Ved hjælp af musen brysttumorceller at undervise Core Biologi Begreber: A Simple Lab Modul

Introduction

Ofte i bachelor generel biologi kurser, er emner af cellecyklusregulering og kræft berørt, men ikke undersøgt i detaljer, fordi bredden af ​​indholdet i disse kurser giver lidt tid til dybde. Desuden er bachelorstuderende biologistuderende ikke typisk udsat for de avancerede teknikker er forbundet med animalsk cellekultur. For at hjælpe eleverne med at udvikle en dybere forståelse af disse begreber, mens anvendelse og analysere, hvad de har lært, blev et laboratorium, der udvikles som en modifikation af Walter Reed Army Institute of Research (WRAIR) udvidet laboratorieaktivitet ^1. Laboratoriet modul anvender en trinvis, eksperimentel strategi, som omfatter dyrkning og karakterisering en cancercelle model, udvikle og gennemføre celletælling metoder, oprettelse optimal tidsforløb og doseringer til behandling af celler med anti-proliferative midler, og identificere aberrerende celle-signalveje . Eksperimentet giver også mulighed for åben-ended undersøgelse.

De fleste af de teknikker, der kræves til denne aktivitet kan udføres i et typisk biologi-undervisning laboratorium. Aktiviteten starter med studerende karakteriserer morfologi og vækstrate for musebrysttumor (MMT) cellelinje, en model for human brystkræft ^2. Brystkræft blev valgt som model kræft på grund af sin udbredelse i befolkningen, dens kendskab til college-alderen studerende, og de udbredte data. MMT cellelinjen blev specifikt valgt, fordi det er vanskeligt at indhente velkarakteriseret, har en kort fordoblingstid og er nemme at dyrke. Desuden MMT celler er østrogen-afhængige som er i overensstemmelse med de fleste kvindelige brystkræft. Studerende derefter identificere afvigende celle-signalveje i MMT celler ved behandling af cellerne med kemoterapi narkotika, hvis virkningsmekanisme er godt established.The koncentration af narkotika og længden af ​​behandlinger varierede giver eleverneat evaluere virkningen af ​​disse variable på hastigheden af ​​celledeling. Nøglen assay for denne aktivitet er bestemmelsen af ​​cellelevedygtighed, som blot kræver celletælling, ved hjælp af en af ​​to metoder. Hver metode afhænger af stærke mikroskopi færdigheder. Studerende bestemme cellelevedygtighed ved anvendelse af en standard, hæmocytometer fremgangsmåde og et hidtil ukendt fotomikroskopi fremgangsmåde og foreslår. Baseret på deres resultater, kan de foreslå og afprøve ændringer til aktiviteten. Studerende derefter repræsentere deres data og fortolke resultaterne til at forfine deres hypotese og udtænke nye eksperimentelle strategier.

Dette laboratorium aktivitet er velegnet til freshman eller sophomore niveau studerende med hovedfag i de biologiske videnskaber. Den er kondenseret til en uges lab modul, der kan være afsluttet i en første år, generel biologi eller andet år, cellulær / molekylær biologi kursus. Færdigheder er nødvendige for korrekt gennemførelse af aktiviteten omfatter grundlæggende aritmetik og algebra, kendskab til en bred vifte af cmalm laboratorie færdigheder (f.eks pipettering, løsning gør, steril teknik), dataanalyse, grundlæggende lysmikroskopi og tidsstyring, sammen med instruktør kendskab til cellekultur og regneark. Reagenser nødvendige omfatter et dyr cellelinie model for cancer (f.eks muse brysttumorceller, MMT ^2), kemoterapeutiske stoffer (f.eks, tamoxifen, curcumin, metformin, og aspirin), trypanblåt og celledyrkningsmedier (f.eks Eagles Minimum Essential Medium ; EMEM) med passende kosttilskud (f.eks donor hest og føtalt bovint serum). Nødvendige instrumenter omfatter en inverteret lysmikroskop med digital kamera vedhæftet fil, computer, 100 mm og 24 brønds vævskulturplader, _{CO2-inkubator} (eller tilsvarende), biosikkerhed kabinet (BSC; klasse II), hæmocytometer, og digital mikroskopi software.

Der er gode eksempler på specifikke lab aktiviteter, der er afhængige af dyrecellekultur at TEACh studerende om begreber i cellebiologi ^3. Men mange kræver forsyninger eller teknikker, som ikke er let tilgængelige (fx radioaktive isotoper, levende dyr væv, avanceret billedbehandling udstyr ^1,4,5), beskriver protokoller, der er ganske fremskreden (fx egnet til en 400-niveau kursus ^6), eller kræver multi-ugers eller semester lange projekter ^6,7. Laboratoriet aktivitet er beskrevet her, er ligetil og kan udføres i en enkelt uge med fælles lab udstyr.

Sammenfattende denne lab modul effektivt introducerer eller styrker begreberne cellecyklus, cellulære signalveje og kræft mens undervisning grundlæggende og avancerede lab færdigheder, eksperimentel dataanalyse, metoden til dyrecellekultur og den videnskabelige proces. Laboratoriet modulet er enkel og økonomisk tilgængelig og giver både fleksibilitet og mulighed for åben undersøgelse. Aktiviteten tilskynder studerende kreativitetved at tilvejebringe en skabelon eksperimentel strategi, der fungerer som en vejledning, men ikke en opskrift. Vigtigst, aktivitet opfylder alle læringsområder af Blooms taksonomi ^8, da det kræver at huske, forståelse, anvendelse, analyse og evaluering og skabe ved at engagere de studerende i en proces, der trækker dem ud af lærebogen og ind i verden af videnskabelig forskning.

