, constitui a base para a exploração do aguda in vivohipóxia como um estímulo pré-condicionamento (ie., antes da colheita de tecidos) sobre a cultura subsequente de células estaminais / progenitoras neurais (NPCs) 11. Notavelmente, quando as crias de rato foram expostos a uma breve (<1 hora) período de hipoxia aguda intermitente (AIH), as células que foram colhidas a partir da zona subventricular (SVZ) tinha aumentado significativamente a capacidade de expansão como neuroesferas ou células em monocamadas aderentes. O protocolo AIH também foi associado com o aumento da expressão de um fator de transcrição "destino neuronal" (Pax6).
Deste modo, in vivo protocolos AIH pode proporcionar um meio para "Prime" NPCs antes da cultura. Por exemplo, os pedidos de esta abordagem poderia incluir a expansão das populações de células antes do transplante para o sistema nervoso central lesionado, ou simplesmente aumentando a diferenciação neuronal de células cultivadas antes de experiências in vitro. Além disso, porque esta é uma entrega sistémica, qualquerórgão, tecido ou célula é um candidato para o estudo semelhante. Portanto, o protocolo é como escrito potencialmente aplicáveis a uma ampla gama de estudos sobre a manipulação de oxigénio intermitente em pequenos mamíferos.
Existem algumas vantagens para esta abordagem. Em outro trabalho publicado, recém-nascidos foram tratados como uma ninhada com a barragem em câmaras hipobáricas, que permite a administração crónica, menos manuseio antes do tratamento, e manteve contato materno durante o tratamento 9. A abordagem actual ultrapassa tratamentos repetidos para uma fêmea de reprodução, ou o uso de uma barragem diferente para cada experimento. Este protocolo também permite o estudo de recém-nascidos pareados por ninhada e da mesma idade precisos. Os dados representativos demonstrar outra força fundamental deste protocolo, ou seja, a rapidez com que AIH, como entregue, provoca uma resposta biológica poderosa e consistente em biologia de células-tronco neurais. Isto estabelece um precedente para esse protocolo para provocar biologi Tecido e-nível celularcal mudanças que alteram a biologia celular.
Este relatório irá delinear os procedimentos detalhados utilizados para expor os filhotes de roedores a AIH, bem como a análise da população de células SVZ cultivadas como neurospheres.
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Protocol
NOTA: Todos os procedimentos com animais neste protocolo são realizadas com a aprovação da University of Florida Animal Care Institucional e Comitê de Uso (IACUC) e estão em conformidade com o "Guia para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório '.
1. Básica Experimental Set up antes da administração intermitente hipóxia
- Expor filhotes 12 a diferentes misturas de gás usando uma de corpo inteiro câmaras rato pletismógrafo em muito da mesma forma que roedores adultos para outros fins experimentais 5,13,14. As câmaras têm um diâmetro de 4 polegadas (volume = 450 ml), que é de tamanho suficiente para acomodar 3-4 filhotes de rato ou 1-2 crias de rato. Aqui, os protocolos de AIH são entregues aos recém-nascidos com idade pós-natal 1-8 dia (P1-P8).
- Use tanques de gás de ar comprimido para entregar a 21% do gás "linha de base", que mantém a oxigenação câmara em 21%. Para alcançar o "hipóxia relativa", use um / 90% tanque de gás nitrogênio de 10% de oxigênio.
NÃOE: tubos de plástico (3/16 "de diâmetro) conecta os tanques de gás de um medidor de caudal. Assim, a entrada para o medidor de fluxo é composto por um tubo para cada linha de base do fluxo de ar e hipóxia. - Configurar o tubo de gás como se segue.
- Executar tubo de plástico (diâmetro de 1/8 ") a partir do medidor de fluxo para um regulador de fluxo de polarização, o que permite que os fluxos de 1 L / min para cada câmara (ou seja, 4 litros / min, se são usadas câmaras 4).
