Summary
Эта статья описывает методику введения короткие периоды прерывистого гипоксии в постнатальном день 1-8 мыши или крысят. Этот подход фактически вызывает устойчивый уровень ткань "грунтовки эффект" на культивируемых нейронных клеток-предшественников, которые собирают в течение 30 мин воздействия гипоксии.
Introduction
Цель этого метода заключается в воспроизводимо и эффективно доставить прерывистый приступы системного снижена кислородом воздуха для новорожденных грызунов. Обоснованием для использования прерывистый гипоксии (IH), чтобы манипулировать биологии стволовых клеток происходит от в пробирке экспериментов на клеточных культурах, в которых O 2 содержание питательных сред меняется. В частности, по сравнению с "стандартных" условиях 20% O 2, расширенный культуры клеточных популяций стволовых клеток / клеток-предшественников в 3% O 2 приводит к усилению пролиферации, апоптоза снизился и увеличилась нейронов выход 1,2.
Эта группа имеет значительный опыт работы с администрацией системного IH, и провел обширные исследования о роли IH в дыхательных пластичности 3-7. Эта работа, а также недавнее открытие, что хронический IH увеличился нейрогенез в грызуна ЦНС 8-10, формирует основу для исследования в естественных условиях остройгипоксия как предварительной подготовки стимула (т.е.., до сбора урожая ткани) на последующее культуры нервных стволовых клеток / клеток-предшественников (НПС) 11. Примечательно, что, когда щенков мыши подвергались краткого (<1 ч) периода острой перемежающейся гипоксии (АИГ), клетки, которые были собраны из субвентрикулярной зоне (SVZ) значительно увеличенную емкость для расширения как нейросферах или адгезивных клеток монослоя. Протокол АИГ был также связан с повышенной экспрессией в "нейронов судьба" фактора транскрипции (Pax6).
Соответственно, в естественных условиях протоколы АИГ может обеспечить средства для "премьер" НПС до культуры. Например, приложения для данного подхода может включать расширение популяции клеток перед трансплантацией в поврежденный центральной нервной системы, или просто повышение нейрональной дифференцировки культивированных клеток до экспериментов в пробирке. Кроме того, потому что это системный доставку любойорган, ткань или клетки является кандидатом на аналогичном исследовании. Таким образом, протокол, как написано потенциально применимы к широкому кругу исследований по прерывистой манипуляции кислорода в мелких млекопитающих.
Есть определенные преимущества такого подхода. В другой опубликованной работе, новорожденные были рассматриваться как помет с плотины в барокамер, что позволяет при хронических дозирования, меньше управляемость до лечения, и поддерживается материнской контакт во время лечения 9. Нынешний подход обходит повторные процедуры для разведения женщина, или использование другого плотины для каждого эксперимента. Этот протокол также позволяет исследование точных мусора соответствием и соответствующего возраста новорожденных. Представительства данные показывают еще один ключевой силу этого протокола, а именно скорость, с которой АИГ, как поставлено, вызывает мощной и последовательной биологическую реакцию в нервной биологии стволовых клеток. Это создает прецедент для этого протокола вызывать ткани, так и сотовой уровня биологически актические изменения, которые изменяют клеточной биологии.
Этот отчет будет наметить подробные процедуры, используемые для разоблачения грызунов щенков в АИГ, а также анализ популяции клеток, выращенных СВЗ в нейросфер.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
ПРИМЕЧАНИЕ: Все процедуры на животных в этом протоколе проводятся с одобрения Университета Флориды Институциональные животных уходу и использованию комитета (IACUC) и в соответствии с «Руководством по уходу и использованию лабораторных животных".
1. Основные Экспериментальная установка Перед администрации Прерывистый гипоксии
- Expose щенков 12 в различных газовых смесей с помощью всего тела мыши плетизмографа камеры во многом таким же образом, как для взрослых грызунов для других экспериментальных целях 5,13,14. Камеры имеют диаметр 4 дюйма (объем = 450 мл), который является достаточным для размера для щенков 3-4 мыши или 1-2 крысят. Здесь протоколы АИГ доставляются новорожденных в возрасте 1-8 день после рождения (Р1-Р8).
