Introduction
Ofte i lavere generell biologi kurs, blir temaene cellesyklus regulering og kreft berørt, men ikke utforsket i detalj fordi bredden i innholdet i disse kursene gir lite tid til dybde. I tillegg er lavere biologistudenter vanligvis ikke utsatt for de avanserte teknikker forbundet med animalsk cellekultur. For å hjelpe studentene utvikle en dypere forståelse av disse begrepene, mens søknad og analysere hva de har lært, ble et laboratorium aktivitet utviklet som en modifikasjon av Walter Reed Army Institute of forskning (WRAIR) utvidet laboratorium aktivitet 1. Laboratoriet modulen bruker en trinnvis, eksperimentell strategi som omfatter vokser og karakterisere en kreftcelle-modell, utvikling og gjennomføring av celletellingsmetoder, å etablere optimal tidsforløp og doser for behandling av celler med anti-proliferative midler, og identifisering av avvikende celle-signalveier . Forsøket gir også mulighet for åpen-ended henvendelse.
De fleste av de teknikker som kreves for denne aktiviteten kan utføres på en typisk biologi-undervisning laboratorium. Aktiviteten starter med elevene karakteriserer morfologi og vekst av musen bryst tumor (MMT) cellelinje, en modell for menneskelig brystkreft to. Brystkreft ble valgt som modell kreft på grunn av sin utbredelse i befolkningen, sin kjennskap til college-alderen studenter, og den utbredte data tilgjengelig. MMT-cellelinjen ble spesifikt valgt fordi den er lett oppnåelig, godt karakterisert, har en kort doblingstid og er lett å vokse. I tillegg er MMT-celler er østrogenavhengig, som er forenlig med de fleste kvinnelige brystkreft. Studenter deretter identifisere avvikende celle-signalveier i MMT cellene ved å behandle cellene med cellegift som virkningsmekanismen er vel established.The konsentrasjon av narkotika og lengden av behandlingene er variert slik at elevenefor å evaluere effekten av disse variable på hastigheten av celledeling. Nøkkelen assay for denne aktiviteten er bestemmelse av cellenes levedyktighet, som bare krever celletelling, ved hjelp av én av to metoder. Hver metode avhenger av sterke mikros ferdigheter. Elevene bestemme cellenes levedyktighet ved anvendelse av en standard, hemocytometer fremgangsmåte og en ny fremgangsmåte og photomicroscopy foreslå. Basert på sine funn, kan de foreslå og teste endringer i aktiviteten. Studenter deretter representere sine data og tolke resultatene å avgrense hypotese og tenke ut nye eksperimentelle strategier.
Dette laboratoriet aktiviteten er egnet for freshman eller sophomore nivå studenter hovedfag i de biologiske vitenskaper. Det er kondensert til en ukes lab-modul som kan gjennomføres i en første året, generell biologi eller andre året, mobil / molekylærbiologi kurset. Ferdighetene som trengs for forsvarlig gjennomføring av aktiviteten omfatter grunnleggende aritmetikk og algebra, fortrolighet med en rekke cmalm laboratorie ferdigheter (f.eks, pipettering, løsning making, steril teknikk), dataanalyse, enkel lysmikroskopi og tidsstyring, sammen med instruktør kunnskap om cellekultur og regnearkprogrammer. Reagenser som kreves inkluderer en dyrecellelinje modell for kreft (for eksempel musebrysttumorceller, MMT 2), kjemoterapi (for eksempel tamoxifen, curcumin, metformin, og aspirin), trypanblått og celledyrkningsmedier (f.eks Eagles Minimum Essential Medium ; EMEM) med riktig kosttilskudd (f.eks donor hest og fosterets storfe serum). Virkemidler som trengs inkluderer en omvendt lysmikroskop med digitalkamera vedlegg, datamaskin, 100 mm og 24 brønners vevskulturplater, CO 2 inkubator (eller tilsvarende), biosikkerhet kabinett (BSC, klasse II), hemocytometer og digital mikros programvare.
Det finnes gode eksempler på konkrete lab aktiviteter som er avhengige av dyr cellekultur til Teach lavere grads studenter om begreper i cellebiologi tre. Men mange trenger forsyninger eller teknikker som ikke er lett tilgjengelig (for eksempel radioaktive isotoper, levende dyr vev, avansert bildebehandling utstyr 1,4,5), beskriver protokoller som er ganske avansert (f.eks egnet for en 400-nivå kurs 6), eller krever multi-uke eller semester lange prosjekter 6,7. Laboratoriet aktivitet er beskrevet her er enkel og kan gjennomføres i en enkelt uke med vanlig laboratorieutstyr.
Oppsummert denne lab modulen effektivt introduserer eller forsterker begrepene cellesyklus, cellulære signalveier og kreft samtidig som du lærer grunnleggende og avanserte lab ferdigheter, eksperimentell dataanalyse, metode for dyr cellekultur og den vitenskapelige prosessen. Laboratoriet modulen er enkel og økonomisk tilgjengelig og gir både fleksibilitet og mulighet for åpent spørsmål. Aktiviteten oppfordrer student kreativitetved å tilveiebringe en mal eksperimentell strategi som fungerer som en veiledning, men ikke en oppskrift. Viktigst, aktivitetstilfredsstiller alle lærings domener av Blooms taksonomi 8 som det krever å huske, forstå, bruke, analysere, vurdere og skape ved å engasjere elevene i en prosess som trekker dem ut av læreboken og inn i verden av vitenskapelig forskning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Merknader: Conduct alt arbeid med celler og cellekultur reagenser i en klasse II biosikkerhet kabinett (BSC) 9. MMT celler er klassifisert som biosikkerhetsnivå jeg, som de utgjør lav til moderat biologisk risiko. Påfør riktig rengjøring og dekontaminering prosedyrer for å BSC mellom bruker (for eksempel ultrafiolett lys, 70% etanol tørke ned).
1. Grow MMT celler
- Dyrke celler i 10 cm vevskulturskåler inneholdende 10 ml næringsrike media som består av Eagles Minimum Essential Medium (EMEM) supplert med 10% føtalt bovint serum (FBS), 2 mM glutamin og 1% fungal / Antibiotikum (10 enheter Penicillin , 100 ug streptomycin, 0,25 ug amfotericin B). Dyrke celler i en fuktet 5% CO2 kammer ved 37 ° C. Plate-celler ved en tetthet på 3,6 x 10 celler / 6 cm 2 (se telle celler i trinn 2).