Protocol

Bemærkninger: Adfærd alt arbejde med celler og cellekulturreagenser i en klasse II biosikkerhed kabinet (BSC) ^9. MMT celler klassificeres som biosikkerhed niveau I, da de udgør lav til moderat biologisk risiko. Påfør ordentlig rengøring og dekontaminering procedurer til BSC mellem anvendelser (f.eks ultraviolet lys, 70% ethanol tørre ned).

1. Grow MMT celler

1. Grow celler i 10 cm vævskulturskåle indeholdende 10 ml næringsrige medier, der består af Eagles Minimum Essential Medium (EMEM) suppleret med 10% føtalt bovint serum (FBS), 2 mM glutamin og 1% antimykotisk / Antibiotikum (10 enheder penicillin , 100 ug streptomycin, 0,25 ug amphotericin B). Dyrk celler i en fugtig 5% _CO2 kammer ved 37 ° C. Plate celler ved en densitet på 3,6 x 10 ⁶ celler / ^cm2 (se Counting Cells i trin 2).
2. Erstatte halvdelen af ​​cellekulturmediet med frisk medium hver 48 timer UNLess andet er angivet. Kontroller levedygtighed og morfologi celle ved undersøgelse med en omvendt fase kontrast lysmikroskop.
   1. Bemærk og karakterisere celler til størrelse, struktur, form, organisation og anslåede antal under 100 - 200X forstørrelse. På denne tæthed, bør cellerne forekommer i et plan, ikke klumpet oven hinanden og i tæt nærhed. Hver celle består af en tyk, sfærisk kerne med tynde, lange, branche-lignende forlængelser ekspanderende fra det, der kommer til et punkt (se figur 1).
3. Underinddele celler, når de når en celledensitet på 7,2 x 10 ⁶ celler / ^cm2. Celler udviser en fordobling på 1,8 x 10 ⁶ celler / ^cm2 per 24 hrs. Udpeg celler Passage X (Px) til angivelse af antallet af gange, de har været delt.
   1. Ved generation 3 (dvs. efter tre passager, P3), høst, tæller, og pladen cellerne på en 24 brønd vævskulturplade med en tæthed på 3,6 x 10 ⁶ cm2.
4. Se celler hver dag og optage digitale mikrofotografier. Bemærk og beskrive cellemorfologi (dvs. størrelse, form, lys reflekterende egenskaber). Bestemme celle fordoblingstid ved at tælle celler regelmæssigt og vedrørende forløbet tid til celleantal.

2. Tæl MMT Cells

Bemærk: Tæl celler at afgøre, om cellerne skal subkultur, at sætte op for et eksperiment eller at bestemme cellernes levedygtighed. Der er to metoder, der præsenteres her.

1. Anvendelse af et hæmocytometer, at en standard teknik tælle celler.
   1. Opnå en lys-line hæmocytometer, en 0,2% opløsning af trypanblåt, en forbindelse lysmikroskop, sterile reagensglas, pipetter og en manuel celletæller.
   2. Under BSC, brug en 10 ml pipette for at fjerne celler fra en 10 cm vævskulturskål. Hvis celler dyrkes på en 24-brønds plader anvendes en 1 ml pipette eller 1.000 pi mikropipette for at fjerne medierne.
   3. Placer resulterende cellesuspension i en 15 ml sterilt rør (eller 1 ml micro centrifuge eller et andet lille volumen tube). Ellers skal cellerne i den oprindelige vævskulturplade / brønd.
   4. Under BSC, kombinere 10 pi af cellesuspensionen med 10 pi af trypanblåt-opløsning (1: 1-forhold) i et ikke-sterilt micro centrifuge eller et andet lille volumen rør.
      Bemærk: Trypan blå er en afgørende plet, der ikke absorberes af sunde levedygtige celler. Når celler er beskadiget eller døde, trypanblåt kan trænge ind i cellen tillader døde celler, der skal tælles (aka farvestof udelukkelse metode). Derfor under et mikroskop, vises døde celler mørklilla mens levedygtige celler er en lys og lys i farven.
   5. Inkuberved stuetemperatur i 5 min.
   6. Placer dækslet slip på hemocytometer. Påfør 10 pi af trypan suspension blandingen blue-celle ind i rillen. Se hæmocytometeret ved 100 - 200X forstørrelse. En fire-hjørne gitter fremgår (se figur 2).
   7. Tæl antallet af levedygtige celler (ufarvede) versus totale celler i hver inddelte areal. Gennemsnittet af fire net og gange med 1 x 10 ⁴ for at opnå celler / ml.
      1. Ekstrapolere det samlede antal celler pr skål (eller celler / ^cm2). Bruge dette nummer til enten bestemme det korrekte volumen af cellesuspensionen at bruge til at pode en ny vævskulturplade ved den ønskede densitet på 3,6 x 10 ⁶ celler / ^cm2 eller bestemme totale antal af levedygtige celler på pladen eller i brønden.
         Bemærk: For yderligere vejledning om brug af et hæmocytometer, se ^10.
2. Bruge software og et digitalt kamera til at tælle levedygtige celler.
   1. Anskaf en digital kamera, dens tilhørende software, en 0,4% opløsning af trypanblåt, en forbindelse lysmikroskop, sterile reagensglas, pipetter og en computer.
      Bemærk: En Moticam 2.000 digitalkamera med tilhørende Motic Software er ansat her. Enhver sammenlignelig kamera og software bør være tilstrækkelig. Sikre, at det digitale kamera software er blevet kalibreret på forhånd (ifølge producentens protokol).
   2. Under BSC, bruge en 1 ml pipette eller 1.000 pi mikropipette at fjerne medier fra MMT celler, der vokser i en 24 brønd vævskulturskål. Vask vedhæftende celler ved forsigtigt at påføre en lille mængde (ca. 500 pi) i un-suppleret (dvs. EMEM uden eventuelle tillæg) frisk medier til pladen derefter fjerne den. Påfør 10 pi 0,2% trypanblåt (fremstillet ved at fortynde 1: 1 med un-suppleret EMEM) direkte til brønden.
   3. Inkubér pladen ved stuetemperatur i 5 min.
   4. Se pladen under mikroskop ved 100 - 200x forstørrelse wed et digitalt kamera vedhæftet. Plade kan vaskes med ikke-supplerede medier, hvis farvning med 2% trypanblåt er for mørkt.
   5. Åbn software på computeren en nd kontrollere, at softwaren er kalibreret til det mål, der anvendes via fanebladet Indstillinger. Et billede af FOV skal vises.
   6. Vælg Grid fra fanen Mål. Et gitter af kvadrater på ca. 0,005 cm i bredden vises. Vælg Grid oplysninger til at bekræfte det område hver firkant.
   7. Vælg et bestemt område i gitteret for at tælle celler (dvs. 5 pladser x 9 firkanter). Vælg rektangel fra fanen Mål. Klik på hjørnet af en firkant, og træk markøren til at omfatte kvadrater af valg.
      Bemærk: En nuance af grøn vil dække de pladser af valg og en hvid boks vises i hjørnet, der giver den bredde, højde, areal og omkreds af den del af den valgte nettet (se figur 3).
   8. Tæl antallet af viaBle celler inden det fastslåede areal. Gør det samme for to andre steder i den samme brønd eller plade ved at bevæge pladen under mikroskopet.
   9. Vær sikker på, at det målte område er den samme, og forstørrelsen er ikke ændret. Beregn det gennemsnitlige antal levedygtige celler i området. Brug af området af brønden (for en 24-brønds plade, en brønd har et areal på 2 ^cm2, for en 100 mm skål området er 78,6 ^cm2), ekstrapolere antallet af levedygtige celler fra området afgrænset i gitteret for at det samlede antal celler i brønd (celler / ^cm2).