- Используйте сжатый воздух газовые баллоны, чтобы поставить 21% "базовый" газ, который поддерживает камеру кислородом на 21%. Для достижения "относительную гипоксию", используйте / 90% бензобак азота 10% кислорода.
НЕE: Пластиковые трубки (3/16 "диаметра) соединяет газовые баллоны с помощью расходомера. Таким образом, на вход расходомера состоит из одной трубы друг к базовой и гипоксии воздушного потока. - Настройка трубки газа следующим образом.
- Запуск пластмассовую трубку (1/8 "диаметр) от расходомера к регулятору потока смещения, которая позволяет потокам 1 л / мин в каждую камеру (т.е. 4 л / мин при использовании 4 камеры).
- Запустите пластиковые трубы (1/8 "диаметр) от регулятора потока смещения к плетизмографии камер. Воздушный поток на 1 л / мин в каждую камеру в заданной скорости потока, при которой газообмен считается не-стресс-индуцирующий животным, основанных на физиологические и поведенческие наблюдения.
- Закройте все неиспользуемые соединения и из блока потока смещения и все неиспользуемые отверстия в камерах с крышками, так что поток газа не не ускользает с другими камерами не в использовании, или из плетизмографии камеры во время протокола.
- Поместите камеру (ы) В инкубатор до ввода животных в камере для достижения равновесия до 37 ° С, или температуры тела.
2. Калибровка рабочего цикла при эпизодическом гипоксии
- Осмотрите все трубки, между воздушными танков и расходомера, расходомера и блока поток смещения, и потока смещения блока и плетизмографии камеру (ы) для собственных соединений. В связи устанавливаются, как описано в шаге 1. Проверьте подключение по ступенчатым проверки всех описанных линий и закрытие: например, проверка блока потока смещения неиспользуемые линии и отверстия камеры не используется.
- Подключите датчик O 2 окружающей среды с ручным O 2 метра, а затем прикрепить датчик к крышке плетизмография камеры.
- Откройте оба газовых баллонов и приложите одну пару хирургических, долго обрабатываются кровоостанавливающих с изоляцией пластиковых труб для закрепления поток от цикла газа. Таким образом, только один топливный бак, в то время как доставку 1 л / мин поток газа в камере, Зажмите "базовый" газа смесь в то время как "гипоксического" газа смесь поставляется в камеру, и наоборот.
- Запишите время, необходимое для камерного O 2, чтобы достичь целевых уровней 10% и вернуться к 21%. Использование записанных раз для последующей доставки протокола.
3. Администрация острой перемежающейся гипоксии
- Осмотрите все трубки и соединения, как описано в шаге 2.1.
- Поместите новорожденных в плетизмографии камеры (ов) и дом плетизмография камеры крышки в камеру базы. Подтверждение надлежащее уплотнение на уплотнительное кольцо на, а также закрытие неиспользованные камерных соединений. Эти шаги имеют решающее значение для обеспечения надлежащего доставку газовых смесей.
- Поместите камеры проведение щенков лечиться в 37 ° C инкубатора и закрыть дверь. Разрешить камеру, чтобы уравновесить до 37 ° C перед началом протокола. Поддержание контрольных животных на 37 ° C в incubatили при комнатной воздуха кислородом.
- Откройте оба газовых баллонов и использовать одну пару хирургических, долго обрабатываются кровоостанавливающих с изоляцией пластиковых труб для закрепления поток от цикла газа. Таким образом, только один газовый баллон, в то время как доставку 1 л / мин поток газа в камере.
- Используйте ручной таймер именно временных циклов и указать время для переключения между кровоостанавливающих труб, в результате чего в чередовании потока газа в камерах.
- Запишите завершение каждого цикла с использованием протокола лечения, такие как предоставляемую на рисунке 1, отметьте все этапы, протокол 2-ступенчатой 20 цикла.