- Erstatte halvparten av cellekulturmedier med friske media hver 48 timer unless annet er angitt. Sjekk celle levedyktighet og morfologi ved undersøkelse med en omvendt fase kontrast lys mikroskop.
- Oppmerksom og karakter celler for størrelse, struktur, form, organisasjon og estimert tall under 100 - 200X forstørrelse. Ved denne tetthet, bør cellene vises i ett plan, ikke klumpet seg oppå hverandre og i umiddelbar nærhet. Hver celle består av en tykk, sfærisk kjerne med tynne, lange, grenlignende utvidelser utvide fra det som kommer til et punkt (se figur 1).
- Dele cellene når de når en celletetthet på 7,2 x 10 6 celler / cm2. Cellene vise en dobling rate på 1,8 x 10 6 celler / cm 2 per 24 timer. Utpeke celler Passage X (Px) for å betegne antall ganger de har blitt splittet.
- At generasjon 3 (dvs. etter tre passasjer, P3), høste, teller, og plate cellene på en 24 brønners vevskulturplate med en tetthet på 3,6 x 10 6 2.
- Vis celler hver dag og rekord digitale photomicrographs. Oppmerksom på og beskrive cellemorfologi (dvs. størrelse, form, lys reflekterende egenskaper). Bestem celle dobling tid ved å telle celler regelmessig og om medgått tid til celle nummer.
2. Tell MMT Cells
Merk: Telle celler for å finne ut om cellene må subkultiveres, for å sette opp for et eksperiment eller å bestemme celle levedyktighet. Det er to metodene som presenteres her.
- Anvendelse av et hemocytometer, til en standardteknikk telle celler.
- Få tak i en lys-linje hemocytometer, en 0,2% løsning av trypan blått fargestoff, et sammensatt lysmikroskop, sterile reagensrør, pipetter og en manuell celleteller.
- Under BSC, bruk en 10 ml pipette for å fjerne celler fra en 10 cm vevskulturskål. Dersom cellene blir dyrket på en 24 brønners plate bruker en 1 ml pipette eller 1000 mL mikropipette for å fjerne media.
- Plasser den resulterende cellesuspensjonen i et 15 ml sterilt rør (eller 1 ml mikro- sentrifugerør eller et annet lite volum tube). Ellers lar cellene i den opprinnelige vevskulturplaten / brønn.
- Under BSC, kombinere 10 ul av cellesuspensjonen med 10 ul av trypanblått-oppløsning (1: 1 forhold) i en ikke-steril mikro- sentrifuge eller et annet lite volum rør.
Merk: trypanblått er en viktig flekk som ikke absorberes av sunne levedyktige celler. Når cellene er skadet eller død, trypanblått kan gå inn i cellen slik at døde celler som skal telles (aka dye eksklusjon metoden). Derfor under et mikroskop, døde celler vises mørk lilla, mens levedyktige celler er en lys og lys i fargen. - Inkuberved RT i 5 min.
- Plasser dekkglass på hemocytometer. Påfør 10 mL av trypanblått-cellesuspensjon blandingen inn i sporet. Viser hemocytometer 100 - 200X forstørrelse. En fire-hjørnet gitter er åpenbart (se figur 2).
- Tell antall levedyktige celler (ufargede) versus totale celler i hvert gitterområdet. Gjennomsnitt de fire nett og multipliser med 1 x 10 4 for å få celler / ml.
- Ekstrapolere det totale antall celler pr tallerken (eller celler / cm2). Bruke dette nummeret til enten å bestemme den korrekte volum av cellesuspensjonen skal brukes til å pode en ny vevskulturskål ved den ønskede tetthet på 3,6 x 10 6 celler / cm 2 eller bestemme antallet levedyktige celler på plate eller i brønnen.
Merk: For ytterligere veiledning om bruk av en hemocytometer, se 10.
- Ekstrapolere det totale antall celler pr tallerken (eller celler / cm2). Bruke dette nummeret til enten å bestemme den korrekte volum av cellesuspensjonen skal brukes til å pode en ny vevskulturskål ved den ønskede tetthet på 3,6 x 10 6 celler / cm 2 eller bestemme antallet levedyktige celler på plate eller i brønnen.
- Bruke programvare og et digitalt kamera til å telle levende celler.
- Skaff en digital kamera, dens tilhørende programvare, en 0,4% løsning av trypan blått fargestoff, en forbindelse lysmikroskop, sterile reagensrør, pipetter og en datamaskin.
Merk: En Moticam 2000 digitalkamera med tilhørende Motic Programvaren er ansatt her. Noen sammenlignbar kamera og programvare bør være tilstrekkelig. Sørg for at det digitale kameraet programvaren har blitt kalibrert på forhånd (i henhold til produsentens protokoll). - Under BSC, bruk en 1 ml pipette eller 1000 mL mikropipette å fjerne medier fra MMT celler vokser i en 24 godt vevskulturskål. Vask de adherente celler ved forsiktig påføring av en liten mengde (ca. 500 ul) av un-supplert (dvs. EMEM uten tilskudd) friskt medium til platen og deretter fjerne den. Anvende 10 ul av 0,2% trypanblått (laget ved fortynning 1: 1 med un-supplert EMEM) direkte til brønnen.
- Inkuber platen ved RT i 5 min.
- Vis platen under mikroskopet ved 100 - 200X forstørrelse wed et digitalt kamera festet. Plate kan vaskes med usupplert media om farging med 2% trypanblått er for mørkt.
- Åpne programvaren på datamaskinen en nd kontrollere at programvaren er kalibrert til målet brukes via fanen innstillinger. Et bilde av FOV skal vises.
- Velg Grid fra kategorien Mål. Et rutenett med firkanter omtrent 0,005 cm i bredden vises. Velg Grid informasjon til å bekrefte området for hver rute.
- Velg et bestemt område i nettet for å telle celler (dvs. 5 ruter x 9 firkanter). Velg rektangel fra kategorien Mål. Klikk på hjørnet av en firkant og dra markøren til å omfatte kvadratene av valget.
