Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

שימוש בתאים סרטניים עכבר החלב ללמד מושגי ביולוגיה Core: מודול מעבדה פשוט

Published: June 18, 2015 doi: 10.3791/52528
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Natural Sciences, Marymount Manhattan College

Introduction

לעתים קרובות בקורסי ביולוגיה כללית לתואר ראשון, בנושאים של רגולציה מחזור התא וסרטן נגעו אך לא נחקרו בפירוט כי רוחבו של תוכן בקורסים אלה משאיר מעט מאוד זמן לעומק. בנוסף, סטודנטים לתואר ראשון בביולוגיה אינם חשופים בדרך כלל לטכניקות המתקדמות הקשורות לתרבות תא של בעלי החיים. כדי לסייע לתלמידים לפתח הבנה עמוקה יותר של מושגים אלה, תוך יישום והניתוח מה שהם למדו, פעילות מעבדה פותחה כשינוי של וולטר ריד צבא מכון המחקר (WRAIR) הרחיב את פעילות המעבדה 1. מודול המעבדה משתמש ב, אסטרטגיה ניסיונית צעד חכם שכוללת גידול ואפיון מודל של תאי סרטן, בפיתוח ובביצוע שיטות ספירת תאים, ההקמה כמובן זמן אופטימלי ומינונים לטיפול בתאים עם סוכנים אנטי-שגשוג, וזיהוי מסלולי איתות תאים חריגים . הניסוי גם מאפשר פתוחהודעה -ended.

רוב הטכניקות הנדרשות לפעילות זו יכולה להתבצע במעבדה הוראת ביולוגיה-טיפוסית. הפעילות מתחילה עם תלמידים המאפיינים את שיעור המורפולוגיה וצמיחה של קו התאים סרטני החלב עכבר (MMT), מודל לסרטן השד אנושי 2. סרטן השד נבחר כמודל הסרטן בגלל שכיחותה באוכלוסייה, היכרותה לתלמידים בגילי קולג ', ונתונים נרחבים הזמינים. שורת תאי MMT נבחרה במיוחד משום שהוא בר השגה בקלות, מאופיין היטב, יש זמן הכפלה קצר וקל לגדול. בנוסף, תאי MMT הם תלויים באסטרוגן אשר עולה בקנה אחד עם רוב מקרי סרטן השד נשיים. תלמידים לאחר מכן לזהות מסלולי איתות תאים חריגים בתאי MMT על ידי טיפול בתאים עם תרופות כימותרפיות מנגנון פעולה שלו הוא גם established.The ריכוז של התרופות והאורך של הטיפולים מגוונים המאפשרים לתלמידיםכדי להעריך את ההשפעה של המשתנים הללו על קצב חלוקת תאים. Assay מפתח לפעילות זו הוא קביעת כדאיות תא, שפשוט דורשת ספירת תאים, באמצעות אחת משתי שיטות. כל שיטה תלויה בכישורי מיקרוסקופ חזקים. תלמידים לקבוע כדאיות תא על ידי שימוש סטנדרטי, שיטת hemocytometer ושיטת photomicroscopy רומן ולהציע. בהתבסס על הממצאים שלהם, הם יכולים להציע ולבחון שינויים בפעילות. תלמידים אז לייצג את הנתונים שלהם ולפרש את התוצאות כדי לחדד את השערתם ולתכנן אסטרטגיות ניסיוניות חדשות.

פעילות מעבדה זה מתאים לתלמידי כיתה ט 'או בכיתה י' ברמת התמחות במדעים הביולוגיים. הוא מרוכז במודול מעבדה של שבוע שניתן להשלים בשנה ראשונה, ביולוגיה כללית או שנה שנייה, כמובן ביולוגיה תאית / מולקולריים. כישורים דרושים להשלמה נכונה של הפעילות כוללים חשבון בסיסי ואלגברה, היכרות עם מערך של גמיומנויות מעבדה עפרות (למשל, pipetting, פתרון קבלת, טכניקה סטרילית), ניתוח נתונים, ניהול מיקרוסקופ האור והזמן בסיסי, יחד עם ידע מורה של תרבית תאים ותוכנת גיליון אלקטרוני. ריאגנטים הנדרשים כוללים מודל שורת התאים של בעלי חיים לסרטן (לדוגמא, תאי החלב עכבר גידול, MMT 2), סוכני כימותרפיה (למשל, טמוקסיפן, כורכום, מטפורמין, ואספירין), תקשורת והתרבות כחולה ותא trypan (למשל, בינוני חיונית המינימלית של הנשר ; EMEM) עם תוספי מזון מתאימים (למשל, סוס תורם וסרום שור עוברי). מכשירים הדרושים כוללים מיקרוסקופ הפוך אור עם קובץ מצורף מצלמה דיגיטלית, מחשב, 100 מ"מ ו -24 צלחות תרבית רקמה היטב, CO 2 באינקובטור (או שווה ערך), ארון בטיחות ביולוגית (BSC; Class II), hemocytometer, ותוכנת מיקרוסקופיה דיגיטלית.

ישנן דוגמאות טובות של פעילויות מעבדה ספציפיות המסתמכות על תרבות תאים של בעלי החיים לTEACסטודנטים לתואר ראשון h על מושגים בביולוגיה של תא 3. עם זאת רבים דורשים אספקה ​​או טכניקות שאינן נגישים בקלות (למשל, איזוטופים רדיואקטיביים, רקמת חיה של בעלי חיים, ציוד הדמיה מתקדם 1,4,5), מתארים פרוטוקולים שהם די מתקדמים (למשל, מתאימים לקורס 400 רמה 6), או דורשים פרויקטים ארוכים רב-שבוע סמסטר או 6,7. פעילות המעבדה המתוארת כאן היא פשוטה ויכולה להיות שנערכה בשבוע עם ציוד מעבדה משותף אחת.

לסיכום, מעבדה מודול זה ביעילות מציג או מחזק את המושגים של מחזור תא, מסלולי איתות תאיים וסרטן תוך הקניית מיומנויות בסיסיות ומתקדמות במעבדה, ניתוח נתוני ניסוי, השיטה של ​​תרבית תאים של בעלי חיים ואת התהליך המדעי. מודול המעבדה הוא פשוט ונגיש מבחינה כלכלית והן מספק גמישות והזדמנות לחקירה פתוחה. הפעילות מעודדת את יצירתיות תלמידעל ידי מתן אסטרטגיה ניסיונית תבנית שפועלת כמדריך, אבל לא מתכון. והכי חשוב, מספק פעילות בכל תחומי הלימוד של טקסונומיה פורח 8 כפי שהוא דורש לזכור, הבנה, יישום, ניתוח, הערכה ויצירה על ידי העוסק תלמידים בתהליך שמושך אותם אל מחוץ לספר הלימוד ולתוך העולם של מחקר מדעי.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

הערות: ניהול כל העבודה עם תאים וחומרים כימיים תרבית תאים בארון בטיחות ביולוגית Class II (BSC) 9. תאי MMT מסווגים כרמת בטיחות ביולוגית אני, כפי שהם מהווים נמוכים עד בינוניים ביולוגי סיכון. החל הליכי ניקוי וטיהור מתאימים לBSC בין שימושים (לדוגמא, אור אולטרה סגול, 70% אתנול לנגב).

1. לגדל תאי MMT

  1. לגדל תאים בצלחות תרבית רקמת 10 סנטימטרים המכילות 10 מיליליטר של תקשורת המזינה העשירה שכוללת הנשרים המינימום ההכרחי בינוני (EMEM) בתוספת סרום 10% שור עוברי (FBS), גלוטמין 2 מ"מ, ו -1% antimycotic / אנטיביוטי (10 יחידות פניצילין , 100 מיקרוגרם סטרפטומיצין, 0.25 מיקרוגרם amphotericin B). לטפח תאים בתא 5% CO 2 humidified, על 37 מעלות צלזיוס. תאי פלייט בצפיפות של 3.6 x 10 6 תאים / 2 סנטימטר (ראו ספירת תאים בשלב 2).
  2. להחליף מחצית מתרבית תאי התקשורת עם תקשורת טרי כל 48 שעות UNLESS צוין אחרת. בדוק כדאיות תא ומורפולוגיה בבדיקה עם מיקרוסקופ לעומת אור שלב הפוך.
    1. שים לב ולאפיין תאים לגודל, מבנה, צורה, ארגון ומספר משוער תחת ב 100 - הגדלת 200X. בצפיפות זה, התאים אמורים להופיע במישור אחד, לא בכבדות על גבי זה בזה ובקרבה. כל תא מורכב מליבה עבה, כדורית עם סיומות דקות, ארוכות, כמו סניף ומתרחבות מזה שמגיע לנקודה (ראה איור 1).
  3. לחלק תאים כאשר הם מגיעים לצפיפות תאים של 7.2 x 10 6 תאים / 2 סנטימטר. תאים להציג שיעור הכפלה של 1.8 x 10 6 תאים / 2 סנטימטר לכל 24 שעות. לייעד X מעבר תאים (פיקסלים) כדי לציין את מספר פעמים שהם כבר נפרדו.
    1. בדור 3 (כלומר, לאחר שלושה קטעים, P3),, קציר לספור, וצלחת התאים על צלחת תרבות 24 רקמות גם בצפיפות של 3.6 x 10 6 2 סנטימטר.
  4. צפה בתאים בכל יום וphotomicrographs הדיגיטלי השיא. שים לב ולתאר מורפולוגיה תא (כלומר, גודל, צורה, מאפיינים רעיוני אור). לקבוע זמן תא הכפלה על ידי ספירת תאים באופן קבוע ונוגע זמן שחלף למספר תא.

2. ספירת תאי MMT

הערה: ספירת תאים כדי לקבוע אם תאים צריכים להיות subcultured, להקים לניסוי או לקבוע כדאיות תא. ישנן שתי שיטות שהוצגו כאן.

  1. שימוש בhemocytometer, טכניקה סטנדרטית לספור תאים.
    1. להשיג hemocytometer בהיר-קו, פתרון 0.2% של צבע הכחול trypan, מיקרוסקופ אור מתחם, מבחנות סטרילית, טפטפות ודלפק תא במדריך.
    2. תחת BSC, להשתמש פיפטה 10 מיליליטר כדי להסיר תאים מצלחת תרבית רקמת 10 סנטימטרים. אם תאים גדלים על צלחת גם 24 להשתמש פיפטה 1 מיליליטר או 1,000 micropipette μl להסיר את המדיה.
    3. מניחים את ההשעיה תא וכתוצאה מכך צינור 15 מיליליטר סטרילי (או 1 מיליליטר צנטריפוגות מיקרו או צינור נפח קטן אחר). אחרת, לעזוב את התאים בצלחת תרבית רקמה המקורית / טוב.
    4. תחת BSC, לשלב 10 μl של ההשעיה התא עם 10 μl של פתרון trypan הכחול (1: 1 יחס) בצנטריפוגה מיקרו אינו סטרילי או צינור נפח קטן אחר.
      הערה: כחול Trypan הוא כתם חיוני שאינו נקלט על ידי תאי קיימא בריאים. כאשר תאים פגומים או כחול מת, trypan יכול להיכנס לתא ומאפשר לתאים מתים ייספרו (aka לצבוע שיטת הדרה). לכן תחת מיקרוסקופ, תאים מתים יופיעו בצבע סגול כהים ואילו תאי קיימא הם בהיר ואור בצבע.
    5. דגירהב RT במשך 5 דקות.
    6. מניחים את תלוש לכסות על hemocytometer. החל 10 μl של תערובת ההשעיה כחול-תא trypan לתוך החריץ. צפה hemocytometer ב 100 - 200X הגדלה. רשת ארבע-פינה היא לכאורה (ראה איור 2).
    7. לספור את מספר תאי קיימא (בלא כתם) לעומת תאים הכולל בכל אזור gridded. ממוצע ארבע הרשתות ולהתרבות על ידי 1 x 10 4 להשיג תאים / מיליליטר.
      1. להסיק את המספר הכולל של תאים לכל צלחת (או תאים / 2 סנטימטר). להשתמש במספר זה או כדי לקבוע את עוצמת הקול הנכונה של ההשעיה התא להשתמש זרע צלחת תרבית רקמה חדשה בצפיפות הרצויה של 3.6 x 10 6 תאים / 2 סנטימטר או לקבוע מספר כולל של תאי קיימא על הצלחת או בבאר.
        הערה: לקבלת הדרכה נוספת על השימוש בhemocytometer, ראה 10.
  2. השתמש בתוכנה ומצלמה דיגיטלית לספור תאי קיימא.
    1. להשיג diהמצלמה gital, תוכנה הנלווית אליו, פתרון 0.4% של צבע הכחול trypan, מיקרוסקופ אור מתחם, מבחנות סטרילית, טפטפות ומחשב.
      הערה: מצלמה דיגיטלית Moticam 2,000 עם נלווה MOTIC תוכנה מועסקת כאן. כל מצלמה ותוכנה דומות צריכה להיות מספיק. ודא שתוכנת המצלמה הדיגיטלית כבר מכוילת מראש (על פי הפרוטוקול של היצרן).
    2. תחת BSC, להשתמש pipet 1 מיליליטר או 1,000 micropipette μl להסיר את המדיה מתאי MMT גדלו בצלחת תרבית רקמת 24 גם. לשטוף את התאים חסיד בעדינות על ידי מריחת כמות קטנה (כ -500 μl) של (כלומר, ללא כל תוספי EMEM) תקשורת טרי-בתוספת של האו"ם לצלחת אז להסיר אותו. החל 10 μl של 0.2% trypan כחולים (שנעשה על ידי דילול 1: 1 עם EMEM-בתוספת של האו"ם) ישירות לטוב.
    3. דגירה את הצלחת על RT במשך 5 דקות.
    4. צפה הצלחת מתחת למיקרוסקופ ב 100 - 200X הגדלה wה- i מצלמה דיגיטלית מצורף. צלחת עשויה לשטוף עם תקשורת unsupplemented אם צביעה עם 2% trypan הכחולים כהה מדי.
    5. פתח את התוכנה על מחשב ND לוודא שהתוכנה מכוילת למטרת שימוש באמצעות כרטיסיית ההגדרות. תמונה של FOV אמורה להופיע.
    6. בחר את הרשת מכרטיסיית מדוד. רשת של ריבועים כ 0.005 ס"מ רוחב יופיעו. בחר רשת מידע כדי לאשר את האזור של כל ריבוע.
    7. בחר אזור ספציפי של הרשת לספור תאים (כלומר, 5 ריבועים x 9 ריבועים). בחר מלבן מכרטיסיית מדוד. לחץ על הפינה של ריבוע ולגרור את הסמן כדי להקיף את הריבועים של בחירה.
      הערה: צל של ירוק יכסה את הריבועים של בחירה וקופסא לבנה תופיע בפינה שמספקת את הרוחב, גובה, האזור, והיקף של הסעיף של הרשת שנבחרה (ראה איור 3).
    8. לספור את מספר viabתאים לה באזור הנחוש. לעשות את אותו הדבר עבור שני מקומות אחרים באותו היטב או צלחת על ידי הזזת הצלחת מתחת למיקרוסקופ.
    9. הקפד שהאזור שנמדד הוא זהה והגדלה לא השתנתה. לחשב את המספר הממוצע של תאי קיימא באזור. שימוש בשטח של הבאר (לצלחת גם 24, יש גם אחד על שטח של 2 סנטימטר 2, ל100 מ"מ צלחת האזור הוא 78.6 סנטימטר 2), להסיק מספר תאי קיימא מהאזור שמסומן ברשת ל המספר הכולל של תאים בתוך הבאר (תאים / 2 סנטימטר).