- Executar tubo de plástico (diâmetro de 1/8 ") a partir do regulador de fluxo de polarização para as câmaras de pletismografia. O fluxo de ar a 1 L / min, para cada uma das câmaras é um caudal predeterminado em que a troca gasosa é considerada não-indução de stress para os animais, com base em observações comportamentais e fisiológicas.
- Vede todas as ligações não utilizadas de e para a unidade de fluxo de polarização e de todas as aberturas não utilizadas para as câmaras com tampas de modo que nenhum fluxo de gás escapa a outras câmaras não em uso, ou para fora das câmaras da pletismografia durante o protocolo.
- Coloque a câmara (s) Em uma incubadora antes de colocar os animais na câmara para permitir o equilíbrio a 37 ° C, ou a temperatura do corpo.
2. Calibração de Ciclo Times por hipóxia intermitente
- Inspecione toda a tubulação, entre tanques de ar e medidor de fluxo, medidor de fluxo e unidade de fluxo de polarização, e fluxo de viés unidade e câmara (s) pletismografia para as conexões adequadas. As conexões são configurados como descrito no Passo 1. Verifique a conexão por uma verificação passo a passo de todas as linhas descritas e fechamentos: por exemplo, verificando linhas não utilizadas fora da unidade de fluxo de polarização e as aberturas de câmara não estiver em uso.
- Ligue um ambiente sensor de O2 com um O 2 metros de mão e, em seguida, conecte o sensor à tampa da câmara pletismografia.
- Abra os dois tanques de gás e anexar um par de hemostats cirúrgicos, de cabo longo isolados com tubos de plástico para prender o fluxo fora de ciclo de gás. Desta forma, apenas um tanque de gás num momento está a fornecer o / min de fluxo de gás de 1 L por câmara. Prenda a mistura de gases de "linha de base", enquanto a mistura de gás "hipóxica" é entregue à câmara, e vice-versa.
- Grave o tempo requerido para a câmara de O 2 para alcançar os níveis pretendidos de 10% e regresso a 21%. Utilizar os tempos registrados para entrega protocolo subsequente.
3. Administração de hipóxia intermitente aguda
- Inspecione toda a tubulação e conexões conforme descrito no Passo 2.1.
- Coloque recém-nascidos na câmara (s) pletismografia e abrigar as tampas de câmara pletismografia na base da câmara. Confirmar uma vedação apropriada para o anel de vedação é assim como o fechamento da câmara de quaisquer ligações não utilizadas. Estes passos são críticos para assegurar o fornecimento adequado de misturas de gás.
- Coloque as câmaras que prendem os filhotes a ser tratada no 37 ° C incubadora e feche a porta. Permitir câmara para equilibrar a 37 ° C antes de se iniciar o protocolo. Manter os animais de controlo a 37 ° C no incubatou na sala de ar oxigenação.
- Abra os dois tanques de gás e usar um par de hemostats cirúrgicos, de cabo longo isolados com tubos de plástico para prender o fluxo fora de ciclo de gás. Desta forma, apenas um tanque de gás num momento está a fornecer o / min de fluxo de gás de 1 L por câmara.
- Use um cronômetro de mão para precisamente ciclos de tempo e para indicar a hora de mudar os hemostats entre tubos, resultando, assim, na alternância do fluxo de gás para as câmaras.
- Grave a conclusão de cada ciclo de tratamento usando um log, como o fornecido na Figura 1 para marcar todas as etapas do 2-step, 20 protocolo de ciclo.
- Monitorar a temperatura da incubadora em cada mudança de ciclo para assegurar animais são mantidos no intervalo designado (33-35 ° C, que é a configuração na incubadora que resulta em 37 ° C).
- Acompanhar de perto a atividade filhote ao longo do protocolo para garantir que os animais tolerar ciclos sem desgaste visível, como vocalizações, alteração do nível deatividade membro ou de rolamento.
4. Isolamento e Cultura de Células tronco / progenitoras da zona subventricular
NOTA: A alteração na formação neurosphere seguinte AIH comparados aos controles é um exemplo de um desfecho que demonstra a eficácia deste protocolo para provocar mudanças Tecido e de nível celular.
- Para isolar neurospheres formando células, remova ratinho ou um rato filhotes da câmara imediatamente após AIH está concluída. Sacrificar os animais de acordo com protocolos IACUC dentro de 30 min de cessação do protocolo.
- Colher o tecido SVZ, coloque na cultura neurosphere e conduzir passagem padrão e expansão da neurospheres derivativos, conforme publicado anteriormente em métodos capítulos 15,16 e um protocolo de vídeo separada 8.
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Representative Results
Os experimentos iniciais, com base em dados históricos, foram conduzidos utilizando comprimentos de ciclo 1 min. Com base nos calibrações subsequentes realizados no Passo 2 acima, determinou-se que o nível de O2 na câmara era de 13% em 1 min de lavagem pós-hipoxia e, que teve um tempo semelhante para voltar à linha de base de 21%. No entanto, um ciclo de 2 minutos foi suficiente tanto para alcançar 10% de oxigénio e um retorno a 21% durante o ciclo de "linha de base". Subsequentemente, os comprimentos de ciclo de 2 min têm sido utilizados. A duração protocolo consistiu de 20 ciclos alternados entre os valores iniciais e hipóxia (80 min tempo de tratamento total). A duração do ciclo 20 foi escolhido devido ao trabalho anterior mostrando que essa duração do ciclo é suficiente para provocar mudanças no resultado respiratório mede 11. Usando o descrito configurar (Figura 2), recém-nascidos submetidos a AIH não tinha eventos adversos aparentes e não apresentaram comportamentos sugestivos de dor e desconforto durante a 80min protocolo. Especificamente, não se observou apnéia do visível, de membros ou de cabeça movimentos excessivos, ou vocalizações. Seguindo HAI, populações de células subventricular derivada da zona do neurais estaminais / progenitoras cultivadas como neuroesferas, durante 14 dias (e populações monocamada também como aderentes, os dados não mostrados), exibem um aumento de quase duas-vezes no diâmetro, demonstrando um aumento de expansão no interior de cada esfera de formação (figura 3). As células que são em seguida plaqueadas em condições permissivas (isto é, ausência de factores mitogénicos) produzem significativamente mais células beta-3-positivo (um aumento de <10% a> 45%), que indica mais extensa a diferenciação neuronal em comparação com células colhidas a partir de normóxica tratados (controlo) filhotes (Figura 4).
Figura 1. Esta folha de registo IH aguda é utilizado para documentar animais e os detalhes experimentais, fornecer uma lista de verificação para antes de começar e após a conclusão do protocolo de IH, e servir como um documento de acompanhamento para registro exato de todos os ciclos completos.
Figura 2. hipóxia intermitente configurado para roedores neonatais. (A) Incubadora para manter o ambiente a 37 ° C. A pletismografia câmara é mostrada dentro da incubadora, e outra vez com a porta da câmara aberta (B). (C) com o botão direito, medidor de fluxo ajustado a 1 L / min para cada câmara. O caudal do gás é dirigido através do fluxo de polarização unidade unidade splitter (centro) a qualquer câmara conectada (à esquerda, dentro da incubadora). (D) controle Hemostat da linha de base (burocracia) e hipóxia (fita amarela) linhas de entrada. ank "> Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3. neuroesferas controle (A) demonstram um diâmetro menor do que o HAI neuroesferas (B). Imagens tiradas a 10X objetiva, barra de escala = 100 mm. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4. neurospheres controle (A) demonstram menos neuroblasts beta-3-tubulina-positivo do que neurospheres AIH (B). Imagens tiradas em 20X objetiva, barra de escala = 50 mm.g "target =" _ blank "> Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mouse plethysmography chambers | Buxco | PLY4211 | |
| Flow meter | Porter | F150 | |
| Bias flow unit | AFPS | ||
| Baseline Gas Mix | Airgas | AIZ300 | Compressed Air |
| Hypoxic Gas Mix | Airgas | X03NI72C2000189 | 10% Oxygen, balance nitrogen |
| Oxygen Meter | Teledyne | AX-300 |
References
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