Merk: En nyanse av grønt vil dekke rutene valg og en hvit boks vil vises i hjørnet som gir bredde, høyde, areal og omkrets av den delen av rutenettet valgt (se figur 3). - Tell antall viable celler i bestemte området. Gjør det samme for to andre steder i samme brønn eller plate ved å bevege platen under mikroskopet.
- Vær sikker på at det målte området er den samme og forstørrelsen er ikke endret. Beregne gjennomsnittlig antall levedyktige celler i området. Ved hjelp av området av brønnen (for en 24-brønners plate, har man også et område på 2 cm 2, for en 100 mm skål i området, er 78,6 cm 2) ekstrapolere antallet levedyktige celler fra området avgrenset i nettet for å det totale antallet celler i brønnen (celler / cm2).
- Skaff en digital kamera, dens tilhørende programvare, en 0,4% løsning av trypan blått fargestoff, en forbindelse lysmikroskop, sterile reagensrør, pipetter og en datamaskin.
3. behandle MMT-celler med anti-proliferative midler
- Forbered løsninger av de utvalgte anti-proliferative terapeutiske midler (tamoxifen, curcumin og metformin) og valgfri narkotika, aspirin under BSC.
- Oppløs curcumin og tamoxifen i 100% etanol for å generere en lager-konsentrasjon på 27 mM. Oppløse metformin og aspirin i unsupplemented EMEM å generere en lager-konsentrasjon på 500 mM og 15 mM, respektivt.
- Etablere en doserespons.
- Unn MMT celler med de tre anti-proliferative terapeutiske midler (tamoxifen, curcumin og metformin) og valgfritt stoff (aspirin) med varierende konsentrasjoner i 96 timer for å generere en doseresponskurve. Utgangspunktet administrere alle rusmidler på en rekke konsentrasjoner basert på publiserte rapporter 1,11-16 og deretter ved konsentrasjoner større eller mindre enn det som er publisert.
Merk: En doserespons bestemmer den minimale konsentrasjon av et medikament nødvendig for å frembringe de ønskede resultater. Her det ønskede resultat er en reduksjon i celleformering som sammenlignet med kontrollen.- For tamoxifen og curcumin, bruker konsentrasjoner (og tilsvarende volum) av 0,054 mm (1 ul), 0,108 mM (2 ul), 0,162 mm (3 mL) og 0,216 mM (4 mL).
- For metformin, bruker konsentrasjoner (og tilsvarende volum) av 2 mm (2 pl), 4 mM (4 mL), 6 mM (6 mL), 8 mM (8 pl) og 10 mM (10 ul).
- For aspirin, bruker konsentrasjoner (og tilsvarende volum) av 0,030 mm (1 ul), 0,060 mM (2 ul), 0,099 mM (3,3 ul), 0,150 mM (5 ul), og 0,216 mM (6,7 ul).
- Split MMT-celler fra 10 cm plate på en 24 brønners plate i en konsentrasjon på 3,6 x 10 6 celler / cm2. Bestem initial cellekonsentrasjon av begge celletellingsmetoder (trinn 2). Kalle denne nye 24 brønners plate av celler "Day Split".
- 24 timer etter celle-plating, behandle MMT-celler med hver av de anti-proliferative terapeutiske midler, tamoxifen, curcumin, metformin og aspirin, i de konsentrasjoner som er beskrevet i trinn 3.2.1. Refererer til dette som "Day 0".
- Som hver brønn kan inneholde maksimalt 500 mL av media, bruk mikropipetter med sterile Mikropipette tips og en ny spiss hver gang en ny brønn er behandlet for å unngå crOss forurensning. Bruk to brønner som kontroller: celler dyrket i fravær av en hvilken som helst medikamentbehandling (negativ kontroll), og cellene ble dyrket i nærvær 100% etanol (løsningsmiddel kontroll).
- Grow celler og re-administrere legemidler på de beskrevne konsentrasjoner når cellene blir matet annenhver dag (se trinn 1.2) i 96 timer (inntil Dag 4) på dag 1 -. 4 av behandling, observere cellene under mikroskop og telle hjelp den metode som i trinn 2.2 (se figur 4).
- Gjenta eksperimentet minst tre ganger.
- Bestemme optimal konsentrasjon av hvert legemiddel ved grafisk fremstilling av forholdet mellom cellenes levedyktighet og medikamentdosen over lengden av forsøket (se figur 5).
- Unn MMT celler med de tre anti-proliferative terapeutiske midler (tamoxifen, curcumin og metformin) og valgfritt stoff (aspirin) med varierende konsentrasjoner i 96 timer for å generere en doseresponskurve. Utgangspunktet administrere alle rusmidler på en rekke konsentrasjoner basert på publiserte rapporter 1,11-16 og deretter ved konsentrasjoner større eller mindre enn det som er publisert.
- Etablere en Time Course.
- Unn MMT celler med de tre anti-proliferative terapeutiske midler (tamoxifen, curcumin og metformin) til en fast konsentrasjon for varierende tidsperioder. Bruk den optimale konsentrasjonen identifiseringIED gjennom doserespons eksperimenter (se trinn 3.2).
- Bruk følgende konsentrasjoner: 0,216 mm tamoxifen, 0,216 mM curcumin og 10 mM metformin.
Merk: En tidsforløps bestemmer den tid som er nødvendig for et medikament for å frembringe den optimale ønskede resultat. Her er det ønskede resultatet en reduksjon i celleproliferasjon sammenlignet med kontrollen.
- Bruk følgende konsentrasjoner: 0,216 mm tamoxifen, 0,216 mM curcumin og 10 mM metformin.
- Split MMT-celler fra 10 cm plate på en 24 brønners plate i en konsentrasjon på 3,6 x 10 6 celler / cm2. Bestem initial cellekonsentrasjon av begge celletellingsmetoder (trinn 2). Kalle denne nye 24 brønners plate av celler "Day Split".
- 24 timer etter celle-plating, behandle MMT-celler med hver av de anti-proliferative terapeutiske midler, tamoxifen, curcumin, metformin og aspirin, ved optimale konsentrasjoner som er identifisert i trinn 3.2. Refererer til dette som "Day 0".
- Som hver brønn kan inneholde maksimalt 500 mL av media, osse mikropipetter med sterile Mikropipette tips og en ny spiss hver gang en ny brønn er behandlet for å unngå smitte.
