Introduction
多くの場合、学部一般生物学コースでは、細胞周期調節および癌のトピックは触れているが、これらのコースの内容の幅は深さのために少し時間を残しているため、詳細に調査していません。また、学部生物学の学生は、通常、動物細胞培養に関連した高度な技術にさらされていません。適用すると、彼らが学んだことを分析しながら学生は、これらの概念のより深い理解の開発を支援するために、実験室での活動は、研究室の活動1を拡張研究のウォルターリード陸軍研究所 (WRAIR)の変形例として開発されました。ラボモジュールは、成長および癌細胞モデルを特徴付ける、細胞計数法を開発し、実行する、抗増殖剤で細胞を処置するための最適な時間経過および用量を確立し、そして異常な細胞シグナル伝達経路を識別することを含む段階的、実験的な戦略を使用して。実験はまた、オープンを可能にします-ended問い合わせ。
この活性のために必要な技術のほとんどは、一般的な生物学教授の研究室で行うことができます。活動は、学生が、ヒト乳癌2のモデルをマウス乳癌(MMT)細胞株の形態と成長速度を特徴づけることから始まります。乳癌は、その集団における有病率、大学中年学生にその親しみやすさ、および利用可能な広範囲のデータのモデルガンとして選択しました。それは十分に特徴づけられ、容易に得られるので、MMT細胞株を特異的に選択された、短い倍加時間を有しており、成長するのは簡単です。また、MMT細胞は、エストロゲン依存性、最も女性の乳癌と一致するあります。学生はその後、その作用機序だけでなく、学生を可能に変えている薬や治療の長さのestablished.The濃度である化学療法剤で細胞を処理することにより、MMT細胞における異常な細胞シグナル伝達経路を特定します細胞分裂の速度に対するこれらの変数の影響を評価しました。このアクティビティのキーアッセイは単に2つの方法のいずれかを使用して、細胞計数を必要とする細胞生存率の決意です。それぞれの方法は、強力な顕微鏡のスキルに依存します。学生は、標準的な、血球計法および新規顕微鏡撮影法を用いて細胞生存率を決定し、提案します。それらの知見に基づいて、彼らは活動への変更を提案し、テストすることができます。生徒はその後、自分のデータを表し、それらの仮説を洗練して、新しい実験的な戦略を考案する結果を解釈します。
この研究室での活動は、生物科学専攻新入生や年生レベルの生徒に適しています。これは、最初の年に、一般的な生物学または二年、分子/細胞生物学のコースを完了することができる1週間のラボ·モジュールに凝縮されています。活動の適切完了するために必要なスキルは、基本的な算術と代数、Cの配列に精通を含みます鉱石ラボのスキル( 例えば 、ピペッティング、解決策作り、滅菌技術)細胞培養や表計算ソフトのインストラクターの知識を持つに沿って、データ分析、基本的な光顕微鏡と時間管理、。必要な試薬( 例えば 、マウス乳腺腫瘍細胞、MMT 2)、化学療法剤は癌の動物細胞株モデルを含む( 例えば 、タモキシフェン、クルクミン、メトホルミン、アスピリン)、トリパンブルーおよび細胞培養培地( 例えば 、 イーグルの最小必須培地 ;適切なサプリメント( 例えば 、ドナー馬とウシ胎児血清)とEMEM)。 、血球計数器、およびデジタル顕微鏡ソフトウェア、必要な楽器は、デジタルカメラの取り付け、コンピュータ、100ミリメートル、24ウェル組織培養プレート、CO 2インキュベーター(または同等)、安全キャビネット(クラスII BSC)と倒立光学顕微鏡を含みます。
TEACする動物細胞培養に依存して、特定のラボ活動の良い例があります。細胞生物学3における概念に関する時間学部学生。しかし、多くは、( 例えば、放射性同位体、生きている動物の組織、高度な画像処理装置1,4,5)は 、(400レベルのコース6に適した、 例えば )はかなり高度なプロトコルを記述し、容易にアクセスできない物資や技術を必要としますか、マルチ週間の学期長いプロジェクト6,7を必要とします。ここで説明する実験室の活動は簡単であり、一般的な実験室機器と1週間で実施することができます。
要約すると、このラボモジュールを効果的に導入したり、基本的で高度な研究室のスキル、実験データ解析、動物細胞培養の方法と科学的なプロセスを教えている間、細胞周期、細胞シグナル伝達経路および癌の概念を強化します。実験用モジュールは、シンプルかつ経済的にアクセス可能で、オープンエンドの問い合わせに対応する柔軟性と機会の両方を提供します。活動は、学生の創造性を奨励しますレシピガイドとしてではなく、機能するテンプレート実験戦略を提供することによって。それは覚え、理解、適用、分析、評価し、教科書のうち、科学研究の世界にそれらを引っ張る過程で学生を係合することによって作成を必要とする最も重要なことは、活動を満たすには、すべての咲く分類8のドメインを学びます。
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Protocol
注:行動クラスII安全キャビネット(BSC)9における細胞および細胞培養試薬を持つすべての作業。彼らは生物学的リスクを低〜中程度のポーズとしてMMT細胞は、バイオセーフティレベルIに分類されます。 (拭う例えば 、紫外線、70%エタノール)使用の間BSCに適切な洗浄と除染の手順を適用します。
1. MMT細胞を成長させます
- 10%ウシ胎児血清(FBS)、2mMグルタミン、および1%抗生物質/抗真菌剤(10単位のペニシリンを補充したイーグル最小必須培地 (EMEM)で構成され、栄養豊富な培地10 mlを入れた10cmの組織培養皿で細胞を増殖させます、100μgのストレプトマイシン、0.25μgのアンホテリシンB)。 37℃で、加湿5%CO 2チャンバー内で細胞を培養。 3.6×10 6細胞/ cm 2の密度でプレート細胞(ステップ2において細胞を計数する参照します)。
- UNL 48時間ごとに新鮮な培地で細胞培養培地の半分を交換してくださいESS他に指示。倒立位相差光学顕微鏡で検査することによって、細胞の生存率及び形態を確認してください。
- (注)と100で下のサイズ、構造、形状、組織と推定数の細胞を特徴付ける - 200X倍率。この密度では、細胞は互いに上にし、接近して凝集していない、一つの面に表示されます。各セルは、ポイントに来て、そこから拡大し、薄くて長い、枝状の拡張子を持つ厚い、球状のコアで構成されています( 図1参照)。
- 彼らは7.2×10 6細胞/ cm 2の細胞密度に達したとき、細胞を分割。細胞は、24時間あたり1.8×10 6細胞/ cm 2の倍加速度を示します。彼らは分割された回数を示すために、細胞の継代X(Pxを)を指定します。
- 3世代での( すなわち 、3継代後、P3)、収穫、カウント、および3.6×10 6の密度で24ウェル組織培養プレート上に細胞をプレー2。
- 表示セル毎日、レコードのデジタル顕微鏡写真。 (注)と細胞の形態( すなわち 、大きさ、形状、光反射特性)を説明します。定期的に細胞を計数し、細胞数に経過時間を関連付けることによって、細胞の倍加時間を決定します。
2. MMT細胞をカウント
注:実験用に設定したり、細胞の生存率を決定するために、細胞を継代培養する必要があるかどうかを決定するために、細胞をカウントします。ここで紹介する2つの方法があります。
- 血球計数器を使用すると、標準的な技術は、細胞をカウントします。
- 輝線血球計数器、トリパンブルー色素、化合物の光学顕微鏡、無菌の試験管、ピペット、マニュアルセルカウンタの0.2%溶液を得ました。
- BSCの下で、10cmの組織培養皿から細胞を除去するために、10mLのピペットを使用します。細胞を、24ウェルプレート上で増殖させている場合は、メディアを削除するには、1 mlピペットまたは千μlのマイクロピペットを使用しています。
- 15ミリリットル滅菌チューブ(または1ミリリットルマイクロ遠心機、または他の小容量チューブ)で得られた細胞懸濁液を置きます。そうでない場合は、元の組織培養プレート中の細胞を残す/ウェル。
- 非滅菌マイクロ遠心機、または他の小容量チューブ内:(1比1)BSCの下で、トリパンブルー溶液10μlと10μlの細胞懸濁液を兼ね備えています。
注:トリパンブルーは、健康な生存細胞に吸収されない生体染色です。細胞が損傷または死滅されている場合には、トリパンブルーは、死細胞を計数することを可能にするセルを入力することができます(別名排除 法を染料 )。生存細胞の色が明るく軽いつつ、顕微鏡下で、死細胞は濃い紫色に表示されます。 - インキュベート5分間室温で。
- 血球計数器のカバースリップを置きます。溝にトリパンブルー細胞浮遊液10μlを適用します。 200X倍率 - 100で血球計数器を表示します。四隅グリッドが明らかである( 図2参照 )。
- 各グリッド領域内の全細胞に対する生存細胞(染色されていない)の数をカウントします。 4グリッドを平均し、細胞/ mlを得るために、1×10 4掛け。
- 皿当たり細胞(または細胞/ cm 2)の合計数を外挿する。 3.6×10 6細胞/ cm 2の所望の密度で新しい組織培養プレートに播種またはプレート上又はウェル中の生存細胞の総数を決定するために使用する細胞懸濁液の正確な量を決定するために、いずれかのこの番号を使用します。
注:血球計数器の使用に関する追加のガイダンスについては、10を参照してください。
- 皿当たり細胞(または細胞/ cm 2)の合計数を外挿する。 3.6×10 6細胞/ cm 2の所望の密度で新しい組織培養プレートに播種またはプレート上又はウェル中の生存細胞の総数を決定するために使用する細胞懸濁液の正確な量を決定するために、いずれかのこの番号を使用します。
- 生存細胞をカウントするソフトウェアとデジタルカメラを使用してください。
- ジを取得gitalカメラ、それに付随するソフトウェア、トリパンブルー色素、化合物の光学顕微鏡、無菌の試験管、ピペットおよびコンピュータの0.4%溶液です。
注:ここで使用されるMOTICソフトウェアを伴うMoticam 2,000デジタルカメラ。任意の同等のカメラとソフトウェアが十分なものでなければなりません。デジタルカメラのソフトウェアは、(製造業者のプロトコルに従って)事前に較正されていることを確認してください。 - BSCの下で、24ウェル組織培養皿の中で成長しているMMT細胞から培地を除去するために、1ミリリットルピペットまたは千μlのマイクロピペットを使用しています。優しくその後プレートに少量の未補充し(すなわち 、EMEM任意のサプリメントを含まない)の新鮮な培地(約500μl)を適用し、それを除去することにより、接着細胞を洗浄。ウェルに直接:0.2%トリパンブルーの10μlのを適用します(未補充しEMEMで1 1に希釈することによって作られました)。
- 室温で5分間静置します。
- 200X倍率W - 100の顕微鏡下でプレートを見ますi番目のデジタルカメラが取り付けられています。 2%トリパンブルーで染色すると、暗すぎる場合はプレートが非補充培地で洗浄することができます。
- コンピュータAにソフトウェアを開き、NDソフトウェアが設定タブから使用目的に合わせて較正されていることを確認します。 FOVの画像が表示されます。
- メジャー ] タブから[グリッド]を選択します。正方形幅約0.005センチメートルのグリッドが表示されます。各正方形の面積を確認するために、 グリッドの情報を選択します。
- 細胞( すなわち 、5乗×9の正方形)をカウントするために、グリッドの特定の領域を選択します。 メジャータブから四角形を選択します。正方形の角をクリックして、選択の正方形を包含するようにカーソルをドラッグします。
注:緑の色合いが選択さと幅、高さ、面積を提供するコーナーに表示されます白いボックス、および選択されたグリッドのセクションの周囲の正方形をカバーします( 図3を参照)。 - viabの数を数えます決定された領域内のル·セル。顕微鏡下でプレートを移動させることにより、同一ウェルまたはプレート内の2つの他の場所についても同じ操作を行います。
- 測定面積が同じであり、倍率が変更されていないことを確認してください。エリア内の生存細胞の平均数を計算します。ウェルの領域を使用する(100 mMのは、面積は78.6センチメートル2皿のために24ウェルプレートのために、1つのウェルが2 cm 2の面積を有する)に格子状に線引き領域から生存細胞の数を推定ウェル内の細胞の合計数(細胞/ cm 2)。
- ジを取得gitalカメラ、それに付随するソフトウェア、トリパンブルー色素、化合物の光学顕微鏡、無菌の試験管、ピペットおよびコンピュータの0.4%溶液です。
3.抗増殖剤とのMMT細胞を処理します
- 選択された抗増殖治療薬(タモキシフェン、クルクミンおよびメトホルミン)とBSCの下で任意の薬剤、アスピリンの溶液を調製します。
- 27mMのストック濃度を生成するために、100%エタノール中でクルクミンおよびタモキシフェンを溶解します。 unsupplementにメトホルミンおよびアスピリンを溶かしますED EMEMは、それぞれ、500ミリモル、15 mMのストック濃度を生成します。
- 用量反応を確立します。
- 96時間は、用量反応曲線を生成するための種々の濃度で3つの抗増殖性治療薬(タモキシフェン、クルクミンおよびメトホルミン)とオプションの薬剤(アスピリン)とMMT細胞を扱います。最初に発表された報告1,11-16に基づく濃度の範囲ですべての薬剤を投与した後、公開されたものよりも大きいか小さい濃度で。
注:用量応答は、所望の結果を生成するために必要な薬剤の最小濃度を決定します。ここで、所望の結果は、対照と比較して細胞増殖の減少です。- タモキシフェンとクルクミンは、0.054ミリ(1μL)、0.108 mMの(2μl)を、0.162ミリ(3μL)および0.216ミリ(4μL)の濃度(および対応するボリューム)を使用します。
- メトホルミンは、2 mMの濃度(および対応するボリューム)(2μLを使用)、4 mMの(4μL)、6 mMの(6μL)、8ミリ(8μL)及び10mM(10μL)。
- アスピリンは、0.030ミリ(1μL)、0.060 mMの(2μl)を、0.099ミリ(3.3μl)を、0.150ミリ(5μL)、および0.216ミリ(6.7μL)の濃度(および対応するボリューム)を使用します。
- 3.6×10 6細胞/ cm 2の濃度で24ウェルプレート上に10cmディッシュからスプリットMMT細胞。両方の細胞計数法(ステップ2)で、初期細胞濃度を決定します。細胞」 の日スプリット」のこの新しい24ウェルプレートを呼び出します。
- 24時間細胞プレーティングした後、ステップ3.2.1で説明した濃度で、抗増殖治療剤、タモキシフェン、クルクミン、メトホルミン及びアスピリンのそれぞれとMMT細胞を処理します。 「0日 」としてこれを参照してください。
- 各ウェルは、メディア、無菌マイクロピペットの先端で使用マイクロピペットと新しいチップを500μlの最大新しい井戸がCRを回避するために処理されるたびに保持することができますようにOSS汚染。対照として2つのウェルを使用します。任意の薬物治療の非存在下で増殖させた細胞(陰性対照)と細胞が存在100%エタノール(溶媒対照)で増殖させました。
- 処理の4、顕微鏡下で細胞を観察し、使用してカウント- 。細胞は、一日おきに供給されたときに1日目96時間(4日目まで)のために(ステップ1.2参照)記載の濃度で細胞と再投与薬を育てますステップ2.2の方法( 図4参照)。
- 実験を少なくとも3回繰り返します。
- 実験の長さにわたって、細胞生存率および薬物投与との関係をグラフ化することによって、各薬剤の最適濃度を決定する( 図5参照)。
- 96時間は、用量反応曲線を生成するための種々の濃度で3つの抗増殖性治療薬(タモキシフェン、クルクミンおよびメトホルミン)とオプションの薬剤(アスピリン)とMMT細胞を扱います。最初に発表された報告1,11-16に基づく濃度の範囲ですべての薬剤を投与した後、公開されたものよりも大きいか小さい濃度で。
- 時間経過を確立します。
- 期間を変化させるための固定濃度で3つの抗増殖性治療薬(タモキシフェン、クルクミンおよびメトホルミン)とMMT細胞を扱います。最適濃度のidentifを使用用量反応実験によってIED(ステップ3.2を参照してください)。
- 0.216 mMのタモキシフェン、0.216ミリモルのクルクミンおよび10mMのメトホルミン:以下の濃度を使用してください。
注:薬物は、その最適な所望の結果を得るために時間の経過が必要な時間の量を決定します。ここでは、所望の結果は、対照と比較して細胞増殖の減少です。
- 0.216 mMのタモキシフェン、0.216ミリモルのクルクミンおよび10mMのメトホルミン:以下の濃度を使用してください。
- 3.6×10 6細胞/ cm 2の濃度で24ウェルプレート上に10cmディッシュからスプリットMMT細胞。両方の細胞計数法(ステップ2)で、初期細胞濃度を決定します。細胞」 の日スプリット」のこの新しい24ウェルプレートを呼び出します。
- 24時間細胞プレーティングした後、ステップ3.2で識別された最適な濃度で、抗増殖治療剤、タモキシフェン、クルクミン、メトホルミン及びアスピリンのそれぞれとMMT細胞を処理します。 「0日」としてこれを参照してください。
- 各だけでなく、私たちのメディアを500μlの最大値を保持することができます無菌マイクロピペットの先端と新しいチップの新しい井戸が交差汚染を回避するために処理されるたびに、と電子のマイクロピペット。
- 対照として2つのウェルを使用します。任意の薬物治療の非存在下で増殖させた細胞(陰性対照)と細胞が存在100%エタノール(溶媒対照)で増殖させました。
- 期間を変化させるための固定濃度で3つの抗増殖性治療薬(タモキシフェン、クルクミンおよびメトホルミン)とMMT細胞を扱います。最適濃度のidentifを使用用量反応実験によってIED(ステップ3.2を参照してください)。
- 細胞を増殖し、細胞を一日おきに送られたときに選択された濃度で薬物を再投与(4日目まで)96時間、(ステップ1.2を参照してください)。 1日目-治療の4、顕微鏡で細胞を観察し、ステップ2.2での方法を用いてカウントする( 図4参照)。
- 実験を少なくとも3回繰り返します。
- 選択された濃度での細胞生存率および薬物治療の長さ(時間)との関係をグラフ化することにより、各薬剤のMMT細胞の最適な露光時間を決定する( 図6参照)。
4.ラボモジュール
注:以下は、5日ですラボ·モジュールの研究室スケジュール。 図7は、スケジュールが5日以内に伴うであろうもののフローチャートです。この活性は、5日間で完了するため、時間経過または用量応答曲線のいずれかが生成されます。両方の曲線を生成するのに十分な時間がありません。用量応答実験について説明します。時間経過実験を容易に交換することができます
- グループにクラスを分割する:一つのグループは、用量応答および提案された用量応答濃度の中央に濃度を選択する他の時間経過を確立しています。
- 適切な濃度で十分な文化や薬剤の在庫を維持します。特に断りのない限り、BSCの下ですべての作業を実行します。
- 1日目
- メディアを作成し、(ステップ1のように)細胞を成長させるための直接の学生。
- 学生は10cmプレート上MMT細胞の株式を取得するように、細胞培養培地を準備しhemocytomeの使用のチュートリアルを与えるために学生を導きますター、デジタル顕微鏡(ステップ2のように)デジタルカメラ顕微鏡ソフトウェア。
- 今、製造業者のプロトコルを使用して、顕微鏡で使用される目標( 例えば、4X、10X、20X)にソフトウェアを調整します。
- 2日目
- 学生は(ステップ2のように)総細胞数および細胞生存率を確認しました。
- 学生は、同様の結果が得られるを確認するために、顕微鏡ソフトウェアおよび血球計法の両方を用いて100 mmディッシュ上で細胞をカウントしています。
- (ステップ1のように)所望の出発細胞プレーティング密度に24ウェルプレートに100ミリメートル皿から24ウェルプレートおよび分割細胞を得るために直接の学生。これは、 日スプリットと考えられています。 24時間細胞培養インキュベーター中で24ウェルプレートを置きます。
- 3日目
- 24ウェルプレート上で24時間、MMT細胞を成長させます。学生は、顕微鏡で細胞を観察し、(ステップ2のように)顕微鏡ソフトウェアを使用してカウントしています。
- 学生/ TEを与えますがん治療薬の株式のサンプルをしています。それらを準備し(ステップ3のように)元のストック溶液を希釈しています。用量応答曲線を確立するために、それらの細胞への薬物の様々な濃度を加えます。これは、0日目と呼ばれています。
- 48時間の最大のための薬剤と細胞(ステップ1.2)をインキュベートします。
- 4日目
- 学生は24時間後に処理した細胞を観察しています。これは、1日目です。
- 顕微鏡ソフトウェアを使用して、各ウェルを数えます。レコードごとの写真よくなるようにカウントが(ステップ2のように)研究室の外に行うことができます。
- 別の24時間の薬剤と細胞(ステップ1.2)をインキュベートします。
注:インストラクターは、追加のチュートリアルやデータ分析とグラフィカル表示の口コミを提供しています。学生は、データ収集の次の日のための図、グラフ、および統計分析を作成することを学びます。
- 5日目
- 学生は48時間、2日目の後に細胞を処理しています。
- 各カウントウェル顕微鏡ソフトウェアを使用して。レコードごとの写真よくなるようにカウントが(ステップ2のように)研究室の外に行うことができます。
- 効果的に(ステップ2のように)顕微鏡ソフトウェアメソッドを使用する学生の能力を検証する手段として、従来の血球計数器法により計数するための細胞を収穫し、収集します。
注:これにより、データを収集し、結論を出すか、仮説を修正します。
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Representative Results
MMT細胞を増殖し、計数法を比較します 。
マウス乳腺腫瘍細胞は正常に増殖させ、特徴付けられる( 図1)と新規な細胞計数法はMOTICソフトウェア、顕微鏡用デジタルカメラ関連のソフトウェアプログラムを使用して開発されました。この新しい細胞計数法は、血球計( 図2)を用いた従来のカウント方法と比較した細胞数( 表1)を決定する際にも同様に正確であることが示されました。 、異なる増殖条件または細胞型への細胞数への影響を制御するために、2つの細胞計数法との比較は、抗増殖剤の存在下および非存在下で、異なる細胞株、神経細胞モデルPC12 17を行いました。
図3は、definの重畳グリッドを使用して、この方法を用いて細胞を計数するための領域の描写を示しています編寸法。グリッドは、視野(FOV)の上に置かれ、緑色のフレームは、グリッド(すなわち、9時間×5日間の正方形)の指定された長さ及び幅に適用されます。細胞は、緑色の枠内にカウントされるプロトコルで説明したように細胞数を外挿する。
MMT細胞を処理する:抗増殖剤のMMT細胞の用量応答を決定します。
用量応答研究( 図4)は 、各抗増殖剤のために行われました。これらの実験を通してデータを継続的に収集、検討し、プロトコルに可能な改定が保証されたかどうかを確認するために分析しました。実験は同様の結果を生成するそれぞれの研究で、3回行いました。すべての細胞が死滅したか、薬の効果が頭打ちまでの実験を続けました。結果のデジタル顕微鏡写真を図4に提示され、それらの知見のグラフィカルな分析が提示されています図5に。効果的な濃度範囲は、 図5のX軸上およびプロトコルセクションで、 図4の凡例に報告されています。
タモキシフェンの最低濃度、0.054 mmと、細胞増殖の強固な阻害は約83%、未処理細胞( 図4A)と比較すると、ありました。細胞生存率は、タモキシフェン( 図5A)の濃度の増加に伴って減少し続けました。タモキシフェンの最適用量は、48時間の完全な細胞死は、その濃度( 図4A)で発生したため、後に0.216 mMであると決定されました。興味深いことに、細胞増殖におけるこれらの減少は、そのin vitro系モデルを強調文献18,19に基づいて予想されるが、常に完全に生体内イベントに表すものではないとして、タモキシフェンに対する細胞耐性の兆候を示さありません。また、最低のTREと対比するときatmentクルクミンの濃度( 図4Bおよび5A)およびメトホルミン( 図4C及び5B)、タモキシフェンの最低濃度は、それぞれ、細胞分裂を停止し、より効果的な9%と50%でした。
クルクミンは、同様に、細胞分裂の阻害に濃度依存的効果を示しました。増加する濃度で、細胞生存率( 図4Dおよび図5A)の有意な減少が認められました。クルクミンの最適な投与量は、0.216 mMのために48時間後、タモキシフェンのように、その濃度で完全な細胞死があったことが決定されました。
メトホルミン治療は、最小濃度の33%の減少をもたらす、MMTの細胞生存率の最も劇的な減少をもたらしました。増加メトホルミン濃度の細胞生存率の同時減少が( 図4C及び5B)が観察されました。メトホルミンの最適な投与量は、試験した最高濃度(1であると決定されました0 mm)です。タモキシフェンとクルクミン、日常的化学療法剤として使用の両方と比較して、メトホルミンは、細胞周期の阻害において30〜40%未満に有効でした。興味深いことに、細胞分裂におけるメトホルミンの効果はアスピリンの投与( 図4Dおよび図5A)、細胞増殖の阻害のない明確機構とサリチル酸薬によって得られるものと一致しました。
MMT細胞を処理する:抗増殖剤にMMT細胞応答の時間経過を決定します。
投与される薬物の有効量は、曝露時間の影響を受けることができるので、時間の経過研究は、各抗増殖剤を行いました。細胞生存率については、このモジュールのアッセイとしては、第1のセルが(倍加時間)ので、細胞を選択することができる薬剤にさらされている時間の長さのための論理的なウィンドウを分割どのように迅速に特定することが重要です。これは、MMT細胞倍加時間があることが、そのため、必須です最初に細胞を特徴付ける際に確認しました。これらの実験を通して、データが継続的に収集、検討し、プロトコルに可能な改定が保証されたかどうかを確認するために分析しました。実験は同様の結果を生成するそれぞれの研究で、3回行いました。すべての細胞が死んでいたか、効果が頭打ちまでの実験を続けました。
時間経過の研究では、96時間のための各抗増殖薬(タモキシフェン0.216ミリモル、クルクミン0.216ミリモル、メトホルミン10mMの)の最適化された濃度のMMT細胞の処理は、完全な細胞死または薬物の影響のオフレベリング(もたらしたことを明らかにしました図6)。アスピリン、「オプション」薬は、私たちの用量反応研究で、細胞生存率に影響を与えなかったが、影響は軽微であったため、時間経過研究に含まれていませんでした。
図1 MMT細胞。改変イーグル最小必須培地 (EMEM).100X、スケール= 0.2ミリメートルで3.6×10 6細胞/ cm 2で成長させた「健康」、未処理のマウス乳癌(MMT)細胞のデジタル顕微鏡写真は、で示されます白バー。 この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。
図2。 血球計数器グリッド。血球計数器グリッドの顕微鏡写真、100倍。円内に示した全体のグリッド部(FOV)。 この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。
ジル/ ftp_upload / 52528 / 52528fig3.jpg "/>
図3。MOTICソフトウェアで計数領域を指定。 顕微鏡で見られるようにMOTICソフトウェアで確立されたMMT細胞をカウントするためのグリッドFOVのオーバーレイと定義された領域の画像。 100Xは、スケール= 0.2ミリメートル、白いバーで示す。 この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。
抗増殖剤のMMT細胞の図4用量反応96時間、様々な濃度の抗増殖剤の存在下で増殖させたMMT細胞のデジタル顕微鏡写真。タモキシフェン:(A1)0.054ミリ(A2)0.108ミリ(A3)0.162ミリ(A4)0.216ミリモル;クルクミン:(B1)0.054 mMの(B2)0.108 mMの(B3)0.162 mMの(B4)0.216 mMの。メトホルミン:(C1)2 mMの(C2)4 mMの(C3)6ミリ(C4)8ミリ(C5)の10mM;アスピリン:(D1)0.030ミリ(D2)0.060ミリ(D3)0.099ミリ(D4)0.150ミリ(D5)0.216ミリモル;エタノール(100%)および未処理の両方を制御しています。 100X、スケール= 0.1ミリメートル、グリッド内の各正方形を構成する青色の線で示す。 この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。
図5.抗増殖剤のMMT細胞の用量応答実験のグラフ表示。抗増殖剤の増加する濃度の効果(A)タモキシフェン、クルクミン、アスピリン、およびMMT細胞生存率に対する(B)メトホルミン。結果A細胞の処置は96時間続けたが、処置の48時間後に対照の割合として表さ再。 n = 3で、STDが示されています。
図6.抗増殖剤にMMT細胞応答の時間経過分析のグラフ表示。時間経過のタモキシフェンの効果の研究(0.216mM)、クルクミン(0.216mM)、および96以上のMMT細胞の生存率に対するメトホルミン(10 mM)の時間。結果は、処置の48時間後に対照の割合として表されます。ここに示した代表的な実験の結果、N = 1です。
5日間の実験室モジュールの7フローチャート図。
細胞型 | 薬AdministereD | 実験の日 | 薬物濃度 | MOTICとセル数 | 血球計数器を用いた細胞数 |
MMT | 未処理の | 2日目 | - | 7.8x10 4細胞/ cm 2 | 8.0×10 4細胞/ cm 2 |
MMT | エタノール | 2日目 | 10 mMの | 7.1x10 4細胞/ cm 2 | 7.2x10 4細胞/ cm 2 |
MMT | タモキシフェン | 2日目 | 0.216 MM | 0セル/ cm 2 | 0セル/ cm 2 |
MMT | タモキシフェン | 2日目 | 0.054 mMの | 1.3×10 4細胞/ cm 2 | 1.5×10 4細胞/ cm 2 |
MMT | クルクミン | 2日目 | 0.054 mMの | 1.9x10 4 Cells / cm 2の | 2.0×10 4細胞/ cm 2 |
MMT | クルクミン | 2日目 | 0.216 mMの | 0セル/ cm 2 | 0セル/ cm 2 |
MMT | メトホルミン | 2日目 | 2 mMの | 5.1x10 4細胞/ cm 2 | 5.2x10 4細胞/ cm 2 |
MMT | メトホルミン | 2日目 | 6 mMの | 3.4x10 4細胞/ cm 2 | 3.5×10 4細胞/ cm 2 |
MMT | アスピリン | 2日目 | 0.099 mMの | 2.8x10 4細胞/ cm 2 | 3.0×10 4細胞/ cm 2 |
PC12 | 未処理の | スプリット | - | 2.5×10 4細胞/ cm 2 | 2.1×10 4細胞/ cm 2 |
表1。血球計数器とMOTICソフトウェア計数法の比較。MMT細胞の細胞計数の結果、MOTICソフトウェアまたは血球計方法のいずれかを使用して。両方の未処理および処理細胞を対照として、カウント、ならびに異なる細胞株、PC12ました。
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Discussion
ラボ·モジュールは、動物細胞培養の高度な技術を介して、細胞生物学のさまざまなトピックを教えることを目指し、その提示されています。モジュールは、モデルヒト乳癌細胞の複製に対する抗増殖性化学物質の数の影響を分析することによって、これを達成します。一次アッセイは細胞計数の基本的な技術に依存しており、顕微鏡ソフトウェアを用いて細胞数を計測するための新しい方法を紹介します。モジュールを備え活動が最も生物学のプログラムで利用可能な器具および装置を用いて行うことができます。モジュールは、安価で容易に得られる電源で5日間のスケジュールで実施することができます。デジタル顕微鏡カメラや顕微鏡ソフトウェアの特定のブランドはここ(MOTICソフトウェア)を用いているが、任意の同等のカメラとソフトウェアで十分です。
このラボモジュールは、ヒト乳癌のモデルとしてMMT細胞を利用します。学生は最初に成長し、これらを特徴づけるために教えられています培養中の細胞。なお、この実験用モジュールの正常に完了したことを強調するために重要であるだけでなく、未処理のMMT細胞を対照として、特に以来、健康なMMT細胞の外観と動作を熟知する(学生別名)の研究者が必要です。適切な用量応答および経時変化データが生成される場合、したがって、時間とMMT細胞の一般的な形態を倍加細胞増殖パターンの完全な特徴付けが不可欠です。
いったん特徴、MMT細胞は、その後、細胞分裂、細胞周期調節、細胞シグナル伝達及び癌のトピックを教える手段として種々の抗増殖剤に対するそれらの応答について試験しました。細胞生存率は、細胞に対するこれらの薬剤の効果を理解するために使用されます。細胞を計数する新規な方法は、顕微鏡に取り付けられたデジタルカメラに関連付けられているソフトウェアを使用して、実施し、その精度を検証するために、従来のカウント血球計ベースの手順と比較されます。ティの新規な方法は、それが学部教授の研究室で使用されているため、特に注目すべき2つの利点が、用意されています。細胞は、計数のために、組織培養プレートから除去する必要がないのでまず、短い時間は、主な実験アッセイを行うために必要とされます。これは、一度に、限られた時間内に試験される実験的な変数の多くを可能にします。第二に、この方法は、学生が結果を評価し、実験室の外で彼らの実験戦略を洗練することを可能にする実験的治療に対する細胞応答のデジタル記録を提供します。
これらのカウント方法の両方を実装する際に注意すべきいくつかの問題があります。まず、いずれの方法を用いて細胞を計数する前に、細胞を、生存細胞と死細胞を区別するためにトリパンブルーを用いてインキュベートします。死んだ細胞は染料が浸透し、生細胞は明るい白であるのに対して、青暗く見えるしています。しかし、細胞をDYとインキュベートされた場合推奨潜伏期間を超えたeは、それらが過剰染色し、区別するのは難しいでしょう。第二に、MMT細胞は血球計または組織培養プレート上で凝集し、個別にカウントすることは困難です。このため、「塊」は、細胞の一定数( 例えば、10個/塊)を含むように指定され、グリッド上に存在するすべての塊は、その後、カウント中にその数が乗じられます。最後に、MMT細胞は、それらが成長している皿の表面に付着します。これは、細胞を除去する際のプレートに直接ピペットの先端をタッチし、細胞塊を破壊し、可能な限り多くのプレートから細胞を除去するために力を適用することが必要です。結果として、従来の血球計数方法を使用するときに正確なカウントを得るためにいくつかの試みを取る私。
細胞が十分に特徴づけられ、カウント方法を確認すると、2つの異なる実験を行っています。種々の濃度の効果の用量反応試験MMTの細胞分裂および時間経過実験で抗増殖薬のこれらの薬剤への曝露の最適な時間を解明します。試行錯誤が必要であり、一次文献の適用が成功した実験のために必要とされるように、これらは非常に有益実験です。例えば、これらの抗増殖剤にMMT細胞の用量応答を解明する最初の試みは、100%の細胞死は、薬物投与の24時間以内にあったように、試験した濃度が高すぎることが明らかになりました。文学の拡大レビューでは処理濃度の改訂範囲につながりました。これは、効果的に、一次文献の記事を、文献データベースを使用読み、分析し、批評する方法を学生に教え、これらのスキルは、科学的プロセスに不可欠であるかを強調しています。
用量反応試験の結果は、タモキシフェンは、試験した全ての濃度で、最も強い抗増殖効果を発揮することが示されました。タモキシフェン、抗mitotiC薬は、典型的には、ホルモン感受性患者18-20閉経後に、エストロゲン感受性の癌のための抗エストロゲン療法として特に使用されます。薬物は、現在、乳癌治療として使用されます。タモキシフェンは、細胞内のエストロゲン受容体に対してエストロゲンと競合し、結合した場合、ダウンサイクリンD及びBは、細胞周期の二つの重要な調節因子の発現を調節します。活動で得られた結果は、タモキシフェンが正常エストロゲン受容体に結合していると認められ、細胞増殖の減少をもたらす、細胞周期を通して細胞の進行を阻害することを示唆しています。興味深いことに、投与タモキシフェンのすべての濃度全体のMMT細胞増殖率の減少は、(実施例19を参照)は、文献に基づいて予想されるように、タモキシフェンに対する細胞耐性の兆候を示さありません。これは、実験を行ったインビトロ条件が完全にモデル私していないことを良いリマインダとして機能しますn個の状況を体内。
MMT細胞のクルクミン処理は、細胞生存率の低下をもたらしました。クルクミンは、細胞増殖抑制剤12,16としてターメリック根および作用から誘導される化合物です。これは、NF-κB経路とオルニチン脱炭酸酵素(ODC)活性をダウンレギュレートすることによって動作します。 NF-κBは、アポトーシスを阻害するタンパク質をコードする抗アポトーシス遺伝子などTRAF1およびTRAF2の転写を制御するタンパク質複合体です。 ODCはポリアミン、増強細胞増殖につながる栄養源を高め、癌細胞を提供するタンパク質の産生を触媒する酵素です。薬剤は、乳癌の治療として現在使用されています。クルクミンの抗増殖効果は、明らかに、細胞分裂にNF-κB及びオルニチンデカルボキシラーゼが関与する細胞シグナル伝達経路の調節をしているダウン効果を示しています。
細胞生存率の減少は、同様に、メトホルミンの下水処理で観察されましたNT。公開された報告は、メトホルミンおよび乳癌15の発生率が低いがかかる患者との間の相関関係を示唆しているため、メトホルミン、典 型的には、II型糖尿病するために投与薬は、選択されました。これは、エージェントが、C-MYC遺伝子を調節すると考えられ、および、サイクリン、細胞周期内のチェックポイントとして機能する分子のサイクリンDのアップレギュレーションの活性を下方制御する細胞がより速い速度でのサイクルを経て進行することを可能にすることにより、さ増加した細胞分裂および増殖をもたらします。 C-MYC遺伝子の調節はまた、サイクリンDのダウンレギュレーションおよび細胞分裂の減少をもたらす方法MMT細胞にメトホルミン治療の効果を示す図です。メトホルミンデータは、薬物がDiabetes-が他の異常な生理学的事象に適した作用機序を有することができ、この場合には1コンディショニング用に設計された方法を例示しています。また、タモキシフェン、クルクミン、およびメトホルミンが、すべてが異常な細胞prolifを遅らせることを強調するすることが重要です異なるメカニズムを介してerationは、各正常細胞集団を減少し、 インビトロでの細胞分裂を妨害します。
このモジュールはまた、別の薬でオープンエンドのお問い合わせは、草の治療を可能にする、または薬剤を試験することができます。アスピリン、店頭鎮痛、解熱、および軽度の痛みを緩和し、発熱を低減するために使用される抗炎症薬は、このモジュールで選ばれました。炎症を軽減するアスピリンの能力は、それらを養う新しい血管の発達を遅らせ、それらの成長11,13,14燃料幹細胞を妨害することによって腫瘍増殖を阻害することができます。興味深いことに、MMT細胞に対するアスピリンの投与は、細胞生存率の一部の減少を生じました。多くの相関の研究は、原因関係対相関の優れた例を提供し、13,14が報告されているが、ほとんどは、がんの予防と治療におけるアスピリンの役割について知られています。
時間もちろん研究は、最適化された用量で投与した場合、抗増殖薬は、最初の曝露の4日以内に、細胞分裂を妨害するのに非常に有効であることが明らかになりました。また、これらの研究は、これらの実験を行うための実験的な戦略を考案する際にはMMT細胞増殖特性について学んだものを使用する学生のための機会を提供します。実際には、MMT細胞の徹底的な細胞増殖パターンを特徴付ける倍加時間および一般的な細胞形態は、正確な用量応答および時間経過の両方のデータのために不可欠です。
両方の用量応答および時間経過の研究では、薬物濃度と時間の曝露の、それぞれ、および薬物が生体系に与える影響との関係を決定します。これは、問い合わせ駆動、研究活動を行っている間の分子間相互作用および生化学における他の基本的な概念について考えて学生を取得するための優れた方法です。これは注目に値する、多くのBIので、学問の専攻は、医療学校に出席するために計画し、このラボモジュールは、医療学校の要件21で新たに制定変化とよく整合します。
このラボモジュールが記載されているように正確に実装することができるか、または容易にテンプレートとして機能することができます。バリエーションのホストは、増殖培地中の抗増殖剤の選択は、細胞型または栄養変形例として、この活動に組み込むことができます。限り仮説は、細胞または一般生物学の基本的かつ高度な概念をテストが開発されているように、このモジュールの順列は多数あります。関係なく順列の、この活動の実施は当然実験技術の大規模な配列を学び、機器や計測機器の様々に精通するために学生に指示します。
要約すると、ここで説明するラボモジュールは、学生が完全に、科学のプロセスに参加を取得する能力を開発し、分析し、グラフとreprすることができますESENTデータ、およびそれらの時間管理と共同のスキルを磨きます。モジュールは、オープンエンドの問い合わせを容易にするように設計されており、様々なコースのスケジュールやスキルレベルに容易に適合されます。これは、本稿の最初の2人の著者は明らかにこのラボ·モジュールがその集団に適していることを実証し、学部生物学の専攻であることに留意すべきです。
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Disclosures
著者はMOTICから金銭または同等の支援を受けていません。
Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Tissue Culture Hood | ESCO Labculture Reliant | Class II Type A2 Biological Safety Cabinet | |
Waterjactor CO2 Incubator | CEDCO | Model 1510 | |
Bright-line Hemocytometer | American Optical | with two separate grids | |
Motic Images Plus | Mac OSX Verison 2.0 or higher | ||
Gilson Pipetman | Rainin instrument co. inc | P-20D, P-200D, P-1000D | |
CK30/CK40 Culture Microscope | Olympus | 4 objective inverted light microscope with camera | |
200 μl Pipet tips | MidSci | 40200C | |
1,000 μl Pipet tips | MidSci | AVR4 | |
10 ml Seriological Pipets | TPP | TP94010 | |
24 well plates | CoStar- Tissue Culture Cluster | 3524 | 24 wells, 16 mm well diameter, radiation sterilized |
Trypan Blue Solution 0.4% | Sigma | T8154 | 100 ml, cell culture tested non-haz |
Bright-line Hemacytometer replacement coverslip, non-haz | Sigma | Z375357 | |
Mouse Mammary Tumor(MMT) cells | ATCC | CCL-51 | |
Eagle Minimum Essentail Medium (EMEM) | ATCC | 30-2003 | 500 ml |
Fetal Bovine Serum | Sigma | F0926 | 500 ml |
Metformin Hydrochloride | Sigma | PHR1084 | 500 mg |
Tamoxifen | Sigma | T5648 | white or white-yellow powder |
Curmumin | Sigma | C1386 | yellow-orange powder |
Aspirin | Sigma | A2093 | meets USP testing specifications |
References
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