Summary
En este artículo se describe la metodología para la administración de cortos períodos de hipoxia intermitente para postnatales días 1-8 de ratón o rata crías. Este enfoque suscita efectivamente un nivel de tejido robusto "efecto priming" en células progenitoras neurales cultivadas que se cosechan en los 30 minutos de exposición a la hipoxia.
Introduction
El objetivo de este método es para entregar de forma reproducible y eficaz episodios intermitentes de oxígeno ambiental sistémica rebajado a los roedores neonatales. La justificación del uso de la hipoxia intermitente (IH) para manipular la biología de células madre se origina a partir de experimentos de cultivo celular in vitro en el que se altera O 2 contenido del medio de crecimiento. En concreto, si se compara con las condiciones "estándar" de 20% de O 2, cultivo prolongado de células madre / progenitoras células poblaciones celulares en 3% O 2 resultados en un aumento de la proliferación, la disminución de la apoptosis y el aumento de 1,2 rendimiento neuronal.
Este grupo tiene una gran experiencia con la administración de IH sistémica, y ha realizado extensos estudios sobre el papel de IH en la plasticidad respiratoria 3-7. Este trabajo, y el hallazgo reciente que IH crónica aumenta la neurogénesis en el roedor CNS 8-10, constituye la base para la exploración de aguda in vivohipoxia como estímulo acondicionamiento previo (es decir., antes de la cosecha de tejidos) en el posterior cultivo de células madre / progenitoras neuronales (CPN) 11. Sorprendentemente, cuando crías de ratón fueron expuestos a un breve período (<1 hr) de la hipoxia intermitente aguda (AIH), las células que fueron cosechadas de la zona subventricular (SVZ) habían aumentado significativamente la capacidad para la expansión como neuroesferas o monocapa de células adherentes. El protocolo AIH también se asoció con un aumento de la expresión de un factor de "destino neuronal" transcripción (Pax6).
En consecuencia, en vivo protocolos AIH pueden proporcionar un medio para "prime" NPCs antes del cultivo. Por ejemplo, las solicitudes de este enfoque podrían incluir la expansión de poblaciones de células antes del trasplante en el sistema nervioso central lesionado, o el simple aumento de la diferenciación neuronal de células cultivadas antes de los experimentos in vitro. Además, dado que se trata de una administración sistémica, cualquierórgano, tejido o célula es un candidato para el estudio similar. Por lo tanto, el protocolo como escrito es potencialmente aplicable a una amplia gama de estudios sobre la manipulación de oxígeno intermitente en pequeños mamíferos.
Hay ciertas ventajas de este enfoque. En otro trabajo publicado, los neonatos fueron tratados como una camada con la presa en cámaras hipobárica, que permite la dosificación crónica, menos manipulación antes del tratamiento, y se mantienen contactos materna durante el tratamiento 9. El enfoque actual no pasa por tratamientos repetidos a una hembra reproductora, o el uso de una presa diferente para cada experimento. Este protocolo también permite el estudio de los recién nacidos de basura de concordancia y de la misma edad precisas. Los datos representativos demuestran otra fortaleza clave de este protocolo, es decir, la rapidez con la que AIH, como entregado, provoca una respuesta biológica potente y consistente en la biología de las células madre neurales. Esto establece un precedente para este protocolo para obtener biologi tejidos y nivel celularCal cambios que alteran la biología celular.
Este informe se esbozarán los procedimientos detallados utilizados para la exposición de las crías de roedores a AIH, así como el análisis de la población de las células SVZ crecido como neuroesferas.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
NOTA: Todos los animales procedimientos en este protocolo se llevan a cabo con la aprobación de la Universidad de Florida Institucional Cuidado de Animales y el empleo Comisión (IACUC) y están en cumplimiento de la 'Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio ".
1. Experimental básico establecido antes de la administración intermitente Hipoxia
- Expose cachorros 12 a las diferentes mezclas de gas usando un conjunto de cuerpo cámaras de pletismógrafo ratón en mucho la misma manera que los roedores adultos para otros fines experimentales 5,13,14. Las cámaras tienen un diámetro de 4 pulgadas (volumen = 450 ml), que es de tamaño amplio para acomodar 3-4 crías de ratón o 1-2 crías de rata. Aquí, los protocolos de HAI se entregan a los recién nacidos el día postnatal 1-8 (P1-P8) años.