- Bruk to brønner som kontroller: celler dyrket i fravær av en hvilken som helst medikamentbehandling (negativ kontroll), og cellene ble dyrket i nærvær 100% etanol (løsningsmiddel kontroll).
- Unn MMT celler med de tre anti-proliferative terapeutiske midler (tamoxifen, curcumin og metformin) til en fast konsentrasjon for varierende tidsperioder. Bruk den optimale konsentrasjonen identifiseringIED gjennom doserespons eksperimenter (se trinn 3.2).
- Grow celler og re-administrere medikamenter på det valgte konsentrasjon når cellene blir matet annenhver dag (se trinn 1.2) for (inntil Dag 4) 96 timer. På dagene 1 - 4 av behandling, observere cellene under mikroskopet og telle ved hjelp av fremgangsmåten i trinn 2.2 (se figur 4).
- Gjenta eksperimentet minst tre ganger.
- Bestem optimal eksponeringstiden av MMT-celler for hvert legemiddel ved grafisk fremstilling av forholdet mellom cellenes levedyktighet og lengde (tid) av medikamentbehandling ved den valgte konsentrasjon (se figur 6).
4. The Lab Module
Merk: Det følgende er en 5-dagerslab plan for laboratoriemodulen. Figur 7 er et flytskjema over det som planen ville innebære innen 5 dager. For denne aktiviteten skal være ferdig i fem dager enten en gang kurs eller en doseresponskurve genereres. Det er ikke tilstrekkelig tid til å generere begge kurver. En dose-respons eksperiment er beskrevet nedenfor. En gang kurs eksperiment kan lett byttes
- Delt klassen i grupper: har en gruppe etablere en dose-respons og den andre en tidsforløpet velge en konsentrasjon i midten av den foreslåtte dose-responskonsentrasjoner.
- Opprettholde tilstrekkelig kulturer og narkotika aksjer i passende konsentrasjoner. Med mindre annet er angitt, utfører alt arbeid under BSC.
- Dag 1
- Direkte elevene å lage media og vokse celler (som i trinn 1).
- Ettersom elevene får et lager av MMT-celler på en 10 cm plate, henvise elevene for å fremstille cellekulturmedier og gir en veiledning i bruken av hemocytometer, digital mikroskopi og digitalkameraet mikroskopi programvare (som i trinn 2).
- Kalibrere programvaren til målene som brukes på mikroskop (f.eks 4X, 10X, 20X) nå bruker produsentens protokoll.
- Dag 2
- La elevene bekrefte total celle nummer og celleviabilitet (som i trinn 2).
- Elevene telle celler på 100 mm skål ved bruk av både mikroskopi og programvare hemocytometer metoder, for å bekrefte at lignende resultater blir oppnådd.
- Direkte studenter å få en 24 brønners plate og dele celler fra 100 mm fatet til 24 brønners plater til ønsket startcellen plating tetthet (som i trinn 1). Dette anses Day Split. Plasser 24-brønners plate i en cellekulturinkubator i 24 timer.
- Dag 3
- Grow MMT celler i 24 timer på en 24 brønners plate. La elevene observere celler under mikroskop og telle ved hjelp av mikroskopi programvare (som i trinn 2).
- Gi studenten / teer eksempler på kreftbehandling narkotika aksjer. La dem forberede og fortynne den opprinnelige stamløsningen (som i trinn 3). Tilsett forskjellige konsentrasjoner av legemidler til deres celler til å etablere en dose-responskurve. Dette kalles dag 0.
- Inkuber cellene (trinn 1.2) med medikamenter for maksimalt 48 timer.
- Dag 4
- La elevene observere behandlede celler etter 24 timer. Dette er dag 1.
- Telle hver brønn med mikroskopi programvare. Record fotografier av hver brønn, slik at telle kan gjennomføres utenfor laboratoriet (som i trinn 2).
- Inkuber celler (trinn 1.2) med narkotika for ytterligere 24 timer.
Merk: Instruktør gir ekstra opplæring og gjennomgang av data analyse og grafisk presentasjon. Studentene lærer å lage figurer, plott og statistisk analyse for den påfølgende dagen av datainnsamlingen.
- Dag 5
- Har elevene behandlet celler etter 48 timer, dag 2.
- Telle hvervel å bruke mikroskopi programvare. Record fotografier av hver brønn, slik at telle kan gjennomføres utenfor laboratoriet (som i trinn 2).
- Harvest og samle celler for telling av den tradisjonelle metoden hemocytometer som et middel for å verifisere student evne til effektivt å bruke mikros programvaren metode (som i trinn 2).
Merk: Samle data og trekke konklusjoner eller revidere hypoteser, tilsvarende.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Økende MMT celler og sammenligne tellemetoder.
Musebrysttumor-celler ble dyrket med hell og karakterisert (figur 1) og en ny celletellingsmetode utviklet ved hjelp av Motic Software, et digitalt kamera-assosiert program for et mikroskop. Denne nye celle-tellemetoden ble sammenlignet med en tradisjonell tellingsmetode anvendelse av et hemocytometer (figur 2), og ble vist å være like nøyaktig å bestemme celleantallet (tabell 1). For å kontrollere for eventuelle virkninger på celletallet på grunn av forskjellige vekstbetingelser eller celletype, ble sammenligning mellom de to celletellingsmetoder utført i nærvær og fravær av anti-proliferative midler og med en annen cellelinje, neuronal modell 17 PC12.
Figur 3 viser avgrensningen av området for telling av celler med denne metoden ved hjelp av et overlagret nett av defined dimensjoner. Risten er lagt over synsfeltet (FOV), og en grønn ramme blir så tilført til en bestemt lengde og bredde av gitteret (dvs. 9x5 firkanter). Cellene telles i den grønne rammen og antall celler avledes, som beskrevet i protokollen.
Behandling av MMT-celler: Bestemmelse av dose-respons av MMT-celler til anti-proliferative midler.
Dose responsundersøkelser (figur 4) ble utført for hvert anti-proliferativ middel. Gjennom disse eksperimenter data ble kontinuerlig samlet, vurdert og analysert for å se om mulige endringer i protokollen ble garantert. Forsøket ble utført tre ganger, med hver studie produsere lignende resultater. Forsøkene ble fortsatt inntil alle cellene var døde eller effekten av legemidlene hadde flatet. Digitale mikrofotografier av resultatene er presentert i figur 4, og en grafisk analyse av disse resultatene er presenterti figur 5. er effektive konsentrasjonsområder rapportert i forklaringen av figur 4, på X-aksen i figur 5 og i protokollen delen.