- Монитор температуры инкубаторе при каждом изменении цикла, чтобы обеспечить животных поддерживают на указанном диапазоне (33-35 ° C, которая является местом на инкубаторе, что приводит к 37 ° C).
- Внимательно следить за щенка деятельность на протяжении протокола для того, чтобы животные переносят циклы без видимых бедствия, такие как вокализации, измененный уровеньдеятельность конечностей или прокатки.
4. Выделение и культивирование стволовых клеток / клеток-предшественников из субвентрикулярной зоны
ПРИМЕЧАНИЕ: Изменение в формировании нейросфера следующие АИГ по сравнению с контрольной является примером конечной точки, который демонстрирует эффективность этого протокола, чтобы выявить ткани, так и сотовой изменения уровней.
- Чтобы изолировать нейросферы клетки, формирующие, удалить мышь или крыса щенков из камеры сразу же после АИГ завершена. Жертвоприношение животных в соответствии с протоколами IACUC в течение 30 мин прекращения протокола.
- Заготавливают СВЗ ткани, поместить в нейросфера культуры и проводить стандартную проход и расширение производных нейросфер, опубликованные ранее в главах методы 15,16 и отдельной видео протокола 8.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Начальные эксперименты, основанные на исторических данных, были проведены с использованием длины цикла 1 мин. На основании последующих калибровок на стадии 2 выше, было установлено, что уровень O 2 в камере 13% по 1 мин после гипоксии промывки и, что он принял аналогичное время, чтобы вернуться в 21% исходного уровня. Тем не менее, 2 мин цикл был достаточно как достижения 10% кислорода и возвращение к 21% во время «базового» цикла. Впоследствии, длина 2 мин цикла были использованы. Продолжительность протокол состоял из 20 чередующихся циклов базовых и гипоксии (80 мин времени в целом лечение). Продолжительность цикла в 20 было выбрано в связи с предыдущей работой, показывая, что такое продолжительности цикла достаточно, чтобы вызвать изменения в дыхательной исхода измеряет 11. Использование описанной настроить (рисунок 2), новорожденные, подвергшиеся АИГ не было явных побочных эффектов и не проявляют поведения, указывающие на боль и дискомфорт во время 80мин протокола. В частности, не видны апноэ не наблюдалось, чрезмерные конечностей или головы движения, или вокализации. После АИГ, зона полученных нейронные популяции субвентрикулярная стволовых / прогениторных клеток культивировали в нейросферах в течение 14 дней (а также в качестве адгезивных популяций монослойных, данные не показаны) демонстрируют почти двукратное увеличение диаметра, демонстрируя повышенную расширение в каждой формовочной области (рис 3). Клетки, которые находятся рядом помещают в разрешающих услови х (т.е. отсутствие митогенных факторов) дают значительно больше бета-3-позитивные клетки (увеличение с <10% до> 45%), который указывает более широкое дифференцировку нейронов по сравнению с клетками, собранных с нормоксических обработанные (контроль) щенков (Рисунок 4).
Рисунок 1. Это острое IH регистрационный лист используется для документирования животное и экспериментальные данные, обеспечить контрольный список для начала и, прежде чем после завершения протокола IH, и служить в качестве документа для точного отслеживания подсчет всех завершенных циклов.