3. Behandl MMT Celler med anti-proliferative Agents

1. Fremstille opløsninger af de udvalgte anti-proliferative terapeutiske midler (tamoxifen, curcumin og metformin) og valgfri lægemiddel, aspirin under BSC.
   1. Opløs curcumin og tamoxifen i 100% ethanol for at generere et lager koncentration på 27 mM. Opløs metformin og aspirin i unsupplemented EMEM at generere en bestand koncentration på 500 mM og 15 mM.
2. Etablere et Dosisrespons.
   1. Behandle MMT celler med de tre anti-proliferative terapeutiske midler (tamoxifen, curcumin og metformin) og valgfri lægemiddel (aspirin) i varierende koncentrationer i 96 timer for at generere en dosisresponskurve. I første omgang administrere alle narkotika på en række koncentrationer baseret på offentliggjorte rapporter ^1,11-16 og derefter ved koncentrationer større eller mindre end dem, der offentliggøres.
      Bemærk: En dosis-respons bestemmes den laveste koncentration af et lægemiddel nødvendig for at producere de ønskede resultater. Her det ønskede resultat er en reduktion i celleproliferation i sammenligning med kontrollen.
      1. For tamoxifen og curcumin, brug koncentrationer (og tilsvarende mængder) af 0,054 mM (1 ul), 0,108 mM (2 pi), 0,162 mM (3 pi) og 0,216 mM (4 pi).
      2. For metformin, brug koncentrationer (og tilsvarende mængder) af 2 mM (2 pi), 4 mM (4 pi), 6 mM (6 pi), 8 mM (8 pi) og 10 mM (10 pi).
      3. For aspirin, brug koncentrationer (og tilsvarende mængder) af 0,030 mM (1 pi), 0,060 mM (2 pi), 0,099 mM (3,3 pi), 0,150 mM (5 pi), og 0,216 mM (6,7 pi).
   2. Split MMT celler fra 10 cm skål på en plade med 24 brønde i en koncentration på 3,6 x 10 ⁶ celler / ^cm2. Bestemme startkoncentration celle ved både celle-tællemetoder (trin 2). Kalder denne nye plade med 24 brønde af celler "Dag Split".
   3. 24 timer efter celleudpladning, behandle MMT-celler med hver af de anti-proliferative terapeutiske midler, tamoxifen, curcumin, metformin og aspirin, ved de koncentrationer, der er beskrevet i trin 3.2.1. Henvise til dette som "dag 0".
      1. Som hver brønd kan rumme maksimalt 500 pi medier, brug mikropipetter med sterile mikropipette tips og en ny spids hver gang en ny brønd behandles for at undgå crOSS kontaminering. Brug to brønde som kontrol: celler dyrket i mangel af behandlingstilbud (negativ kontrol) og celler dyrket i tilstedeværelsen 100% ethanol (opløsningsmiddel kontrol).
   4. Grow celler og re-administrere narkotika på de beskrevne koncentrationer, når cellerne fodres hver anden dag (se trin 1.2) i 96 timer (indtil dag 4) på dag 1 -. 4 i behandling, observere cellerne under mikroskop og tælle bruge fremgangsmåden i trin 2.2 (se figur 4).
   5. Gentage eksperimentet mindst tre gange.
   6. Bestemme optimale koncentration af hvert medikament ved grafer forholdet mellem cellelevedygtighed og lægemiddeldosis over længden af eksperimentet (se figur 5).
3. Etablere et tidsforløb.
   1. Behandle MMT celler med de tre anti-proliferative terapeutiske midler (tamoxifen, curcumin og metformin) ved en fast koncentration i varierende tidsperioder. Brug den optimale koncentration IDENTIFIED gennem dosisresponset eksperimenter (se trin 3.2).
      1. Brug følgende koncentrationer: 0,216 mM tamoxifen, 0,216 mM curcumin og 10 mM metformin.
         Bemærk: En tidsforløb bestemmer mængden af ​​nødvendige tid til et lægemiddel til at producere sin optimale ønskede resultat. Her, det ønskede resultat er en reduktion i celleproliferation i sammenligning med kontrollen.
   2. Split MMT celler fra 10 cm skål på en plade med 24 brønde i en koncentration på 3,6 x 10 ⁶ celler / ^cm2. Bestemme startkoncentration celle ved både celle-tællemetoder (trin 2). Kalder denne nye plade med 24 brønde af celler "Dag Split".
   3. 24 timer efter celleudpladning, behandle MMT-celler med hver af de anti-proliferative terapeutiske midler, tamoxifen, curcumin, metformin og aspirin, ved optimale koncentrationer bestemt i Trin 3.2. Henvise til dette som "dag 0".
      1. Som hver brønd kan rumme maksimalt 500 pi medier ose mikropipetter med sterile mikropipette tips og en ny spids hver gang en ny brønd behandles for at undgå krydskontaminering.
      2. Brug to brønde som kontrol: celler dyrket i mangel af behandlingstilbud (negativ kontrol) og celler dyrket i tilstedeværelsen 100% ethanol (opløsningsmiddel kontrol).
4. Vokse celler og re-indgive lægemidler ved den valgte koncentration når cellerne fodret hver anden dag (se trin 1.2) i 96 timer (indtil dag 4). På dag 1 - 4 under behandling, observere cellerne under mikroskop og tælle anvendelse af fremgangsmåden i trin 2.2 (se figur 4).
5. Gentage eksperimentet mindst tre gange.
6. Bestemme optimal eksponering på cirka MMT celler til hvert medikament ved grafer forholdet mellem levedygtighed og længde (tid) af lægemiddelbehandling celle ved den valgte koncentration (se figur 6).