På tamoxifen laveste konsentrasjon, 0,054 mM, var det sterk inhibering av cellevekst, ca 83% sammenlignet med ubehandlede celler (figur 4A). Celleviabilitet fortsatte å avta med økende konsentrasjoner av tamoxifen (figur 5a). Den optimale dosen av tamoxifen ble bestemt til å være 0,216 mM fordi etter 48 timers fullstendig celledød oppstod ved den konsentrasjonen (figur 4A). Interessant, disse reduksjonene i cellen forplantning indikerer ingen indikasjon på en mobil motstand mot tamoxifen, som ville være forventet basert på litteraturen 18,19 streker at in vitro systemer modell, men ikke alltid fullt representere in vivo hendelser. Videre, når kontrast med den laveste treling konsentrasjoner av curcumin (figur 4B og 5A) og metformin (figur 4C og 5B), tamoxifen sin laveste konsentrasjon var 9% og 50% mer effektive i å stoppe celledelingen henholdsvis.
Curcumin oppviste en konsentrasjonsavhengig effekt på inhibering av celledeling i tillegg. Med økende konsentrasjoner, var det en signifikant reduksjon i cellelevedyktighet (figur 4D og 5A). Den optimale dosen av curcumin ble bestemt til å være 0,216 mM fordi etter 48 timer, som tamoxifen, det var fullstendig celledød ved denne konsentrasjonen.
Metformin behandling ga den minst dramatisk reduksjon i MMT celleviabilitet, som fører til 33% reduksjon ved lavest konsentrasjon. En samtidig reduksjon i cellelevedyktighet med økende metformin konsentrasjon ble observert (figur 4C og 5B). Den optimale dosen av metformin var fast bestemt på å bli den høyeste konsentrasjonen testet (10 mM). Sammenlignet med tamoksifen og curcumin, både rutinemessig anvendt som kjemoterapeutiske midler, metformin var 30-40% mindre effektive i å inhibere cellesyklus. Interessant, effekten av metformin på celledeling var i samsvar med de som oppnås ved administrering av aspirin (figur 4D og 5A), et medikament med salicylsyre klart identifisert mekanisme for hemming av cellevekst.
Behandling av MMT-celler: Bestemmelse av tidsforløpet av MMT cellulær respons til anti-proliferative midler.
En gang kurs studie ble også gjennomført for hver anti-proliferative agent fordi den effektive dose av en administrert stoffet kan bli påvirket av eksponeringstiden. Når denne modulen analyser for celleviabilitet, er det viktig å først identifisere hvor raskt cellene deler (doblingstiden) slik at en logisk vindu for hvor lenge cellene er utsatt for medikamentene kan velges. Det er derfor avgjørende at MMT celle doblingstiden blifastslås ved å begynne med å karakterisere cellene. Gjennom disse eksperimentene, ble data kontinuerlig samlet, vurdert og analysert for å se om mulige endringer i protokollen ble garantert. Forsøket ble utført tre ganger, med hver studie produsere lignende resultater. Forsøkene ble fortsatt inntil alle cellene var døde eller virkningene hadde flatet.
Tidsforløpet studier viste at behandling av MMT-celler med optimale konsentrasjoner av hvert anti-proliferativ medikament (tamoxifen 0,216 mM, curcumin 0,216 mM, metformin 10 mM) i 96 timer resulterte i fullstendig celledød, eller en utflating av virkningene av medikamentet ( Figur 6). Selv aspirin, den "valgfri" narkotika, gjorde påvirke cellenes levedyktighet i våre dose respons studier, virkningen var mindre, og derfor ble ikke inkludert i tidskurs studier.
Figur 1. MMT celler. Digital mikrofotografi av "sunn", ubehandlet mus brysttumor (MMT) celler dyrket på 3,6 x 10 6 celler / cm 2 i modifisert Eagles Minimum Essential Medium (EMEM) .100X, skala = 0,2 mm, angitt med hvit bar. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2. Hemocytometer rutenett. Mikroskopbilde av hemocytometer rutenett, 100x. Hele grid utsnittet i sirkel (FOV). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
iles / ftp_upload / 52528 / 52528fig3.jpg "/>
Figur 3. Designa tellingen med Motic programvaren. Bilde av rutenett på FOV og definert område for telling MMT celler etablert med Motic programvaren som sett gjennom mikroskop. 100X, skala = 0,2 mm, angitt med hvite linjen. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4. Dose respons av MMT-celler overfor anti-proliferative midler. Digitale mikrofotografier av MMT-celler dyrket i nærvær av anti-proliferative midler ved varierende konsentrasjoner i 96 timer. Tamoxifen: (A1) 0,054 mm (A2) 0,108 mm (A3) 0,162 mm (A4) 0,216 mm; Curcumin: (B1) 0,054 mm (B2) 0,108 mm (B3) 0,162 mm (B4) .216 mm; Metformin: (C1) 2 mM (K2) 4 mM (C3) 6 mm (C4) 8 mm (C5) 10 mm; Aspirin: (D1) 0,030 mm (D2) 0,060 mm (D3) 0,099 mm (D4) 0,150 mm (D5) 0,216 mm; Etanol (100%) og ubehandlet er begge kontroller. 100X, skala = 0,1 mm, angitt med blå linjer som utgjør hver rute i rutenettet. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5. Grafisk fremstilling av dose-responsforsøk med MMT-celler til anti-proliferative midler. Effekt av økende konsentrasjoner av anti-proliferative midler (A) tamoxifen, curcumin, aspirin, og (B) metformin på MMT celleviabilitet. Resultater enre uttrykt som en prosent av kontroll etter 48 timers behandling, selv om cellen behandling fortsettes i 96 timer. n = 3, er STD indikert.
Figur 6. Grafisk fremstilling av tidsforløpet analyse av MMT cellulær respons til anti-proliferative midler. Tidsforløp studie av virkningene av tamoxifen (0.216mM), curcumin (0.216mM), og metformin (10 mM) på MMT celleviabilitet over 96 t. Resultater er uttrykt som en prosent av kontroll etter 48 timers behandling. Vist her er resultatet av et representativt eksperiment, n = 1.
Figur 7. Flytskjema av 5-dagers lab modul.
| Celletype | Drug Administered | Day of Experiment | Konsentrasjon av Drug | Cell Count med Motic | Cell Count med hemocytometer |
| MMT | Ubehandlet | Dag 2 | - | 7.8x10 4 celler / cm2 | 8.0x10 4 celler / cm2 |
| MMT | Etanol | Dag 2 | 10 mm | 7.1x10 4 celler / cm2 | 7.2x10 4 celler / cm2 |
| MMT | Tamoxifen | Dag 2 | 0,216 MM | 0 celler / cm2 | 0 celler / cm2 |
| MMT | Tamoxifen | Dag 2 | 0,054 mm | 1.3x10 4 celler / cm2 | 1.5x10 4 celler / cm2 |
| MMT | Curcumin | Dag 2 | 0,054 mm | 1.9x10 4 calen / cm 2 | 2.0x10 4 celler / cm2 |
| MMT | Curcumin | Dag 2 | 0,216 mm | 0 celler / cm2 | 0 celler / cm2 |
| MMT | Metformin | Dag 2 | 2 mm | 5.1x10 4 celler / cm2 | 5.2x10 4 celler / cm2 |
| MMT | Metformin | Dag 2 | 6 mm | 3.4x10 4 celler / cm2 | 3.5x10 4 celler / cm2 |
| MMT | Aspirin | Dag 2 | 0,099 mm | 2.8x10 4 celler / cm2 | 3.0x10 4 celler / cm2 |
| PC12 | Ubehandlet | Split | - | 2.5x10 4 celler / cm2 | 2.1x10 4 celler / cm2 |
Tabell 1. Sammenligning av hemocytometer og Motic programvare telle metoder. Resultater av celletelling av MMT celler, enten ved hjelp Motic programvare eller hemocytometer metoder. Både ubehandlede og behandlede celler ble tellet, samt en annen cellelinje, PC12, som en kontroll.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
En lab-modul blir presentert som tar sikte på å lære en rekke emner i cellebiologi gjennom avanserte teknikker av animalsk cellekultur. Modulen oppnår dette ved å analysere virkningene av en rekke anti-proliferative kjemikalier på replikasjonen av celler som modellerer human brystkreft. Den primære analysen er avhengig av den grunnleggende teknikken for celletelling, og introduserer en ny måte å telle celler ved hjelp av mikroskopi programvare. Aktivitetene omfatter modulen kan utføres med instrumenter og utstyr er tilgjengelig i de fleste biologiske programmer. Modulen kan implementeres i en 5-dagers planen med forsyninger som er billig og lett tilgjengelig informasjon. Selv om en spesiell type digitalt mikroskop kamera og mikros programvare brukes her (Motic programvare), bør noen sammenlignbar kameraet og programvaren nok.
Denne prøve modulen benytter MMT-celler som en modell for human brystkreft. Studentene er først lært å vokse og karakterisere disseceller i kultur. Det er viktig å understreke at en vellykket gjennomføring av dette laboratoriet modulen krever etterforskerne (aka studenter) være godt kjent med utseendet og oppførselen til sunne MMT celler, spesielt siden ubehandlede MMT celler fungere som kontroller. Derfor grundig karakterisering av cellevekstmønstre, dobling tid og generell morfologi MMT celler er avgjørende hvis riktig dose respons og tidskurs data skal genereres.
Når preget, ble MMT cellene deretter testet for deres respons på ulike anti-proliferative midler som et middel til å undervise emner av celledeling, cellesyklusregulering, cellesignalering og kreft. Celleviabilitet brukes til å forstå virkningen av disse stoffene på cellene. En ny fremgangsmåte for å telle celler, ved hjelp av programvare i forbindelse med et mikroskop-montert digital kamera, er gjennomført og sammenlignet med en tradisjonell hemocytometer telling basert fremgangsmåte for å kontrollere nøyaktigheten. Thiroman metoden gir to fordeler, som er spesielt bemerkelsesverdig fordi den brukes i undervisning undervisningslaboratorier. Først, siden cellene ikke trenger å bli fjernet fra vevskultur plate for telling, blir mindre tid som trengs for å utføre de viktigste forsøksanalysen. Dette gjør det mulig for et stort antall eksperimentelle variabler som skal testes på en gang og i en begrenset tidsperiode. For det andre gir metoden en digital registrering av cellulær respons til eksperimentell behandling slik at studentene til å evaluere resultatene og avgrense sin eksperimentelle strategi utenfor laboratoriet.
Det er flere problemer å merke seg når gjennomføre begge disse tellemetoder. Først, før telling av celler med enten metode, blir cellene inkubert med trypanblått å skille mellom en levedyktig celle og en død celle. Døde celler blir penetrert av fargestoff og vises mørk blå, mens levedyktige celler er helt hvitt. Men hvis cellene blir inkubert med dye utover det anbefalte inkubasjonstiden, vil de være over-farget og vanskelig å skille. For det andre kan MMT-celler klumper på hemocytometer eller vevskultur plate og være vanskelig å telle individuelt. Derfor er en "klump" utpekt til å inneholde et visst antall celler (f.eks, 10 celler / klump) er til stede og hver klump på gitteret multipliseres deretter med det nummer under tellingen. Endelig MMT cellene holder seg til overflaten av retter der de er vokst. Det er derfor nødvendig å berøre spissen av pipetten direkte til platen ved fjerning av cellene og anvende kraft for å bryte opp celleklumper og fjerne så mange celler fra platen som mulig. Som et resultat av min det ta flere forsøk på å få en nøyaktig telling når du bruker tradisjonell hemocytometer metoden.
Med cellene godt karakterisert, og tellemetoder verifisert, blir to forskjellige eksperimenter utført; en dose-responsstudie av effektene av varierende konsentrasjonerav anti-proliferative medikamenter på MMT celledeling og et tidsforløp eksperiment for å belyse den optimale tid for eksponering for disse stoffene. Disse er meget læreforsøk som prøving og feiling er nødvendig, og anvendelsen av det primære litteraturen er nødvendig for en vellykket eksperiment. For eksempel, de første forsøk på å belyse en dose respons av MMT-celler til disse anti-proliferative midler viste at konsentrasjonene som ble testet var for høyt, da det var 100% celledød i 24 timer for legemiddeladministrering. En utvidet gjennomgang av litteraturen førte til en revidert rekke konsentrasjoner behandling. Dette lærer effektivt elevene hvordan de skal bruke litteraturdatabaser, lese, analysere og kritisere primære litteratur artikler og understreker hvordan disse ferdighetene er avgjørende for den vitenskapelige prosessen.
Resultater av doseresponsstudier viste at tamoxifen utviser den sterkeste anti-proliferativ effekt ved alle konsentrasjoner som ble testet. Tamoxifen, et anti-mitotic stoffet, er spesielt brukt som et anti-østrogenbehandling for østrogensensitive kreftformer, typisk i postmenopausal, hormon-sensitive pasienter 18-20. Stoffet brukes i dag som en brystkreft behandling. Tamoxifen konkurrerer med østrogen for intracellulær østrogenreseptoren og når de er bundet, regulerer ned ekspresjon av cykliner D og B, to viktige regulatorer av cellesyklusen. Resultatene oppnådd i aktiviteten antyder at tamoxifen hell bundet til østrogenreseptoren og inhiberte celle progresjon gjennom cellesyklus, noe som resulterer i nedsatt celleformering observert. Interessant, reduksjonen i MMT celle forplantningsRatene i alle konsentrasjoner av tamoxifen som administreres viser ingen indikasjon på cellulær resistens overfor tamoxifen, som ville være forventet på grunnlag av litteraturen (se for eksempel 19). Dette fungerer som en god påminnelse om at in vitro-betingelser som eksperimentet ble utført i ikke fullt ut modellen in vivo omstendigheter.
Curcumin behandling av MMT-celler resulterte også i en reduksjon av cellelevedyktighet. Curcumin er en forbindelse avledet fra gurkemeie roten og virker som en cellevekst-inhibitor 12,16. Det fungerer ved nedregulering av NF-kappa B veien og ornitindekarboksylase (ODC) -aktivitet. NF-kappa B er et proteinkompleks som styrer transkripsjonen av anti-apoptotiske gener slik TRAF1 og TRAF2, som koder for proteiner som inhiberer apoptose. ODC er et enzym som katalyserer fremstillingen av polyaminer, proteiner som gir kreftceller med økt næringskilder som fører til forbedret cellevekst. Stoffet er i nåværende bruk som en behandling av brystkreft. Den anti-proliferative effekt av curcumin viser klart den effekt som nedregulering av cellesignalveien omfatter NF-kappa B og ornitindekarboksylase har på celledeling.
Redusert celleviabilitet ble tilsvar observert med metformin renseanleggnt. Metformin, et medikament som vanligvis administreres til type II diabetikere, ble valgt fordi publiserte rapporter tyder på en sammenheng mellom pasienter som tar metformin og en lavere forekomst av brystcancer 15. Det antas at midlet modulerer c-myc-genet, og derved ned-regulerer aktiviteten av cyclin D. oppregulering av cykliner, molekyler som tjener som kontrollpunktet inne i cellesyklus, tillater cellene å komme seg gjennom syklusen på en raskere hastighet resulterer i økt celledeling og vekst. Effekten av metformin behandling på MMT-celler viser hvor modulering av c-myc-genet også fører til nedregulering av cyclin D og en reduksjon i celledeling. De metformin data eksemplifiserer videre hvordan en medisin beregnet for én betingelse i dette tilfellet Diabetes kan ha en virkningsmekanisme egnet for andre avvikende fysiologiske hendelser. I tillegg er det viktig å understreke at selv om tamoxifen, curcumin, og metformin alle hemmer unormal celle formeringenbeid gjennom ulike mekanismer, hver med hell redusert cellepopulasjoner og forstyrret celledeling in vitro.
Denne modulen gir også mulighet for åpent henvendelse i at en annen medisiner, urtemedisin, eller agent kan testes. Aspirin, en over-the-counter smertestillende, febernedsettende, og anti-betennelse medisiner som brukes til å avlaste mild smerte og redusere feber ble valgt i denne modulen. Aspirin evne til å redusere betennelse kan hemme tumorvekst ved å bremse utviklingen av nye blodårer som gir næring dem og forstyrrer stamceller som drivstoff deres vekst 11,13,14. Interessant, administrasjon av aspirin til MMT celler resultere i en viss reduksjon i celle levedyktighet. Lite er kjent om rollen som aspirin i kreftforebygging og behandling selv om mange korrelative studier er rapportert 13,14, noe som gir et utmerket eksempel på korrelative versus årsaksforhold.
Tidenkurs studier viste at, når det gis ved optimalisert doser, anti-proliferative narkotika er svært effektiv på å forstyrre celledeling innen 4 dager etter første eksponering. Disse studiene gir også en mulighet for studentene til å bruke det de har lært om MMT cellevekstegenskaper når utforme en eksperimentell strategi for å gjennomføre disse eksperimentene. Faktisk er nøye karakterisering av cellevekstmønstre, doblingstiden og generell cellemorfologi av MMT-celler er viktig for både nøyaktig dose-responsdata og tidsforløp.
Både dose-respons og tidsforløpsstudier bestemme forholdet mellom legemiddelkonsentrasjonen og eksponeringstiden, henholdsvis, og effekten et medikament har i et biologisk system. Dette er en utmerket måte å få elevene tenker om inter interaksjoner og andre grunnleggende begreper i biokjemi mens drive henvendelse drevet, forskningsaktiviteter. Det er verdt å merke seg at siden mange biology fagretninger har tenkt å delta på medisinstudiet, justerer denne lab-modulen godt med de nylig innført endringer i medisinsk skolens krav 21.
Denne prøvemodulen kan gjennomføres nøyaktig som beskrevet, eller kan lett tjene som en mal. En rekke variasjoner kan bli innarbeidet i denne aktiviteten, slik som valg av anti-proliferativ middel, celletype eller næringsstoff endring i vekstmediet. Så lenge en hypotese er utviklet som tester grunnleggende og avanserte konsepter i cellen eller generell biologi, permutasjoner av denne modulen er mange. Uavhengig av permutasjon, naturlig leder gjennomføringen av denne aktiviteten student å lære et stort utvalg av laboratorieteknikker og bli kjent med en rekke utstyr og instrumentering.
Oppsummert laboratoriet modulen beskrevet her tillater elevene å delta fullt ut i prosessen med vitenskap, utvikle sine evner til å tilegne seg, analysere og grafisk ReprESENT data, og finpusse sin tid ledelse og samarbeidsevner. Modulen er designet for å forenkle åpent forespørsel og er lett å tilpasse til ulike kurstider og ferdighetsnivåer. Det skal bemerkes at de to første forfatterne av denne papiret er lavere biologiske større, hvilket klart viser at denne prøve modulen er egnet for det befolkningen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne fikk ingen økonomisk eller tilsvarende støtte fra Motic.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tissue Culture Hood | ESCO Labculture Reliant | Class II Type A2 Biological Safety Cabinet | |
| Waterjactor CO2 Incubator | CEDCO | Model 1510 | |
| Bright-line Hemocytometer | American Optical | with two separate grids | |
| Motic Images Plus | Mac OSX Verison 2.0 or higher | ||
| Gilson Pipetman | Rainin instrument co. inc | P-20D, P-200D, P-1000D | |
| CK30/CK40 Culture Microscope | Olympus | 4 objective inverted light microscope with camera | |
| 200 μl Pipet tips | MidSci | 40200C | |
| 1,000 μl Pipet tips | MidSci | AVR4 | |
| 10 ml Seriological Pipets | TPP | TP94010 | |
| 24 well plates | CoStar- Tissue Culture Cluster | 3524 | 24 wells, 16 mm well diameter, radiation sterilized |
| Trypan Blue Solution 0.4% | Sigma | T8154 | 100 ml, cell culture tested non-haz |
| Bright-line Hemacytometer replacement coverslip, non-haz | Sigma | Z375357 | |
| Mouse Mammary Tumor(MMT) cells | ATCC | CCL-51 | |
| Eagle Minimum Essentail Medium (EMEM) | ATCC | 30-2003 | 500 ml |
| Fetal Bovine Serum | Sigma | F0926 | 500 ml |
| Metformin Hydrochloride | Sigma | PHR1084 | 500 mg |
| Tamoxifen | Sigma | T5648 | white or white-yellow powder |
| Curmumin | Sigma | C1386 | yellow-orange powder |
| Aspirin | Sigma | A2093 | meets USP testing specifications |
References
- Hammamieh, R., et al. Students investigating the antiproliferative effects of synthesized drugs on mouse mammary tumor cells. Cell Biol Educ. 4 (3), 221-234 (2005).
- Sykes, J. A., Whitescarver, J., Briggs, L. Observations on a cell line producing mammary tumor virus. J Natl Cancer Inst. 41 (6), 1315-1327 (1968).
- Palombi, P. S. J., Snell, K. Learning about Cells as Dynamic Entities: An Inquiry-Driven Cell Culture Project. Bioscene: Journal of College Biology Teaching. 33, 27-33 (2008).
- Ledbetter, M. L. S., Lippert, M. J. Glucose Transport in Cultured Animal Cells: An Exercise for the Undergraduate Cell Biology Laboratory. Cell Biology Education. 1 (3), 76-86 (2002).
- Weaver, D. Cardiac Cells Beating in Culture: A Laboratory Exercise. American Biology Teacher. 69, 407-410 (2007).
- Marion, R. E., Gardner, G. E., Parks, L. D. Multiweek cell culture project for use in upper-level biology laboratories. Advances in Physiology Education. 36, 154-157 (2012).
- Mozdziak, P. E. P., James, N., Carson, S. usanD. An Introductory Undergraduate Course Covering Animal Cell Culture Techniques. Biochemistry and Molecular Biology Education. 32 (5), 319-322 (2004).
- Anderson, L. W., et al. A taxonomy for learning, teaching and assessing: A revision of Bloom's Taxonomy of educational objectives (Complete Edition). , Longman, London, England. (2001).
- Centers for Disease Contol and Prevention. Appendix A - Primary Containment for Biohazards: Selection, Installation and Use of Biological Safety Cabinets. , (2014).
- Davis, J. M. Basic Cell Culture: A Practical Approach. , 2nd edn, Oxford University Press. Oxford, UK. (2002).
- Algra, A. M., Rothwell, P. M. Effects of regular aspirin on long-term cancer incidence and metastasis: a systematic comparison of evidence from observational studies versus randomised trials. Lancet Oncol. 13 (5), 518-527 (2012).
- Anand, P., Sundaram, C., Jhurani, S., Kunnumakkara, A. B., Aggarwal, B. B. Curcumin and cancer: an 'old-age' disease with an 'age-old' solution. Cancer Lett. 267 (1), 133-164 (2008).
- Ararat, E., Sahin, I., Altundag, K. Mechanisms behind the aspirin use and decreased breast cancer incidence. J BUON. 16 (1), 180 (2011).
- Ararat, E., Sahin, I., Altundag, K. Aspirin intake may prevent metastasis in patients with triple-negative breast cancer. Med Oncol. 28 (4), 1308-1310 (2011).
- Blandino, G., et al. Metformin elicits anticancer effects through the sequential modulation of DICER and c-MYC. Nat Commun. 3, 865 (2012).
- Kunnumakkara, A. B., Anand, P., Aggarwal, B. B. Curcumin inhibits proliferation, invasion, angiogenesis and metastasis of different cancers through interaction with multiple cell signaling proteins. Cancer Lett. 269 (2), 199-225 (2008).
- Burstein, D. E., Blumberg, P. M., Greene, L. A. Nerve growth factor-induced neuronal differentiation of PC12 pheochromocytoma cells: lack of inhibition by a tumor promoter. Brain Res. 247 (1), 115-119 (1982).
- Nazarali, S. A., Narod, S. A. Tamoxifen for women at high risk of breast cancer. Breast Cancer (Dove Med Press). 6, 29-36 (2014).
- Cui, J., et al. Cross-talk between HER2 and MED1 regulates tamoxifen resistance of human breast cancer cells). Cancer Res. 72 (21), 5625-5634 (2012).
- Komm, B. S., Mirkin, S. An overview of current and emerging SERMs. J Steroid Biochem Mol Biol. 143C, 207-222 (2014).
- Kaplan, R. M., Satterfield, J. M., Kington, R. S. Building a better physician--the case for the new MCAT. N Engl J Med. 366 (14), 1265-1268 (2012).