Рисунок 2. Периодическое гипоксия настроен на новорожденных грызунов. (A) инкубатор для поддержания среды при 37 ° С. Плетизмография камера показана в инкубаторе, и снова дверь камеры приоткрыта (B). (С) Право, метр доводят до 1 л / мин для каждой камеры течь. Газовый поток направляется через блок смещения блока сплиттера блока (в центре) на любом подключенном камеры (слева, в инкубаторе). (D), кровоостанавливающего контроль исходного уровня (красный лента) и гипоксия (желтая лента) входных линий. АНК "> Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3. нейросферы управления (A) демонстрируют меньший диаметр, чем АИГ нейросферах (B). Изображения, снятые в 10-кратным цель, масштаб бар = 100 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 4. нейросферы управления (A) демонстрируют меньше бета-тубулина 3-положительным нейробластов-чем АИГ нейросферах (б). Изображения, снятые в 20-кратным цель, масштаб бар = 50 мкм.г "целевых =" _blank "> Нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mouse plethysmography chambers | Buxco | PLY4211 | |
| Flow meter | Porter | F150 | |
| Bias flow unit | AFPS | ||
| Baseline Gas Mix | Airgas | AIZ300 | Compressed Air |
| Hypoxic Gas Mix | Airgas | X03NI72C2000189 | 10% Oxygen, balance nitrogen |
| Oxygen Meter | Teledyne | AX-300 |
References
- Studer, L., et al. Enhanced proliferation, survival, and dopaminergic differentiation of CNS precursors in lowered oxygen. J Neurosci. 20 (19), 7377-7383 (2000).
- Chen, H. L., et al. Oxygen tension regulates survival and fate of mouse central nervous system precursors at multiple levels. Stem Cells. 25 (9), 2291-2301 (2007).
- Ling, L., et al. Chronic intermittent hypoxia elicits serotonin-dependent plasticity in the central neural control of breathing. J Neurosci. 21 (14), 5381-5388 (2001).
- Mitchell, G. S., et al. Invited review: Intermittent hypoxia and respiratory plasticity. J Appl Physiol. 90 (6), 2466-2475 (2001).
- Fuller, D. D., Zabka, A. G., Baker, T. L., Mitchell, G. S. Phrenic long-term facilitation requires 5-HT receptor activation during but not following episodic hypoxia. J Appl Physiol. 90 (5), 2001-2006 (2001).
- Fuller, D. D., Johnson, S. M., Olson, E. B., Mitchell, G. S. Synaptic pathways to phrenic motoneurons are enhanced by chronic intermittent hypoxia after cervical spinal cord injury. J Neurosci. 23 (7), 2993-3000 (2003).
- Baker-Herman, T. L., et al. BDNF is necessary and sufficient for spinal respiratory plasticity following intermittent hypoxia. Nat Neurosci. 7 (1), 48-55 (2004).
- Zhu, L. L., et al. Neurogenesis in the adult rat brain after intermittent hypoxia. Brain Res. 1055, 1-6 (2005).
- Zhang, J. X., Chen, X. Q., Du, J. Z., Chen, Q. M., Zhu, C. Y. Neonatal exposure to intermittent hypoxia enhances mice performance in water maze and 8-arm radial maze tasks. Journal of neurobiology. 65 (1), 72-84 (2005).
- Zhu, L. L., Wu, L. Y., Yew, D. T., Fan, M. Effects of hypoxia on the proliferation and differentiation of NSCs. Mol Neurobiol. 31 (1-3), 231-242 (2005).
- Ross, H. H., et al. In vivo intermittent hypoxia elicits enhanced expansion and neuronal differentiation in cultured neural progenitors. Exp Neurol. 235 (1), 238-245 (2012).
- Fuller, D. D., et al. Induced recovery of hypoxic phrenic responses in adult rats exposed to hyperoxia for the first month of life. J Physiol. 536 (Pt 3), 917-926 (2001).
- Fuller, D. D., Fregosi, R. F. Fatiguing contractions of tongue protrudor and retractor muscles: influence of systemic hypoxia. J Appl Physiol. 88 (6), 2123-2130 (2000).
- Baker, T. L., Fuller, D. D., Zabka, A. G., Mitchell, G. S. Respiratory plasticity: differential actions of continuous and episodic hypoxia and hypercapnia. Respir Physiol. 129 (1-2), 25-35 (2001).
- Marshall, G. P. 2nd, et al. Production of neurospheres from CNS tissue. Methods Mol Biol. 438, 135-150 (2008).
- Azari, H., Rahman, M., Sharififar, S., Reynolds, B. A. Isolation and expansion of the adult mouse neural stem cells using the neurosphere assay. J Vis Exp. (45), (2010).