- Utilice los tanques de gas de aire comprimido para entregar el gas "línea de base" 21%, lo que mantiene la oxigenación de cámara en un 21%. Para lograr la "hipoxia relativa", utilice un tanque de gas nitrógeno 10% de oxígeno / 90%.
NOE: Los tubos de plástico (3/16 "de diámetro) conecta los tanques de gas para un medidor de flujo. Por lo tanto, la entrada al medidor de flujo consiste en un tubo para cada línea de base y el flujo de aire hipoxia. - Configure el tubo de gas de la siguiente manera.
- Ejecutar tubo de plástico (1/8 "de diámetro) desde el medidor de flujo a un regulador de flujo de sesgo, que permite a los flujos de 1 L / min a cada cámara (es decir, 4 L / min si se utilizan cámaras 4).
- Ejecutar un tubo de plástico (1/8 "de diámetro) del regulador de flujo sesgo a las cámaras de pletismografía. El flujo de aire a 1 L / min a cada cámara es una velocidad de flujo predeterminada a la que se considera el intercambio de gases a ser no de inducción de estrés a los animales sobre la base de observaciones fisiológicas y de comportamiento.
- Selle todas las conexiones no utilizadas hacia y desde la unidad de flujo sesgo y todas las aberturas no utilizadas a las cámaras con tapas de manera que no hay flujo de gas se escapa a otras cámaras no están en uso, o fuera de las cámaras de pletismografía durante el protocolo.
- Coloque la cámara (s) En una incubadora antes de poner los animales en la cámara para permitir el equilibrio a 37 ° C, o temperatura corporal.
2. Calibración de los tiempos de ciclo de hipoxia intermitente
- Inspeccione todos los tubos, entre los tanques de aire y medidor de flujo, el flujo unidad de metro y la unidad de flujo de sesgo, y el flujo de sesgo y la cámara (s) pletismografía para las conexiones adecuadas. Las conexiones se configuran como se describe en el Paso 1. Verifique la conexión de un control gradual de todas las líneas y los cierres descritos: por ejemplo, la comprobación de líneas no utilizadas lejos de la unidad de flujo de sesgo y las aberturas de la cámara no esté en uso.
- Conecte un sensor de ambiente O2 con un O 2 metros de mano y luego conecte el sensor a la tapa de la cámara pletismografía.
- Abra las dos tanques de gas y conecte un par de pinzas quirúrgicas, de mango largo aislados con tubo de plástico para sujetar el flujo fuera de ciclo de gas. De esta manera, sólo un tanque de gas a la vez es la entrega de la 1 L / min de flujo de gas por cámara. Sujete la mezcla de gas "línea de base", mientras que la mezcla de gas "hipóxica" se entrega a la cámara, y viceversa.
- Registre el tiempo requerido para la cámara de O 2 para llegar a los niveles objetivo de 10% y volver a 21%. Utilizar los tiempos registrados para la entrega de protocolo subsiguiente.
3. Administración de aguda intermitente Hipoxia
- Inspeccionar todos los tubos y las conexiones como se describe en el Paso 2.1.
- Coloca los recién nacidos en la cámara (s) pletismografía y albergar a las tapas de la cámara pletismografía en la base de la cámara. Confirmar un sello propio de la junta tórica es así como el cierre de las conexiones de cámara no utilizadas. Estos pasos son fundamentales para garantizar la prestación adecuada de mezclas de gases.
- Coloque las cámaras de la celebración de los cachorros para ser tratados en la incubadora a 37 ° y cierran la puerta. Permitir que la cámara se equilibre a 37 ° C antes de iniciar el protocolo. Mantener los animales de control a 37 ° C en el incubato en la sala de la oxigenación del aire.
- Abra las dos tanques de gas y el uso de un par de pinzas quirúrgicas, de mango largo aislados con tubo de plástico para sujetar el flujo fuera de ciclo de gas. De esta manera, sólo un tanque de gas a la vez es la entrega de la 1 L / min de flujo de gas por cámara.
