Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biology

Çekirdek Biyoloji Kavramları öğretmek için Fare Meme Tümör Hücreleri kullanma: Basit Lab Modülü

doi: 10.3791/52528 Published: June 18, 2015

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Genellikle lisans genel biyoloji derslerinde, hücre döngüsü düzenlenmesi ve kanser konuları değindi ama bu derslerden içeriğin genişliği derinliği için çok az zaman bırakır, çünkü ayrıntılı olarak incelenmiştir değil. Buna ek olarak, lisans biyoloji öğrenciler genellikle hayvan hücre kültürü ile ilişkili gelişmiş teknikler maruz değildir. Uygulanması ve öğrendiklerini analiz ederken öğrencilerin bu kavramları daha derin bir anlayış geliştirmelerine yardımcı bir laboratuvar faaliyeti laboratuvar faaliyeti 1 uzatılmış Araştırma Walter Reed Ordu Enstitüsü (WRAIR) bir modifikasyonu olarak geliştirilmiştir. Laboratuar modülü olarak anormal hücre sinyalizasyon yolları büyüyen bir kanser hücresi modeli karakterize geliştirilmesi ve hücre sayımı yürütme yöntemleri, anti-proliferatif ajanlar ile hücrelerin tedavisi için uygun bir zaman ve dozajların oluşturulması ve tanımlanması içeren bir adım adım, deneysel strateji kullanır . Deney da açık veriyor-ended soruşturma.

Bu etkinlik için gereken teknikleri çoğu tipik biyoloji öğretim laboratuarda gerçekleştirilebilir. aktivitesi, fare meme tümörü (MMT) hücre çizgisinin morfolojisi ve büyüme hızı, insan göğüs kanseri 2 için bir model karakterize öğrenciler ile başlar. Meme kanseri nedeniyle nüfusta yaygınlığı, üniversite çağındaki öğrencilere yönelik aşinalık ve mevcut yaygın veri modeli kanseri olarak seçildi. MMT hücre hattı özellikle de karakterize, kolayca elde edilebilir, çünkü seçilen kısa katlama süresi vardır ve büyümek kolaydır edildi. Buna ek olarak, MMT hücreleri estrojene bağlı en kadın, göğüs kanseri ile tutarlı olan bulunmaktadır. Öğrenciler daha sonra kimin etki mekanizması iyi öğrenciler sağlayan çeşitlidir ilaçlar ve tedavilerin uzunluğu belirlendiğine konsantrasyonu kemoterapi ilaçları ile hücrelerin tedavi ederek MMT hücrelerinde anormal hücre sinyal yolları belirlemekhücre bölünmesi oranı üzerinde bu değişkenlerin etkisini değerlendirmek için. Bu etkinlik için anahtar tahlil sadece iki yöntemden birini kullanarak, hücre sayımı gerektiren hücre canlılığı, belirlenmesidir. Her yöntemin güçlü mikroskopi becerileri bağlıdır. Öğrenciler standart, hemositometre yöntemi ve yeni bir fotomikroskopi yöntemini kullanarak hücre canlılığı belirlemek ve önermek. Onların bulgularına dayanarak, teklif ve aktivite değişiklikleri test edin. Öğrenciler daha sonra kendi veri temsil ve hipotez rafine ve yeni deneysel stratejiler hazırlamak için sonuçları yorumlama.

Bu laboratuvar faaliyeti biyolojik bilimlerde bölümünden birinci veya ikinci sınıf düzeyinde öğrenciler için uygundur. Bu, bir ilk yıl genel biyoloji ya da ikinci yıl, moleküler / hücresel biyoloji dersi tamamlanabilir bir haftalık laboratuvar modülü içine yoğunlaşır. Faaliyetin uygun tamamlanması için gerekli becerileri c bir dizi temel aritmetik ve cebir, aşinalık dahilCevher laboratuvar becerileri (örneğin, pipet, çözüm yapımı, steril tekniği) hücre kültürü ve elektronik tablo yazılımı eğitmen bilgisi ile birlikte, veri analizi, temel ışık mikroskobu ve zaman yönetimi. Gereken belirteçleri (örneğin, fare meme tümörü hücreleri, MMT 2), kemoterapi maddeleri kanser için bir hayvan hücre çizgisi modeli, (örneğin, tamoksifen, kurkumin, metformin, ve aspirin), tripan mavi ve hücre kültür ortamı (örneğin, Eagle Minimum Essential Medium , uygun takviyesi (örneğin, donör At ve fetal inek serumu) ile EMEM). (Sınıf II BSC) hemasitometre ve dijital mikroskopi yazılım gerekli aletler ters ışık dijital kamera eki, bilgisayar, 100 mm ve 24 oyuklu doku kültür plakaları, CO2 inkübatöründe (veya eşdeğeri), biyo-güvenlik kabini ile mikroskop bulunmaktadır.

TEAC hayvan hücre kültürü güveniyor belirli laboratuvar faaliyetlerinin iyi örnekler vardırhücre biyolojisi 3 kavramlar hakkında h lisans öğrencisi. Ancak pek çok (örneğin, radyoaktif izotoplar, canlı hayvan dokusu, ileri görüntüleme donanımları 1,4,5), (400 seviye kurs 6 için uygun gibi) oldukça gelişmiş protokolleri tarif kolay erişilebilir olmayan malzemeleri veya teknikleri gerektiren, ya da çok-haftalık veya dönem uzun projelere 6,7 gerektirir. Burada anlatılan laboratuvar aktivite basittir ve ortak laboratuar ekipmanları ile tek bir hafta içinde yapılabilir.

Özetle, bu laboratuar modülü etkin bir tanıtır ya da temel ve ileri laboratuar becerileri, deneysel veri analizi, hayvan hücre kültürü yöntemi ve bilimsel süreç öğretirken hücre döngüsü, hücresel sinyal yolları ve kanser kavramlarını güçlendirmektedir. Laboratuvar modülü basit ve ekonomik erişilebilir ve açık uçlu soruşturma için esneklik ve fırsat hem de sağlar. etkinlik öğrenci yaratıcılığı teşvikBir reçete rehber olarak değil, hareket eden bir şablon deneysel bir strateji sağlayarak. O hatırlayarak gerektirir En önemlisi, etkinlik tatmin Blooms Taksonomi 8 tüm öğrenme alanları, anlayış, uygulanması, analiz etmek, değerlendirmek ve ders kitabı dışında ve bilimsel araştırma dünyasına onları çeken bir süreçte öğrencilere yaparak yaratır.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Notlar: Davranış Sınıf II biyogüvenlik kabini içinde hücreler ve hücre kültürü reaktifleri ile tüm iş (BSC) 9. Biyolojik risk orta düşük poz olarak MMT hücreleri, Biyogüvenlik Seviyesi I olarak sınıflandırılır. Kullanımlar (örneğin, ultraviyole ışık,% 70 etanol aşağı silin) ​​arasında BSC uygun temizleme ve dekontaminasyon prosedürleri uygulayın.

