Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biology

Använda musbrösttumör celler att undervisa Kärn Biologi Concepts: En enkel Lab Modul

Published: June 18, 2015 doi: 10.3791/52528

Introduction

Ofta i grund allmän biologi kurser, är ämnen av cellcykelreglering och cancer berörts men inte utforskat i detalj eftersom bredden av innehållet i dessa kurser lämnar lite tid för djup. Dessutom är grundbiologistudenter normalt inte exponeras för de avancerade tekniker i samband med djurcellodling. För att hjälpa eleverna att utveckla en djupare förståelse av dessa begrepp, samtidigt som och analysera vad de har lärt sig, var en laboratorieverksamhet utvecklats som en modifiering av Walter Reed Army Institute of Research (WRAIR) förlängdes laboratorieverksamhet 1. Labbet modulen använder en stegvis, experimentell strategi som omfattar allt och karakterisera en cancercell modell, utveckla och genomföra cellräkning metoder, inrättande av optimala tidsförloppet och doseringar för behandling av celler med anti-proliferativa medel, och identifiera avvikande cellsignalvägar . Experimentet kan också öppna-ended utredning.

De flesta av de tekniker som krävs för denna aktivitet kan åstadkommas på ett typiskt biologi-undervisande laboratorium. Aktiviteten börjar med studenter som kännetecknar morfologi och tillväxttakten för musbrösttumör (MMT) cellinje, en modell för human bröstcancer 2. Bröstcancer valdes som modell cancer på grund av dess utbredning i befolkningen, dess kännedom till college-äldre studenter och de omfattande uppgifter som finns tillgängliga. MMT-cellinjen var speciellt utvalda eftersom det är lätt att få, väl karakteriserade, har en kort dubbleringstid och är lätt att odla. Dessutom MMT-celler är östrogenberoende, vilket är förenligt med de flesta kvinnliga bröstcancerformer. Eleverna identifierar sedan avvikande cellsignalvägar i MMT-celler genom behandling av cellerna med cytostatika vars verkningsmekanism är väl established.The koncentrationen av läkemedel och längden på behandlingar varierar låta elevernaför att utvärdera effekten av dessa variabler på hastigheten för celldelning. Nyckeln analys för denna verksamhet är att fastställa cellviabilitet, som helt enkelt kräver cellräkning, med hjälp av en av två metoder. Varje metod beror på starka mikroskopi kompetens. Eleverna bestämmer cellviabiliteten med hjälp av en standard, hemocytometer metod och en ny photomicroscopy metod och föreslå. Baserat på deras iakttagelser, kan de föreslå och testa ändringar av verksamheten. Eleverna får sedan företräda sina uppgifter och tolka resultaten för att förfina sin hypotes och utarbeta nya experimentella strategier.

Detta laboratorium verksamhet lämpar sig för nybörjare eller sophomore nivå huvudämnesstuderande i de biologiska vetenskaperna. Det kondenseras i en veckas lab-modul som kan fyllas i på ett första år, allmän biologi eller andra året, cellulär / molekylärbiologi kurs. Färdigheter som behövs för korrekt slutförande av verksamheten omfattar grundläggande aritmetik och algebra, förtrogenhet med en rad cmalm laborativa färdigheter (t.ex. pipettering, lösning gör, sterilteknik), dataanalys, grundläggande ljusmikroskop och tidsplanering, tillsammans med instruktör kunskap om cellkultur och kalkylprogram. Reagens som krävs innefattar en djur cellinje modell för cancer (t.ex. mus brösttumörceller, MMT 2), kemoterapeutiska medel (t.ex. tamoxifen, curcumin, metformin och aspirin), trypanblått och cellodlingsmedia (t.ex., Eagles Minimum Essential Medium ; EMEM) med lämpliga kosttillskott (t.ex. givare häst och fetalt bovint serum). Instrument som behövs bland annat en inverterad ljusmikroskop med digitalkamera kvarstad, dator, 100 mm och 24 vävnadsodlingsplattor, CO 2 inkubator (eller motsvarande), biosäkerhet skåp (BSC, klass II), hemocytometer och digital mikroskope programvara.

Det finns goda exempel på specifika lab verksamheter som är beroende av djurcellkultur till Teach studenter om begrepp i cellbiologi 3. Men många kräver varor eller teknik som inte är lättillgängliga (t.ex. radioaktiva isotoper, levande djurvävnad, avancerad bildutrustning 1,4,5) beskriver protokoll som är ganska avancerade (t.ex. lämpar sig för en 400-nivå kurs 6), eller kräver flera veckor eller termin långa projekt 6,7. Labbet de verksamheter som beskrivs här är enkel och kan utföras i en enda vecka med vanlig laboratorieutrustning.

Sammanfattningsvis denna laboration modul effektivt inför eller förstärker begreppen cellcykeln, cellulära signaleringsvägar och cancer samtidigt undervisa grundläggande och avancerade lab färdigheter, experimentell dataanalys, metoden för djurcellkultur och den vetenskapliga processen. Laboratoriet modulen är enkel och ekonomiskt tillgängliga och ger både flexibilitet och möjlighet till öppen utredning. Aktiviteten uppmuntrar studerande kreativitetgenom att tillhandahålla en mall experimentell strategi som fungerar som en guide men inte ett recept. Viktigast, verksamhets uppfyller alla lärande domäner av Blooms taxonomi 8 eftersom det kräver att minnas, förstå, tillämpa, analysera, utvärdera och skapa genom att engagera eleverna i en process som drar ut dem ur läroboken och i en värld av vetenskaplig forskning.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Anmärkningar: Conduct allt arbete med celler och cellodlingsreagens i en klass II biosäkerhet skåp (BSC) 9. MMT-celler klassificeras som biosäkerhetsnivå jag, eftersom de utgör låg till måttlig biologisk risk. Applicera ordentlig rengöring och saneringsåtgärder till BSC mellan användningarna (t.ex. ultraviolett ljus, 70% etanol torka).