- Use un cronómetro de mano para, precisamente, ciclos de tiempo y para indicar el momento de cambiar las pinzas hemostáticas entre tubos, lo que resulta en la alternancia de flujo de gas a las cámaras.
- Registre la terminación de cada ciclo usando un registro de tratamiento tal como el proporcionado en la Figura 1 para marcar todos los pasos del 2-paso, protocolo de ciclo de 20.
- Monitorear la temperatura de la incubadora en cada cambio de ciclo para asegurar que los animales se mantienen en el rango señalado (33-35 ° C, que es el ajuste en la incubadora que se traduce en 37 ° C).
- Seguir de cerca la actividad de las crías durante todo el protocolo para asegurar que los animales toleran ciclos sin angustia visible como vocalizaciones, alteración del nivel deactividad de la integridad física o la rodadura.
4. Aislamiento y cultivo de células madre / progenitoras de células de la zona subventricular
NOTA: El cambio en la formación neuroesfera siguiente AIH comparación con los controles es un ejemplo de un punto final que demuestra la eficacia de este protocolo para provocar cambios en tejidos y nivel celular.
- Para aislar neuroesferas forman células, retire ratón o rata crías de la cámara inmediatamente después de HAI se ha completado. Sacrificio de los animales de acuerdo a los protocolos del IACUC dentro de los 30 min de terminación de protocolo.
- Recoger el tejido SVZ, coloque en la cultura neuroesfera y llevar a cabo el paso y la expansión de neuroesferas derivados estándar, según lo publicado previamente en métodos capítulos 15,16 y un protocolo de video por separado 8.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Los experimentos iniciales, basados en datos históricos, se realizaron utilizando longitudes de ciclo 1 min. Sobre la base de las calibraciones posteriores realizadas en el Paso 2 anterior, se determinó que el nivel de O 2 en la cámara era 13% en 1 min de lavado post-hipoxia y, que tomó un tiempo similar para volver a la línea de base 21%. Sin embargo, un ciclo de 2 min era suficiente para lograr tanto 10% de oxígeno y un retorno a 21% durante el ciclo de "línea base". Posteriormente, se han utilizado longitudes de ciclo 2 min. La duración protocolo consistió en 20 ciclos alternados entre el inicio y la hipoxia (80 min tiempo de tratamiento global). Una duración de 20 ciclos fue elegido debido a trabajos anteriores que muestran que dicha duración del ciclo es suficiente para provocar cambios en el resultado respiratoria mide 11. Utilizando el descrito configurar (Figura 2), recién nacidos sometidos a AIH no tenían efectos adversos aparentes y no mostraron comportamientos sugestivos de dolor y molestias durante el 80Protocolo min. Específicamente, no se observó apnea visible, o de las extremidades de cabeza movimientos excesivos, o vocalizaciones. Después de AIH, neurales poblaciones de células madre / progenitoras zona derivado de subventricular cultivaron como neuroesferas durante 14 días (y poblaciones monocapa también como adherentes, datos no mostrados) exhiben un aumento de casi el doble de diámetro, lo que demuestra una mayor expansión dentro de cada esfera de conformado (figura 3). Las células que están al lado colocaron en placas en condiciones permisivas (es decir, ausencia de factores mitogénicos) Rendimiento número significativamente mayor de células beta-3-positivo (un aumento de <10% a> 45%), que indica más extensa diferenciación neuronal en comparación con células cosechadas a partir de normoxia tratados (control) cachorros (Figura 4).
Figura 1. Esta hoja aguda registro IH se utiliza para documentar los animales y los detalles experimentales, proporcionan una lista de verificación para antes de empezar y una vez finalizado el protocolo de IH, y sirven como un documento de seguimiento para recuento preciso de todos los ciclos completados.
Figura 2. hipoxia intermitente configurado para roedores neonatales. (A) Incubadora de mantener el medio ambiente a 37 ° C. Cámara de pletismografía se muestra dentro de la incubadora, y de nuevo con la puerta de la cámara abierta (B). (C) Derecho, medidor de flujo se ajustó a 1 L / min para cada cámara. El flujo de gas se dirige a través de la unidad de unidad de divisor de flujo de sesgo (centro) a cualquier cámara conectada (a la izquierda, dentro de la incubadora). (D) el control hemostático de la línea de base (la cinta roja) y la hipoxia (cinta amarilla) líneas de entrada. ank "> Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3. neuroesferas control (A) demuestran un diámetro menor que AIH neuroesferas (B). Imágenes tomadas en 10X objetivo barra de escala = 100 micras. Por favor haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4. neuroesferas de control (A) demuestran menos neuroblastos beta-3-tubulina-positivas que neuroesferas AIH (B). Imágenes tomadas en 20X objetivo barra de escala = 50 micras.g "target =" _ blank "> Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mouse plethysmography chambers | Buxco | PLY4211 | |
| Flow meter | Porter | F150 | |
| Bias flow unit | AFPS | ||
| Baseline Gas Mix | Airgas | AIZ300 | Compressed Air |
| Hypoxic Gas Mix | Airgas | X03NI72C2000189 | 10% Oxygen, balance nitrogen |
| Oxygen Meter | Teledyne | AX-300 |
References
- Studer, L., et al. Enhanced proliferation, survival, and dopaminergic differentiation of CNS precursors in lowered oxygen. J Neurosci. 20 (19), 7377-7383 (2000).
- Chen, H. L., et al. Oxygen tension regulates survival and fate of mouse central nervous system precursors at multiple levels. Stem Cells. 25 (9), 2291-2301 (2007).
- Ling, L., et al. Chronic intermittent hypoxia elicits serotonin-dependent plasticity in the central neural control of breathing. J Neurosci. 21 (14), 5381-5388 (2001).
- Mitchell, G. S., et al. Invited review: Intermittent hypoxia and respiratory plasticity. J Appl Physiol. 90 (6), 2466-2475 (2001).
- Fuller, D. D., Zabka, A. G., Baker, T. L., Mitchell, G. S. Phrenic long-term facilitation requires 5-HT receptor activation during but not following episodic hypoxia. J Appl Physiol. 90 (5), 2001-2006 (2001).
- Fuller, D. D., Johnson, S. M., Olson, E. B., Mitchell, G. S. Synaptic pathways to phrenic motoneurons are enhanced by chronic intermittent hypoxia after cervical spinal cord injury. J Neurosci. 23 (7), 2993-3000 (2003).
- Baker-Herman, T. L., et al. BDNF is necessary and sufficient for spinal respiratory plasticity following intermittent hypoxia. Nat Neurosci. 7 (1), 48-55 (2004).
- Zhu, L. L., et al. Neurogenesis in the adult rat brain after intermittent hypoxia. Brain Res. 1055, 1-6 (2005).
- Zhang, J. X., Chen, X. Q., Du, J. Z., Chen, Q. M., Zhu, C. Y. Neonatal exposure to intermittent hypoxia enhances mice performance in water maze and 8-arm radial maze tasks. Journal of neurobiology. 65 (1), 72-84 (2005).
- Zhu, L. L., Wu, L. Y., Yew, D. T., Fan, M. Effects of hypoxia on the proliferation and differentiation of NSCs. Mol Neurobiol. 31 (1-3), 231-242 (2005).
- Ross, H. H., et al. In vivo intermittent hypoxia elicits enhanced expansion and neuronal differentiation in cultured neural progenitors. Exp Neurol. 235 (1), 238-245 (2012).
- Fuller, D. D., et al. Induced recovery of hypoxic phrenic responses in adult rats exposed to hyperoxia for the first month of life. J Physiol. 536 (Pt 3), 917-926 (2001).
- Fuller, D. D., Fregosi, R. F. Fatiguing contractions of tongue protrudor and retractor muscles: influence of systemic hypoxia. J Appl Physiol. 88 (6), 2123-2130 (2000).
- Baker, T. L., Fuller, D. D., Zabka, A. G., Mitchell, G. S. Respiratory plasticity: differential actions of continuous and episodic hypoxia and hypercapnia. Respir Physiol. 129 (1-2), 25-35 (2001).
- Marshall, G. P. 2nd, et al. Production of neurospheres from CNS tissue. Methods Mol Biol. 438, 135-150 (2008).
- Azari, H., Rahman, M., Sharififar, S., Reynolds, B. A. Isolation and expansion of the adult mouse neural stem cells using the neurosphere assay. J Vis Exp. (45), (2010).