4. Lab Module

Bemærk: Det følgende er en 5-dageslab tidsplan for laboratoriet modulet. Figur 7 er et rutediagram over hvad tidsplanen ville medføre inden for de 5 dage. Til denne aktivitet skal være afsluttet i fem dage enten et tidsforløb eller et dosisreaktionskurve genereres. Der er ikke tid nok til at frembringe begge kurver. En dosis-respons eksperiment er beskrevet nedenfor. En tidsforløb eksperiment kan let udskiftes

1. Opdel klassen i grupper: have en gruppe etablere en dosis respons, og den anden et tidsforløb vælge en koncentration i midten af ​​de foreslåede koncentrationer dosis-respons.
   1. Oprethold tilstrækkelige kulturer og narkotika bestande på passende koncentrationer. Med mindre andet er angivet, udfører alt arbejde under BSC.
2. Dag 1
   1. Direkte studerende til at gøre medierne og vokse celler (som i trin 1).
   2. Som studerende får et lager af MMT celler på en 10 cm plade, dirigere de studerende til at forberede cellekultur medier og give en tutorial i brugen af ​​hemocytometer, digital mikroskopi og digitalkameraet mikroskopi software (som i trin 2).
   3. Kalibrer softwaren til de mål, der anvendes på mikroskopet (f.eks 4X, 10X, 20X) nu bruger producentens protokol.
3. Dag 2
   1. Skal eleverne bekræfte samlede celleantal og cellelevedygtighed (som i trin 2).
   2. Har eleverne tælle celler på 100 mm skål under anvendelse af både den mikroskopi software og hæmocytometeret metoder, for at bekræfte opnås lignende resultater.
   3. Direkte studerende at få en 24 brønds plade og opdele celler fra 100 mm skål til de 24-brønds plader til det ønskede startpunkt celleudpladning tæthed (som i trin 1). Dette anses Day Split. Placer plade med 24 brønde i en cellekultur inkubator i 24 timer.
4. Dag 3
   1. Grow MMT-celler i 24 timer på en 24 brønds plade. Lad eleverne observere celler under mikroskop og tælle bruge mikroskopi software (som i trin 2).
   2. Give den studerende / team prøver af kræftbehandling narkotika bestande. Har dem forberede og fortynd den oprindelige stamopløsning (som i trin 3). Tilføje de forskellige koncentrationer af lægemidlerne til deres celler for at etablere en dosis-respons-kurve. Dette kaldes dag 0.
   3. Inkuber celler (trin 1.2) med lægemidler til højst 48 timer.
5. Dag 4
   1. Har eleverne observere behandlede celler efter 24 timer. Det er dag 1.
   2. Tæl hver brønd med mikroskopi software. Kan udføres Optag fotografier af hver brønd, så tælling uden for laboratoriet (som i trin 2).
   3. Inkuber celler (trin 1.2) med lægemidlerne i yderligere 24 timer.
      Bemærk: Instruktør giver ekstra tutorials og anmeldelser af dataanalyse og grafisk præsentation. Eleverne lærer at skabe figurer, plots, og statistiske analyser for den følgende dag for dataindsamling.
6. Dag 5
   1. Har eleverne behandlede celler efter 48 timer, Dag 2.
   2. Tæl hverbrønd under anvendelse mikroskopi software. Kan udføres Optag fotografier af hver brønd, så tælling uden for laboratoriet (som i trin 2).
   3. Høsten og indsamle cellerne til tælling ved den traditionelle hemocytometer metode som et middel til at kontrollere studerendes evne til effektivt at anvende mikroskopi softwaremetode (som i trin 2).
      Bemærk: Indsamle data og drage konklusioner eller revidere hypoteser, i overensstemmelse hermed.

Representative Results

Voksende MMT celler og sammenligne tællemetoder.

Musebrysttumor celler lykkedes dyrket og karakteriseret (figur 1) og en hidtil ukendt celletælling metode udviklet under anvendelse Motic Software, et digitalt kamera-associeret softwareprogram til et mikroskop. Denne nye celletælling metode blev sammenlignet med en traditionel optælling metode anvender et hæmocytometer (figur 2) og blev vist at være lige nøjagtig ved bestemmelse celletal (tabel 1). For at kontrollere for eventuelle virkninger for celleantal på grund af forskellige vækstbetingelser eller celletype, blev sammenligningen mellem de to celletælling metoder udføres i nærvær og fravær af anti-proliferative midler og med en anden cellelinie, den neuronale model PC12 ^17.

Figur 3 viser afgrænsningen af området for at tælle celler med denne metode ved hjælp af en overlejret gitter af defined dimensioner. Gitteret er lagt over synsfeltet (FOV) og en grøn ramme påføres derefter på en udpeget længde og bredde af gitteret (dvs. 9x5 kvadrater). Cellerne tælles inden for det grønne ramme og antallet af celler ekstrapoleres, som diskuteret i protokollen.

Behandling af MMT celler: Bestemmelse af dosis respons af MMT-celler til anti-proliferative midler.

Dosisreaktionsundersøgelser (figur 4) blev udført for hver antiproliferative middel. Gennem disse eksperimenter data løbende indsamlet, gennemgået og analyseret for at se, om eventuelle ændringer af protokollen blev berettiget. Eksperimentet blev udført tre gange, med hver undersøgelse producerer lignende resultater. Forsøg blev fortsat, indtil alle celler var døde eller virkninger af lægemidlerne havde toppet. Digitale mikrofotografier af resultaterne er vist i figur 4, og en grafisk analyse af disse resultater præsenteresi figur 5. er effektive koncentrationsintervaller rapporteret i legenden om figur 4, på X-aksen i figur 5 og i protokol afsnittet.

På tamoxifen laveste koncentration, 0,054 mM, der var robuste inhibering af cellevækst, ca. 83% i forhold til ubehandlede celler (figur 4A). Cellelevedygtighed fortsatte med at falde med stigende koncentrationer af tamoxifen (figur 5A). Den optimale dosering af tamoxifen var bestemt til at være 0,216 mM fordi efter 48 timers komplet celledød indtraf ved denne koncentration (figur 4A). Interessant, disse reduktioner i cellepropagering viser ingen tegn på en cellulær resistens over for tamoxifen, som det ville forventes på grundlag af litteraturen ^18,19 understreger, at in vitro-systemer model, men ikke altid repræsenterer fuldt in vivo begivenheder. Endvidere, når kontrast til den laveste threevådt, koncentrationer af curcumin (figur 4B og 5A) og metformin (figur 4C og 5B), tamoxifen laveste koncentration var 9% og 50% mere effektive i at stoppe celledeling, hhv.

Curcumin udviste en koncentrationsafhængig virkning på inhibering af celledeling samt. Med stigende koncentrationer, der var et signifikant fald i cellelevedygtighed (figur 4D og 5A). Den optimale dosering af curcumin blev bestemt til at være 0,216 mM fordi efter 48 timer, ligesom tamoxifen, der var fuldstændig celledød ved denne koncentration.

Metformin behandling gav den mindste dramatisk fald i MMT cellelevedygtighed, hvilket fører til 33% reduktion ved laveste koncentration. En ledsagende fald i cellelevedygtighed med stigende metformin koncentration blev observeret (figur 4C og 5B). Den optimale dosis af metformin blev bestemt til at være den højeste koncentration testet (10 mM). Sammenlignet med tamoxifen og curcumin, både rutinemæssigt som kemoterapimidler, metformin var 30-40% mindre effektiv til inhibering cellecyklussen. Interessant, effekten af metformin på celledeling var i overensstemmelse med dem, der opnås ved administration af aspirin (figur 4D og 5A), en salicylsyre lægemiddel med nogen klart identificeret mekanisme af cellevækstinhibering.

Behandling af MMT celler: Bestemmelse af tidsforløbet for MMT cellulære respons på anti-proliferative midler.

En tidsforløb undersøgelse blev også udført for hver antiproliferative agent, fordi den effektive dosis af et indgivet lægemiddel kan blive påvirket af eksponeringstiden. Som dette modul assays for cellelevedygtighed, er det vigtigt først at identificere, hvor hurtigt celler deler (fordoblingstid), så en logisk vindue for det tidsrum cellerne er udsat for lægemidlerne kan vælges. Det er derfor vigtigt, at MMT celle fordobling tid værekonstateret ved første karakterisering af cellerne. Gennem disse eksperimenter blev data løbende indsamlet, gennemgået og analyseret for at se, om eventuelle ændringer af protokollen blev berettiget. Eksperimentet blev udført tre gange, med hver undersøgelse producerer lignende resultater. Forsøg blev fortsat, indtil alle celler var døde eller virkningerne havde toppet.

Tidsforløb undersøgelser viste, at behandling af MMT-celler med optimerede koncentrationer af hvert antiproliferative lægemiddel (tamoxifen 0,216 mM, curcumin 0,216 mM, metformin 10 mM) i 96 timer resulterede i fuldstændig celledød eller en udjævning af virkningerne af lægemidlet ( figur 6). Selvom aspirin, de "valgfri" stof, gjorde påvirke cellernes levedygtighed i vores dosis-respons undersøgelser, virkningen var mindre, og derfor ikke blev medtaget i tidsforløb studier.

Figur 1. MMT celler. Digital mikrofotografi af "sunde", ubehandlet muse-brysttumor (MMT) celler dyrket ved 3,6 x 10 ⁶ celler / ^cm2 i modificeret Eagles Minimum Essential Medium (EMEM) .100X, skala = 0,2 mm, er angivet med hvid bar. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 2. Hæmocytometer gitter. Mikrofotografi af hæmocytometer gitter, 100x. Hele gitter sektion vist i cirkel (FOV). Klik her for at se en større version af dette tal.

iles / ftp_upload / 52528 / 52528fig3.jpg "/>

Figur 3. Udpege den optælling med Motic software.   Billede af grid overlay på FOV og defineret område til at tælle MMT celler, der er etableret med Motic software set gennem mikroskop. 100X, skala = 0,2 mm, angivet med hvide bar. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 4. Dosisrespons af MMT-celler til anti-proliferative midler. Digitale mikrofotografier af MMT celler dyrket i nærværelse af anti-proliferative midler i varierende koncentrationer i 96 timer. Tamoxifen: (A1) 0,054 mM (A2) 0,108 mM (A3) 0,162 mM (A4) 0,216 mM; Curcumin: (B1) 0,054 mM (B2) 0,108 mM (B3) 0,162 mM (B4) .216 mM; Metformin: (C1) 2 mM (C2) 4 mM (C3) 6 mM (C4) 8 mM (C5) 10 mM; Aspirin: (D1) .030 mM (D2) 0,060 mM (D3) 0,099 mM (D4) 0,150 mM (D5) 0,216 mM; Ethanol (100%), og ubehandlet er begge kontroller. 100X, skala = 0,1 mm, angivet med blå linjer, der udgør hver firkant i nettet. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 5. Grafisk fremstilling af dosis-respons-eksperimenter af MMT-celler til anti-proliferative midler. Virkninger af stigende koncentrationer af anti-proliferative midler (A) tamoxifen, curcumin, aspirin, og (B) metformin på MMT cellelevedygtighed. Resultater enre udtrykt som en procentdel af kontrol efter 48 timers behandling, selvom celle behandling fortsættes i 96 timer. n = 3, er STD angivet.

Figur 6. Grafisk fremstilling af tidsforløbet analyse af MMT cellulære respons på anti-proliferative midler. Tidsforløb undersøgelse af virkningerne af tamoxifen (0.216mM), curcumin (0.216mM), og metformin (10 mM) på MMT cellelevedygtighed end 96 hrs. Resultater udtrykkes som en procentdel af kontrol efter 48 timers behandling. Vist her er resultatet af et repræsentativt eksperiment, n = 1.

Figur 7. Rutediagram af 5-dages lab modul.

Celle type	Drug Administered	Dag i eksperiment	Koncentration af lægemiddel	Celletal med Motic	Celletal med hemocytometer
MMT	Ubehandlet	Dag 2	-	7.8x10 4 celler / cm2	8.0x10 4 celler / cm2
MMT	Ethanol	Dag 2	10 mM	7.1x10 4 celler / cm2	7.2x10 4 celler / cm2
MMT	Tamoxifen	Dag 2	0,216 MM	0-celler / cm2	0-celler / cm2
MMT	Tamoxifen	Dag 2	0,054 mM	1.3x10 4 celler / cm2	1,5x10 4 celler / cm2
MMT	Curcumin	Dag 2	0,054 mM	1.9x10 4 calen / cm2	2.0x10 4 celler / cm2
MMT	Curcumin	Dag 2	0,216 mM	0-celler / cm2	0-celler / cm2
MMT	Metformin	Dag 2	2 mM	5.1x10 4 celler / cm2	5.2x10 4 celler / cm2
MMT	Metformin	Dag 2	6 mM	3.4x10 4 celler / cm2	3.5x10 4 celler / cm2
MMT	Aspirin	Dag 2	0,099 mM	2.8x10 4 celler / cm2	3.0x10 4 celler / cm2
PC12	Ubehandlet	Split	-	2.5x10 4 celler / cm2	2.1x10 4 celler / cm2

Tabel 1. Sammenligning af hæmocytometer og Motic software optælling metoder. Resultater af celletælling af MMT celler under anvendelse af enten Motic software eller hæmocytometeret metoder. Både ubehandlede og behandlede celler blev talt, samt en anden cellelinie, PC12, som en kontrol.

Discussion

En lab modul præsenteres der sigter mod at undervise i en række emner i cellebiologi gennem de avancerede teknikker af animalsk cellekultur. Modulet opnår dette ved at analysere virkningerne af en række anti-proliferative kemikalier på replikationen af ​​celler, der modellerer human brystcancer. Det primære assay er afhængig af den grundlæggende teknik med celletælling og indfører en ny måde at tælle celler under anvendelse mikroskopi software. Aktiviteterne omfatter modulet kan udføres med instrumenter og udstyr til rådighed i de fleste biologi programmer. Modulet kan implementeres i en 5-dages tidsplan med forsyninger, der er billige og let opnås. Selv om en bestemt mærke af digitalt mikroskop kamera og mikroskopi software bruges her (Motic Software), bør enhver sammenlignelig kamera og software tilstrækkeligt.

Denne lab modul udnytter MMT celler som en model for human brystcancer. Eleverne først lært at vokse og karakterisere disseceller i kultur. Det er vigtigt at understrege, at en vellykket gennemførelse af dette laboratorium modul kræver efterforskerne (aka studerende) være godt bekendt med udseende og opførsel af sunde MMT celler, især da ubehandlede MMT celler tjener som kontroller. Derfor grundig karakterisering af mønstrene cellevækst, fordoblingstid og generel morfologi MMT-celler er afgørende, hvis korrekt dosis-respons og tidsforløb data skal genereres.

Når karakteriseret blev MMT cellerne derefter testet for deres reaktion på forskellige anti-proliferative midler som et middel til at undervise emner af celledeling, cellecyklusregulering, cellesignalering og kræft. Cellelevedygtighed bruges til at forstå virkningen af ​​disse lægemidler på cellerne. En ny metode til at tælle celler, ved hjælp af software i forbindelse med et mikroskop monteret digitalt kamera, der er gennemført, og i forhold til en traditionel optælling hæmocytometer-baserede procedure for at kontrollere dets nøjagtighed. Thiroman metode giver to fordele, som er særligt bemærkelsesværdigt, fordi den bruges i prægraduat undervisning laboratorier. Først, da cellerne ikke behøver at blive fjernet fra vævskulturplade til tælling, er mindre tid nødvendig for at udføre de vigtigste eksperimentelle assay. Dette giver mulighed for et stort antal eksperimentelle variabler, der skal testes på en gang og i en begrænset periode. For det andet, metoden giver en digital registrering af den cellulære respons på den eksperimentelle behandling, så de studerende til at vurdere resultaterne og forfine deres eksperimentelle strategi uden for laboratoriet.

Der er flere spørgsmål at bemærke ved gennemførelsen begge disse tælle metoder. Første, forud for tælling af celler med enten fremgangsmåde, inkuberes cellerne med trypanblåt at skelne mellem en levedygtig celle og en døde celle. Døde celler gennemtrænges af farvestoffet og synes mørkeblå, mens levedygtige celler er lyse hvid. Men hvis cellerne inkuberes med dye ud over det anbefalede inkubationstid, vil de være over-farves og svært at skelne. For det andet kan MMT celler klumpe på hæmocytometeret eller vævskulturplade og være vanskeligt at tælle individuelt. Derfor er en "klump" udpeget til at indeholde et vist antal celler (fx 10 celler / klump) er, og hver klump til stede på nettet derefter ganget med dette nummer under optællingen. Endelig MMT celler klæbe til overfladen af ​​skåle, hvori de dyrkes. Det er derfor nødvendigt at røre spidsen af ​​pipetten direkte til pladen, når fjernelse af cellerne og anvende kraft til at bryde op celleklumper og fjerne så mange celler fra pladen som muligt. Som følge heraf min tage flere forsøg på at få en nøjagtig optælling ved brug af traditionelle hemocytometer metoden.

Med cellerne velkarakteriseret og optælling metoder verificeret, er to forskellige eksperimenter udført; en dosis respons undersøgelse af virkningerne af forskellige koncentrationeraf antiproliferative lægemidler på MMT celledeling og et tidsforløb eksperiment for at belyse den optimale tid for eksponering for disse lægemidler. Disse er meget instruktive eksperimenter som er nødvendig trial and error og anvendelse af den primære litteratur er nødvendig for en vellykket eksperiment. For eksempel indledende forsøg på at belyse en dosis respons af MMT celler til disse anti-proliferative midler viste, at de testede koncentrationer var for høj, da der var 100% celledød inden 24 timer af lægemiddelindgivelse. En udvidet gennemgang af litteraturen førte til et revideret række former for behandling koncentrationer. Dette lærer effektivt eleverne, hvordan man bruger litteraturdatabaser, læse, analysere og kritik primære litteratur artikler og understreger, hvordan disse færdigheder er afgørende for den videnskabelige proces.

Resultater af dosis-respons undersøgelser viste, at tamoxifen udviser den stærkeste antiproliferativ virkning ved alle testede koncentrationer. Tamoxifen, et anti-mitotic lægemiddel, anvendes specifikt som en anti-østrogen terapi for østrogenfølsomme cancere, typisk i postmenopausale, hormon-følsomme patienter ^18-20. Lægemidlet anvendes i dag som et brystkræft behandling. Tamoxifen konkurrerer med østrogen for den intracellulære østrogenreceptoren og når de er bundet, nedregulerer ekspression af cycliner D og B, to vigtige regulatorer af cellecyklus. Resultater opnået i aktiviteten antyder, at tamoxifen held bundet til østrogenreceptoren og inhiberede cellens progression gennem cellecyklus, hvilket resulterer i nedsat celleproliferation observeret. Interessant reduktionen i MMT celle formering satser på tværs af alle koncentrationer af tamoxifen administreres viser ingen tegn på cellulær resistens over for tamoxifen, som det ville være forventet baseret på litteraturen (se eksempel ^19). Dette tjener som en god påmindelse om, at de in vitro-betingelser, hvorunder forsøget blev gennemført ikke helt model in vivo omstændigheder.

Curcumin behandling af MMT-celler resulterede også i en reduktion af cellelevedygtighed. Curcumin er en forbindelse afledt af tumeric roden og virker som en cellevækst inhibitor ^12,16. Det virker ved nedregulering af NF-kappa B-vejen og ornithindecarboxylase (ODC) aktivitet. NF-kappa B er et proteinkompleks, der kontrollerer transkription af anti-apoptotiske gener, såsom TRAF1 og TRAF2, som koder for proteiner, der inhiberer apoptose. ODC er et enzym, der katalyserer produktionen af ​​polyaminer, proteiner, der giver kræftceller med forhøjet ernæringskilder fører til forøget cellevækst. Det stof er i brug som et brystkræft behandling. De antiproliferative virkninger af curcumin viser klart den virkning, at nedreguleringen af ​​cellen signalvej involverer NF-kappa B og ornithindecarboxylase har på celledeling.

Reduceret cellelevedygtighed blev ligeledes observeret med metformin treatment. Metformin, en medicin indgives typisk til type II-diabetikere, blev valgt, fordi offentliggjorte rapporter tyder på en korrelation mellem patienter, som tager metformin og en lavere forekomst af brystkræft ^15. Det antages, at midlet modulerer c-MYC-genet og derved nedregulerer aktiviteten af ​​cyclin D. opregulering af cycliner, molekyler, der tjener som kontrolpunkt i cellecyklus, tillader celler at fremskridt gennem cyklussen ved en hurtigere hastighed resulterer i øget celledeling og vækst. Virkningerne af metformin behandling på MMT-celler viser, hvordan modulation af c-MYC-genet også fører til nedregulering af cyclin D og en reduktion i celledeling. De metformin data yderligere eksempel på, hvordan en medicin beregnet til én konditionering i dette tilfælde diabetes- kan have en virkningsmekanisme egnet til andre afvigende fysiologiske begivenheder. Derudover er det vigtigt at understrege, at selv om tamoxifen, curcumin og metformin alle retard unormal cellulær spredningsrelateredebejde gennem forskellige mekanismer, hver succesfuldt reduceret cellepopulationer og forstyrret celledeling in vitro.

Dette modul giver også mulighed for åben undersøgelse, at en anden medicin, urtemedicin, eller agent kan testes. Aspirin, en over-the-counter smertestillende, antipyretiske og anti-betændelse medicin, som anvendes til at lindre mild smerte og nedsætte feber blev valgt i dette modul. Aspirin evne til at reducere inflammation kan inhibere tumorvækst ved at bremse udviklingen af nye blodkar, der puster dem og blande sig med stamceller at brændstof deres vækst ^11,13,14. Interessant indgivelse af aspirin for at MMT celler førte til en vis reduktion i cellelevedygtighed. Der vides kun lidt om den rolle, aspirin i forebyggelse og behandling af kræft selv om mange korrelative studier er rapporteret ^13,14, hvilket giver et glimrende eksempel på korrelative versus sygdomsfremkaldende relationer.

Tidenselvfølgelig undersøgelser viste, at, når det administreres på den bedst mulige doser, anti-proliferative lægemidler er meget effektiv til at interferere med celledeling inden for 4 dage efter første eksponering. Disse undersøgelser giver også en mulighed for de studerende at bruge, hvad de har lært om MMT vækst celle egenskaber, når udformningen en eksperimentel strategi til gennemførelse af disse eksperimenter. Faktisk grundigt karakterisering mønstrene cellevækst, fordoblingstid og generel cellemorfologi af MMT-celler er essentiel for både nøjagtige dosis-respons og tidsforløb data.

Både dosis-respons og tid kursus undersøgelser bestemme forholdet mellem koncentration og eksponeringstid henholdsvis narkotika, og effekten af ​​et lægemiddel har i et biologisk system. Dette er en fremragende måde at få de studerende tænker intermolekylære interaktioner og andre fundamentale begreber i biokemi, mens ledende undersøgelse drevet, forskningsaktiviteter. Det er værd at bemærke, at da mange biOlogy majors planlægger at deltage medicinsk skole, denne lab modul flugter godt med de nyligt anlagt ændringer i medicinsk skole krav ^21.

Dette laboratorium modul kan gennemføres nøjagtigt som beskrevet eller kan let tjene som skabelon. Et væld af variationer kan inkorporeres i denne aktivitet, såsom valget af antiproliferative middel, celletype eller ændring næringsstof i vækstmediet. Så længe en hypotese er udviklet, der tester grundlæggende og avancerede koncepter i celle eller generel biologi, de permutationer af dette modul er talrige. Uanset den permutation, gennemførelsen af ​​denne aktivitet naturligvis dirigerer studerende til at lære en bred vifte af laboratorieteknikker og blive fortrolig med en bred vifte af udstyr og instrumentering.

Sammenfattende laboratoriet modulet beskrevet her giver eleverne mulighed for at deltage fuldt ud i processen med videnskab, udvikle deres evner til at erhverve, analysere og grafisk ReprESENT data, og skærpe deres tidsstyring og samarbejdsevner. Modulet er designet til at lette åben undersøgelse og er let at tilpasse til forskellige kursus tidsplaner og niveauer. Det skal bemærkes, at de to første forfattere dette papir er bachelor biologi store selskaber, klart viser, at denne lab modul er egnet til denne population.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Tissue Culture Hood	ESCO Labculture Reliant		Class II Type A2 Biological Safety Cabinet
Waterjactor CO2 Incubator	CEDCO	Model 1510
Bright-line Hemocytometer	American Optical		with two separate grids
Motic Images Plus			Mac OSX Verison 2.0 or higher
Gilson Pipetman	Rainin instrument co. inc		P-20D, P-200D, P-1000D
CK30/CK40 Culture Microscope	Olympus		4 objective inverted light microscope with camera
200 μl Pipet tips	MidSci	40200C
1,000 μl Pipet tips	MidSci	AVR4
10 ml Seriological Pipets	TPP	TP94010
24 well plates	CoStar- Tissue Culture Cluster	3524	24 wells, 16 mm well diameter, radiation sterilized
Trypan Blue Solution 0.4%	Sigma	T8154	100 ml, cell culture tested non-haz
Bright-line Hemacytometer replacement coverslip, non-haz	Sigma	Z375357
Mouse Mammary Tumor(MMT) cells	ATCC	CCL-51
Eagle Minimum Essentail Medium (EMEM)	ATCC	30-2003	500 ml
Fetal Bovine Serum	Sigma	F0926	500 ml
Metformin Hydrochloride	Sigma	PHR1084	500 mg
Tamoxifen	Sigma	T5648	white or white-yellow powder
Curmumin	Sigma	C1386	yellow-orange powder
Aspirin	Sigma	A2093	meets USP testing specifications