3. לטפל בתאי MMT עם סוכנים אנטי-שגשוג

  1. הכן את הפתרונות של הסוכנים נבחרו אנטי-השגשוג הטיפוליים (טמוקסיפן, כורכום ומטפורמין) ותרופה אופציונלית, אספירין תחת BSC.
    1. לפזר כורכום וטמוקסיפן באתנול 100% כדי ליצור ריכוז המניה של 27 מ"מ. לפזר מטפורמין ואספירין בunsupplementאד EMEM ליצור ריכוז מניות של 500 מ"מ ו -15 מ"מ, בהתאמה.
  2. להקים תגובת מינון.
    1. פנק את תאי MMT עם שלושה סוכנים אנטי-השגשוג טיפוליים (טמוקסיפן, כורכום ומטפורמין) ותרופה אופציונאלי (אספירין) בריכוזים שונים עבור 96 שעות כדי ליצור עקומת תגובת מינון. בתחילה לנהל את כל התרופות בטווח של ריכוזים המבוססים על דיווחים שפורסמו 1,11-16 ולאחר מכן בריכוזים גדולים יותר או קטנים יותר מאלה שפורסמו.
      הערה: תגובת מינון קובעת את הריכוז המינימאלי של תרופה נחוצה כדי להפיק את התוצאות הרצויות. הנה התוצאה הרצויה היא הפחתה בהתפשטות תאים בהשוואה לשליטה.
      1. לטמוקסיפן וכורכום, להשתמש ריכוזים (וכרכים מקביל) של 0.054 מ"מ (μl 1), .108 מ"מ (2 μl), 0.162 מ"מ (3 μl) ו.216 מ"מ (4 μl).
      2. למטפורמין, להשתמש ריכוזים (וכרכים מקביל) של 2 מ"מ (2 μl), 4 מ"מ (4 μl), 6 מ"מ (6 μl), 8 מ"מ (8 μl) ו -10 מ"מ (10 μl).
      3. לאספירין, להשתמש ריכוזים (וכרכים מקביל) של 0.030 מ"מ (μl 1), 0.060 מ"מ (2 μl), 0.099 מ"מ (3.3 μl), 0.150 מ"מ (5 μl), ו.216 מ"מ (6.7 μl).
    2. פיצול תאי MMT מצלחת 10 סנטימטרים על צלחת גם 24 בריכוז של 3.6 x 10 6 תאים / 2 סנטימטר. לקבוע ריכוז תא ראשוני על ידי שני שיטות התא-הספירה (שלב 2). התקשר צלחת זה חדש 24 גם של תאים "יום פיצול".
    3. 24 שעות לאחר ציפוי תא, טיפול בתאים MMT עם כל אחד מהסוכנים טיפוליים אנטי-שגשוג, טמוקסיפן, הכורכום, מטפורמין והאספירין, בריכוזים שתוארו בשלב 3.2.1. מתייחס לזה כמו "יום 0".
      1. כמו כל גם יכול להחזיק מקסימום של 500 μl של תקשורת, micropipettes שימוש עם טיפים micropipette סטרילי וקצה חדש בכל פעם הוא טיפל גם חדש, כדי למנוע CRזיהום OSS. השתמש בשתי בארות כפקדים: תאים שגודלו בהיעדר טיפול תרופתי (שליטה שלילית) ותאים שגודל באתנול נוכחות 100% (שליטת ממס).
    4. לגדל תאים מחדש לנהל תרופות בריכוזים המתוארים כאשר התאים ניזונים בכל יום אחר (ראה שלב 1.2) עבור 96 שעות (עד ליום 4) בימי 1 -. 4 של טיפול, להתבונן התאים מתחת למיקרוסקופ ולספור באמצעות השיטה בשלב 2.2 (ראה איור 4).
    5. חזור על הניסוי לפחות שלוש פעמים.
    6. לקבוע את הריכוז אופטימלי של כל תרופה על ידי גרפים היחסים בין כדאיות תא ומינון תרופה על פני האורך של הניסוי (ראה איור 5).
  3. להקים כמובן זמן.
    1. פנק את תאי MMT עם שלושה סוכנים אנטי-השגשוג טיפולי (טמוקסיפן, כורכום ומטפורמין) בריכוז קבוע לתקופות שונות בזמן. השתמש בidentif הריכוז האופטימלימטען באמצעות ניסויי תגובת מינון (ראה שלב 3.2).
      1. השתמש בריכוזים הבאים: .216 מ"מ טמוקסיפן, .216 כורכומין מ"מ ו -10 מ"מ מטפורמין.
        הערה: כמובן זמן קובע את משך זמן דרוש לתרופה כדי לייצר התוצאה הרצויה האופטימלית שלה. הנה, את התוצאה הרצויה היא הפחתה בהתפשטות תאים בהשוואה לשליטה.
    2. פיצול תאי MMT מצלחת 10 סנטימטרים על צלחת גם 24 בריכוז של 3.6 x 10 6 תאים / 2 סנטימטר. לקבוע ריכוז תא ראשוני על ידי שני שיטות התא-הספירה (שלב 2). התקשר צלחת זה חדש 24 גם של תאים "יום פיצול".
    3. 24 שעות לאחר ציפוי תא, טיפול בתאים MMT עם כל אחד מהסוכנים טיפוליים אנטי-שגשוג, טמוקסיפן, הכורכום, מטפורמין והאספירין, בריכוזים אופטימליים שזוהו בשלב 3.2. מתייחס לזה כמו "יום 0".
      1. כמו כל גם יכול להחזיק מקסימום של 500 μl של תקשורת,micropipettes דואר עם טיפים micropipette סטרילי וקצה חדש בכל פעם הוא טיפל גם חדש, כדי למנוע זיהום צולב.
      2. השתמש בשתי בארות כפקדים: תאים שגודלו בהיעדר טיפול תרופתי (שליטה שלילית) ותאים שגודל באתנול נוכחות 100% (שליטת ממס).
  4. לגדל תאים מחדש לנהל תרופות בריכוז שנבחר כאשר התאים ניזונים בכל יום אחר (ראה שלב 1.2) עבור 96 שעות (עד ליום 4). בימי 1 - 4 מתוך טיפול, להתבונן התאים מתחת למיקרוסקופ ולספור בשיטה בשלב 2.2 (ראה איור 4).
  5. חזור על הניסוי לפחות שלוש פעמים.
  6. לקבוע זמן חשיפה אופטימלי של תאי MMT לכל תרופה על ידי גרפים היחסים בין כדאיות תא ואורך (זמן) של טיפול תרופתי בריכוז שנבחר (ראה איור 6).

4. המעבדה מודול

הערה: להלן 5 ימיםמעבדה לוח זמנים למעבדה מודול. איור 7 הוא תרשים זרימה של מה לוח הזמנים יהיו כרוכים בתוך 5 הימים. עבור פעילות זו להסתיים בחמישה ימים או כמובן זמן או עקומת תגובת מינון נוצרה. אין מספיק זמן כדי ליצור שני העקומות. ניסוי תגובת מינון מתואר להלן. יכול להיות להחלפה בקלות ניסוי כמובן זמן

  1. לפצל את הכיתה לקבוצות: קבוצה אחת יש להקים תגובת מינון וכמובן זמן האחר בוחרים ריכוז באמצע ריכוזי תגובת מינון המוצע.
    1. לשמור על תרבויות מספיק ומניות תרופות בריכוזים מתאימים. אלא אם צוין אחרת, לבצע את כל העבודה תחת BSC.
  2. יום 1
    1. סטודנטים ישירים לעשות תקשורת ולגדל תאים (כמו בשלב 1).
    2. בשעה שהתלמידים לקבל מניות של תאי MMT על צלחת 10 סנטימטרים, לכוון את התלמידים להכין תרבית תאי תקשורת ולתת הדרכה בשימוש בhemocytometer, מיקרוסקופיה הדיגיטלית ותוכנת מיקרוסקופ המצלמה הדיגיטלית (כמו בשלב 2).
    3. כייל את התוכנה למטרות שימוש במיקרוסקופ (למשל, 4X, 10X, 20X) כיום באמצעות הפרוטוקול של היצרן.
  3. יום 2
    1. תלמידים לאשר את מספר תא כולל וכדאיויות תא (כמו בשלב 2).
    2. תלמידים לספור תאים על צלחת 100 מ"מ בשתי תוכנות מיקרוסקופיה ושיטות hemocytometer, כדי לאשר את תוצאות דומות מתקבלות.
    3. סטודנטים ישירים להשיג 24 תאי צלחת ופיצול גם מצלחת 100 מ"מ ל24 צלחות גם לצפיפות הרצויה ציפוי התא מתחילה (כמו בשלב 1). זה נחשב יום פיצול. מניחים את הצלחת גם 24 בתרבית תאי חממה למשך 24 שעות.
  4. יום 3
    1. לגדל תאי MMT במשך 24 שעות על צלחת גם 24. תלמידים להתבונן תאים תחת מיקרוסקופ ולספור באמצעות תוכנת מיקרוסקופיה (כמו בשלב 2).
    2. תן הסטודנט / teאני דגימות של מניות תרופות לטיפול בסרטן. יש להם להכין ולדלל את פתרון המניות המקורי (כמו בשלב 3). הוסף את הריכוזים השונים של התרופות לתאיהם להקים עקומת תגובת מינון. זה נקרא יום 0.
    3. דגירה תאים (שלב 1.2) עם התרופות למקסימום של 48 שעות.
  5. יום 4
    1. תלמידים להתבונן תאים שטופלו לאחר 24 שעות. זה יום 1.
    2. לספור כל תוכנת מיקרוסקופ באמצעות היטב. שיא תמונות של כל כך טוב בספירה שיכולות להתנהל מחוץ למעבדה (כמו בשלב 2).
    3. דגירה תאים (שלב 1.2) עם התרופות לעוד 24 שעות.
      הערה: מדריך מספק הדרכות וביקורות של ניתוח נתונים והצגה גרפית נוספות. תלמידים לומדים ליצור דמויות, עלילות, וניתוח סטטיסטי ליום של איסוף הנתונים הבא.
  6. יום 5
    1. האם תלמידים שטופלו בתאים לאחר 48 שעות, יום 2.
    2. לספור כלגם שימוש בתוכנת מיקרוסקופ. שיא תמונות של כל כך טוב בספירה שיכולות להתנהל מחוץ למעבדה (כמו בשלב 2).
    3. קציר ולאסוף תאים לספירה על ידי שיטת hemocytometer המסורתית כאמצעי לאימות יכולת תלמיד להשתמש בשיטת תוכנת מיקרוסקופיה ביעילות (כמו בשלב 2).
      הערה: איסוף נתונים ולהסיק מסקנות או לתקן השערות, בהתאם.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

גידול תאי MMT והשוואת שיטות ספירה.

תאי גידול החלב עכבר גדלו בהצלחה ומאופיינת (איור 1) ושיטת ספירת תאים חדשנית שפותחה באמצעות MOTIC תוכנה, הקשורים מצלמה דיגיטלי תוכנה למיקרוסקופ. שיטת ספירת תאים חדשה זו בהשוואה לשיטת ספירה מסורתית העסקת hemocytometer (איור 2) והוצגה להיות מדויק באותה מידה בקביעת מספר תא (טבלת 1). כדי לשלוט על כל השפעות על מספר תא בשל תנאי גידול שונים או סוג תא, ההשוואה בין שתי שיטות ספירת תאים נערכה בנוכחות והיעדרות של סוכנים אנטי-שגשוג ועם שורת תאים שונה, PC12 המודל העצבי 17.

איור 3 מציג את התיחום של האזור לספירת תאים בשיטה זו משתמשת ברשת על גבי של definממדי ed. הרשת הוא הניח על שדה הראייה (FOV) ומסגרת ירוקה לאחר מכן להחיל את אורך ורוחב מיועדים של הרשת (כלומר, ריבועי 9x5). התאים נספרים במסגרת הירוקה ואת מספר תאי מסביר, כפי שפורט בפרוטוקול.

טיפול בתאי MMT: קביעת מינון התגובה של תאי MMT לסוכנים אנטי-שגשוג.

מחקרי תגובת מינון (איור 4) נערכו עבור כל סוכן אנטי-שגשוג. לאורך נתונים ניסויים אלה נאספו הרף, ביקורת וניתח כדי לראות אם שינויים אפשריים בפרוטוקול היו מוצדקים. הניסוי נערך שלוש פעמים, עם כל מחקר הפקת תוצאות דומות. ניסויים המשיכו עד שכל התאים מתים או את ההשפעות של התרופות שהתייצבו. photomicrographs הדיגיטלי של התוצאות מוצגים באיור 4, וניתוח גרפי של ממצאים אלה מוצגבאיור 5. טווחי ריכוז אפקטיביים מדווחים באגדה של איור 4, על ציר ה- X של איור 5 ובסעיף הפרוטוקול.

בריכוז הנמוך ביותר של טמוקסיפן, 0.054 מ"מ, היו עיכוב חזק של צמיחת תאים, כ 83% בהשוואה לתאים שלא טופלו (איור 4 א). כדאיות תא נמשכו ירידה בריכוזים הולכים וגדל של טמוקסיפן (איור 5 א). המינון האופטימלי של טיפול בטמוקסיפן היה נחוש להיות .216 מ"מ כי אחרי המוות של תאים מלאים 48 שעות התרחש באותו הריכוז (איור 4 א). מעניין לציין, הפחתות אלה בהתפשטות תאים לחשוף שום אינדיקציה של התנגדות סלולרית לטמוקסיפן, כפי שניתן היה לצפות על סמך הספרות 18,19 מדגישה במבחנה מודל מערכות ש, אבל לא תמיד מייצגות באופן מלא באירועי vivo. יתר על כן, כאשר בניגוד Tre הנמוך ביותרריכוזי atment של כורכומין (איור 4 ו5A) ומטפורמין (איור 4C ו5B), הריכוז הנמוך ביותר של טמוקסיפן היה 9% ו -50% יותר יעילים בעצירת חלוקת תאים, בהתאמה.

כורכומין הציג השפעה תלויה ריכוז בעיכוב של חלוקת תא, כמו גם. עם ריכוזים גוברים, חלה ירידה משמעותית בתא כדאיות (איור 4D ו5A). המינון האופטימלי של כורכומין היה נחוש להיות .216 מ"מ כי אחרי 48 שעות, כמו טמוקסיפן, היה מוות של תאים מלאים בריכוז ש.

טיפול מטפורמין הניב הירידה הדרמטית לפחות בכדאיויות תא MMT, שהוביל לירידה של 33% בריכוז הנמוך ביותר. ירידה במקביל בכדאיויות תא עם ריכוז מטפורמין הגדלת נצפתה (איור 4C ו5B). המינון האופטימלי של מטפורמין היה נחוש להיות הריכוז הגבוה ביותר שנבדק (10 מ"מ). בהשוואה לטמוקסיפן וכורכום, שניהם משמש באופן שגרתי כסוכני כימותרפיה, מטפורמין היה 30-40% פחות יעיל בעיכוב מחזור התא. מעניין, את ההשפעות של מטפורמין על חלוקת תאים בקנה אחד עם אלה שהושגו על ידי ממשל של אספירין (איור 4D ו5A), תרופה סליצילית ללא מנגנון מזוהה בבירור של עיכוב צמיחת תאים.

טיפול בתאי MMT: קביעה כמובן של התגובה התאית MMT לסוכנים אנטי-שגשוג הזמן.

מחקר כמובן זמן נערך גם עבור כל סוכן אנטי-שגשוג כי המינון האפקטיבי של תרופה מנוהלת עשוי להיות מושפע מזמן של חשיפה. כמבחני מודול זה לכדאיויות תא, חשוב לזהות ראשון כמה מהר התאים מתחלקים (זמן הכפלה) כך חלון הגיוני לאורכו של זמן התאים נחשפים לסמים יכול להיבחר. זה חיוני, אפוא, כי זמן הכפלת תא MMT להיותהוברר כאשר תחילה מאפיין את התאים. לאורך ניסויים אלה, הנתונים נאספו הרף, ביקורת וניתחו כדי לראות אם שינויים אפשריים בפרוטוקול היו מוצדקים. הניסוי נערך שלוש פעמים, עם כל מחקר הפקת תוצאות דומות. ניסויים המשיכו עד שכל התאים מתים או ההשפעות שהתייצבו.

מחקרים כמובן זמן גילו כי טיפול בתאי MMT עם ריכוזים מותאמים של כל תרופה אנטי-שגשוג (טמוקסיפן .216 מ"מ, כורכומין .216 מ"מ, מטפורמין 10 מ"מ) למשך 96 שעות, הסתיימו במותם של תאים שלמים או פילוס את ההשפעות של התרופה ( איור 6). למרות שהאספירין, התרופה "האופציונלית", עשה להשפיע על כדאיויות תא במחקרי תגובת מינון שלנו, ההשפעה הייתה קטנה ולכן לא נכללה במחקרים כמובן זמן.

איור 1
תאי MMT איור 1.. photomicrograph הדיגיטלי של תאים, גידול החלב "בריא" עכבר שלא טופל (MMT) גדלו ב -3.6 x 10 6 תאים / 2 סנטימטר בבינוני (EMEM) .100X, בקנה מידה = 0.2 מ"מ חיוני נשרים המזערי שונה, שצוינו על ידי בר לבן. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 2

איור 2. רשת hemocytometer. Photomicrograph של רשת hemocytometer, 100x. סעיף רשת כולה מוצג במעגל (FOV). אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

Iles / ftp_upload / 52,528 / 52528fig3.jpg "/>

איור 3. ייעוד שטח הספירה עם תוכנת MOTIC.   תמונה של כיסוי רשת על FOV ואזור מוגדר לספירת תאי MMT הוקמו עם תוכנת MOTIC כפי שניתן לראות דרך מיקרוסקופ. 100X, בקנה מידה = 0.2 מ"מ, שצוין על ידי בר לבן. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 4
איור 4. תגובת מינון של תאי MMT לסוכנים אנטי-שגשוג. Photomicrographs הדיגיטלי של תאי MMT גדלו בנוכחות חומרים אנטי-שגשוג בריכוזים שונים עבור 96 שעות. טמוקסיפן: (A1) 0.054 מ"מ (A2) 108 מ"מ (A3) 0.162 מ"מ (A4) 0.216 מ"מ; כורכומין: (B1) 0.054 מ"מ (B2) 108 מ"מ 0.162 מ"מ (B4) (B3) .216 מ"מ; מטפורמין: (C1) 2 מ"מ (C2) 4 מ"מ (C3) 6 מ"מ (C4) 8 מ"מ (C5) 10 מ"מ; אספירין: (D1) .030 מ"מ (D2) 0.060 מ"מ (D3) 0.099 מ"מ (D4) 0.150 מ"מ (D5) 0.216 מ"מ; אתנול (100%) ושאינה מטופלת הם גם שולט. 100X, בקנה מידה = 0.1 מ"מ, שצוין על ידי קווים כחולים שהופכים את כל ריבוע בתוך הרשת. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 5

איור 5 ב '

איור 5. ייצוג גרפי של ניסויי תגובת מינון של תאי MMT לסוכנים אנטי-שגשוג. אפקטים של הגדלת ריכוזים של חומרים אנטי-שגשוג () טמוקסיפן, כורכום, אספירין, מטפורמין ו- (ב) על כדאיות תא MMT. תוצאותמחדש מבוטא באחוזים מכלל שליטה לאחר 48 שעות של טיפול, למרות שטיפול בתאים נמשכו 96 שעות. n = 3, STD מצויינים.

איור 6
איור 6. ייצוג גרפי של ניתוח כמובן זמן של תגובה התאית MMT לסוכנים אנטי-שגשוג. מחקר כמובן זמן של ההשפעות של טמוקסיפן (0.216mM), כורכום (0.216mM), ומטפורמין (10 מ"מ) בכדאיויות תא MMT מעל 96 שעות. תוצאות באות לידי ביטוי כאחוז משליטה לאחר 48 שעות של טיפול. המוצגים כאן הם תוצאותיו של ניסוי נציג, n = 1.

איור 7
איור 7. תרשים זרימה של המעבדה מודול 5 ימים.

סוג התא תרופת Administereד יום של ניסוי ריכוז של תרופות תא רוזן עם MOTIC תא רוזן עם hemocytometer
MMT שלא טופל יום 2 - 4 תאי 7.8x10 / 2 סנטימטר 4 תאי 8.0x10 / 2 סנטימטר
MMT אתנול יום 2 10 מ"מ 4 תאי 7.1x10 / 2 סנטימטר 4 תאי 7.2x10 / 2 סנטימטר
MMT טמוקסיפן יום 2 0.216 MM 0 תאים / 2 סנטימטר 0 תאים / 2 סנטימטר
MMT טמוקסיפן יום 2 0.054 מ"מ 4 תאי 1.3x10 / 2 סנטימטר 4 תאי 1.5x10 / 2 סנטימטר
MMT כורכום יום 2 0.054 מ"מ 1.9x10 ג 4אמות / 2 סנטימטר 4 תאי 2.0x10 / 2 סנטימטר
MMT כורכום יום 2 0.216 מ"מ 0 תאים / 2 סנטימטר 0 תאים / 2 סנטימטר
MMT מטפורמין יום 2 2 מ"מ 4 תאי 5.1x10 / 2 סנטימטר 4 תאי 5.2x10 / 2 סנטימטר
MMT מטפורמין יום 2 6 מ"מ 4 תאי 3.4x10 / 2 סנטימטר 4 תאי 3.5x10 / 2 סנטימטר
MMT אספירין יום 2 0.099 מ"מ 4 תאי 2.8x10 / 2 סנטימטר 4 תאי 3.0x10 / 2 סנטימטר
PC12 שלא טופל פיצול - 4 תאי 2.5x10 / 2 סנטימטר 4 תאי 2.1x10 / 2 סנטימטר

טבלת 1. השוואה של hemocytometer ותוכנת MOTIC לספור שיטות. תוצאות של ספירת תאים של תאי MMT, או באמצעות תוכנת MOTIC או שיטות hemocytometer. שני תאים שלא טופלו ומטופלים נספרו, כמו גם שורת תאים שונה, PC12, כביקורת.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

מודול מעבדה מוצג שמטרתו ללמד מגוון של נושאים בביולוגיה של תא בטכניקות המתקדמות של תרבית תאים של בעלי החיים. מודול משיג זאת על ידי ניתוח ההשפעות של מספר הכימיקלים אנטי-שגשוג על השכפול של תאים שמודל סרטן השד אנושי. Assay העיקרי מסתמך על הטכניקה הבסיסית של ספירת תאים ומציג דרך חדשנית לספור תאים באמצעות תוכנת מיקרוסקופ. הפעילויות הכוללות את המודול ניתן לבצע במכשירים וציוד זמין ברוב תוכניות ביולוגיה. מודול יכול להיות מיושם בלוח זמנים של 5 ימים עם ציוד שהם לא יקרים ומתקבלים בקלות. למרות שמותג מסוים של תוכנת מצלמה מיקרוסקופ ומיקרוסקופ דיגיטלית משמש כאן (MOTIC תוכנה), כל מצלמה ותוכנה דומות צריכה להספיק.

מודול מעבדה זו מנצל תאי MMT כמודל לסרטן השד אנושי. תלמידים לומדים ראשון לגדול ולאפיין אלהתאים בתרבית. חשוב להדגיש כי השלמה מוצלחת של מודול מעבדה זו דורש חוקרים (aka תלמידים) להיות מכיר היטב את המראה והתנהגותם של תאים בריאים MMT, במיוחד מאז תאים שלא טופלו MMT לשמש כקבוצת ביקורת. אפיון לכן יסודי של דפוסי צמיחת תאים, זמן הכפלה ומורפולוגיה כללית של תאי MMT הוא חיוני אם הנתונים כמובן תגובת מינון נכונה ובזמן הם להיות שנוצרו.

ברגע שאפיינו, תאי MMT היו אז נבדקו על תגובתם לסוכנים אנטי-שגשוג שונים כאמצעי להוראת הנושאים של חלוקת תא, ויסות מחזור התא, תא איתות וסרטן. כדאיות תא משמשת כדי להבין את ההשפעה של תרופות אלה על התאים. שיטה חדשה של ספירת תאים, באמצעות תוכנה הקשורים למצלמה דיגיטלית רכוב מיקרוסקופ, מתנהלת ובהשוואה להליך המבוסס על hemocytometer ספירה מסורתי כדי לוודא הדיוק שלה. תישיטה החדשה של מספקת שני יתרונות, שהם ראויים לציון מיוחד משום שהוא משמש במעבדות הוראה לתואר ראשון. ראשית, מאז התאים לא צריכים להסיר מצלחת תרבית הרקמה לספירה, יש צורך בפחות זמן כדי לבצע את assay הניסיוני העיקרי. זה מאפשר למספר רב של משתנים ניסיוניים להיבדק מייד ובתקופת זמן מוגבלת. שנית, השיטה מספקת תיעוד דיגיטלי של התגובה התאית לטיפול הניסיוני המאפשר לתלמידים להעריך את התוצאות ולחדד את האסטרטגיה הניסיונית שלהם מחוץ למעבדה.

יש כמה בעיות לציין בעת ​​יישום שתי שיטות ספירה אלה. ראשית, לפני ספירת התאים עם או שיטה, התאים הודגרו עם trypan הכחול כדי להבדיל בין תאי קיימא ותאים מתים. תאים מתים חדרו על ידי הצבע ומופיעים בצבע כחול כהה, ואילו תאי קיימא הם לבנים בוהקים. עם זאת, אם התאים הודגרו עם dyדואר מעבר לתקופת הדגירה המומלצת, הם יהיו יותר מוכתמים וקשים להבחין. שנית, תאי MMT עשויים גוש על hemocytometer או צלחת תרבית הרקמה ויהיה קשה לספור בנפרד. לכן, "גוש" מיועד להכיל מספר מסוים של תאים (לדוגמא, 10 תאים / גוש) וכל גוש נוכחי ברשת מוכפלים במספר שבמהלך הספירה. לבסוף, תאי MMT לדבוק פני השטח של מנות שבו הם גדלו. לכן, יש לגעת בקצה pipet ישירות לצלחת בעת הסרת התאים ולהפעיל כוח כדי לשבור את גושי תאים ולהסיר תאים רבים מהצלחת ככל האפשר. כתוצאה מכך לקחת כמה ניסיונות להשיג ספירה מדויקת בעת השימוש בשיטת hemocytometer המסורתית.

עם התאים מאופיינים היטב ושיטות ספירה מאומתות, שני ניסויים שונים שנערכו; מחקר תגובת מינון של ההשפעות של ריכוזים שוניםשל תרופות אנטי-שגשוג על חלוקת תא MMT וניסוי כמובן זמן על מנת להבהיר את הזמן האופטימלי של חשיפה לתרופות אלה. אלה הם ניסויים מאלף ביותר כניסוי וטעייה הוא הכרחי ויישום של הספרות הראשונית נדרש לניסוי מוצלח. לדוגמא, ניסיונות ראשוניים בהבהרת תגובת מינון של תאי MMT לסוכנים אנטי-שגשוג אלה עולים כי הריכוזים שנבדקו היו גבוהים מדי, כפי שהיה 100% מוות של תאים בתוך 24 שעות של מתן תרופה. סקירה מורחבת של הספרות הובילה למגוון מתוקן של ריכוזי טיפול. זה למעשה מלמד את התלמידים כיצד להשתמש במאגרי מידע ספרות, לקרוא, לנתח ולבקר מאמרי ספרות ראשוניים ומדגיש עד כמה מיומנויות אלה הן חיוניות לתהליך המדעי.

תוצאות של המחקרים הראו כי מינון תגובת טמוקסיפן מציג השפעה אנטי-השגשוג החזקה בכל הריכוזים שנבדקו. טמוקסיפן, אנטי-mitotiתרופת ג, משמשת במיוחד כטיפול אנטי-אסטרוגן לסרטן רגיש לאסטרוגן, בדרך כלל בגיל מעבר, חולי הורמון רגיש 18-20. התרופה משמשת כיום כטיפול בסרטן השד. טמוקסיפן מתחרה עם אסטרוגן לרצפטור אסטרוגן תאיים וכאשר חייב, מטה מווסת את הביטוי של cyclins D ו- B, שני רגולטורים חשובים של מחזור התא. תוצאות שהתקבלו בפעילות מצביעות על כך שטמוקסיפן ערובה בהצלחה לקולטן אסטרוגן ועכב את ההתקדמות של התא דרך מחזור התא, וכתוצאה מכך התפשטות תאי ירידה שנצפתה. מעניין לציין, כי הירידה בשיעורי התפשטות תאי MMT בכל הריכוזים של טמוקסיפן מנוהל לחשוף שום אינדיקציה של התנגדות סלולרית לטמוקסיפן, כפי שניתן היה לצפות על סמך הספרות (ראה לדוגמא 19). זה משמש תזכורת טובה שבמבחנת התנאים שבהם הניסוי נערך לעשות אני לא מודל באופן מלאn vivo נסיבות.

טיפול כורכומין של תאי MMT גם הביא לירידה של כדאיות תא. כורכום הוא תרכובת הנגזרת משורש הכורכום ופועל כמעכב צמיחת תאים 12,16. זה עובד על ידי מסלול ה- NF-kappa B ופעילות decarboxylase ornithine (ODC) ויסות כלפי מטה. NF-kappa B הוא מורכב חלבון השולט שעתוק של גנים אנטי-אפופטוטיים TRAF1 וTRAF2 כזה, ששם קוד לחלבונים המעכבים אפופטוזיס. ODC הוא אנזים שמזרז את הייצור של פוליאמינים, חלבונים המספקים תאי סרטן עם מקורות מוגברים של תזונה המובילה לצמיחת תאים משופרות. התרופה נמצאת בשימוש שוטף לטיפול בסרטן השד. ההשפעות אנטי-השגשוג של כורכומין מראה בבירור את ההשפעה שלמטה רגולציה של מסלול איתות תא מעורב NF-kappa B וdecarboxylase ornithine יש על חלוקת תא.

כדאיות תא מופחתות נצפו באופן דומה עם treatme מטפורמיןNT. מטפורמין, תרופה בדרך כלל מנוהלת על חולי סוכרת מסוג II, נבחר בגלל דיווחים שפורסמו מצביעים על מתאם בין חולים שלוקחים מטפורמין ושכיחות נמוכה יותר של סרטן השד 15. הוא האמין כי הסוכן מודולציה הגן-MYC ג ובכך מווסת את-הפעילות של cyclin ד עד-רגולציה של cyclins, מולקולות המשמשות כמחסום בתוך מחזור התא, מאפשר לתאים להתקדם דרך המחזור בקצב מהיר יותר וכתוצאה מכך חלוקת תא מוגברת וצמיחה. ההשפעות של טיפול במטפורמין על תאי MMT מראה כיצד אפנון של גן c-myc מוביל גם את תקנה של cyclin D וירידה בחלוקת תא. נתונים נוספים מטפורמין מדגימים כיצד תרופה מיועדת לcondition- אחד במקרה זה ייתכן שיש לי Diabetes- מנגנון פעולה מתאימה לאירועים פיסיולוגיים חריגים אחרים. בנוסף, חשוב להדגיש כי למרות שטמוקסיפן, כורכום, ומטפורמין כל לעכב prolif הסלולרי לא תקיןeration באמצעות מנגנונים שונים, כל ירידה בהצלחה אוכלוסיות תאים והפריע לחלוקת תאים במבחנה.

מודול זה מאפשר גם לחקירה פתוחה שבתרופות אחרת, תרופה צמחית, או סוכן יכול להיבדק. אספירין, משכך כאבים מעל לדלפק, מוריד חום, ותרופות אנטי-דלקתיות המשמשות כדי להקל על כאב מתון והורדת חום נבחר במודול זה. היכולת של האספירין כדי להפחית את הדלקת עלולה לעכב את צמיחת גידול על ידי האטת קצב התפתחות של כלי דם חדשים המזינים אותם ומפריעים לתאי גזע שדלק 11,13,14 הצמיחה שלהם. מעניין לציין, ממשל של אספירין לMMT תאים לא לגרום לירידה מסוימת בכדאיויות תא. מעט מאוד ידוע על תפקידו של אספירין במניעת הסרטן וטיפול למרות שמחקרים רבים גומלים מדווחים 13,14, מתן דוגמא מצוינת למתאם לעומת יחסים סיבתי.

הזמןמחקרים גילו כי כמובן, ניתן במינונים אופטימליים, התרופות אנטי-השגשוג הן יעילות מאוד במפריע חלוקת תאים בתוך 4 ימים של חשיפה ראשונית. מחקרים אלה גם מספקים הזדמנות לתלמידים להשתמש במה שלמדו על מאפייני צמיחת תאי MMT, כאשר בתכנון אסטרטגיה ניסיונית לביצוע ניסויים אלה. למעשה, אפיון יסודיות את דפוסי צמיחת תאים, זמן הכפלה ומורפולוגיה תא כללית של תאי MMT חיוני לשני נתונים תגובת מינון וכמובן זמן מדויקים.

שני מחקרים כמובן תגובת מינון והזמן לקבוע את הקשר בין ריכוז תרופה וזמן חשיפה, בהתאמה, וההשפעה שיש סמים במערכת ביולוגית. זוהי דרך מצוינת לקבל תלמידים לחשוב על אינטראקציות מולקולאריים ומושגי יסוד אחרים בביוכימיה בעת ביצוע החקירה מונעת, פעילויות מחקר. ראוי לציין כי מאז רב דומגמות ology מתכננות ללמוד בבית ספר לרפואה, מעבדה מודול זה מיישר גם עם השינויים שהונהגו לאחרונה בדרישות בית הספר לרפואה 21.

מודול מעבדה זו יכול להיות מיושם בדיוק כפי שתואר או בקלות יכול לשמש כתבנית. מארח של וריאציות יכול להיות משולב בפעילות זו, כגון בחירת סוכן אנטי-שגשוג של, סוג תא או שינוי תזונתי בתקשורת הצמיחה. כל עוד השערה מפותחת כי בדיקות מושגי יסוד ומתקדמים בתא או ביולוגיה כללית, התמורות של מודול זה הן רבות. ללא קשר לתמורה, לביצוע פעילות זו באופן טבעי מפנה את התלמיד ללמוד מגוון רחב של טכניקות מעבדה ולהכיר מגוון רחב של ציוד ומכשור.

לסיכום, מודול המעבדה המתואר כאן מאפשר לתלמידים להשתתף באופן מלא בתהליך של מדע, לפתח את היכולות שלהם לרכישה, לנתח וגרפי represent נתונים, ולחדד את ניהול הזמן שלהם וכישורי שיתוף פעולה. מודול נועד להקל הודעה פתוחה והוא להתאמה בקלות ללוחות זמנים שונים וכמובן רמות מיומנות. יש לציין כי שני המחברים הראשונים של מאמר זה הם מגמות ביולוגיה לתואר ראשון, באופן ברור הוכחה כי המעבדה מודול זה מתאים לאוכלוסייה זו.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים לא קיבלו תמיכה כספית או דומה מMOTIC.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Tissue Culture Hood ESCO Labculture Reliant Class II Type A2 Biological Safety Cabinet
Waterjactor CO2 Incubator CEDCO Model 1510
Bright-line Hemocytometer American Optical with two separate grids
Motic Images Plus Mac OSX Verison 2.0 or higher
Gilson Pipetman Rainin instrument co. inc P-20D, P-200D, P-1000D
CK30/CK40 Culture Microscope Olympus 4 objective inverted light microscope with camera
200 μl Pipet tips MidSci 40200C
1,000 μl Pipet tips MidSci AVR4
10 ml Seriological Pipets TPP TP94010
24 well plates CoStar- Tissue Culture Cluster 3524 24 wells, 16 mm well diameter, radiation sterilized
Trypan Blue Solution 0.4% Sigma T8154 100 ml, cell culture tested non-haz
Bright-line Hemacytometer replacement coverslip, non-haz Sigma Z375357
Mouse Mammary Tumor(MMT) cells ATCC CCL-51
Eagle Minimum Essentail Medium (EMEM) ATCC 30-2003 500 ml
Fetal Bovine Serum Sigma F0926 500 ml
Metformin Hydrochloride Sigma PHR1084 500 mg
Tamoxifen Sigma T5648 white or white-yellow powder
Curmumin Sigma C1386 yellow-orange powder
Aspirin Sigma A2093 meets USP testing specifications

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hammamieh, R., et al. Students investigating the antiproliferative effects of synthesized drugs on mouse mammary tumor cells. Cell Biol Educ. 4 (3), 221-234 (2005).
  2. Sykes, J. A., Whitescarver, J., Briggs, L. Observations on a cell line producing mammary tumor virus. J Natl Cancer Inst. 41 (6), 1315-1327 (1968).
  3. Palombi, P. S. J., Snell, K. Learning about Cells as Dynamic Entities: An Inquiry-Driven Cell Culture Project. Bioscene: Journal of College Biology Teaching. 33, 27-33 (2008).
  4. Ledbetter, M. L. S., Lippert, M. J. Glucose Transport in Cultured Animal Cells: An Exercise for the Undergraduate Cell Biology Laboratory. Cell Biology Education. 1 (3), 76-86 (2002).
  5. Weaver, D. Cardiac Cells Beating in Culture: A Laboratory Exercise. American Biology Teacher. 69, 407-410 (2007).
  6. Marion, R. E., Gardner, G. E., Parks, L. D. Multiweek cell culture project for use in upper-level biology laboratories. Advances in Physiology Education. 36, 154-157 (2012).
  7. Mozdziak, P. E. P., James, N., Carson, S. usanD. An Introductory Undergraduate Course Covering Animal Cell Culture Techniques. Biochemistry and Molecular Biology Education. 32 (5), 319-322 (2004).
  8. Anderson, L. W., et al. A taxonomy for learning, teaching and assessing: A revision of Bloom's Taxonomy of educational objectives (Complete Edition). , Longman, London, England. (2001).
  9. Centers for Disease Contol and Prevention. Appendix A - Primary Containment for Biohazards: Selection, Installation and Use of Biological Safety Cabinets. , (2014).
  10. Davis, J. M. Basic Cell Culture: A Practical Approach. , 2nd edn, Oxford University Press. Oxford, UK. (2002).
  11. Algra, A. M., Rothwell, P. M. Effects of regular aspirin on long-term cancer incidence and metastasis: a systematic comparison of evidence from observational studies versus randomised trials. Lancet Oncol. 13 (5), 518-527 (2012).
  12. Anand, P., Sundaram, C., Jhurani, S., Kunnumakkara, A. B., Aggarwal, B. B. Curcumin and cancer: an 'old-age' disease with an 'age-old' solution. Cancer Lett. 267 (1), 133-164 (2008).
  13. Ararat, E., Sahin, I., Altundag, K. Mechanisms behind the aspirin use and decreased breast cancer incidence. J BUON. 16 (1), 180 (2011).
  14. Ararat, E., Sahin, I., Altundag, K. Aspirin intake may prevent metastasis in patients with triple-negative breast cancer. Med Oncol. 28 (4), 1308-1310 (2011).
  15. Blandino, G., et al. Metformin elicits anticancer effects through the sequential modulation of DICER and c-MYC. Nat Commun. 3, 865 (2012).
  16. Kunnumakkara, A. B., Anand, P., Aggarwal, B. B. Curcumin inhibits proliferation, invasion, angiogenesis and metastasis of different cancers through interaction with multiple cell signaling proteins. Cancer Lett. 269 (2), 199-225 (2008).
  17. Burstein, D. E., Blumberg, P. M., Greene, L. A. Nerve growth factor-induced neuronal differentiation of PC12 pheochromocytoma cells: lack of inhibition by a tumor promoter. Brain Res. 247 (1), 115-119 (1982).
  18. Nazarali, S. A., Narod, S. A. Tamoxifen for women at high risk of breast cancer. Breast Cancer (Dove Med Press). 6, 29-36 (2014).
  19. Cui, J., et al. Cross-talk between HER2 and MED1 regulates tamoxifen resistance of human breast cancer cells). Cancer Res. 72 (21), 5625-5634 (2012).
  20. Komm, B. S., Mirkin, S. An overview of current and emerging SERMs. J Steroid Biochem Mol Biol. 143C, 207-222 (2014).
  21. Kaplan, R. M., Satterfield, J. M., Kington, R. S. Building a better physician--the case for the new MCAT. N Engl J Med. 366 (14), 1265-1268 (2012).

Tags

ביולוגיה הסרטן גיליון 100 מחזור תא איתות תא סרטן מודול מעבדה תאים סרטניים בעכבר החלב תאי MMT סטודנט לתואר ראשון חקירה פתוחה סרטן שד תא-ספירה כדאיות תא מיקרוסקופיה חינוך מדעי תרבית תאים מעבדה הוראה
שימוש בתאים סרטניים עכבר החלב ללמד מושגי ביולוגיה Core: מודול מעבדה פשוט
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

McIlrath, V., Trye, A., Aguanno, A.… More

McIlrath, V., Trye, A., Aguanno, A. Using Mouse Mammary Tumor Cells to Teach Core Biology Concepts: A Simple Lab Module. J. Vis. Exp. (100), e52528, doi:10.3791/52528 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter