Introduction
종종 학부 일반 생물학 과정에서, 세포주기 조절과 암의 주제에 감동하고 있지만이 과정에서 콘텐츠의 폭이 깊이 약간의 시간이 나뭇잎 때문에 자세히 살펴 없습니다. 또한, 학부 생물학 학생들은 일반적으로 동물 세포 배양과 관련된 고급 기술에 노출되지 않습니다. 적용하고 그들이 배운 것을 분석하면서 학생들이 이러한 개념의 깊은 이해를 개발하기 위해, 실험실 활동은 실험실 활동 1을 확장 연구의 월터 리드 육군 연구소 (WRAIR)의 변형으로 개발되었다. 랩 모듈은 비정상적인 세포 신호 전달 경로를 성장 및 암세포 모델을 특성화 개발 및 셀 카운팅 방법을 실행하는, 항 증식 제와 세포를 치료하기위한 최적의 시간 과정 및 투여 량을 설정하고, 식별하는 단계를 포함 단계적 실험 전략을 사용 . 실험은 오픈 가능-ended 질문.
이 작업에 필요한 대부분의 기술은 전형적인 교시 생물학 실험실에서 수행 될 수있다. 활성은 마우스 유방 종양 (MMT) 세포주의 성장 속도 및 형태, 인간 유방암 2 모델을 특성화 학생들 시작한다. 유방암은 때문에 인구의 유병률, 대학 세 학생들의 친숙하고 사용할 수있는 광범위한 데이터 모델 암으로 선택되었다. MMT 세포주는 특별히 잘 특징으로 쉽게 얻을 수 있기 때문에, 선택된 짧은 배가 시간을 갖는 성장이 용이 하였다. 또한, MMT 세포가 에스트로겐 의존성 가장 여성의 유방암과 일치하는이다. 학생들은 그 행동의 메커니즘을 잘 학생들을 가능하게 변화하고있는 약물과 치료의 길이의 established.The 농도 화학 요법 약물로 세포를 처리하여 MMT 세포에서 비정상적인 세포 신호 전달 경로를 식별세포 분열의 속도에 이러한 변수의 효과를 알아보고자 하였다. 이 활동에 대한 키 분석은 단순히 두 가지 방법 중 하나를 사용하여, 세포 계수를 필요 세포 생존의 판정이다. 각 방법은 강력한 현미경 기술에 따라 달라집니다. 학생들은 표준 혈구 방법 및 신규 photomicroscopy 방법을 사용하여 세포 생존을 결정하고 제안한다. 자신의 연구 결과를 바탕으로, 그들은 제안 할 수 및 활동에 수정을 테스트합니다. 학생들은 그들의 데이터를 표현하고 그 가설을 수정하고 새로운 실험 전략을 고안하는 결과를 해석한다.
이 연구소의 활동은 생물 과학 전공 신입생 또는 학년 수준의 학생에 적합합니다. 그것은, 첫 해에 일반 생물학 또는 두 번째 해, 분자 / 세포 생물학 과정을 완료 할 수있는 한 주간의 실험 모듈로 응축된다. 활동의 적절한 완료에 필요한 기술은 C의 배열과 기본 산술 및 대수, 익숙 포함광석 실험실 기술 (예를 들면, 피펫, 솔루션 제작, 멸균 기술) 세포 배양 및 스프레드 시트 소프트웨어의 강사에 대한 지식과 함께, 데이터 분석, 기본 광학 현미경 및 시간 관리,. 필요한 시약 (예, 마우스 유방 종양 세포, MMT 2), 화학 요법 제를 암 동물 세포주 모델을 포함한다 (예를 들어, 타목시펜, 커큐민, 메트포르민, 아스피린), 트립 판 블루 및 세포 배양 배지 (예, 이글 최소 필수 중간 ; 적절한 보조제 (예를 들면, 도너 말 및 소 태아 혈청)와 EMEM). (; 클래스 II BSC), 혈구, 디지털 현미경 소프트웨어를 필요 인스트루먼트는 역 광 디지털 카메라 부착, 컴퓨터, 100mm 24 잘 조직 배양 플레이트, CO 2 배양기 (또는 동급), 바이오 안전성 캐비닛 현미경을 포함한다.
TEAC하는 동물 세포 배양에 의존하는 특정 실험실 활동의 좋은 사례가있다세포 생물학 3의 개념에 대한 H 학부 학생. 그러나 많은 사람들이 (예, 방사성 동위 원소, 라이브 동물 조직, 첨단 영상 장비 1,4,5가), (400 레벨 코스 6에 적합, 예를 들어) 상당히 진보 프로토콜을 설명 쉽게 접근 할 수없는 공급 또는 기술을 필요로하거나, 멀티 주 학기 긴 프로젝트 6, 7을 필요로한다. 여기에 설명 된 실험 활동 간단하고 일반적인 실험실 장비 단일 주에 수행 될 수있다.
요약하면,이 실험 모듈 효과적으로 도입 또는 기본 및 고급 실험실 기술, 실험 데이터 분석, 동물 세포 배양 방법 및 과학적 프로세스를 가르치는 동안 세포주기, 세포 신호 전달 경로와 암의 개념을 강화한다. 실험실 모듈은 간단하고 경제적으로 액세스 할 수 있으며 개방형 질문에 대한 유연성과 기회를 모두 제공합니다. 활동은 학생들의 창의력을 장려조리법 가이드로하지만 역할을하는 템플릿 실험 전략을 제공함으로써. 그것은 기억 필요로 가장 중요한 활동 만족 개화 분류 8의 모든 학습 영역은, 이해, 적용, 분석은 평가하고 교과서에서 과학 연구의 세계로 끌어 과정에서 학생들의 결합에 의해 생성.
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Protocol
주 : 행동 클래스 II 바이오 안전성 캐비닛에서 세포와 세포 배양 시약 모든 작업 (BSC) 9. 그들은 생물학적 위험을 완화하기 위해 낮은 자세로 MMT 세포, 바이오 안전성 레벨 I로 분류됩니다. 사용 (예를 들어, 자외선은 70 % 에탄올 닦아) 사이의 BSC에 적절한 세척 및 오염 제거 절차를 적용합니다.
1. MMT 세포를 성장
- 영양이 풍부한 10 % 소 태아 혈청 (FBS)으로 보충 된 이글스 최소 필수 중간 (EMEM)로 구성 미디어, 2 mM의 글루타민, 및 1 % 안티 곰팡이 항생제 / 10 ㎖를 함유 10cm 조직 배양 접시에 세포 (10 단위 페니실린 성장 100 μg의 스트렙토 마이신, 0.25 μg의 암포 테리 신 B). 37 ℃, 가습 된 5 % CO 2 챔버에서 세포를 배양. 3.6 × 106 세포 / ㎠의 밀도로 세포를 플레이트 (2 단계에서 세포를 카운팅 참조).
- 매 48 시간이 UNL 신선한 매체와 함께 세포 배양 배지의 절반을 바꾸기ESS는 달리 표시. 역 위상 대비 가벼운 현미경으로 검사에 의해 세포 생존 및 형태를 확인합니다.
- 참고 100에서 크기, 구조, 모양, 조직 및 추정 번호 세포의 특성 - 200X 확대. 이 농도에서 세포가 하나의 평면에 표시, 서로 꼭대기와 근접 뭉쳐하지. 각 셀이 점에 와서 그것으로부터 확장 가늘고 긴, 분기 형 확장자 두꺼운 구형 코어로 구성된다 (도 1 참조).
- 그들은 7.2 × 106 세포 / ㎠의 셀 밀도에 도달하면 세포 세분. 세포를 1.8 × 106 세포 / ㎠ 당 24 시간의 두배 속도를 나타낸다. 그들은 분리 된 횟수를 표시하기 위해 셀들 항로 X (PX)를 지정한다.
- 3 세대에서 (즉, 세 구절, P3 후), 수확, 계산, 3.6 × 10 (6)의 밀도로 24 잘 조직 배양 접시에 세포를 판 / ㎠까지.
- 보기 세포 매일 기록 디지털 현미경 사진. 참고 및 세포 형태 (즉, 크기, 모양, 빛 반사 특성)를 설명합니다. 정기적으로 세포를 계산하고 세포 수에 경과 시간과 관련하여 세포 배가 시간을 결정합니다.
2. MMT 세포를 계산
참고 : 세포를 계대 배양 할 필요가 있는지 확인하기 위해 세포를 계산, 실험 설정 또는 세포 생존을 결정합니다. 여기에 제시된 두 가지 방법이 있습니다.
- 혈구의 사용은, 표준 기술은 세포를 계산합니다.
- 밝은 줄 혈구, 트리 판 블루 염료, 복합 광학 현미경, 멸균 시험관, 피펫과 수동 셀 카운터의 0.2 % 용액을 얻었다.
- BSC에서 10cm 조직 배양 접시에서 세포를 제거하기 위해 10 ML의 피펫을 사용합니다. 세포를 24 웰 플레이트에서 재배하는 경우 용지를 제거하기 위해 1 ML의 피펫 또는 1,000 μL 마이크로 피펫을 사용합니다.
- 15 ml의 멸균 튜브 (또는 1 ml의 마이크로 원심 분리기 또는 다른 작은 볼륨 관)에서 생성 된 세포 현탁액을 놓습니다. 그렇지 않으면, 원래의 조직 배양 접시에 세포를 남겨 / 웰.
- 비 - 무균 마이크로 원심 분리기 또는 다른 작은 부피 튜브 (1 비율 1) BSC 하에서 트립 판 블루 용액 10 μL와 세포 현탁액 10 μL을 결합한다.
참고 : 트리 판 블루 건강 가능한 세포에 의해 흡수되지 않는 중요한 얼룩입니다. 세포가 손상되거나 죽은, 트리 판 블루가 죽은 세포가 계산 될 수 있도록 셀을 입력 할 수 있습니다 (일명 배제 방법을 염색). 가능한 세포는 색에서 밝은 빛을하는 동안 따라서 현미경, 죽은 세포는 어두운 보라색이 나타납니다. - 품다5 분 동안 실온에서.
- 혈구에 커버 슬립을 놓습니다. 홈에 트리 판 블루 세포 현탁액 혼합물의 10 μl를 적용합니다. 200X 확대 - (100)에서 혈구를 볼 수 있습니다. 네 모서리의 격자 명백한 (도 2 참조).
- 각각의 그리드 화 지역의 총 세포 대 (흠) 가능한 세포의 수를 계산합니다. 네 그리드 평균 세포 / ml를 얻을 수 1 × 104을 곱한다.
- 접시 당 셀 (또는 셀 / ㎠)의 총 수 외삽. 3.6 × 106 세포 / ㎠의 원하는 농도로 새로운 조직 배양 판을 시드 또는 플레이트 나 웰의 생존 세포의 총 수를 결정하기 위해 사용하는 세포 현탁액의 정확한 용적을 결정하거나,이 번호를 사용한다.
참고 : 혈구의 사용에 대한 추가 지침은, 10를 참조하십시오.
- 접시 당 셀 (또는 셀 / ㎠)의 총 수 외삽. 3.6 × 106 세포 / ㎠의 원하는 농도로 새로운 조직 배양 판을 시드 또는 플레이트 나 웰의 생존 세포의 총 수를 결정하기 위해 사용하는 세포 현탁액의 정확한 용적을 결정하거나,이 번호를 사용한다.
- 가능한 세포를 계산하는 소프트웨어와 디지털 카메라를 사용합니다.
- 디를 얻습니다gital 카메라, 그것의 동반 소프트웨어, 트리 판 블루 염료, 복합 광학 현미경, 멸균 시험관, 피펫과 컴퓨터의 0.4 % 용액.
참고 : 여기에 사용된다 Motic 소프트웨어를 동반 Moticam 2000 디지털 카메라. 모든 비교 카메라와 소프트웨어는 충분합니다. 디지털 카메라 소프트웨어 (제조 업체의 프로토콜에 따라) 사전에 교정되었는지 확인하십시오. - BSC에서 24 잘 조직 배양 접시에서 성장하는 MMT 세포에서 용지를 제거하기 위해 1 mL를 피펫 또는 1,000 μL 마이크로 피펫을 사용합니다. 부드럽게 한 다음 접시에 소량 않은 보충 (즉, EMEM 어떤 보충없이) 신선한 미디어 (약 500 μL)를 적용을 제거하여 부착 세포를 씻으십시오. 우물에 직접 : 0.2 % 트리 판 블루의 10 μl를 적용 (UN-보충 EMEM으로 1 희석하여 만든).
- 5 분 동안 실온에서 접시를 품어.
- 200X 확대 W - 100의 현미경 판보기i 번째 디지털 카메라가 부착. 2 % 트리 판 블루로 염색하는 것은 너무 어두우면 판을 비추 미디어로 세척 할 수있다.
- 컴퓨터에 소프트웨어를 열고 차 소프트웨어가 설정 탭을 통해 사용 목적에 보정되어 있는지 확인합니다. 시야의 이미지가 나타납니다.
- 측정 탭에서 그리드를 선택합니다. 사각형의 격자는 약 폭 0.005 cm가 나타납니다. 각 사각형의 영역을 확인하는 그리드 정보를 선택합니다.
- 세포를 계산 그리드의 특정 영역을 선택합니다 (즉, 5 제곱 X 9 사각형). 측정 탭에서 사각형을 선택합니다. 사각형의 모서리를 클릭하고 선택의 제곱을 포함하도록 커서를 끕니다.
참고 : 녹색의 그늘 선택과 폭, 높이, 면적을 제공하는 코너에 나타납니다 흰색 상자 및 선택 그리드의 부분의 둘레의 사각형을 다룰 것입니다 (그림 3 참조). - viab의 수를 계산결정된 지역에서 제작 세포. 현미경으로 접시를 이동하여 동일한 잘 또는 판에 두 개의 다른 위치에 대해 동일한 작업을 수행합니다.
- 측정 영역은 동일하며 배율이 변경되지 않았 음을 확인합니다. 지역 내 생존 세포 수의 평균을 계산한다. 웰의 면적 이용을 그리드에 묘사 영역으로부터 생존 세포의 수를 추정 (24 웰 플레이트를 하나의 웰은 100 mm만큼 면적이 78.6 cm 인 접시 2cm (2)의 면적을 갖는다) 웰 (세포 / cm 2) 내 셀들의 총 수.
- 디를 얻습니다gital 카메라, 그것의 동반 소프트웨어, 트리 판 블루 염료, 복합 광학 현미경, 멸균 시험관, 피펫과 컴퓨터의 0.4 % 용액.
3. 항 증식 에이전트와 MMT 세포 치료
- 선택한 항 증식 치료제 (타목시펜, 커큐민과 메트포르민)와 BSC에서 선택 약물, 아스피린의 솔루션을 준비합니다.
- 27 mm의 재고 농도를 생성하기 위해 100 % 에탄올에 커큐민과 타목시펜을 녹인다. unsupplement에서 메트포르민과 아스피린을 녹여ED EMEM은 각각 500 mM의 15 mm의 재고 농도를 생성합니다.
- 용량 반응을 설정합니다.
- 96 시간은 투여 량 반응 곡선을 생성하기위한 다양한 농도에서 세 개의 항 - 증식 치료제 (타목시펜, 커큐민 및 메트포르민) 및 선택적 약물 (아스피린)과 MMT 세포 치료. 처음 게시 된 보고서 1,11-16 기반으로 농도의 범위에서 다음 발표보다 농도가 크거나 작은 모든 약물을 관리 할 수 있습니다.
주 : 투여 량 반응은 원하는 결과를 생성하기 위해 필요한 약물의 최소 농도를 결정한다. 여기서 원하는 결과는 제어에 비해 세포 증식의 감소이다.- 타목시펜과 커큐민의 경우, 0.054 mM의 (1 μL), 0.108 mM의 (2 μL), 0.162 mM의 (3 μL)과 0.216 mM의 (4 μL)의 농도 (및 해당 볼륨)를 사용합니다.
- 메트포민, 2 mM의 농도 (및 해당 볼륨) (2 μl를 사용), 4 mM의 (4 μL), 6 mM의 (6 μL), 8 mM의 (8 μL) 및 10 mM의 (10 μL).
- 아스피린의 경우, 0.030 mM의 (1 μL), 0.060 mM의 (2 μL), 0.099 mM의 (3.3 μL), 0.150 mM의 (5 μL), 및 0.216 mM의 (6.7 μL)의 농도 (및 해당 볼륨)를 사용합니다.
- 3.6 × 106 세포 / ㎠의 농도로 24 웰 플레이트 상에 10cm 접시에서 MMT 세포 분열. 두 세포 계수 방법 (2 단계)에 의해 초기 세포 농도를 결정한다. 세포의 새로운 24 웰 플레이트 "일 분할"를 호출합니다.
- 24 시간 후 세포 도금 단계 3.2.1에 기재된 농도에서, 항 - 증식 치료제, 타목시펜, 커큐민, 메트포르민 및 아스피린 각각과 MMT 세포 치료. "일 0"으로이 참조하십시오.
- 각 웰 (500) 미디어의 μL, 사용 가능한 Micropipette 멸균 마이크로 피펫 팁 새로운 팁 새로운 우물 CR을 방지하기 위해 처리 할 때마다 최대 보유 수 있듯이OSS 오염. 존재 100 % 에탄올 (용매 대조군)에서 재배 어떠한 약물 치료 (대조군) 세포의 부재하에 성장 된 세포 두 컨트롤 등의 웰을 사용한다.
- 세포 성장 및 세포는 격일 넣으면 기재된 농도로 약물을 다시 투여 96 시간 동안 (단계 1.2 참조) (까지를 4 일) 일 1 일 -. 치료 4, 현미경으로 세포를 관찰하여 카운트 단계 2.2의 방법은 (도 4 참조).
- 실험을 적어도 세 번 반복합니다.
- 실험의 길이에 걸쳐 세포 생존 및 약물 투여 량 사이의 관계를 그래프 화하여 각 약물의 최적 농도를 결정 (도 5 참조).
- 96 시간은 투여 량 반응 곡선을 생성하기위한 다양한 농도에서 세 개의 항 - 증식 치료제 (타목시펜, 커큐민 및 메트포르민) 및 선택적 약물 (아스피린)과 MMT 세포 치료. 처음 게시 된 보고서 1,11-16 기반으로 농도의 범위에서 다음 발표보다 농도가 크거나 작은 모든 약물을 관리 할 수 있습니다.
- 시간 코스를 설정합니다.
- 시간 기간을 변화시키는 고정 농도 세 항 - 증식 치료제 (타목시펜, 커큐민과 메트포민)와 MMT 세포 치료. 최적의 농도 IDENTIF를 사용하여용량 반응 실험을 통해 IED (단계 3.2 참조).
- 0.216 mM의 타목시펜, 0.216 밀리미터 커큐민 10 밀리미터 메트포르민 : 다음과 같은 농도를 사용합니다.
주 : 약물이 원하는 최적의 결과를 생성하기 위해 타임 코스에 필요한 시간의 양을 결정한다. 여기에서, 원하는 결과는 컨트롤과 비교하여 세포 증식의 감소이다.
- 0.216 mM의 타목시펜, 0.216 밀리미터 커큐민 10 밀리미터 메트포르민 : 다음과 같은 농도를 사용합니다.
- 3.6 × 106 세포 / ㎠의 농도로 24 웰 플레이트 상에 10cm 접시에서 MMT 세포 분열. 두 세포 계수 방법 (2 단계)에 의해 초기 세포 농도를 결정한다. 세포의 새로운 24 웰 플레이트 "일 분할"를 호출합니다.
- 24 시간 후 세포 도금, 단계 3.2에서 식별 된 최적 농도에서, 항 - 증식 치료제, 타목시펜, 커큐민, 메트포르민 및 아스피린 각각과 MMT 세포 치료. "일 0"으로이 참조하십시오.
- 각뿐만 아니라, 우리가 미디어의 500 μL의 최대를 보유 할 수 있습니다멸균 마이크로 피펫 팁과 새로운 팁 새로운 잘가 교차 오염을 방지하기 위해 처리 될 때마다와 전자 마이크로 피펫.
- 존재 100 % 에탄올 (용매 대조군)에서 재배 어떠한 약물 치료 (대조군) 세포의 부재하에 성장 된 세포 두 컨트롤 등의 웰을 사용한다.
- 시간 기간을 변화시키는 고정 농도 세 항 - 증식 치료제 (타목시펜, 커큐민과 메트포민)와 MMT 세포 치료. 최적의 농도 IDENTIF를 사용하여용량 반응 실험을 통해 IED (단계 3.2 참조).
- 세포 성장과 세포가 매일 공급 될 때 선택된 농도로 약물을 다시 관리 (4 일까지) 96 시간 동안 (단계 1.2 참조). 일 1 일 - 처리 4, 현미경으로 세포를 관찰하고 단계 2.2 (도 4 참조) 방법을 사용하여 계산.
- 실험을 적어도 세 번 반복합니다.
- 선택된 농도에서 세포 생존 및 약물 치료의 길이 (시간)의 관계를 그래프 화하여 각 약물 MMT 세포의 최적의 노출 시간을 결정 (도 6 참조).
4. 실험실 모듈
주 : 다음 5 일이며랩 모듈을 포함한다.도 7에 대한 랩 일정 스케줄이 오일 내에 수반 것의 흐름도이다. 이 작업은 5 일 완료되기 위해서는 시간 경과 또는 투여 량 반응 곡선 중 하나가 생성된다. 양방의 커브를 생성 할 수있는 충분한 시간이 아니다. 용량 반응 실험에 대하여 설명한다. 시간 경과 실험을 용이하게 교환 될 수있다
- 그룹으로 분할 급 : 한 군은 투여 량 반응 및 제안 된 투여 량 반응 농도의 중간 농도를 선택하는 다른 시간 코스를 설정할 수있다.
- 적절한 농도에서 충분한 문화와 약물 주식을 유지한다. 다른 설명이없는 한, BSC에서 모든 작업을 수행합니다.
- 1 일
- 직접 학생들은 미디어를 확인하고 (1 단계에서와 같이) 세포를 성장합니다.
- 학생들은 10cm의 접시에 MMT 세포의 주식을 취득으로, 학생들이 세포 배양 배지를 준비하는 지시하고 hemocytome의 사용에 튜토리얼을 제공터, 디지털 현미경 (단계 2에서와 같이) 디지털 카메라 현미경 소프트웨어.
- 지금 제조자의 프로토콜을 사용하여 현미경에서 사용 목적 (예를 들면, 4X, 10X, 20X)에 대한 소프트웨어를 보정.
- 2 일
- 학생들이 (2 단계로) 총 세포 수 및 세포 생존 능력을 확인하게한다.
- 학생들은 유사한 결과가 얻어진다 확인하기 위하여 현미경 소프트웨어 및 혈구 방법을 모두 사용하여 100mm 접시에 세포를 계산하게한다.
- 다이렉트 학생 (단계 1에서와 같이) 원하는 시작 셀 도금 밀도 24 웰 플레이트에 100mm 접시에서 24 웰 플레이트 및 분할 세포를 얻었다. 이것은 일 분할 간주됩니다. 24 시간 동안 세포 배양 인큐베이터에서 24 웰 플레이트를 놓습니다.
- 3 일
- 24 웰 플레이트에 24 시간 동안 MMT 세포를 성장. 학생들은 현미경으로 세포를 관찰하고 (단계 2에서와 같이) 현미경 소프트웨어를 사용하여 계산하게한다.
- 학생 / 테를 줘암 치료 약물 주식의 샘플입니다. 그들이 준비하고 (3 단계)을 원래의 원액을 희석 있습니다. 투여 량 반응 곡선을 확립 그들의 세포에 약물의 다양한 농도를 추가한다. 이 날은 0이라고합니다.
- 48 시간의 최대의 의약품과 세포 (단계 1.2)을 품어.
- 4 일
- 학생들은 24 시간 이후 처리 된 세포를 관찰하게한다. 이는 1 일입니다.
- 각 웰 사용하여 현미경 소프트웨어를 계산합니다. 각 레코드의 사진 잘되도록 카운팅 (단계 2에서와 같이) 외부 랩 수행 될 수있다.
- 또 다른 24 시간 동안 약물과 세포 (단계 1.2)을 품어.
참고 : 강사 추가 자습서 및 데이터 분석 및 그래픽 표현의 리뷰를 제공합니다. 학생들은 데이터 수집의 다음 날을위한 그림, 그래프, 통계 분석을 만들 수 배웁니다.
- 5 일
- 48 시간, 2 일 후 세포를 학생들 처리했다.
- 각각의 카운트잘 현미경 소프트웨어를 사용하여. 각 레코드의 사진 잘되도록 카운팅 (단계 2에서와 같이) 외부 랩 수행 될 수있다.
- 수확하고 (단계 2에서와 같이)을 효과적으로 현미경 소프트웨어 방식을 사용하는 학생의 능력을 확인하는 수단으로서 혈구 전통적인 방법에 의해 카운트하는 세포를 모은다.
참고 : 따라서, 데이터를 수집하고 결론을 도출하거나 가설을 조정한다.
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Representative Results
MMT 세포 성장 및 계수를 비교하는 방법.
마우스 유방 종양 세포가 성공적으로 (도 1)과 Motic 소프트웨어, 현미경 용 디지털 카메라 관련된 소프트웨어 프로그램을 사용하여 개발 된 신규 한 셀 카운팅 방법을 특징으로 성장 하였다. 이 새로운 셀 카운팅 방법은 혈구 (도 2)을 이용하는 전통적인 계산 방법에 비교하고, 세포 수 (표 1)을 결정 똑같이 정확한 것으로 나타났다. 인해 상이한 성장 조건 또는 세포 유형으로 세포 수에 어떤 효과를 제어하기 위해, 두 셀 카운팅 방법 간의 비교는 항 증식 제의 존재 및 부재와 다른 세포주, 뉴런 모델 PC12 (17)을 실시 하였다.
도 3은 defin의 중첩 격자를 사용하여이 방법으로 세포를 계수 영역의 묘사를 도시에드 치수. 그리드는 시야 (FOV) 위에 배치되고, 녹색 프레임은 그리드 (즉 동안 9x5 사각형)의 지정된 길이 및 폭에인가된다. 세포는 녹색 프레임 내에서 카운트 및 프로토콜에서 설명한 바와 같이 셀의 개수가 추정된다.
MMT 세포 치료 : 항 증식 제제로 MMT 셀의 용량 응답을 결정.
용량 반응 실험 (도 4) 각각의 항 - 증식 제에 대해 실시 하였다. 이 실험 데이터를 지속적으로 수집 된 동안, 검토 및 프로토콜에 대한 개정 가능성이 보증 것을 알아보기 위해 분석했다. 실험은 유사한 결과를 생성하는 각각의 연구로, 세 번 수행 하였다. 모든 세포가 죽은 때까지 실험을 계속 하였다 또는 약물의 효과는 plateaued했다. 결과의 디지털 현미경은 그림 4에 제시하고, 그 결과를 그래픽으로 분석 제시도 5. 유효 농도 범위는도 5의 X 축과 프로토콜 부분에,도 4의 범례에보고된다.
타목시펜의 최저 농도 0.054 mm 크기, 미처리 세포 (도 4a)와 비교하여 대략 83 % 세포 성장의 강력한 저해가 있었다. 세포 생존율은 타목시펜의 농도를 증가 (도 5a)로 지속적으로 감소. 타목시펜의 최적 투여 량은 48 시간 완전한 세포사 그 농도 (도 4a)에서 발생하여 후 0.216 mm로 측정되었다. 흥미롭게도, 세포 증식에서 이러한 감소는 체외 시스템 모델을 강조 문학 (18, 19)을 기준으로 예상 할 수 있지만, 항상 완전히 생체 이벤트에 표시하지 않는 한, 타목시펜에 휴대 저항의 징후를 공개하지 않습니다. 또한, 경우에 가장 낮은 트레과 대조각각 세포 분열을 중지 더 효과적 커큐민 (그림 4B 및 5A)과 메트포르민 (그림 4C 및도 5b), 타목시펜의 가장 낮은 농도는 9 %와 50 %의 atment 농도.
커큐민은 또한 세포 분열의 억제에 대한 농도 의존성 효과를 나타내었다. 증가하는 농도가 세포 생존 능력 (도 4d 및도 5a)에서 유의 한 감소가 있었다. 커큐민의 최적 투여 량은 0.216 mM의 때문에 48 시간 후, 타목시펜 (tamoxifen)과 같은, 그 농도에서 완전한 세포 사멸이 있었다로 측정되었다.
메트포르민 치료는 낮은 농도에서 33 % 감소로 이어지는, MMT의 세포 생존율에 적어도 극적인 감소를 수득 하였다. 증가 메트포르민 농도 세포 생존에 수반 감소 (도 4c 및도 5b)을 관찰 하였다. 메트포민의 최적 투여 량은 최대 농도 (1 테스트로 측정되었다0 mm)이다. 타목시펜과 커큐민, 모두 통상적 화학 요법 제로서 사용에 비해, 메트포르민은 세포주기 억제 30-40 % 감소 효과적이었다. 흥미롭게도, 세포 분열에 메트포르민의 효과가 아스피린의 투여 (도 4d 및도 5a), 세포 성장 억제없이 명확하게 식별 메커니즘 살리실산 약물에 의해 얻어진 결과와 일치했다.
MMT 세포 치료 : 항 증식 제제로 MMT 세포 반응의 시간 코스를 결정.
투여 약물의 유효량이 노출 시간에 의해 영향을받을 수 있기 때문에 시간 과정 연구는 또한 각 항 - 증식 제 행했다. 세포 생존 능력에 대한 분석이 모듈로서, 먼저 셀 (배가 시간) 따라서 세포가 선택 될 수 약물에 노출되는 시간의 길이에 대한 논리 윈도우를 분할 얼마나 빨리 식별하기 위해 중요하다. 이 MMT 셀 배가 시간이되는 것이 필수적이며초기에는 세포를 특성화 확인. 이 실험을 통해, 데이터는 지속적으로 수집 검토 및 프로토콜에 대한 개정 가능성이 보증 것을 알아보기 위해 분석 하였다. 실험은 유사한 결과를 생성하는 각각의 연구로, 세 번 수행 하였다. 모든 세포가 죽은 때까지 실험을 계속 하였다 또는 효과가 plateaued했다.
시간 과정 연구 각 항 증식 성 약물의 최적 농도 MMT 세포의 치료는 것으로 나타났다 (0.216 밀리미터 타목시펜, 커큐민 0.216 mm의 메트포민 10 mM)을 96 시간 동안 완전한 세포 사멸을 초래하거나 약물의 효과 오프 레벨링 ( 그림 6). 아스피린, "선택적"약물, 우리의 투여 량 반응 연구에서 세포 생존에 영향을 미치지 않았지만 사소한 영향이었고, 따라서 시간 과정 연구에 포함되지 않았다.
그림 1. MMT 세포. 수정 이글스 최소 필수 중간 (EMEM) .100X, 규모 = 0.2 mm에서 3.6 × 10 6 세포 / ㎠로 성장 "건강한"치료 마우스 유선 종양 (MMT) 세포의 디지털 현미경은로 표시 흰색 막대. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2. 혈구 그리드. 혈구 그리드의 현미경 사진, 100 배. 원 (FOV)에 도시 전체 그리드 섹션. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
세틸 / ftp_upload / 52528 / 52528fig3.jpg "/>
도 3. Motic 소프트웨어 카운팅 영역을 지정. 현미경을 통해 본 Motic 소프트웨어와 함께 설립 MMT 세포를 계산하기위한 그리드 시야에 오버레이 및 정의 된 영역의 이미지. 100X는 규모 = 0.2 mm, 흰색 막대로 표시. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
항 - 증식 제에 MMT 셀도 4 용량 반응. 96 시간 동안 다양한 농도에서 항 - 증식 제의 존재하에 성장 MMT 셀 디지털 현미경 사진. 타목시펜 (A1) 0.054 mM의 (A2) 0.108 mM의 (A3) 0.162 mM의 (A4) 0.216 mM의; 커큐민 (B1) 0.054 mM의 (B2) 0.108 mM의 (B3) 0.162 mM의 (B4) 0.216 mM의; 메트포민 : (C) 2 mM의 (C2) 4 mM의 (C3) 6 mM의 (C4) 8 mM의 (C5) 10 mM의; 아스피린 (D1) 0.030 mM의 (D2) 0.060 mM의 (D3) 0.099 mM의 (D4) 0.150 mM의 (D5) 0.216 mM의; 에탄올 (100 %)과 비 처리는 모두 컨트롤입니다. 100X, 규모 0.1 mm, 그리드 내에서 각 사각형을 구성하는 파란색 선으로 표시. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
항 - 증식 제에 MMT 세포의 투여 량 반응 실험도 5 그래픽 표시. 항 - 증식 제제 MMT 세포 생존 능력에 대한 (A) 타목시펜, 커큐민, 아스피린, 및 (B) 메트포르민의 농도를 증가시키는 효과. 결과세포 치료 96 시간 동안 계속되지만, 치료 48 시간 후 제어 백분율로 재. N = 3, STD가 표시됩니다.
항 증식 에이전트 MMT 세포 반응의 시간 과정 분석 그림 6. 그래픽 표현입니다. (96)를 통해 MMT의 세포 생존에 타목시펜의 효과 (0.216mM), 커큐민 (0.216mM) 및 메트포르민 (10 mM의)의 시간 코스 연구 시간. 결과는 48 시간의 처리 후 제어의 백분율로 표현된다. 대표적인 실험의 결과, N = 1이 여기에있는 바와 같다.
5 일간의 실험 모듈 7. 흐름도도.
| 세포의 종류 | 약물 Administere디 | 실험의 날 | 약물의 농도 | Motic와 세포 수 | 혈구와 세포 수 |
| MMT | 처리되지 않은 | 2 일 | - | 7.8x10 104 세포 / cm 2 | 8.0x10 104 세포 / cm 2 |
| MMT | 에탄올 | 2 일 | 10 mM의 | 7.1x10 104 세포 / cm 2 | 7.2x10 104 세포 / cm 2 |
| MMT | 타목시펜 | 2 일 | 0.216 MM | 0 세포 / cm 2 | 0 세포 / cm 2 |
| MMT | 타목시펜 | 2 일 | 0.054 mM의 | 1.3 × 104 세포 / ㎠ | 1.5 × 104 세포 / ㎠ |
| MMT | 커큐민 | 2 일 | 0.054 mM의 | 1.9 4 CELL 학생 / ㎠ | 2.0x10 104 세포 / cm 2 |
| MMT | 커큐민 | 2 일 | 0.216 mM의 | 0 세포 / cm 2 | 0 세포 / cm 2 |
| MMT | 메트포민 | 2 일 | 2 mM의 | 5.1x10 104 세포 / cm 2 | 5.2x10 104 세포 / cm 2 |
| MMT | 메트포민 | 2 일 | 6 mM의 | 3.4x10 104 세포 / cm 2 | 3.5x10 104 세포 / cm 2 |
| MMT | 아스피린 | 2 일 | 0.099 mM의 | 2.8x10 104 세포 / cm 2 | 3.0x10 104 세포 / cm 2 |
| PC12 | 처리되지 않은 | 스플릿 | - | 웰당 2.5 104 세포 / cm 2 | 2.1x10 104 세포 / cm 2 |
표 1. Motic 소프트웨어 나 혈구 방법 중 하나를 사용하여 혈구와 방법을 계산 Motic 소프트웨어입니다. MMT 세포의 세포 계산 결과의 비교. 모두 미처리 및 처리 된 세포를 계수뿐만 아니라 제어와 같은 다른 세포주, PC12, 하였다.
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Discussion
실험실 모듈은 동물 세포 배양의 고급 기술을 통해 세포 생물학의 다양한 주제를 가르 칠 목적으로 그 표시됩니다. 모듈은 인간 유방암 모델 세포 복제에 대한 항 증식 화학 물질의 수의 효과를 분석함으로써이를 달성한다. 주요 분석은 세포 계수의 기본 기술에 의존하고 현미경 소프트웨어를 사용하여 세포를 계산하는 새로운 방법을 소개합니다. 모듈을 더 포함하는 활동은 악기와 가장 생물학 프로그램 가능한 장비로 수행 될 수있다. 모듈은, 저렴하고 용이하게 얻을 아르 용품으로 5 일간 일정으로 구현 될 수있다. 디지털 현미경 카메라와 현미경 소프트웨어의 특정 브랜드가 여기 (Motic 소프트웨어)를 사용하지만, 어떤 비교 카메라와 소프트웨어는 충분합니다.
랩이 모듈은 인간 유방암 모델 MMT 세포를 이용한다. 학생들은 먼저 성장하고 이들의 특성을 배운다문화에 세포. 그것은이 실험실 모듈의 성공적인 완료를 강조하는 것이 중요하다 잘 치료 MMT 세포가 컨트롤 역할을 특히 때문에, 건강한 MMT 세포의 모양과 동작에 익숙해 수 (학생 일명) 연구자가 필요합니다. 적절한 투여 량 반응 시간 코스 데이터가 생성 될 경우 세포 성장 패턴 따라서 철저한 특성, 배가 시간 및 MMT 세포의 일반적인 형태는 필수적이다.
일단 특징 MMT 세포이어서 세포 분열, 세포주기 조절, 세포 시그널링 및 암의 주제를 가르치는 방법 등 다양한 항 - 증식 제제에 대한 반응에 대해 시험 하였다. 세포 생존율은 이들 세포에 약물의 효과를 이해하기 위해 사용된다. 현미경에 장착 된 디지털 카메라와 연관된 소프트웨어를 이용하여 세포를 계수하는 신규 한 방법은, 수행 및 정확도를 확인하기 위해 전통적인 계산 혈구 계 절차와 비교된다. 티S의 신규 한 방법은 교시 학부 실험실에서 사용되기 때문에 특히 주목할 만하다 두 가지 장점을 제공한다. 세포 계수를위한 조직 배양 플레이트로부터 제거 될 필요가 없기 때문에 우선 짧은 시간은 메인 실험적 분석을 수행하기 위해 필요하다. 이것은 실험 변수 다수 번 및 제한된 시간주기에 대해 시험 할 수있다. 둘째, 본 방법은 학생들이 결과를 평가하고, 그 이외의 실험실 실험 전략을 세분화 할 수 있도록 실험적 치료에 세포 반응의 디지털 기록을 제공한다.
이러한 계산 방법 모두를 구현할 때주의해야 할 몇 가지 문제가 있습니다. 우선, 어느 방법으로 세포를 계수하기 전에, 세포는 생존 세포 및 사균을 구별하기 위해 트립 판 블루로 배양된다. 죽은 세포는 염료가 침투하고 가능한 세포는 밝은 흰색 반면, 진한 파란색 나타납니다. 그러나, 세포 배양 DY 경우권장 잠복기 이후 전자, 그들은 오버 염색 구별하기 힘들 것입니다. 둘째, MMT 세포는 혈구 또는 조직 배양 플레이트에 응집하고 개별적으로 계산하는 것이 어려울 수있다. 따라서, "덩어리"는 (예를 들어, 10 셀 / 덩어리) 그리드상의 모든 존재 덩어리이어서 카운트 중에 그 번호 곱한 세포의 소정 수를 포함하도록 지정된다. 마지막으로, MMT 세포들은 성장되는 요리의 표면에 부착. 그것은 세포를 제거 할 때 판에 직접 피펫의 끝을 터치 세포 덩어리를 분쇄하고 가능한 한 판에서 많은 세포를 제거하는 힘을 적용 할 필요가있다. 결과적으로 그것은 전통적인 혈구 법을 이용하는 경우 정확한 카운트를 획득하기 위해 여러 가지 시도를 취의 나.
세포가 잘 특징과 계산 방법은 검증으로, 서로 다른 두 가지 실험을 실시하고 있습니다; 다양한 농도의 효과의 투여 량 반응 연구MMT의 세포 분열과 시간 경과 실험에서 항 증식 성 약물의 이러한 약물에 대한 노출의 최적의 시간을 해명. 시행 착오가 필요하고, 일차 문헌 애플리케이션이 성공적으로 실험을 위해 요구되는 이러한 매우 유익 실험이다. 예를 들어, 이러한 항 증식 제제로 MMT 세포의 투여 량 반응을 해명에 초기 시도 100 % 세포 사멸 약물 투여 24 시간 이내에 있었다로서 시험 농도가 너무 높은 것으로 확인된다. 문학의 확장 된 리뷰 치료 농도의 수정 범위로했다. 이것은 효과적으로 차 문학 기사, 문헌 데이터베이스를 사용 읽고, 분석하고 비판하는 방법을 학생들에게 가르치고 그 기술은 과학적인 과정에 필수적인 방법을 강조한다.
투여 량 반응 연구 결과 타목시펜 테스트 모든 농도에서 강한 항 - 증식 효과를 나타냄을 보여 주었다. 타목시펜, 항 mitotiC 약물은 일반적으로 호르몬에 민감한 환자의 18 ~ 20 폐경기에 에스트로겐에 민감한 암에 대한 항 에스트로겐 요법으로 특별히 사용된다. 약물은 현재 유방암 치료에 사용된다. 타목시펜은 세포 내 에스트로겐 수용체의 에스트로겐과 경쟁과 결합 할 때, 다운 사이클린 D 및 B, 세포주기의 두 가지 중요한 레귤레이터의 발현을 조절한다. 활성에서 얻어진 결과는 타목시펜 성공적 에스트로겐 수용체에 결합하고 관찰 감소 세포 증식의 결과 세포주기를 통해 세포의 진행을 억제하는 것이 제안한다. 문헌에 기초하여 예상되는 바와 같이 흥미롭게도, 관리 타목시펜의 모든 농도에서 MMT 세포 전파 속도의 감소 (예 19 참조), 타목시펜에 세포 저항의 징후를 공개하지 않습니다. 이것은 실험을 행한 시험 관내 조건이없는 완전히 난 모델을 수행하는 것이 좋은 일깨우는N 상황을 생체 내.
MMT 셀 커큐민 치료는 세포 생존율의 감소를 초래. 커큐민은 세포 성장 억제제 등 12,16 심황 뿌리 작용에서 유래하는 화합물이다. 그것은 아래로 조절 NF-카파 B 경로와 오르니 틴 디카 르 복실 라 아제 (ODC) 활동을하여 작동합니다. NF-카파 B는 세포 사멸을 억제하는 단백질을 코드 항 세포 사멸 유전자 등 TRAF1과 TRAF2의 전사를 조절하는 단백질 복합체이다. ODC는 폴리아민, 향상된 세포 성장 선도 영양 높게 소스와 암 세포를 제공하는 단백질의 생성을 촉매하는 효소이다. 약물은 유방암 치료제로 현재 사용 중입니다. 커큐민의 항 증식 효과는 명확하게 세포 분열에 NF-카파 B와 오르니 틴 디카 르 복실 라 아제를 포함하는 세포 신호 전달 경로의 조절을했다 아래로 효과를 보여줍니다.
감소 된 세포 생존도 마찬가지로 자원 처리 메트포르민으로 관찰NT. 게시 된 보고서는 메트포르민과 유방암 (15)의 낮은 발생률을 환자 사이의 상관 관계를 제안하기 때문에 메트포민, 일반적으로 II 당뇨병 환자를 입력 투여 약물이 선택되었다. 이것은 에이전트가 C-MYC 유전자를 변조 것으로 생각하여 빠른 속도로 사이클을 통해 진행하는 세포를, 사이클린, 세포주기 내에서 체크 포인트 역할 분자 사이클린 D. 상향 조절 (up-regulation)의 활성 아래는-조절있게된다 증가 세포 분열과 성장의 결과. C-MYC 유전자의 조절도 사이클린 D의 하향 조절 및 세포 분열의 감소에 이르게하는 방법 MMT 세포에 메트포르민 치료 효과를 나타낸다. 메트포르민 데이터는 더 약이 당뇨병 - 다른 비정상적인 생리 이벤트에 적합한 행동의 메커니즘을 가질 수있다이 경우에는 하나의 조건 -을 위해 설계 방법을 예시한다. 또한, 타목시펜, 커큐민과 메트포민 비록 모두 비정상적인 세포 prolif을 지연 것을 강조하는 것이 중요다양한 메커니즘을 통해 eration 각 성공적으로 세포 집단을 감소 시험 관내 세포 분열을 방해.
이 모듈은 또한 다른 약물의 개방형 질문, 한방 치료를 허용, 또는 에이전트는 테스트 할 수 있습니다. 아스피린, 오버 - 더 - 카운터 진통제, 해열, 그리고 가벼운 통증을 완화하고 열을 줄이기 위해 사용되는 항 염증 약물이 모듈에서 선택되었다. 염증을 감소시키는 아스피린의 능력은 이들 영양 새로운 혈관의 발달을 늦추고 그들의 성장 11,13,14 연료 줄기 세포를 방해함으로써 종양 성장을 억제 할 수있다. 흥미롭게도, 세포를 MMT하는 아스피린의 투여는 세포 생존에 약간의 감소를 초래했다. 많은 상관 관계 연구가 원인 관계 대 상호의 좋은 예를 제공, 13, 14을보고 있지만, 약간은 암 예방 및 치료에 아스피린의 역할에 대한 알려져있다.
시간연구 과정 최적화 용량으로 투여 될 때, 항 증식 성 약물의 초기 노출 4 일 이내에 세포 분열을 간섭에 매우 효과적인 것으로 밝혀. 이 연구는 이러한 실험을위한 실험 전략을 고안 할 때 그들이 MMT 세포의 성장 특성에 대해 배운 것을 사용하는 학생들을위한 기회를 제공합니다. 사실, 충분히 시간 MMT 세포의 일반적인 세포 형태를 배로 세포 성장 패턴을 특징 짓는 것은 모두 정확한 용량 반응 시간 코스 데이터에 필수적이다.
두 투여 량 반응 및 시간 과정 연구는 약물 농도를 각각 노출 시간, 생물학적 시스템 내의 약물이 갖는 효과 사이의 관계를 결정한다. 이것은, 메시지 중심의 연구 활동을 수행하는 동안 생화학에서 분자간 상호 작용 등의 기초 개념에 대해 생각하는 학생들을 얻을 수있는 좋은 방법입니다. 그것은 주목할 가치가 많은 BI 이후ology 전공이 의대에 참석할 계획이 실험실 모듈은 의과 대학의 요구 사항을 21에서 새로 제정 변화에 잘 정렬합니다.
랩이 모듈은 한 바와 같이 정확하게 구현 될 수 있거나, 또는 당해 템플릿으로서 역할을 할 수있다. 변형 호스트는 이러한 성장 배지에서의 항 증식 제의 선택, 세포 유형 또는 영양 변형 예로서,이 작업에 혼입 될 수있다. 언제 까지나 가설은 세포 또는 일반 생물학의 기초 및 고급 개념을 테스트하는 개발로,이 모듈의 순열이 많다. 에 관계없이 순열의,이 활동의 구현은 자연스럽게 실험실 기술의 큰 배열을 배우고 장비 및 계측의 다양한에 익숙해 학생을 지시합니다.
요약하면, 여기에 설명 된 실험실 모듈은 학생들이 완전히 과학의 과정에 참여 취득하는 자신의 능력을 개발, 분석 및 그래픽에 repr 수 있습니다데이터를 ESENT, 자신의 시간 관리 및 협업 기술을 연마. 이 모듈은 개방형 질문을 촉진하기위한 다양한 코스 일정과 기술 수준에 쉽게 적응할 수 있습니다. 그것은이 논문의 첫 두 저자는 분명히이 실험실 모듈은 그 인구에 적합 함을 입증, 학부 생물학 전공 있음을 주목해야한다.
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Disclosures
저자는 Motic로부터 금융 또는 유사한 지원을받지.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tissue Culture Hood | ESCO Labculture Reliant | Class II Type A2 Biological Safety Cabinet | |
| Waterjactor CO2 Incubator | CEDCO | Model 1510 | |
| Bright-line Hemocytometer | American Optical | with two separate grids | |
| Motic Images Plus | Mac OSX Verison 2.0 or higher | ||
| Gilson Pipetman | Rainin instrument co. inc | P-20D, P-200D, P-1000D | |
| CK30/CK40 Culture Microscope | Olympus | 4 objective inverted light microscope with camera | |
| 200 μl Pipet tips | MidSci | 40200C | |
| 1,000 μl Pipet tips | MidSci | AVR4 | |
| 10 ml Seriological Pipets | TPP | TP94010 | |
| 24 well plates | CoStar- Tissue Culture Cluster | 3524 | 24 wells, 16 mm well diameter, radiation sterilized |
| Trypan Blue Solution 0.4% | Sigma | T8154 | 100 ml, cell culture tested non-haz |
| Bright-line Hemacytometer replacement coverslip, non-haz | Sigma | Z375357 | |
| Mouse Mammary Tumor(MMT) cells | ATCC | CCL-51 | |
| Eagle Minimum Essentail Medium (EMEM) | ATCC | 30-2003 | 500 ml |
| Fetal Bovine Serum | Sigma | F0926 | 500 ml |
| Metformin Hydrochloride | Sigma | PHR1084 | 500 mg |
| Tamoxifen | Sigma | T5648 | white or white-yellow powder |
| Curmumin | Sigma | C1386 | yellow-orange powder |
| Aspirin | Sigma | A2093 | meets USP testing specifications |
References
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