1. MMT hücreleri büyütün

  1. Besin yönünden zengin,% 10 fetal sığır serumu (FBS) ile desteklenmiş Eagles Minimum Essential Medium (EMEM) oluşur ortam, 2 mM glütamin ve% 1 antibiyotik / antimikotik 10 ml içeren 10 cm'lik doku kültür tabakları hücreleri (10 birim penisilin büyümek , 100 ug streptomisin, 0.25 mikrogram amfoterisin B). 37 ° C'de, nemlendirilmiş bir% 5 CO2 odası içinde hücrelerin kültive edilmesi. 3.6 x 10 6 hücre / cm2 'lik bir yoğunlukta Plaka hücreleri (aşama 2'de hücre sayımı bakınız).
  2. Her 48 saat Unl taze ortam ile hücre kültür ortamının yarısı yerineess aksi belirtilmedikçe. Ters faz kontrast ışık mikroskobu ile incelenmesi ile hücre canlılığını ve morfolojisi kontrol edin.
    1. Not ve 100 ° C'de altında büyüklüğü, yapısı, şekli, organizasyon ve tahmini sayısı için hücreleri karakterize - 200X büyütme. Bu yoğunluk, hücreler bir düzlemde yer almalıdır, birbirlerine tepesinde ve yakın topaklaşan değildir. Her hücre bir noktaya geldik ondan genişleyen ince, uzun, dal gibi uzantıları olan kalın, küresel çekirdek oluşur (Şekil 1).
  3. Onlar 7.2 x 10 6 hücre / cm2 hücre yoğunluğu ulaştığınızda hücreleri bölmek. Hücreler 1.8 x 10 6 hücre / cm 2 24 saat başına bir iki katına oranı sergilemektedir. Onlar bölünmüş olan sayısını göstermek için hücreler Passage X (Px) atayın.
    1. Kuşak 3 de (örneğin, üç geçiş noktası, P3 sonra) hasat, sayısı ve 3.6 x 10 6 arasında bir yoğunlukta bir 24 oyuklu doku kültürü plakası üzerine hücreleri plaka cm2 kadar.
  4. Görünüm hücreleri her gün ve kayıt dijital fotomikrograflarıdır. Not ve hücre morfolojisi (örneğin, boyut, şekil, ışık yansıtıcı özellikler) tarif eder. Düzenli hücrelerin sayımı ve hücre sayısına geçen zamanı ile ilgili hücre iki katına zaman belirleyin.

2. MMT Hücreleri sayın

Not: Hücreler alt kültürleri gerekiyorsa belirlemek için hücreleri sayın, bir deney için kurmak veya hücre canlılığını belirlemek için. Burada sunulan iki yöntem vardır.

  1. Bir hemasitometre kullanımı, standart bir teknik hücreleri saymak için.
    1. Parlak-çizgi hemasitometre, tripan mavi boya, bir bileşiğin ışık mikroskobu, steril bir test tüpleri, pipet ve manuel hücre sayacı bir% 0.2 solüsyon elde edilir.
    2. BSC altında, 10 cm doku kültürü çanağı hücreleri çıkarmak için, bir 10 ml'lik bir pipet kullanın. Hücreler 24 plaka üzerinde yetiştirilen varsa ortamı çıkarmak için 1 ml pipet veya 1000 ul mikropipet kullanın.
    3. Bir 15 ml'lik steril bir tüpe (veya 1 ml mikro santrifüj ya da diğer küçük hacimli tüp) ile sonuçlanan hücre süspansiyonu yerleştirin. Aksi takdirde, orijinal doku kültür plakasına hücrelerin terk / oyuk.
    4. Steril olmayan bir mikro santrifüj ya da diğer küçük hacimli bir tüp içinde: (1 oranında 1) BSC altında, tripan mavisi çözeltisi 10 ul hücre süspansiyonu, 10 ul birleştirir.
      Not: Tripan mavisi, sağlıklı canlı hücreler tarafından emilir değildir hayati leke olduğunu. Hücreler hasarlı veya ölü, tripan mavisi ölü hücreler sayılır sağlayan hücreye girebilirsiniz (aka dışlama yöntemi boya). Canlı hücreler renkte bir aydınlık ve ışık ise nedenle mikroskop altında, ölü hücreler koyu mor görünür.
    5. Tasarlamak5 dakika boyunca oda sıcaklığında karıştırıldı.
    6. Hemasitometre kapak kayma yerleştirin. Oluğa tripan mavi hücre süspansiyonu 10 | il karışımı uygulanır. 200X büyütme - 100 hemasitometre görüntüleyin. Dört köşe ızgara açıktır (Şekil 2).
    7. Her ızgarah alanda toplam hücrelerin karşı (lekesiz) canlı hücrelerin sayısını. Dört ızgaraları ortalama ve hücre / ml elde etmek için 1 x 10 4 ile çarpın.
      1. Çanak başına hücreleri (veya hücre / cm 2) toplam sayısını tahmin. 3.6 x 10 6 hücre / cm2 istenen yoğunlukta yeni bir doku kültürü plakası, tohum ya plaka üzerinde ya da iyi olarak canlı hücre sayısını belirlemek için kullanmak hücre süspansiyonu doğru hacmi belirlemek için, ya bu numarayı kullanarak.
        Not: Bir hemasitometre kullanımına ek rehberlik, 10 bkz.
  2. Canlı hücreleri saymak için yazılım ve dijital fotoğraf makinesi kullanın.
    1. Bir di ediningital makinesi, eşlik eden program, tripan mavi boya, bir bileşiğin ışık mikroskobu, steril bir test tüpleri, pipet ve bir bilgisayar bir% 0.4 çözeltisi.
      Not: Burada kullanılır Motic Yazılımı ile birlikte A Moticam 2.000 dijital fotoğraf makinesi. Herhangi bir karşılaştırılabilir kamera ve yazılım yeterlidir. Dijital kamera yazılımı (üreticinin protokolüne göre) önceden kalibre edilmiş olduğundan emin olun.
    2. BSC altında, 24 iyi doku kültürü çanak büyüyen MMT hücrelerinden ortamı çıkarmak için 1 ml pipet ya da 1,000 ul mikropipet kullanın. Sonra yavaşça plakaya küçük bir miktar un takviye (yani, EMEM herhangi bir ek olmadan) taze medya (yaklaşık 500 ul) uygulayarak kaldırarak yapışık hücreleri yıkayın. Kuyuya doğrudan% 0.2 tripan mavisi 10 ul uygulayın (BM-EMEM ile 1: 1 seyreltilmesi).
    3. 5 dakika boyunca oda sıcaklığında plaka inkübe edin.
    4. 200X büyütme w - 100 mikroskop altında plaka görüntülei bir dijital kamera takılı. % 2 tripan mavisi ile boyanarak çok karanlık ise plaka katkısız ortam ile yıkanabilir.
    5. Bilgisayar a yazılım açın nd yazılım ayarları sekmesinden kullanılan hedefe kalibre doğrulayın. FOV bir görüntü görünmelidir.
    6. Tedbir sekmesinden Izgara seçin. Kareler bir ızgara yaklaşık genişliği 0.005 cm görünecektir. Her bir karenin alanını doğrulamak için Izgara Bilgisi seçin.
    7. Hücreleri saymak için ızgaranın belirli bir alan seçin (örneğin, 5 kare x 9 kareler). Tedbir sekmesinden Dikdörtgen seçin. Bir kare köşesini tıklayın ve seçim kareler kapsayacak şekilde imleci sürükleyin.
      Not: yeşil bir gölge seçimi ve genişlik, yükseklik, alanı sağlar köşesinde görünecek bir beyaz kutu ve seçilen ızgara bölümünün çevresinin kareler kapsayacak (bakınız Şekil 3).
    8. Viab sayısınıBelirlenen alanda le hücreleri. Mikroskop altında plaka hareket ettirerek aynı kuyuda veya plaka diğer iki yerler için aynı işlemi uygulayın.
    9. Ölçülen alan aynıdır ve büyütme değişmedi emin olun. Alanda yaşayan hücrelerin ortalama sayısını hesaplayın. Oyuk alanı kullanarak için ızgara tarif alandan yaşayan hücrelerin sayısını tahmin (24 gözlü bir plaka için, bir de, bir 100 mM için alan 2 78.6 cm çanak, 2 cm2'lik bir alana sahip) oyuk (hücre / cm2) olan hücrelerin toplam sayısı.

3. anti-proliferatif Agents ile MMT Hücreler davranın

  1. Seçilen, çoğalma karşıtı terapötik maddeler (tamoksifen, kurkumin ve metformin) ve BSC altında isteğe bağlı bir ilaç, aspirin oluşan çözeltiler hazırlayın.
    1. 27 mM'lik bir stok konsantrasyonu oluşturmak için% 100 etanol içinde kurkumin ve tamoksifen çözündürülür. Unsupplement metformin ve aspirin çözündürülüred ENEM sırasıyla 500 mm ve 15 mM'lik bir stok konsantrasyonu oluşturmak için.
  2. Bir Doz Yanıtı kurun.
    1. 96 saat bir doz tepki eğrisi oluşturmak için değişen konsantrasyonlarda üç, çoğalma karşıtı terapötik maddeler (tamoksifen, kurkumin ve metformin) ve isteğe bağlı bir ilaç (aspirin) ile MMT hücreleri tedavi edin. Başlangıçta yayınlanan raporlar 1,11-16 göre bir konsantrasyon aralığında ve daha sonra yayınlanan daha konsantrasyonları büyük veya daha küçük de tüm ilaçları uygulayın.
      Not: bir doz tepkisi istenen sonuçları üretmek için gerekli olan, bir ilacın minimum konsantrasyonu belirlenir. Burada arzu edilen sonuç, kontrol ile karşılaştırıldığında hücre proliferasyonunun bir azalmadır.
      1. Tamoksifen ve kurkumin için, 0.054 mM (1 ul), 0.108 mM (2 ul), 0.162 mM (3 | il) ve 0.216 mm (4 ul), konsantrasyonları (ve karşılık gelen hacimleri) kullanın.
      2. Metformin için, 2 mM konsantrasyonlarda (ve karşılık gelen hacim) (2 ul kullanımı), 4 mM (4 ul), 6 mM (6 ul), 8 mM (8 ul) ve 10 mM (10 ul).
      3. Aspirin, 0.030 mM (1 ul), 0.060 mM (2 ul), 0.099 mM (3.3 ul), 0.150 mm (5 ul) ve 0.216 mM (6.7 ul), konsantrasyonları (ve karşılık gelen hacimleri) kullanın.
    2. 3.6 x 10 6 hücre / cm2 'lik bir konsantrasyonda, 24 oyuklu bir plaka üzerinde 10 cm'lik bir tabak, MMT hücreleri Böl. Her iki hücre-sayım yöntemleri (Aşama 2), başlangıç ​​hücre konsantrasyonunu belirleyin. Hücrelerin bu yeni 24 kuyu plaka "Gün Bölünmüş" arayın.
    3. 24 saat Hücre sonra kaplama, Aşama 3.2.1 tarif konsantrasyonlarda, çoğalma karşıtı terapötik maddeler, tamoksifen, kurkumin, metformin ve aspirinin her biri, MMT hücreleri tedavi. "Gün 0" olarak bakın.
      1. Her kuyu 500 medya ul, kullanım mikropipetler steril mikropipet ipuçları ve yeni bir ipucu yeni bir kuyu cr önlemek için tedavi her zaman maksimum tutmak gibioss kirlenme. Varlığı% 100 etanol (çözücü kontrolü) yetiştirilen herhangi bir ilaç tedavisi (negatif kontrol) ve hücrelerin yokluğunda yetiştirilen hücreler: İki kontrol grubu olarak kuyu kullanın.
    4. Hücrelerin büyümesine ve hücreler her gün beslenir zaman açıklanan konsantrasyonlarda uyuşturucu yeniden yönetmek 96 saat boyunca (Adım 1.2) (kadar Günü 4) Gün 1 Açık -. Tedavinin 4, mikroskop altında hücreleri gözlemlemek ve kullanma sayısı Adım 2.2 yöntemi (Şekil 4).
    5. Denemeyi en az üç kez tekrarlayın.
    6. Deneyin uzunluğu boyunca, hücre canlılığı ve ilaç dozaj arasındaki ilişkiyi grafik her ilacın optimal konsantrasyonunu belirlemek (bakınız Şekil 5).
  3. Bir Zaman Kursu oluşturulması.
    1. Zaman dilimlerinin değiştirilmesi için sabit bir konsantrasyonda, üç, çoğalma karşıtı terapötik maddeler (tamoksifen, kurkumin ve metformin) ile MMT hücreleri tedavi edin. Optimal konsantrasyon IDENTIF kullanınDoz Tepki deneyler yoluyla ied (Adım 3.2).
      1. 0.216 mM tamoksifen, 0.216 mM kurkumin ve 10 mM metformin: Aşağıdaki konsantrasyonları kullanın.
        Not: Bir ilacın optimum istenilen sonucu elde etmek için bir zaman süreci gerekli süre miktarını belirler. Burada, arzu edilen sonuç, kontrol ile karşılaştırıldığında hücre proliferasyonunun bir azalmadır.
    2. 3.6 x 10 6 hücre / cm2 'lik bir konsantrasyonda, 24 oyuklu bir plaka üzerinde 10 cm'lik bir tabak, MMT hücreleri Böl. Her iki hücre-sayım yöntemleri (Aşama 2), başlangıç ​​hücre konsantrasyonunu belirleyin. Hücrelerin bu yeni 24 kuyu plaka "Gün Bölünmüş" arayın.
    3. 24 saat Hücre sonra kaplama, Aşama 3.2'de tanımlanan uygun konsantrasyonlarda, çoğalma karşıtı terapötik maddeler, tamoksifen, kurkumin, metformin ve aspirinin her biri, MMT hücreleri tedavi. "Gün 0" olarak bakın.
      1. Her Yanı sıra, bize medya 500 ul maksimum tutabilirSteril mikropipet ipuçları ve yeni bir ipucu yeni bir kuyu çapraz kontaminasyonu engellemek için tedavi her zaman e mikropipetler.
      2. Varlığı% 100 etanol (çözücü kontrolü) yetiştirilen herhangi bir ilaç tedavisi (negatif kontrol) ve hücrelerin yokluğunda yetiştirilen hücreler: İki kontrol grubu olarak kuyu kullanın.
  4. Hücrelerin büyümesine ve hücreler her gün beslenir seçilen konsantrasyonda ilaçlar yeniden yönetmek (Gün 4 kadar) 96 saat boyunca (Adım 1.2). Gün 1 Açık - Tedavinin 4, mikroskop altında hücrelerin gözlemlemek ve Adım 2.2 (bakınız Şekil 4) yöntemini kullanarak saymak.
  5. Denemeyi en az üç kez tekrarlayın.
  6. Seçilen konsantrasyonda hücre canlılığı ve ilaç tedavi süresi (saat) arasındaki ilişkiyi grafik her ilaca MMT hücrelerin optimal pozlama süresi belirlemek (bakınız Şekil 6).

4. Lab Modülü

Not: Aşağıdaki, bir 5 günlük birlaboratuvar modülü. Şekil 7 laboratuvar çizelgesi 5 gün içinde gerektirecektir ne bir akış şeması. Bu etkinlik beş gün içinde tamamlanacak bir zaman ders veya bir doz yanıt eğrisi ya oluşturulur. Her iki eğrileri oluşturmak için yeterli bir süre yok. Bir doza cevap deneyi, aşağıda tarif edilmektedir. Bir zaman ders deney kolayca değiştirilebilen olabilir

  1. Gruba sınıfı bölünmüş: bir grup, bir doz tepkisi ve önerilen doz tepki konsantrasyonları ortasında bir konsantrasyon tercih farklı bir zaman süreci kurmak var.
    1. Uygun konsantrasyonlarda yeterli kültür ve ilaç stoklarını korumak. Aksi belirtilmedikçe, BSC altında tüm çalışmaları gerçekleştirmek.
  2. 1.Gün
    1. Doğrudan öğrenciler medyayı yapmak ve (adım 1 gibi) hücreleri büyümek.
    2. Öğrenciler 10 cm plaka üzerinde MMT hücrelerinin bir stok elde olarak, öğrenciler hücre kültürü ortamı hazırlamak için yönlendirmek ve hemocytome kullanımında bir öğretici vermekter, dijital mikroskopi ve (adım 2'de olduğu gibi) dijital kamera mikroskopi yazılımı.
    3. Şimdi üreticinin protokolü kullanılarak mikroskop kullanılan hedefleri (örneğin, 4X, 10X, 20X) yazılımı kalibre.
  3. Gün 2
    1. Öğrenci (Aşama 2'de olduğu gibi) toplam hücre sayısı ve hücre canlılığı teyit yazıldı.
    2. Öğrenciler benzer sonuçlar elde edilir onaylamak için, mikroskopi yazılım ve hemositometre yöntemleri her ikisini de kullanarak 100 mm çanak hücreleri saymak var.
    3. Doğrudan öğrenci (aşama 1 'deki gibi) arzu edilen çıkış hücresi ile kaplanmış 24 yuvalı plakalara 100 mm tabak bir 24 oyuklu plaka ve bölünmüş hücreleri elde etmek için. Bu Gün Bölünmüş olarak kabul edilir. 24 saat süre ile, bir hücre kültürü kuluçka makinesi içinde, 24 gözlü plaka koyun.
  4. 3. Gün
    1. 24 plaka üzerinde 24 saat MMT hücreleri büyütün. Öğrenciler mikroskop altında hücrelerin gözlemlemek ve (adım 2'de olduğu gibi) mikroskopi yazılımını kullanarak saymak gerekir.
    2. Öğrenci / te verKanser tedavisi ilaç stoklarının örnekleri duyuyorum. Onları hazırlamak ve (adım 3 gibi) orijinal stok solüsyonu sulandırmak var. Bir doz-yanıt eğrisi elde etmek hücrelerine çeşitli ilaç konsantrasyonları ekleyin. Bu Gün 0 denir.
    3. 48 saat arasında süre için ilaç ile hücrelerin (aşama 1.2) inkübe edilir.
  5. 4. Gün
    1. Öğrenciler 24 saat sonra tedavi hücreleri gözlemlemek var. Bu Gün 1 olduğunu.
    2. Her bir kuyunun kullanarak mikroskopi yazılımını güvenin. Tutanak her fotoğraf iyi böylece sayma (adım 2'de olduğu gibi) laboratuar dışında yapılabilir.
    3. Başka bir 24 saat için ilaç ile hücrelerin (aşama 1.2) inkübe edilir.
      Not: Öğretim Ek öğreticiler ve veri analizi ve grafik sunum yorumlar sağlar. Öğrenciler veri toplama ertesi gün rakamları, araziler ve istatistiksel analiz oluşturmak için öğrenirler.
  6. 5. Gün
    1. 48 saat, 2. gün sonra hücreler öğrencilerin tedavi etmiş.
    2. Her Sayısıiyi mikroskobu yazılımı kullanarak. Tutanak her fotoğraf iyi böylece sayma (adım 2'de olduğu gibi) laboratuar dışında yapılabilir.
    3. Hasat ve (adım 2'de olduğu gibi) etkin bir şekilde mikroskopi yazılım yöntemi kullanmak için, öğrenci yeteneği doğrulayarak bir araç olarak geleneksel hemositometre yöntemi ile sayım için hücreleri toplamak.
      Not: buna göre, veri toplamak ve sonuçlar çıkarmak veya hipotezler revize.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

MMT hücrelerini Büyüyen ve sayma yöntemleri karşılaştıran.

Fare meme tümör hücreleri başarıyla (Şekil 1) ve Motic Software, bir mikroskop için dijital kamera ile ilişkili yazılım programı kullanılarak geliştirilen yeni bir hücre sayımı yöntemi büyüdü ve karakterize edilmiştir. Bu yeni yöntem, hücre sayımı bir hemasitometre (Şekil 2) kullanılarak geleneksel bir sayım yöntemine göre ve hücre sayısı (Tablo 1) belirlenmesinde aynı hassas olduğu gösterilmiştir. , Farklı büyüme koşulları ya da hücre tipi için hücre sayısı üzerinde herhangi bir etkileri kontrol etmek için, iki hücre sayımı yöntemlerinin karşılaştırılması antiproliferatif ajanların varlığında veya yokluğunda ve farklı bir hücre çizgisi, nöronal modeli PC12 17 ile yapılmıştır.

Şekil 3 defin bir bindirilmiş ızgara kullanarak bu yöntemle hücre sayımı için bölgesinin sınırlarını gösterired boyutlar. Izgara görüş alanı (FOV) üzerine yerleştirilir ve yeşil bir çerçeve daha sonra ızgara (yani, 9x5 kareler), belirli bir uzunlukta ve genişlikte uygulanır. Hücreler, yeşil çerçeve içinde sayılır ve protokolde tarif edildiği gibi hücre sayısı, ekstrapole edilir.

MMT hücreleri tedavi: antiproliferatif ajanlarla MMT hücrelerinin doz tepkisini belirlenmesi.

Doz karşılık çalışmaları (Şekil 4) her anti-proliferatif ajanın boyunca yürütülmüştür. Bu deneyler veriler sürekli olarak toplanan boyunca, gözden ve protokole olası revizyonlar garanti olup olmadığını görmek için inceledik. Deney benzer sonuçlar üreten her çalışma ile, üç kez gerçekleştirilmiştir. Tüm hücreleri ölmüş olana kadar Deneyler devam edilmiştir ya da uyuşturucu etkisi plato etmişti. Sonuçların Dijital fotomikrografları Şekil 4'te sunulmuştur ve bu bulguların bir grafik analizi sunulmuşturŞekil 5. Etkin konsantrasyon aralıkları, Şekil 5, X ekseni üzerindeki ve Protokol bölümünde, Şekil 4'ün göstergede rapor edilmiştir.

Tamoksifen en düşük konsantrasyon, 0.054 mM olarak, muamele edilmemiş hücrelere (Şekil 4A) ile karşılaştırıldığında, yaklaşık% 83 hücre büyümesinin güçlü bir şekilde inhibe oldu. Hücre canlılığı, tamoksifen artan konsantrasyonları (Şekil 5A) ile azalmaya devam etmiştir. tamoksifen optimal dozu 48 saat tam bir hücre ölümü bu konsantrasyon (Şekil 4a) oluştuğundan sonra 0,216 mm olarak tespit edilmiştir. İlginçtir, hücre yayılımı bu azalma in vitro sistemler modeli vurgulayan literatüre 18,19 dayalı beklenen ama her zaman tam olarak in vivo olaylarda temsil etmemektedir olarak, tamoksifen bir hücresel direnci hiçbir belirti ortaya koymaktadır. Ayrıca, ne zaman en tre ile tezatsırasıyla, hücre bölünmesini durdurarak daha etkili kurkumin (Şekil 4B ve 5A) ve metformin (Şekil 4C ve 5B), tamoksifen en düşük konsantrasyonu% 9 ve% 50 ait kısmi konsantrasyonu.

Kurkumin da hücre bölünmesi inhibisyonu üzerinde, konsantrasyon bağımlı bir etki göstermiştir. Artan konsantrasyonları ile, hücre canlılığı (Şekil 4D ve 5A) önemli bir düşüş olmuştur. kurkumin optimal dozu 0,216 mM, çünkü saat 48 sonra, tamoksifen gibi, bu konsantrasyonda komple hücre ölümü orada olduğu tespit edilmiştir.

Metformin tedavisi düşük konsantrasyonda% 33 azalmasına yol açan, MMT hücre canlılığı en az dramatik azalma sağlamıştır. Artan metformin konsantrasyonu ile hücre viyabilitesinde birlikte azalma (Şekil 4C ve 5B) gözlenmiştir. Metforminin uygun bir dozaj, en yüksek konsantrasyonu (1 Test edilecek belirlendi0 mM). Tamoksifen ve kurkumin, hem de rutin olarak, kemoterapi maddeleri olarak kullanılan ile karşılaştırıldığında, metformin, hücre döngüsü önlenmesinde% 30-40 daha az etkili idi. İlginç bir şekilde, hücre bölünmesi ile ilgili metformin etkileri aspirin uygulama (Şekil 4D ve Şekiller 5A), hücre büyümesinin engellenmesi için hiç açık bir şekilde tanımlanmış bir mekanizma ile salisilik ilaç ile elde edilenler ile tutarlı olmuştur.

MMT hücreleri tedavi: Anti-proliferatif ajanlar MMT hücre cevabının veriliş zamanını belirlemek.

Uygulanan bir ilacın etkili dozu maruz kalma süresi tarafından etkilenebilir çünkü bir zaman süreci çalışma aynı zamanda, her anti-proliferatif ajanın yapılmıştır. Hücre canlılığı için bu modül deneylerinde olduğu gibi, ilk önce hücreler (ikileme sayısı) içine nedenle hücreler seçilebilir ilaçlara maruz kalan zaman uzunluğu için mantıklı bir pencere bölmek kadar hızlı bir şekilde tespit etmek önemlidir. Bu MMT hücre katlama süresi olması, bu nedenle, çok önemlidirBaşlangıçta hücreleri karakterize ederken tespit. Bu deneylerde boyunca, veriler sürekli olarak, toplanan gözden ve protokole olası revizyonlar garanti olup olmadığını görmek için analiz edildi. Deney benzer sonuçlar üreten her çalışma ile, üç kez gerçekleştirilmiştir. Tüm hücreleri ölmüş olana kadar Deneyler devam edilmiştir ya da efektler plato etmişti.

Zaman derste her anti-proliferatif ilaç optimize konsantrasyonları ile MMT hücrelerinin tedavi olduğunu göstermiştir (0.216 mM tamoksifen, kurkumin 0.216 mM, metformin 10 mM) 96 saat boyunca tam hücre ölümü ile sonuçlanmıştır veya ilacın etkilerinin kapalı tesviye ( Şekil 6). Aspirin, "isteğe bağlı" uyuşturucu, bizim doz yanıt çalışmalarında hücre canlılığını etkileyen Her ne kadar, darbe küçük olduğunu ve bu nedenle zaman ders çalışmalarına dahil edilmemiştir.

Şekil 1
Şekil 1. MMT hücreleri. Modifiye Eagles Minimum Essential Medium (EMEM) .100X, ölçeği = 0,2 mm 3,6 x 10 6 hücre / cm2 yetiştirilen "sağlıklı", tedavi edilmeyen fare meme tümörü (MMT), hücrelerin dijital fotomikrografıdır ile gösterilen beyaz çubuk. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 2,

Şekil 2. Hemasitometre ızgara. Hemositometre ızgara Photomicrograph, 100x. Daire (FOV) 'de gösterilen tüm ızgara bölümü. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

iles / ftp_upload / 52528 / 52528fig3.jpg "/>

Şekil 3. Motic yazılımı ile sayma alanı Belirlenmesi.   Mikroskop aracılığıyla görüldüğü gibi Motic yazılımı ile kurulan MMT hücre sayımı için grid FOV üzerinde bindirme ve tanımlı alanın görüntüsü. 100X, ölçek = 0.2 mm, beyaz çubuğu ile gösterilir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 4,
Anti-proliferatif ajanlar MMT hücrelerinin Şekil 4. Doz tepkisi. 96 saat süreyle değişen konsantrasyonlarda bir anti-proliferatif maddeler mevcudiyetinde büyütülen MMT hücrelerinin dijital fotomikrograflarıdır. Tamoksifen: (A1) 0,054 mM (A2) 0,108 mm (A3) 0,162 mm (A4) 0,216 mM; Kurkumin: (B1) 0,054 mM (B2) 0,108 mM (B3) 0,162 mM (B4) .216 mM; Metformin (C1) 2 mM (C2), 4 mM (C3), 6 mM (C4) 8 mM (C5), 10 mM; Bir miktar aspirin (D1), 030 mM (D2) 0,060 mM (D3) 0,099 mM (D4) 0,150 mM (D5) 0,216 mM; Etanol (% 100) ve Tedavi edilmeyen her iki kontroller bulunmaktadır. 100X, ölçek = 0.1 mm, ızgara içinde her kareyi oluşturan mavi çizgilerle belirlenmiştir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 5, bir

Şekil 5 B

Anti-proliferatif ajanlar MMT hücrelerinin doz tepki deneyleri Şekil 5 grafik sunumu., Anti-proliferatif ajanlar, MMT, hücre canlılığı ile ilgili (A), tamoksifen, kurkumin, aspirin ve (B) metformin artan konsantrasyonlarının etkisi. Sonuçlarhücre tedavisi 96 saat süre ile devam etti, ancak tedavi 48 saat sonra, bir kontrol yüzdesi olarak ifade yeniden. n = 3 olduğunda, STD gösterilir.

Şekil 6,
Anti-proliferatif ajanlar, MMT, hücresel cevabın zaman süreci analizi Şekil 6. grafiksel temsili. 96 üzerinden MMT hücre canlılığı ile ilgili tamoksifen etkilerin (0.216mM), kurkumin (0.216mM) ve metformin (10 mM) zaman seyri çalışması saat. Sonuçlar tedavi 48 saat sonra, bir kontrol yüzdesi olarak ifade edilmiştir. Temsili bir deneyin sonuçları, n = 1 burada gösterilmiştir.

Şekil 7,
5 günlük laboratuar modülünün 7. Akış grafiği Şekil.

Hücre Tipi İlaç Administered Deney Günü İlaç konsantrasyonu, Motic ile Hücre Sayısı Hemasitometre ile Hücre Sayısı
MMT İşlenmemiş Gün 2 - 7.8x10 4 hücreleri / cm2 8.0x10 4 hücreleri / cm2
MMT Etanol Gün 2 10 mM 7.1x10 4 hücreleri / cm2 7.2x10 4 hücreleri / cm2
MMT Tamoksifen Gün 2 0,216 MM 0 hücre / cm2 0 hücre / cm2
MMT Tamoksifen Gün 2 0,054 mM 1.3x10 4 hücreleri / cm2 1.5x10 4 hücreleri / cm2
MMT Kurkumin Gün 2 0,054 mM 1.9x10 4 Carşın / cm2 2.0x10 4 hücreleri / cm2
MMT Kurkumin Gün 2 0,216 mM 0 hücre / cm2 0 hücre / cm2
MMT Metformin Gün 2 2 mM 5.1x10 4 hücreleri / cm2 5.2x10 4 hücreleri / cm2
MMT Metformin Gün 2 6 mM 3.4x10 4 hücreleri / cm2 3.5x10 4 hücreleri / cm2
MMT Aspirin Gün 2 0,099 mM 2.8x10 4 hücreleri / cm2 3.0x10 4 hücreleri / cm2
PC12 İşlenmemiş Bölünmüş - 2.5x10 4 hücreleri / cm2 2.1x10 4 hücreleri / cm2

Tablo 1. Motic yazılım veya hemositometre yöntemlerini kullanarak hemasitometre ve yöntemleri sayma Motic yazılımı. MMT hücrelerinin hücre sayımı Sonuçlarının, Karşılaştırılması. Hem tedavi görmüş ve görmemiş hücreler sayıldı, hem de bir kontrol olarak, farklı bir hücre çizgisi PC12, bulundu.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Bir laboratuvar modülü hayvan hücre kültürü gelişmiş teknikler sayesinde hücre biyolojisinde çeşitli konuları öğretmeyi amaçlamaktadır olduğu sunulmuştur. Modül insan göğüs kanseri modelinde hücre replikasyonu üzerindeki anti-proliferatif kimyasal bir dizi etkisini analiz ederek, bu elde edilir. Birincil tahlil hücre sayımı temel tekniği dayanır ve mikroskopi yazılımı kullanarak hücreleri saymak için yeni bir yol sunuyor. modülü içeren faaliyetler aletleri ve çoğu biyoloji programlarında mevcut ekipman ile yapılabilir. Modül ucuz ve kolayca elde olan malzemeleri ile 5 günlük programda uygulanabilir. Dijital mikroskop kamera ve mikroskop yazılımı belirli bir marka burada (Motic Yazılımı) kullanılmasına rağmen, herhangi bir karşılaştırılabilir kamera ve yazılım yeterli olacaktır.

Bu laboratuar modülü insan göğüs kanseri için bir model olarak MMT hücreleri kullanır. Öğrenciler ilk olarak büyümek ve bu karakterize öğretilirkültür hücreleri. Bu laboratuar modülünün bu başarıyla tamamlanması altını önemlidir iyi tedavi edilmemiş MMT hücreler kontrol olarak hizmet özellikle bu yana, sağlıklı MMT hücrelerinin görünüşü ve davranışları tanımak (öğrenci aka) müfettişler gerektirir. Uygun doz yanıtı ve zaman ders veri elde edilecek ise hücre büyümesi kalıplarının nedenle kapsamlı karakterizasyonu, katlama süresi ve MMT hücrelerinin genel morfolojisi esastır.

Bir kez, özelliği, MMT hücreler daha sonra, hücre bölünmesi, hücre döngüsü regülasyonu, hücre sinyal iletimi ve kanser konuları öğretmek için bir araç olarak çeşitli anti-proliferatif ajanlar tepki açısından test edildi. Hücre canlılığı, hücreleri üzerinde bu ilaçların etkisini anlamak için kullanılır. Bir mikroskop takılan bir dijital kamera ile ilgili yazılım kullanılarak, hücre sayımı bir yeni bir yöntem olup, yapılmış ve doğruluğunu kontrol etmek için geleneksel bir sayım hemositometre dayalı prosedür ile karşılaştırılır. This romanı yöntemi lisans öğretim laboratuarlarında kullanılır, çünkü özellikle dikkat çekicidir iki avantaj sağlar. Hücre sayımı için doku kültürü plakası kaldırılacak gerek olmadığı İlk olarak, daha az zaman, ana deney tahlili gerçekleştirmek için gereklidir. Bu deney değişken sayıda aynı anda ve sınırlı bir süre içinde test edilecek sağlar. İkincisi, yöntem öğrencileri sonuçları değerlendirmek ve laboratuvar dışında deneysel strateji rafine izin deneysel tedavi hücresel yanıtın bir dijital kaydını sağlar.

Bu sayım yöntemlerin her ikisi de uygularken dikkat edilmesi gereken birkaç husus vardır. İlk olarak, her iki yöntem ile hücre sayımı önce hücreler, uygun bir hücre ve ölü hücre ayırt etmek için tripan mavisi ile inkübe edilir. Ölü hücreler boya ile nüfuz ve canlı hücreler parlak beyaz iken, koyu mavi görünür. Bununla birlikte, hücreler dy ile inkübe edilir, eğerönerilen inkübasyon süresi dışında e, bunlar aşırı lekeli ve ayırt etmek zor olacaktır. İkinci olarak, MMT hücreleri hemasitometre veya doku kültürü plakasında kümelenir ve tek tek saymak zor olabilir. Bu nedenle, bir "yığın" (örneğin, 10 hücre / yığın) ızgara üzerinde bulunan ve her küme ardından sayımı sırasında bu sayı ile çarpılır hücrelerin belirli bir sayıda içeren belirlenmiştir. Son olarak, MMT hücreler yetiştirilen Tabakların yüzeyine yapışır. Bu hücrelerin çıkartırken plakasına doğrudan pipetlemeyin ucu dokunma ve hücre kümeleri break up ve mümkün olduğunca plaka gibi birçok hücreleri çıkarmak için kuvvet uygulamak için gereklidir. Sonuç olarak geleneksel hemositometre yöntemini kullanırken doğru bir sayım elde etmek için birkaç deneme alabilir Gözat.

Hücreler, iyi karakterize ve sayma yöntemleri belirlenmiş olan iki farklı deneyler yapılmaktadır; değişik konsantrasyonlarda etkilerinin bir doz yanıtı araştırmasıMMT, hücre bölünmesi ve zamana yayılmış bir deneyi anti-proliferatif ilaçlar, bu ilaçlara maruz bırakılma optimal süresi aydınlatmak için. Deneme yanılma gerekli olduğunu ve birincil edebiyat uygulaması başarılı bir deney için gerekli olduğu gibi bu son derece öğreticidir deneyler bulunmaktadır. Örneğin, bu, anti-proliferatif ajanlar MMT hücrelerinin bir doz cevap açıklık başlangıç ​​girişimler% 100 hücre ölümü ilaç uygulama 24 saat içinde ek olarak test edilen konsantrasyonlarda çok yüksek olduğunu ortaya koymuştur. Literatürde genişletilmiş bir yorum tedavi konsantrasyonları revize dizi yol açtı. Bu etkili bir birincil edebiyat yazılar, edebiyat veritabanları kullanmak okumak, analiz etmek ve eleştirmek için nasıl öğrencilere öğretir ve bu beceriler, bilimsel süreç için gerekli olan ne çiziyor.

Doz yanıt çalışmalarının sonuçları tamoksifen test edilen bütün konsantrasyonlarda güçlü anti-proliferatif bir etki sergilediğini göstermektedir. Tamoksifen, bir anti-mitotiC ilaç, tipik haliyle, hormona duyarlı hastalarda 18-20 postmenopozal östrojen duyarlı kanserler için, bir anti-östrojen tedavisi spesifik olarak kullanılır. İlaç anda bir göğüs kanseri tedavisi için kullanılır. Tamoksifen, hücre içi, östrojen reseptörü için estrojen ile rekabete girmekte ve bağlandığında, d Aşağı siklinlerin ve B, hücre döngüsünün iki önemli regülatörleri ekspresyonunu düzenler. Aktivitesi elde edilen sonuçlar tamoksifen başarılı bir şekilde östrojen reseptörüne bağlandığı ve gözlenen azalmış hücre çoğalması ile sonuçlanan, hücre döngüsü aracılığıyla hücre ilerlemesini inhibe ettiğini göstermektedir. Literatüre dayalı beklenir gibi İlginçtir, uygulanan tamoksifen tüm konsantrasyonları arasında MMT hücre çoğalma oranlarının azaltılması (örneğin 19 için bakınız), tamoksifen hücresel direnci hiçbir belirti ortaya koymaktadır. Bu deney yapılmıştır edildiği in vitro koşullarda tam olarak modeli i yapmak iyi bir hatırlatma olarak hizmet vermektedirn koşullar vivo.

MMT hücrelerinin Kurkumin tedavisi, aynı zamanda, hücre canlılığı, bir azalma ile sonuçlandı. Kurkumin, bir hücre büyüme inhibitörü 12,16 olarak tumeric kökü ve hareket türetilen bir bileşiktir. Bu aşağı doğru düzenleyen NF-kappa B yolu ve ornitin dekarboksilaz (ODC) aktivitesi çalışır. NF-kappa B apoptozisi inhibe proteinleri kodlayan, anti-apoptotik genlerin bu TRAF1 ve TRAF2, transkripsiyonunu kontrol eden, bir protein kompleksi. ODC poliaminler, gelişmiş hücre büyümesine yol beslenme artan kaynaklarla kanser hücrelerini sağlayan proteinlerin üretimini katalize eden bir enzimdir. İlaç, bir göğüs kanseri tedavisi için güncel kullanılıyor. kurkumin anti-proliferatif etkiler açık bir şekilde, hücre bölünmesi ile ilgili NF-kappa B ve ornitin dekarboksilaz içeren hücre sinyal yolunun düzenlenmesi olan aşağı etkisi gösterir.

Azaltılmış hücre canlılığı Benzer metformin yüzey işlenmesi ile gözlemlendint. Yayınlanan raporlar metformin ve meme kanseri 15 daha düşük bir oranda alan hastaların arasında bir korelasyon göstermektedir, çünkü, metformin, tipik haliyle II diyabet Tip verilen bir ilaç seçilmiştir. Bu madde, c-myc geni, modüle inanılmaktadır ve bu şekilde daha hızlı bir oranda döngüsü yoluyla ilerleme hücreleri, siklinler, hücre siklüsü içinde kontrol noktası olarak hizmet moleküllerinin siklin D üste-düzenleme aktivitesi aşağı regüle izin verir artan hücre bölünmesi ve büyüme ile sonuçlanır. c-myc geninin modülasyonu siklin D aşağı-regülasyonu ve hücre bölünmesi bir azalmaya yol açar kadar MMT hücreleri üzerinde metformin tedavisi etkilerini gösterir. Metformin veriler ayrıca bir ilaç Diyabet-Diğer anormal fizyolojik olaylar için uygun bir etki mekanizmasına sahip olabilir, bu durumda, bir koşullandırma için tasarlanmış kadar örnek teşkil etmektedir. Buna ek olarak, tamoksifen, kurkumin, ve metformin, ancak tüm anormal hücre Prolif geciktirir olduğunu vurgulamak için önemlidirFarklı mekanizmalarla eration, her başarılı hücre popülasyonlarının azaldığı ve in vitro hücre bölünmesi ile müdahale etti.

Bu modül aynı zamanda başka bir ilaç olarak açık uçlu soruşturma, bitkisel ilaç sağlar, ya da ajan test edilebilir. Aspirin, bir reçetesiz satılan ağrı kesici, ateş düşürücü ve hafif ağrı dindirmek ve ateşi düşürmek için kullanılan anti-iltihap ilaçları bu modülde seçildi. Inflamasyonu azaltmak için Aspirin yeteneği bunları besleyen yeni kan damarlarının gelişmesini yavaşlatan ve büyüme 11,13,14 yakıt kök hücreleri ile müdahale etmek suretiyle tümör büyümesini inhibe edebilir. İlginçtir ki, hücreler MMT'in aspirinin yönetim hücre canlılığı bazı azalmaya neden etmedi. Birçok bağıntılı çalışmalar nedensel ilişkilerin karşı bağlaşık mükemmel bir örneğini sunan 13,14 rapor olmasına rağmen çok az kanserin önlenmesi ve tedavisinde aspirin rolü hakkında bilinmektedir.

zamanders, iyileştirilmiş dozlarda tatbik edildiği zaman, anti-proliferatif ilaçlar, ilk maruz 4 gün içinde hücre bölünmesi ile müdahale etmek son derece etkili olduğunu ortaya koymuştur. Bu çalışmalar aynı zamanda bu deneyler için deneysel bir strateji oluşturulması zaman MMT hücre büyümesi özellikleri hakkında öğrendiklerini kullanmak için öğrenciler için bir fırsat sağlamaktadır. Aslında, iyice zaman ve MMT hücrelerinin genel hücre morfolojisi iki katına, hücre büyümesi modellerini karakterize hem hassas doz tepkisi ve zaman süreci verileri için gereklidir.

Hem doz yanıtı ve zaman derste ilaç konsantrasyonu sırasıyla maruz kalma, zamanında ve biyolojik sistemde bir ilaç vardır etkisi arasındaki ilişkiyi belirler. Bu, soruşturma tahrik araştırma faaliyetlerini yürütürken biyokimya moleküller arası etkileşimler ve diğer temel kavramlar hakkında düşünmeye öğrencileri almak için mükemmel bir yoldur. Bu fazlalaştı birçok bi yanaology binbaşı tıp fakültesine devam planlıyoruz bu laboratuvar modülü tıp fakültesi gereksinimleri 21 yeni tesis değişikliklerle iyi hale getirir.

Bu laboratuar modülü tarif edildiği gibi tam olarak uygulanabilir ya da hali hazırda bir şablon olarak hizmet edebilir. Varyasyon bir konakçı tür büyüme ortamı içinde bir anti-proliferatif ajanın seçimi, hücre tipi veya besin değişiklik olarak, bu aktivitenin dahil edilebilir. Sürece bir hipotez hücresine ya da genel biyolojinin temel ve ileri kavramları test geliştirilmiştir gibi, bu modülün permütasyonu çoktur. Ne olursa olsun permutation, bu faaliyetin uygulanması doğal laboratuvar teknikleri büyük bir dizi öğrenmek ve ekipman ve enstrümantasyon çeşitli aşina olmak için öğrenci yönlendirir.

Özetle, burada açıklanan laboratuar modülü öğrencileri tam, bilimin sürecine katılmak kazanmak için kendi yeteneklerini geliştirmek, analiz etmek ve grafiksel Repr sağlarveri ESENT ve onların zaman yönetimi ve işbirlikçi becerilerini bilemek. Modül açık uçlu soruşturma kolaylaştırmak için tasarlanmış ve çeşitli kurs programları ve beceri düzeyleri kolayca adapte olduğunu. Bu yazıda ilk iki yazar açıkça bu laboratuvar modülü o nüfus için uygun olduğunu gösteren, lisans biyoloji binbaşı olduğu unutulmamalıdır.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarlar Motic hiçbir maddi veya benzer destek aldı.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Tissue Culture Hood ESCO Labculture Reliant Class II Type A2 Biological Safety Cabinet
Waterjactor CO2 Incubator CEDCO Model 1510
Bright-line Hemocytometer American Optical with two separate grids
Motic Images Plus Mac OSX Verison 2.0 or higher
Gilson Pipetman Rainin instrument co. inc P-20D, P-200D, P-1000D
CK30/CK40 Culture Microscope Olympus 4 objective inverted light microscope with camera
200 μl Pipet tips MidSci 40200C
1,000 μl Pipet tips MidSci AVR4
10 ml Seriological Pipets TPP TP94010
24 well plates CoStar- Tissue Culture Cluster 3524 24 wells, 16 mm well diameter, radiation sterilized
Trypan Blue Solution 0.4% Sigma T8154 100 ml, cell culture tested non-haz
Bright-line Hemacytometer replacement coverslip, non-haz Sigma Z375357
Mouse Mammary Tumor(MMT) cells ATCC CCL-51
Eagle Minimum Essentail Medium (EMEM) ATCC 30-2003 500 ml
Fetal Bovine Serum Sigma F0926 500 ml
Metformin Hydrochloride Sigma PHR1084 500 mg
Tamoxifen Sigma T5648 white or white-yellow powder
Curmumin Sigma C1386 yellow-orange powder
Aspirin Sigma A2093 meets USP testing specifications

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hammamieh, R., et al. Students investigating the antiproliferative effects of synthesized drugs on mouse mammary tumor cells. Cell Biol Educ. 4, (3), 221-234 (2005).
  2. Sykes, J. A., Whitescarver, J., Briggs, L. Observations on a cell line producing mammary tumor virus. J Natl Cancer Inst. 41, (6), 1315-1327 (1968).
  3. Palombi, P. S. J., Snell, K. Learning about Cells as Dynamic Entities: An Inquiry-Driven Cell Culture Project. Bioscene: Journal of College Biology Teaching. 33, 27-33 (2008).
  4. Ledbetter, M. L. S., Lippert, M. J. Glucose Transport in Cultured Animal Cells: An Exercise for the Undergraduate Cell Biology Laboratory. Cell Biology Education. 1, (3), 76-86 (2002).
  5. Weaver, D. Cardiac Cells Beating in Culture: A Laboratory Exercise. American Biology Teacher. 69, 407-410 (2007).
  6. Marion, R. E., Gardner, G. E., Parks, L. D. Multiweek cell culture project for use in upper-level biology laboratories. Advances in Physiology Education. 36, 154-157 (2012).
  7. Mozdziak, P. E. P., James, N., Carson, S. usanD. An Introductory Undergraduate Course Covering Animal Cell Culture Techniques. Biochemistry and Molecular Biology Education. 32, (5), 319-322 (2004).
  8. Anderson, L. W., et al. A taxonomy for learning, teaching and assessing: A revision of Bloom's Taxonomy of educational objectives (Complete Edition). Longman, London, England. (2001).
  9. Centers for Disease Contol and Prevention. Appendix A - Primary Containment for Biohazards: Selection, Installation and Use of Biological Safety Cabinets. (2014).
  10. Davis, J. M. Basic Cell Culture: A Practical Approach. 2nd edn, Oxford University Press. Oxford, UK. (2002).
  11. Algra, A. M., Rothwell, P. M. Effects of regular aspirin on long-term cancer incidence and metastasis: a systematic comparison of evidence from observational studies versus randomised trials. Lancet Oncol. 13, (5), 518-527 (2012).
  12. Anand, P., Sundaram, C., Jhurani, S., Kunnumakkara, A. B., Aggarwal, B. B. Curcumin and cancer: an 'old-age' disease with an 'age-old' solution. Cancer Lett. 267, (1), 133-164 (2008).
  13. Ararat, E., Sahin, I., Altundag, K. Mechanisms behind the aspirin use and decreased breast cancer incidence. J BUON. 16, (1), 180 (2011).
  14. Ararat, E., Sahin, I., Altundag, K. Aspirin intake may prevent metastasis in patients with triple-negative breast cancer. Med Oncol. 28, (4), 1308-1310 (2011).
  15. Blandino, G., et al. Metformin elicits anticancer effects through the sequential modulation of DICER and c-MYC. Nat Commun. 3, 865 (2012).
  16. Kunnumakkara, A. B., Anand, P., Aggarwal, B. B. Curcumin inhibits proliferation, invasion, angiogenesis and metastasis of different cancers through interaction with multiple cell signaling proteins. Cancer Lett. 269, (2), 199-225 (2008).
  17. Burstein, D. E., Blumberg, P. M., Greene, L. A. Nerve growth factor-induced neuronal differentiation of PC12 pheochromocytoma cells: lack of inhibition by a tumor promoter. Brain Res. 247, (1), 115-119 (1982).
  18. Nazarali, S. A., Narod, S. A. Tamoxifen for women at high risk of breast cancer. Breast Cancer (Dove Med Press). 6, 29-36 (2014).
  19. Cui, J., et al. Cross-talk between HER2 and MED1 regulates tamoxifen resistance of human breast cancer cells). Cancer Res. 72, (21), 5625-5634 (2012).
  20. Komm, B. S., Mirkin, S. An overview of current and emerging SERMs. J Steroid Biochem Mol Biol. 143C, 207-222 (2014).
  21. Kaplan, R. M., Satterfield, J. M., Kington, R. S. Building a better physician--the case for the new MCAT. N Engl J Med. 366, (14), 1265-1268 (2012).
Çekirdek Biyoloji Kavramları öğretmek için Fare Meme Tümör Hücreleri kullanma: Basit Lab Modülü
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

McIlrath, V., Trye, A., Aguanno, A. Using Mouse Mammary Tumor Cells to Teach Core Biology Concepts: A Simple Lab Module. J. Vis. Exp. (100), e52528, doi:10.3791/52528 (2015).More

McIlrath, V., Trye, A., Aguanno, A. Using Mouse Mammary Tumor Cells to Teach Core Biology Concepts: A Simple Lab Module. J. Vis. Exp. (100), e52528, doi:10.3791/52528 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter