Summary
I den här artikeln beskrivs metoden för att administrera korta perioder av intermittent hypoxi till postnatal dag 1-8 mus eller råttungar. Detta tillvägagångssätt effektivt framkallar en robust vävnadsnivå "priming effekt" på odlade neurala stamceller som skördas inom 30 min av hypoxi exponering.
Introduction
Målet med denna metod är att reproducerbart och effektivt leverera intermittent anfall av systemisk sänkt omgivnings syre till nyfödda gnagare. Den logiska grunden för att använda intermittent hypoxi (IH) att manipulera stamcellsbiologi kommer från i cellodlings vitro experiment där O2 halt av odlingsmediet ändras. Speciellt jämfört med "vanliga" villkoren för 20% O 2, förlängd kultur av stam / progenitorceller cellpopulationer celler i 3% O 2 resulterar i ökad spridning, minskad apoptos och ökad neuronal avkastning 1,2.
Denna grupp har betydande erfarenhet av administration av system IH, och har genomfört omfattande studier om vilken roll IH i andnings plasticitet 3-7. Detta arbete, och den senaste upptäckten att kronisk IH ökad neurogenes i gnagare CNS 10/08, utgör grunden för utforskning av akut in vivohypoxi som konditionerings stimulus (dvs. före vävnads skörd) på den efterföljande kultur neurala stam / progenitorceller (NPC) 11. Anmärkningsvärt, när musen ungar utsattes för en kort (<1 timme) period av akut intermittent hypoxi (AIH), celler som skördades från subventrikulära zonen (SVZ) hade signifikant ökad kapacitet för expansion som neurospheres eller vidhäftande monoskiktceller. Den AIH-protokollet var också förenad med ökad expression av en "neuronal öde" transkriptionsfaktor (Pax6).
Följaktligen in vivo AIH protokoll kan tillhandahålla ett medel för att "prime" NPC före odling. Till exempel kan applikationer för detta tillvägagångssätt inkluderar expanderande cellpopulationer före transplantation in i skadade centrala nervsystemet, eller att helt enkelt öka neuronal differentiering av odlade celler före försök in vitro. Vidare, eftersom detta är en systemisk tillförsel, någonorgan, vävnad eller cell är en kandidat för liknande studie. Därför är det protokoll som skrivet potentiellt tillämplig på ett brett spektrum av studier på intermittent syre manipulation i små däggdjur.
Det finns vissa fördelar med detta tillvägagångssätt. I andra publicerade arbeten, var nyfödda behandlas som en kull med dammen i hypobaric kammare, som gör det möjligt för kronisk dosering, mindre hantering före behandlingen, och underhållas moderns kontakt under behandlingen 9. Den nuvarande metoden kringgår upprepade behandlingar till en avelshona, eller användning av en annan damm för varje experiment. Detta protokoll kan också studera exakta kull-matchade och åldersmatchade nyfödda. Representativa data visar en annan viktig styrka detta protokoll, nämligen den snabbhet med vilken AIH, som levereras, framkallar en kraftfull och konsekvent biologiskt svar i neurala stamcellsbiologi. Det skapar ett prejudikat för detta protokoll för att framkalla vävnads- och cellnivå biological förändringar som förändrar cellbiologi.
Denna rapport kommer att beskriva de detaljerade förfaranden som används för att exponera gnagare valpar till AIH samt populationsanalys av SVZ celler odlas som neurosfärer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
OBS: Alla djurförsök i detta protokoll genomförs med godkännande av University of Florida Institutional Animal Care och användning kommittén (IACUC) och är i överensstämmelse med "Guide för skötsel och användning av försöksdjur.
1. Grund Experimental Ställ in Innan Intermittent Hypoxi Administration
- Exponera valpar 12 till de olika gasblandningar med hjälp av en hela kroppen mus pletysmograf kammare på ungefär samma sätt som vuxna gnagare på andra experimentsyfte 5,13,14. Kamrarna har en 4 tums diameter (volym = 450 ml), som är riklig storlek för att rymma 3-4 musungar eller 1-2 råttungar. Här är AIH protokoll levereras till nyfödda åldern postnatal dag 1-8 (P1-P8).
- Använd tryckluftsgastankar att leverera 21% "baseline" gas, som upprätthåller kammar syresättning på 21%. För att uppnå "relativ hypoxi", använd en 10% syre / 90% kväve gastank.
INTEE: Plaströr (3/16 "diameter) ansluter gastankarna till en flödesmätare. Sålunda ingången till flödesmätaren består av ett rör vardera för baslinje och hypoxi luftflöde. - Konfigurera gasen slangen enligt följande.
- Kör plaströr (1/8 "i diameter) från flödesmätaren till en bias flödesregulator, som möjliggör flöden av 1 l / min till varje kammare (dvs, 4 l / min om 4 kamrar används).
- Kör plaströr (1/8 "diameter) från bias flödesregulator till pletysmografi kamrarna. Luftflöde vid ett L / min till varje kammare är en förutbestämd flödeshastighet, vid vilken gasväxling anses vara icke-stress-inducing till djuren baserade på fysiologiska och beteendeobservationer.
- Förslut alla oanvända anslutningar till och från bias flödesenheten och alla oanvända öppningar till kamrarna med locken så att ingen gasflödet flyr till andra kammare inte används, eller ut ur pletysmografi kamrarna under protokollet.
- Placera kammaren (er) I en inkubator innan sätta djuren i kammaren för att tillåta ekvilibrering till 37 ° C, eller kroppstemperatur.
2. Kalibrering av cykeltider för intermittent hypoxi
- Inspektera alla slangar, mellan lufttankar och flödesmätare, flödesmätare och fördomar flödesenhet och fördomar flödesenhet och pletysmografi kammare (s) för korrekta anslutningar. Anslutningarna har inrättats som beskrivs i steg 1. Kontrollera anslutningen av en stegvis kontroll av alla beskrivna linjer och nedläggningar: t.ex. kontroll outnyttjade av bias flödesenheten och eventuella kammaröppningar inte används.
- Anslut en omgivnings O 2 sensor med en handhållen O 2 meter och sedan bifoga sensorn till locket pletysmografi kammaren.
- Öppna båda gastankar och bifoga ett par av kirurgiska, lång hanteras peanger isolerade med plaströr att klämma off-cykeln gasflöde. På detta sätt är endast en gastank i taget leverera en l / min gasflöde per kammare. Klämma "baseline" gasblandningen medan "hypoxisk" gasblandningen levereras till kammaren, och vice versa.
- Notera den tid som krävs för kammar O 2 för att nå de målnivåer av 10% och återgå till 21%. Utnyttja de inspelade gånger för efterföljande protokoll leverans.
3. Administration av akut intermittent hypoxi
- Inspektera alla slangar och anslutningar som beskrivs i steg 2.1.
- Placera nyfödda i pletysmografi kammaren (s) och hysa pletysmografi kammar locken in i kammaren basen. Bekräfta en ordentlig tätning mot O-ringen är samt stängning av oanvända kammaranslutningar. Dessa steg är avgörande för att säkerställa en lämplig leverans av gasblandningar.
- Placera kamrarna håller valparna som skall behandlas in i 37 ° C inkubator och stänga dörren. Låt kammaren till jämvikt till 37 ° C före start av protokollet. Behåll kontrolldjur vid 37 ° C i incubateller rumsluft syresättning.
- Öppna båda gastankar och använda ett par av kirurgiska, lång hanteras peanger isolerade med plaströr att klämma off-cykeln gasflöde. På detta sätt är endast en gastank i taget leverera en l / min gasflöde per kammare.
- Använd en handhållen timer för att exakt tidscykler och ange tid att byta peanger mellan rören, vilket resulterar i växlingen mellan gasflödet till kamrarna.
- Registrera slutförandet av varje cykel med en metod som log som det som föreskrivs i figur 1 för att markera alla steg i två steg, 20 cykel protokoll.
- Övervaka inkubatortemperaturen vid varje cykel förändring för att säkerställa djuren hålls vid den angivna intervallet (33-35 ° C, vilket är inställningen på inkubatorn som resulterar i 37 ° C).
- Noga övervaka valpen aktivitet i protokollet för att se till att djuren tål cykler utan synlig nöd såsom läten, förändrad nivålem verksamhet eller valsning.
4. Isolering och kultur av stam- / progenitorceller från subventrikulära zonen
OBS: Förändringen i neurosphere bildning efter AIH jämfört med kontroller är ett exempel på en slutpunkt som visar effekten av detta protokoll för att framkalla vävnads- och cellnivå förändringar.
- För att isolera neurospheres bildande celler, ta bort musen eller råttungar från kammaren omedelbart efter AIH är klar. Offra djuren enligt IACUC protokoll inom 30 minuter protokoll uppsägning.
- Skörda SVZ vävnad, placera i neurosphere kultur och genomföra standard passage och expansion av derivatneurosfärer, som tidigare publicerats i metoder kapitlen 15,16 och en separat video protokoll 8.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De initiala experiment, baserat på historiska data, genomfördes med hjälp av en min cykellängder. Baserat på de efterföljande kalibreringar som gjorts i steg 2 ovan bestämdes att O 2-nivå i kammaren var 13% vid 1 min efter hypoxi spolning och att det tog en liknande tid att återgå till baslinjen 21%. Det var en 2 min cykel är tillräcklig för att både uppnå 10% syre och en återgång till 21% under "baseline" cykel. Därefter har två min cykellängder använts. Protokollet varaktighet bestod av 20 cykler alternerande mellan baslinjen och hypoxi (80 min totala behandlingstiden). En 20 cykeltid valdes på grund av tidigare arbete visar att en sådan programtiden är tillräcklig för att framkalla förändringar i andnings utfall mäter 11. Använda den beskrivna inrättats (Figur 2), nyfödda som utsatts för AIH hade inga uppenbara biverkningar och uppvisade inte beteenden som tyder på smärta och obehag under 80min-protokollet. Specifikt var ingen synlig apné observerats, alltför lem eller huvudrörelser, eller läten. Efter AIH, subventrikulära zonen härrörande neurala stam / föregångarcellpopulationer odlas som neurospheres under 14 dagar (och även som vidhäftande monoskikts populationer, data ej visade) uppvisar en nästan två-faldig ökning i diameter, vilket visar ökad expansion inom varje formnings sfär (Figur 3). Celler som nästa stryks ut i tillåtliga betingelser (det vill säga, avsaknad av mitogena faktorer) erhållande signifikant fler beta-3-positiva celler (en ökning från <10% till> 45%), vilket indikerar en mer omfattande neuronal differentiering jämfört med celler som skördats från normoxisk behandlade (kontroll) valpar (Figur 4).
Figur 1. Denna akuta IH diagrambladet används för att dokumentera djur och experimentella detaljer, ger en checklista för före start och efter slutförandet av IH-protokollet, och fungera som ett spårnings dokument för noggrann sammanställning av alla genomförda cykler.
Figur 2. Intermittent hypoxi inställd för neonatala gnagare. (A) Inkubator att bibehålla miljön vid 37 ° C. Pletysmografi kammare visas i inkubatorn, och igen med kammardörren på glänt (B). (C) Höger, flödesmätare justerades till 1 liter / min för varje kammare. Gasflödet leds via förspänningen flödesenheten delningsenheten (mitten) till alla anslutna kammare (vänster, inom inkubator). (D) Hemostat kontroll över baslinjen (byråkrati) och hypoxi (gul tejp) ingångsledningar. ank "> Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3. Kontrollneuro (A) visar en mindre diameter än AIH neurospheres (B). Bilder tagna vid 10X objektiv, skala bar = 100 um. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4. Kontrollneurosfärer (A) visar färre beta-3-tubulin-positiva neuroblaster än AIH neurosfärer (B). Bilder tagna vid 20X objektiv, skala bar = 50 um.g "target =" _ blank "> Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mouse plethysmography chambers | Buxco | PLY4211 | |
| Flow meter | Porter | F150 | |
| Bias flow unit | AFPS | ||
| Baseline Gas Mix | Airgas | AIZ300 | Compressed Air |
| Hypoxic Gas Mix | Airgas | X03NI72C2000189 | 10% Oxygen, balance nitrogen |
| Oxygen Meter | Teledyne | AX-300 |
References
- Studer, L., et al. Enhanced proliferation, survival, and dopaminergic differentiation of CNS precursors in lowered oxygen. J Neurosci. 20 (19), 7377-7383 (2000).
- Chen, H. L., et al. Oxygen tension regulates survival and fate of mouse central nervous system precursors at multiple levels. Stem Cells. 25 (9), 2291-2301 (2007).
- Ling, L., et al. Chronic intermittent hypoxia elicits serotonin-dependent plasticity in the central neural control of breathing. J Neurosci. 21 (14), 5381-5388 (2001).
- Mitchell, G. S., et al. Invited review: Intermittent hypoxia and respiratory plasticity. J Appl Physiol. 90 (6), 2466-2475 (2001).
- Fuller, D. D., Zabka, A. G., Baker, T. L., Mitchell, G. S. Phrenic long-term facilitation requires 5-HT receptor activation during but not following episodic hypoxia. J Appl Physiol. 90 (5), 2001-2006 (2001).
- Fuller, D. D., Johnson, S. M., Olson, E. B., Mitchell, G. S. Synaptic pathways to phrenic motoneurons are enhanced by chronic intermittent hypoxia after cervical spinal cord injury. J Neurosci. 23 (7), 2993-3000 (2003).
- Baker-Herman, T. L., et al. BDNF is necessary and sufficient for spinal respiratory plasticity following intermittent hypoxia. Nat Neurosci. 7 (1), 48-55 (2004).
- Zhu, L. L., et al. Neurogenesis in the adult rat brain after intermittent hypoxia. Brain Res. 1055, 1-6 (2005).
- Zhang, J. X., Chen, X. Q., Du, J. Z., Chen, Q. M., Zhu, C. Y. Neonatal exposure to intermittent hypoxia enhances mice performance in water maze and 8-arm radial maze tasks. Journal of neurobiology. 65 (1), 72-84 (2005).
- Zhu, L. L., Wu, L. Y., Yew, D. T., Fan, M. Effects of hypoxia on the proliferation and differentiation of NSCs. Mol Neurobiol. 31 (1-3), 231-242 (2005).
- Ross, H. H., et al. In vivo intermittent hypoxia elicits enhanced expansion and neuronal differentiation in cultured neural progenitors. Exp Neurol. 235 (1), 238-245 (2012).
- Fuller, D. D., et al. Induced recovery of hypoxic phrenic responses in adult rats exposed to hyperoxia for the first month of life. J Physiol. 536 (Pt 3), 917-926 (2001).
- Fuller, D. D., Fregosi, R. F. Fatiguing contractions of tongue protrudor and retractor muscles: influence of systemic hypoxia. J Appl Physiol. 88 (6), 2123-2130 (2000).
- Baker, T. L., Fuller, D. D., Zabka, A. G., Mitchell, G. S. Respiratory plasticity: differential actions of continuous and episodic hypoxia and hypercapnia. Respir Physiol. 129 (1-2), 25-35 (2001).
- Marshall, G. P. 2nd, et al. Production of neurospheres from CNS tissue. Methods Mol Biol. 438, 135-150 (2008).
- Azari, H., Rahman, M., Sharififar, S., Reynolds, B. A. Isolation and expansion of the adult mouse neural stem cells using the neurosphere assay. J Vis Exp. (45), (2010).