1. Odla MMT-celler

  1. Odla celler i 10 cm vävnadsodlingsskålar innehållande 10 ml av näringsrika medier som består av Eagles Minimum Essential Medium (EMEM) kompletterat med 10% fetalt bovint serum (FBS), 2 mM glutamin och 1% Antimykotika / Antibiotikum (10 enheter penicillin , 100 | ig streptomycin, 0,25 ^ g amfotericin B). Odla celler i en fuktad 5% CO 2 kammare, vid 37 ° C. Plate celler vid en densitet av 3,6 x 10 6 celler / cm 2 (se räkna celler i steg 2).
  2. Ersätt hälften av cellodlingsmedier med färskt medium var 48 timmar Unless annat anges. Kontrollera cellviabiliteten och morfologi genom undersökning med en inverterad faskontrast ljusmikroskop.
    1. Notera och karaktärisera celler för storlek, struktur, form, organisation och uppskattade antalet i 100 - 200 gångers förstoring. Vid denna densitet, bör cellerna visas i ett plan, inte hopklumpade ovanpå varandra och i omedelbar närhet. Varje cell består av en tjock, sfärisk kärna med tunna, långa, grenliknande förlängningar expanderar från det som kommit till en punkt (se figur 1).
  3. Subdivide celler när de når en celldensitet på 7,2 x 10 6 celler / cm 2. Celler uppvisar en dubbleringstid hastighet av 1,8 x 10 6 celler / cm 2 per 24 timmar. Utse celler Passage X (PX) för att beteckna antalet gånger de har delats upp.
    1. Vid generation 3 (dvs efter tre passager, P3), skörd, räkna, och plattan cellerna på en 24 brunnars vävnadsodlingsplatta med en densitet på 3,6 x 10 6 cm2.
  4. Se celler varje dag och spela in digitala mikrofotografier. Notera och beskriva cellmorfologin (dvs. storlek, form, ljusreflekterande egenskaper). Bestäm cellfördubblingstiden genom att räkna celler regelbundet och som avser förfluten tid till cell nummer.

2. Räkna MMT-celler

Obs: Räkna celler för att bestämma om celler måste subkultiveras för att ställa upp för ett experiment eller för att bestämma cellviabilitet. Det finns två metoder som presenteras här.

  1. Användning av en hemocytometer, till en standardteknik räkna celler.
    1. Skaffa en ljus-line hemocytometer, en 0,2% lösning av trypanblått färgämne, en förening ljusmikroskop, sterila provrör, pipetter och en manuell cellräknare.
    2. Enligt BSC, använd en 10 ml pipett för att avlägsna celler från en 10 cm vävnadsodlingsskål. Om celler odlas på en 24 brunnar använda en 1 ml pipett eller 1.000 pl mikropipett för att ta bort media.
    3. Placera den erhållna cellsuspensionen i ett 15 ml sterilt rör (eller 1 ml mikrocentrifug eller annan liten volym rör). Annars, lämna cellerna i den ursprungliga vävnadsodlingsplatta / brunn.
    4. Enligt BSC, kombinera 10 pl av cellsuspensionen med 10 | il av lösning av trypanblått (1: 1 förhållande) i en icke-steril mikro centrifug eller annan liten volym rör.
      Obs: Trypan blå är en viktig fläck som inte absorberas av friska levande celler. När cellerna är skadade eller döda, trypanblått kan komma in i cellen tillåter döda celler som skall räknas (alias färgämnesuteslutningsmetod). Därför under ett mikroskop, döda celler verkar mörkt lila medan levande celler är en ljus och ljus i färgen.
    5. Inkuberavid RT i 5 min.
    6. Placera täckglas på hemocytometer. Applicera 10 | il av trypanblått-cellsuspensionsblandning in i spåret. Visa hemocytometer vid 100 - 200 gångers förstoring. En fyra-hörn nätet är uppenbar (se figur 2).
    7. Räkna antalet viabla celler (ofärgade) kontra totala celler i varje inrutade ytan. Genomsnitt de fyra gallren och multiplicera med ett x 10 4 för att erhålla celler / ml.
      1. Extrapolera det totala antalet celler per skål (eller celler / cm 2). Använd detta nummer för att antingen bestämma den korrekta volymen av cellsuspension för att använda för att ympa en ny vävnadsodlingsplatta vid den önskade tätheten av 3,6 x 10 6 celler / cm 2 eller bestämma totala antalet livskraftiga celler på plattan eller i brunnen.
        Obs! För ytterligare vägledning om användning av en hemocytometer, se 10.
  2. Använd mjukvara och en digitalkamera för att räkna livskraftiga celler.
    1. Skaffa en digital kamera, dess tillhörande mjukvara, en 0,4% lösning av trypanblått färgämne, en förening ljusmikroskop, sterila provrör, pipetter och en dator.
      Obs: En Moticam 2000 digitalkamera med tillhörande Motic Software är anställd här. Alla jämförbar kamera och programvara bör vara tillräcklig. Se till att den digitala kamerans mjukvara har kalibrerats i förväg (enligt tillverkarens protokoll).
    2. Enligt BSC, använd en 1 ml pipett eller 1.000 pl mikropipett för att ta bort media från MMT celler som växer i en 24 brunnars vävnadsodlingsskål. Tvätta vidhäftande cellerna genom att försiktigt applicera en liten mängd (ca 500 l) av un-kompletteras (dvs EMEM utan tillägg) färskt medium till plattan sedan ta bort det. Applicera 10 | il av 0,2% trypanblått (tillverkad genom utspädning 1: 1 med icke-kompletterat EMEM) direkt till brunnen.
    3. Inkubera plattan vid rumstemperatur under 5 minuter.
    4. Visa plattan under mikroskop vid 100 - 200 gångers förstoring wed en digitalkamera bifogas. Plate kan tvättas med okompletterat media om färgning med 2% trypanblått är för mörk.
    5. Öppna mjukvaran på datorn en nd kontrollera att programvaran är kalibrerad till målet användas via fliken Inställningar. En bild av FOV ska visas.
    6. Välj Grid på fliken Mått. Ett rutnät av rutorna är cirka 0,005 cm i bredd visas. Välj Grid information till bekräfta området för varje kvadrat.
    7. Välj ett visst område i nätet för att räkna celler (dvs 5 rutor x 9 rutor). Välj rektangel på fliken Mått. Klicka på hörnet av en kvadrat och dra markören till att omfatta kvadraterna av val.
      Obs: En grön nyans kommer att omfatta kvadraterna av val och en vit ruta visas i hörnet som ger bredd, höjd, area och omkrets av den del av nätet som valts (se figur 3).
    8. Räkna antalet VIABle celler inom den fastställda arealen. Gör samma sak för två andra platser i samma brunn eller platta genom att förflytta plattan under mikroskop.
    9. Se till att den uppmätta området är densamma och förstoringen har inte förändrats. Beräkna det genomsnittliga antalet viabla celler inom området. Med användning av området av brunnen (till en 24 brunnars platta, har en väl en area av 2 cm 2, för en 100 mm skål området är 78,6 cm 2), extrapolera antalet viabla celler från det område som utgörs i rutnätet för att det totala antalet celler i brunnen (celler / cm 2).

3. Behandla MMT Celler med antiproliferativa medel

  1. Bered lösningar av de utvalda antiproliferativa terapeutiska medel (tamoxifen, curcumin och metformin) och valfri läkemedel, aspirin under BSC.
    1. Lös curcumin och tamoxifen i 100% etanol för att alstra en förrådskoncentration av 27 mM. Lös metformin och acetylsalicylsyra i unsupplementEd EMEM för att generera en förrådskoncentration av 500 mM och 15 mM.
  2. Inrätta en dos-respons.
    1. Behandla MMT-celler med de tre antiproliferativa terapeutiska medel (tamoxifen, curcumin och metformin) och valfri läkemedel (acetylsalicylsyra) vid varierande koncentrationer under 96 timmar för att generera en dosresponskurva. Inledningsvis administrera alla droger på ett intervall av koncentrationer baserade på publicerade rapporter 1,11-16 och därefter vid koncentrationer större eller mindre än de som publicerats.
      Obs: En dos respons bestämmer den minsta koncentration av ett läkemedel som krävs för att ge de önskade resultaten. Här det önskade resultatet är en minskning av cellproliferation jämfört med kontrollen.
      1. För tamoxifen och curcumin, använder koncentrationer (och motsvarande volymer) av 0,054 mm (1 pl), 0,108 mM (2 pl), 0,162 mM (3 il) och 0,216 mM (4 pl).
      2. För metformin, använder koncentrationer (och motsvarande volymer) på 2 mm (2 pl), 4 mM (4 ul), 6 mM (6 ^ il), 8 mM (8 | il) och 10 mM (10 | il).
      3. För aspirin, använder koncentrationer (och motsvarande volymer) av 0,030 mm (1 pl), 0,060 mM (2 pl), 0,099 mM (3,3 pl), 0,150 mM (5 pl), och 0,216 mM (6,7 l).
    2. Split MMT-celler från 10 cm skål på en 24 brunnars platta vid en koncentration av 3,6 x 10 6 celler / cm 2. Bestäm initial cellkoncentration av båda cellräkningsmetoder (Steg 2). Kalla den nya 24 brunnar av celler "Dag Split".
    3. 24 timmar efter cell plätering, behandla MMT-celler med var och en av de anti-proliferativa terapeutiska medel, tamoxifen, curcumin, metformin och acetylsalicylsyra, vid de koncentrationer som beskrivs i Steg 3.2.1. Se detta som "dag 0".
      1. Som varje brunn rymmer högst 500 l av media, använder mikropipetter med sterila mikropipett tips och en ny spets varje gång en ny brunn behandlas för att undvika sposs förorening. Använd två brunnar som kontroller: celler odlade i frånvaro av läkemedelsbehandling (negativ kontroll) och celler odlas i närvaro 100% etanol (lösningsmedelskontroll).
    4. Odla celler och åter administrera läkemedel vid de beskrivna koncentrationerna när cellerna matas varannan dag (se steg 1,2) under 96 timmar (tills Dag 4) på dag 1 -. 4 av behandlingen, observera cellerna under mikroskop och räkna med förfarandet i Steg 2,2 (se figur 4).
    5. Upprepa experimentet åtminstone tre gånger.
    6. Bestäm optimal koncentration av varje läkemedel genom att plotta relationen mellan cellviabilitet och läkemedelsdos över längden av experimentet (se fig 5).
  3. Inrätta ett tidsförlopp.
    1. Behandla MMT-celler med de tre antiproliferativa terapeutiska medel (tamoxifen, curcumin och metformin) vid en fast koncentration under varierande tidsperioder. Använd den optimala koncentrationen identiferat genom dosresponsen experiment (se steg 3.2).
      1. Använd följande koncentrationer: 0,216 mM tamoxifen, 0,216 mM curcumin och 10 mM metformin.
        Obs: Ett tidsförlopp bestämmer mängden tid som krävs för ett läkemedel för att producera sin optimala önskade resultatet. Här, är det önskade resultatet en minskning av cellproliferation jämfört med kontrollen.
    2. Split MMT-celler från 10 cm skål på en 24 brunnars platta vid en koncentration av 3,6 x 10 6 celler / cm 2. Bestäm initial cellkoncentration av båda cellräkningsmetoder (Steg 2). Kalla den nya 24 brunnar av celler "Dag Split".
    3. 24 timmar efter cell plätering, behandla MMT-celler med var och en av de anti-proliferativa terapeutiska medel, tamoxifen, curcumin, metformin och acetylsalicylsyra, vid optimala koncentrationer som anges i Steg 3.2. Se detta som "dag 0".
      1. Som varje brunn rymmer högst 500 l av media, osse mikropipetter med sterila mikropipett tips och en ny spets varje gång en ny brunn behandlas för att undvika korskontaminering.
      2. Använd två brunnar som kontroller: celler odlade i frånvaro av läkemedelsbehandling (negativ kontroll) och celler odlas i närvaro 100% etanol (lösningsmedelskontroll).
  4. Odla celler och åter administrera läkemedel i vald koncentration när cellerna matas varannan dag (se steg 1,2) under 96 timmar (tills Dag 4). På Dag 1 - 4 av behandlingen, observera cellerna under mikroskop och räkna med den metod som i steg 2,2 (se figur 4).
  5. Upprepa experimentet åtminstone tre gånger.
  6. Bestämma optimala exponeringstiden för MMT-celler till varje läkemedel genom att plotta relationen mellan cellviabilitet och längd (tid) av läkemedelsbehandling i vald koncentration (se figur 6).

4. The Lab Module

Obs: Följande är en 5-dagarslab schema för labbmodulen. Figur 7 är ett flödesschema över vad schemat skulle medföra inom de fem dagarna. För denna verksamhet som ska slutföras under fem dagar antingen ett tidsförlopp eller en dos-responskurva genereras. Det finns inte tillräckligt med tid för att generera båda kurvorna. En dosrespons experiment beskrivs nedan. Ett tidsförlopp experiment kan lätt bytas ut

  1. Dela upp klassen i grupper: ha en grupp inrätta en dos-respons och den andra en tidsförloppet välja en koncentration i mitten av de föreslagna dos-respons koncentrationer.
    1. Bibehålla tillräcklig kulturer och narkotikalager vid lämpliga koncentrationer. Om inget annat anges, kan utföra allt arbete under BSC.
  2. Dag 1
    1. Direkt eleverna att göra media och odla celler (som i steg 1).
    2. När eleverna få ett lager av MMT-celler på en 10 cm platta, styra eleverna att förbereda cellodlingsmedia och ger en handledning i användningen av hemocytometer, digital mikroskopering och digitalkamera mikroskopi programvara (som i steg 2).
    3. Kalibrera programvaran för att de mål som används på mikroskop (t.ex. 4X, 10X, 20X) nu använder tillverkarens protokoll.
  3. Dag 2
    1. Låt eleverna bekräftar totala antalet celler och cellviabilitet (som i steg 2).
    2. Låt eleverna räkna celler på 100 mm skål med användning av både mikroskopi programvara och hemocytometern metoder, för att bekräfta liknande resultat erhålles.
    3. Direkt studenter att få en 24 brunnar och dela celler från 100 mm skålen till plattor med 24 brunnar till önskad utgångscellen plätering densitet (som i steg 1). Detta anses Dag Split. Placera 24 brunnar i en cellkultur inkubator i 24 timmar.
  4. Dag 3
    1. Väx MMT-celler under 24 timmar på en 24-brunnsplatta. Låt eleverna observera celler under mikroskop och räkna med mikroskopi programvara (som i steg 2).
    2. Ge studenten / team prover av cancerbehandling läkemedelslager. Låt dem förbereda och späd den ursprungliga stamlösningen (som i steg 3). Lägg de olika koncentrationerna av drogerna till deras celler för att etablera en dosresponskurva. Detta kallas dag 0.
    3. Inkubera cellerna (steg 1.2) med läkemedel för högst 48 timmar.
  5. Dag 4
    1. Låt eleverna observera behandlade celler efter 24 timmar. Detta är Dag 1.
    2. Räkna varje brunn med hjälp av mikroskopi programvara. Rekord fotografier av varje brunn så att räkna kan utföras utanför laboratoriet (som i steg 2).
    3. Inkubera cellerna (steg 1.2) med läkemedel för ytterligare 24 timmar.
      Obs: Instruktör ger ytterligare handledning och recensioner av dataanalys och grafisk presentation. Eleverna lär sig att skapa figurer, tomter, och statistisk analys för följande dag för datainsamling.
  6. Dag 5
    1. Låt eleverna behandlade celler efter 48 timmar, Dag 2.
    2. Räkna varjebra med mikroskopi programvara. Rekord fotografier av varje brunn så att räkna kan utföras utanför laboratoriet (som i steg 2).
    3. Harvest och samla celler för räkning av den traditionella hemocytometer metoden som ett sätt att kontrollera studerande förmåga att effektivt använda mikroskopi programvara metod (som i steg 2).
      Obs: Samla in data och dra slutsatser eller revidera hypoteser, i enlighet därmed.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Växande MMT-celler och jämföra räkningsmetoder.

Musbrösttumör celler framgångsrikt odlas och karakteriserats (figur 1) och en ny cellräkningsmetod utvecklats med hjälp Motic Software, en digital kamera-associerad programvara för ett mikroskop. Denna nya cellräkning metod jämfört med en traditionell räkningsmetod som använder en hemocytometer (Figur 2) och visade sig vara lika exakt för att fastställa cellantal (tabell 1). För att kontrollera för eventuella effekter på cellantalet på grund av olika tillväxtbetingelser eller celltyp, var jämförelsen mellan de två cellräkningsmetoder genomförs i närvaro och frånvaro av anti-proliferativa medel och med en annan cellinje, den neuronala modell PC12 17.

Figur 3 visar avgränsningen av det område för att räkna celler med denna metod med användning av en överlagrad rutnät av defined dimensioner. Gallret läggs över synfältet (FOV) och en grön ram appliceras sedan på en därför avsedd längd och bredd av nätet (dvs 9x5 fyrkanter). Cellerna räknas i den gröna ramen och antalet celler extrapoleras, såsom diskuteras i protokollet.

Behandling av MMT-celler: Fastställande av dos-respons av MMT-celler till anti-proliferativa medel.

Dos-responsstudier (figur 4) utfördes för varje antiproliferativ medlet. Under dessa experiment data kontinuerligt samlas in, granskas och analyseras för att se om eventuella ändringar i protokollet var motiverad. Experimentet utfördes tre gånger, med varje studie som producerar liknande resultat. Experiment fortsatte tills alla celler var döda eller effekterna av drogerna hade planade. Digitala mikrofotografier av resultaten presenteras i figur 4, och en grafisk analys av dessa konstateranden presenterasi figur 5. är effektiva koncentrationsintervall rapporteras i legenden i fig 4, på X-axeln i fig 5 och i protokollet sektion.

På tamoxifen lägsta koncentrationen, 0,054 mM, det var stark hämning av celltillväxt, cirka 83% jämfört med obehandlade celler (Figur 4A). Cellviabilitet fortsatte att minska med ökande koncentrationer av tamoxifen (Figur 5A). Den optimala dosen av tamoxifen bestämdes till 0,216 mM eftersom efter 48 timmar komplett celldöd inträffade vid denna koncentration (Figur 4A). Intressant, dessa minskningar i cellförökningen visade inte några tecken på en cellulär resistens mot tamoxifen, som kan förväntas baserat på litteraturen 18,19 stryka att in vitro-system modell, men inte alltid fullt ut representera in vivo händelser. Dessutom, när den jämförs med den lägsta treatment koncentrationer av curcumin (figur 4B och 5A) och metformin (fig 4C och 5B), var tamoxifen lägsta koncentration 9% och 50% mer effektiva i att stoppa celldelning, respektive.

Curcumin uppvisade en koncentrationsberoende effekt på hämning av celldelning också. Med ökande koncentrationer, fanns en signifikant minskning av cellviabilitet (Figur 4D och 5A). Den optimala dosen av curcumin bestämdes till 0,216 mM eftersom efter 48 timmar, som tamoxifen, det var fullständig celldöd vid denna koncentration.

Metformin behandling gav minst dramatiska minskningen i MMT cellviabilitet, vilket leder till 33% minskning till lägsta koncentration. En åtföljande minskning av cellviabilitet med ökande metforminkoncentration observerades (fig 4C och 5B). Den optimala dosen av metformin var fast besluten att vara den högsta testade koncentrationen (10 mM). Jämfört med tamoxifen och curcumin, både rutinmässigt används som kemoterapeutiska medel, metformin var 30-40% mindre effektiv vid inhibering av cellcykeln. Intressant nog effekterna av metformin på celldelning överensstämde med dem som erhålles genom administrering av aspirin (Figur 4D och 5A), en salicylsyra läkemedel utan någon tydligt identifierad mekanism för celltillväxthämning.

Behandla MMT-celler: Fastställande av tidsförloppet för MMT cellulärt svar på antiproliferativa medel.

En kurs studietid utfördes också för varje antiproliferativ agent eftersom den effektiva dosen av en administrerad läkemedel kan påverkas av exponeringstiden. Som denna modul analyser för cellviabilitet, är det viktigt att först identifiera hur snabbt cellerna delar (fördubbling tid) så en logisk fönster för den tid cellerna utsätts för läkemedlen kan väljas. Det är därför viktigt att MMT cell fördubbling tid varafastställas vid första karakterisera cellerna. Under dessa experiment, var uppgifter kontinuerligt samlas in, granskas och analyseras för att se om eventuella ändringar i protokollet var motiverad. Experimentet utfördes tre gånger, med varje studie som producerar liknande resultat. Experiment fortsatte tills alla celler var döda eller effekterna hade planade.

Kursstudier tid visade att behandling av MMT-celler med optimerade koncentrationer av varje läkemedel som hämmar celldelning (tamoxifen 0,216 mM, curcumin 0,216 mM, metformin 10 mM) under 96 timmar resulterade i fullständig celldöd eller en utplaning av effekterna av läkemedlet ( Figur 6). Även aspirin, "frivilligt" läkemedel, påverkade cellviabiliteten i våra dosresponsstudier, var effekten mindre och därför inte ingår i kursstudier tid.

Figur 1
Figur 1. MMT-celler. Digital mikrofotografi av "friska", obehandlade musbrösttumör (MMT) celler odlade på 3,6 x 10 6 celler / cm2 i modifierad Eagles Minimum Essential Medium (EMEM) .100X, skala = 0,2 mm, indikeras av vit bar. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 2

Figur 2. Hemocytometer rutnät. Mikrofoto av hemocytometer rutnät, 100x. Hela gallersektion som visas i cirkeln (FOV). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

iles / ftp_upload / 52.528 / 52528fig3.jpg "/>

Figur 3. Att utse räkningsområde med Motic programvara.   Bild av hjälplinjer på FOV och definierat område för att räkna MMT-celler etablerade med Motic programvara som sett genom mikroskop. 100X, skala = 0,2 mm, anges av vit bar. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 4
Figur 4. Dos-respons av MMT-celler till anti-proliferativa medel. Digitala mikrofotografier av MMT-celler som odlats i närvaro av anti-proliferativa medel vid varierande koncentrationer under 96 timmar. Tamoxifen: (A1) 0,054 mM (A2) 0,108 mM (A3) 0,162 mM (A4) 0,216 mM; Curcumin: (B1) 0,054 mM (B2) 0,108 mM (B3) 0,162 mM (B4) .216 mM; Metformin: (C1) 2 mM (C2) 4 mM (C3) 6 mM (C4) 8 mm (C5) 10 mM; Aspirin: (D1) 0,030 mM (D2) 0,060 mM (D3) 0,099 mM (D4) 0,150 mM (D5) 0,216 mM; Etanol (100%) och Obehandlad är båda kontrollerna. 100X, skala = 0,1 mm, som visas med blå linjer som utgör varje ruta i rutnätet. klicka gärna här för att se en större version av denna siffra.

Figur 5 A

Figur 5 B

Figur 5. Grafisk representation av dos-responsexperiment av MMT-celler till anti-proliferativa medel. Effekter av ökande koncentrationer av anti-proliferativa medel (A) tamoxifen, curcumin, aspirin, och (B) metformin på MMT cellviabilitet. Resultat enre uttryckt i procent av kontrollen efter 48 timmars behandling, även om cellbehandling fortsattes under 96 timmar. n = 3, är STD anges.

Figur 6
Figur 6. Grafisk representation av tidsförloppet analys av MMT cellulärt svar på antiproliferativa medel. Tidsförloppet studie av effekterna av tamoxifen (0.216mM), curcumin (0.216mM) och metformin (10 mm) på MMT cellviabilitet över 96 tim. Resultaten uttrycks som en procentandel av kontroll efter 48 timmars behandling. Här visas resultaten av ett representativt experiment, n = 1.

Figur 7
Figur 7. Flödesschema av 5-dagars lab-modul.

Celltyp Drug Administered Dagen för experimentet Koncentration av drog Cellräkning med Motic Cell Count med hemocytometer
MMT Obehandlad Dag 2 - 7.8x10 4 celler / cm2 8.0x10 4 celler / cm2
MMT Etanol Dag 2 10 mM 7.1x10 4 celler / cm2 7.2x10 4 celler / cm2
MMT Tamoxifen Dag 2 0,216 MM 0 celler / cm 2 0 celler / cm 2
MMT Tamoxifen Dag 2 0,054 mM 1,3x10 4 celler / cm2 1,5x10 4 celler / cm2
MMT Curcumin Dag 2 0,054 mM 1.9x10 4 calnar / cm 2 2,0x10 4 celler / cm2
MMT Curcumin Dag 2 0,216 mM 0 celler / cm 2 0 celler / cm 2
MMT Metformin Dag 2 2 mM 5.1x10 4 celler / cm2 5.2x10 4 celler / cm2
MMT Metformin Dag 2 6 mM 3.4x10 4 celler / cm2 3,5x10 4 celler / cm2
MMT Aspirin Dag 2 0,099 mM 2.8x10 4 celler / cm2 3,0x10 4 celler / cm2
PC12 Obehandlad Split - 2,5x10 4 celler / cm2 2.1x10 4 celler / cm2

Tabell 1. Jämförelse av hemocytometer och Motic programvara räknar metoder. Resultat av cellräkning av MMT-celler, antingen Motic programvara eller hemocytometern metoder. Både obehandlade och behandlade celler räknades, samt en annan cellinje, PC 12, såsom en kontroll.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

En labbmodul presenteras som syftar till att lära en mängd olika ämnen i cellbiologi genom de avancerade tekniker för djur cellodling. Modulen åstadkommer detta genom att analysera effekterna av ett antal anti-proliferativa kemikalier på replikation av celler som modellerar human bröstcancer. Den primära analysen bygger på den grundläggande tekniken för cellräkning och introducerar ett nytt sätt att räkna celler med hjälp av mikroskopi programvara. Verksamheten omfattar modulen kan utföras med instrument och utrustning finns i de flesta biologiprogram. Modulen kan implementeras i en 5-dagars schema med förnödenheter som är billiga och lätta att få. Även om ett visst märke av digitala mikroskopkamera och mikroskopi programvara används här (Motic Software), bör någon jämförbar kamera och programvara räcker.

Denna labbmodulen utnyttjar MMT-celler som en modell för human bröstcancer. Studenterna först lära sig att växa och karakterisera dessaceller i kultur. Det är viktigt att understryka att ett framgångsrikt slutförande av detta laboratorium modul kräver utredarna (aka studenter) vara väl förtrogen med utseendet och beteendet hos friska MMT-celler, särskilt eftersom obehandlade MMT celler fungerar som kontroller. Därför grundlig karaktärisering av celltillväxtmönster, en fördubbling tid och allmän morfologi MMT-celler är en förutsättning för att kursdata korrekt dos-respons och tid ska genereras.

När tecknas ades MMT cellerna sedan med avseende på deras svar på olika antiproliferativa medel som ett medel för att lära ut ämnen av celldelning, cellcykelreglering, cellsignalering och cancer. Cellviabilitet används för att förstå effekten av dessa läkemedel på cellerna. En ny metod för att räkna celler med hjälp av programvara som är associerade med ett mikroskop monterad digitalkamera, genomförs och jämfört med en traditionell räknar hemocytometer baserad procedur för att verifiera dess riktighet. Thiroman metod tillhandahåller två fördelar, som är särskilt anmärkningsvärt eftersom det används i grundundervisningslaboratorier. Först, eftersom cellerna behöver inte tas bort från vävnadsodlingsplatta för räkning, krävs mindre tid för att utföra de viktigaste experimentella analysen. Detta möjliggör ett stort antal experimentella variabler som skall testas på en gång och i en begränsad tidsperiod. För det andra, ger metoden en digital dokumentation av cellulärt svar på den experimentella behandlingen låta eleverna att utvärdera resultaten och förbättra sin experimentella strategi utanför laboratoriet.

Det finns flera frågor att notera när de genomför båda dessa beräkningssättet. Först, innan räkna cellerna med endera metoden, inkuberas cellerna med trypanblått för att skilja mellan en livsduglig cell och en död cell. Döda celler penetreras av färgämnet och verkar mörkblå, medan viabla celler är ljusa vita. Om emellertid cellerna inkuberas med DYe utöver det rekommenderade inkubationsperioden, kommer de att vara över-färgade och svåra att urskilja. För det andra kan MMT-celler klumpar på hemocytometer eller vävnadsodlingsplattan och vara svåra att räkna individuellt. Därför är en "klump" som utsetts att innehålla ett visst antal celler (t ex 10 celler / klump) är och varje klump som finns på nätet sedan multiplicerat med det numret under räkningen. Slutligen, MMT-celler vidhäfta till ytan av rätter där de odlas. Det är därför nödvändigt att röra spetsen på pipett direkt till plattan när avlägsna cellerna och applicera kraft för att bryta upp cellklumpar och ta bort så många celler från plattan som möjligt. Som ett resultat av det min ta flera försök att få en exakt räkning när du använder den traditionella hemocytometer metoden.

Med cellerna väl karakteriserade och räkningsmetoder verifieras, är två olika experiment; en dos-responsstudie av effekterna av varierande koncentrationerav anti-proliferativa läkemedel på MMT celldelning och ett tidsförlopp experiment för att klargöra den optimala tiden för exponering för dessa läkemedel. Dessa är mycket lärorika experiment som trial and error är nödvändig och det krävs tillämpning av den primära litteraturen för ett lyckat experiment. Exempelvis initiala försök att belysa en dosrespons av MMT-celler till dessa antiproliferativa medel visade att de testade koncentrationerna var för hög, eftersom det fanns 100% celldöd inom 24 h av läkemedelsadministrering. En utökad genomgång av litteraturen ledde till en reviderad rad behandlingskoncentrationer. Det lär effektivt eleverna hur man använder litteraturdatabaser, läsa, analysera och kritisera primära litteratur artiklar och understryker hur dessa färdigheter är väsentliga för den vetenskapliga processen.

Resultat av dos-responsstudier visade att tamoxifen uppvisar den starkaste antiproliferativ effekt vid alla koncentrationer som testades. Tamoxifen, en anti-mitotic läkemedel, används speciellt som en anti-östrogenbehandling för östrogenkänsliga cancer, vanligen i postmenopausal, hormonkänsliga patienter 18-20. Drogen används för närvarande som en bröstcancerbehandling. Tamoxifen konkurrerar med östrogen för den intracellulära östrogenreceptorn och när den är bunden, reglerar ned uttryck av cykliner D och B, två viktiga regulatorer av cellcykeln. Resultat som erhållits i verksamheten tyder på att tamoxifen framgångsrikt bundet till östrogenreceptorn och hämmade cellens progression genom cellcykeln, vilket resulterar i minskad celltillväxt observerades. Intressant minskningen av MMT cellutbredningshotellpriser från alla koncentrationer av tamoxifen administrerade visade inte några tecken på cellulär resistens mot tamoxifen, som kan förväntas baserat på litteraturen (se t ex 19). Detta fungerar som en bra påminnelse om att in vitro villkor i där försöket genomfördes inte fullt modell in vivo omständigheter.

Curcumin behandling av MMT-celler resulterade också i en minskning av cellviabilitet. Curcumin är en förening härledd från gurkmeja roten och fungerar som en celltillväxthämmare 12,16. Det fungerar genom nedreglering av NF-kappa B-vägen och ornitindekarboxylas (ODC) -aktivitet. NF-kappa B är ett proteinkomplex som styr transkription av anti-apoptotiska gener, TRAF1 och TRAF2, som kodar för proteiner som hämmar apoptos. ODC är ett enzym som katalyserar produktionen av polyaminer, proteiner som ger cancerceller med förhöjda näringskällor som leder till ökad tillväxt cellen. Läkemedlet är i nuvarande användning som en bröstcancerbehandling. De antiproliferativa effekterna av curcumin visar tydligt effekten som nedreglering av banan cellsignalering som involverar NF-kappa B och ornitindekarboxylas har på celldelning.

Reducerad cellviabilitet på liknande sätt observer med metformin behandlingsrumnt. Metformin, ett läkemedel administreras typiskt till typ II diabetes, valdes eftersom publicerade rapporter tyder på ett samband mellan patienter som tar metformin och en lägre förekomst av bröstcancer 15. Det antages att medlet modulerar c-myc-genen och därigenom nedreglerar aktiviteten av cyklin D. Uppreglering av cykliner, molekyler som fungerar som riktpunkt inom cellcykeln, tillåter celler att gå vidare genom cykeln i en snabbare takt vilket resulterar i ökad celldelning och tillväxt. Effekterna av metforminbehandling på MMT-celler visar hur modulering av c-myc-genen leder också till nedreglering av cyklin D och en minskning i celldelning. De metformin uppgifter exemplifierar vidare hur en medicin avsedd för en Skick- i detta fall Diabetes- kan ha en verkningsmekanism lämplig för andra avvikande fysiologiska händelser. Dessutom är det viktigt att understryka att även om tamoxifen, curcumin, och metformin alla bromsa onormal cell prolifbete genom olika mekanismer, varje minskade framgångsrikt cellpopulationer och störde celldelning in vitro.

Denna modul gör det också möjligt för öppen utredning i att en annan medicin, naturläkemedel, eller medel kan testas. Aspirin, en over-the-counter smärtstillande, febernedsättande och anti inflammation läkemedel som används för att lindra lindrig smärta och minska feber valdes i denna modul. Aspirin förmåga att minska inflammation kan hämma tumörtillväxt genom att bromsa utvecklingen av nya blodkärl som ger näring åt dem och störa stamceller som bränsle sin tillväxt 11,13,14. Intressant, hade administrering av aspirin för att MMT celler resultera i viss minskning av cellernas livskraft. Lite är känt om den roll som aspirin i förebyggande och behandling av cancer även om många korrelat studier redovisas 13,14, vilket ger ett utmärkt exempel på korrelat kontra orsakande relationer.

TidenKursen studier visade att när de administreras vid optimerade doser, anti-proliferativa läkemedel är mycket effektiva på att störa celldelning inom 4 dagar efter första exponeringen. Dessa studier ger också en möjlighet för studenterna att använda vad de lärt sig om MMT celltillväxtegenskaper när man utformar en experimentell strategi för att genomföra dessa experiment. I själva verket, noggrant karakterisera celltillväxtmönster, en fördubbling tid och allmän cellmorfologin av MMT-celler är av avgörande betydelse för både korrekta dos-respons och tidskursdata.

Båda kursstudier dos-respons och tids bestämma förhållandet mellan läkemedelskoncentration och exponeringstiden, respektive, och effekten ett läkemedel har i ett biologiskt system. Detta är ett utmärkt sätt att få eleverna att tänka om intermolekylära interaktioner och andra fundamentala begrepp i biokemi under den tid som utredningen drivs, forskningsverksamhet. Det är värt att notera att eftersom många biology majors planerar att delta i läkarutbildningen, anpassar denna laboration modulen väl med det nyinstiftade förändringar i läkarutbildningen krav 21.

Denna labb modul kan genomföras exakt såsom beskrivits eller kan lätt tjäna som mall. En mängd variationer kan införlivas i denna verksamhet, såsom valet av antiproliferativa medel, celltyp eller närings ändring i tillväxtmediet. Så länge som en hypotes utvecklas som testar grundläggande och avancerade koncept för cell eller allmän biologi, permutationer av denna modul är många. Oavsett permutation, styr genomförandet av denna verksamhet naturligtvis student att lära sig ett stort utbud av laboratorietekniker och bli bekant med en mängd utrustning och instrumentering.

Sammanfattningsvis labbet modulen beskrivs här tillåter eleverna att delta fullt ut i processen för vetenskap, utveckla sin förmåga att förvärva, analysera och grafiskt reprESENT data och finslipa sin tidsplanering och samarbetsförmåga. Modulen är utformad för att underlätta öppen utredning och är lätt att anpassa till olika kursscheman och kompetensnivå. Det bör noteras att de båda första författarna till detta dokument är grund biologi stora företagen, vilket tydligt visar att denna labb modulen är lämplig för denna population.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna erhöll inga ekonomiska eller motsvarande stöd från Motic.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Tissue Culture Hood ESCO Labculture Reliant Class II Type A2 Biological Safety Cabinet
Waterjactor CO2 Incubator CEDCO Model 1510
Bright-line Hemocytometer American Optical with two separate grids
Motic Images Plus Mac OSX Verison 2.0 or higher
Gilson Pipetman Rainin instrument co. inc P-20D, P-200D, P-1000D
CK30/CK40 Culture Microscope Olympus 4 objective inverted light microscope with camera
200 μl Pipet tips MidSci 40200C
1,000 μl Pipet tips MidSci AVR4
10 ml Seriological Pipets TPP TP94010
24 well plates CoStar- Tissue Culture Cluster 3524 24 wells, 16 mm well diameter, radiation sterilized
Trypan Blue Solution 0.4% Sigma T8154 100 ml, cell culture tested non-haz
Bright-line Hemacytometer replacement coverslip, non-haz Sigma Z375357
Mouse Mammary Tumor(MMT) cells ATCC CCL-51
Eagle Minimum Essentail Medium (EMEM) ATCC 30-2003 500 ml
Fetal Bovine Serum Sigma F0926 500 ml
Metformin Hydrochloride Sigma PHR1084 500 mg
Tamoxifen Sigma T5648 white or white-yellow powder
Curmumin Sigma C1386 yellow-orange powder
Aspirin Sigma A2093 meets USP testing specifications

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hammamieh, R., et al. Students investigating the antiproliferative effects of synthesized drugs on mouse mammary tumor cells. Cell Biol Educ. 4 (3), 221-234 (2005).
  2. Sykes, J. A., Whitescarver, J., Briggs, L. Observations on a cell line producing mammary tumor virus. J Natl Cancer Inst. 41 (6), 1315-1327 (1968).
  3. Palombi, P. S. J., Snell, K. Learning about Cells as Dynamic Entities: An Inquiry-Driven Cell Culture Project. Bioscene: Journal of College Biology Teaching. 33, 27-33 (2008).
  4. Ledbetter, M. L. S., Lippert, M. J. Glucose Transport in Cultured Animal Cells: An Exercise for the Undergraduate Cell Biology Laboratory. Cell Biology Education. 1 (3), 76-86 (2002).
  5. Weaver, D. Cardiac Cells Beating in Culture: A Laboratory Exercise. American Biology Teacher. 69, 407-410 (2007).
  6. Marion, R. E., Gardner, G. E., Parks, L. D. Multiweek cell culture project for use in upper-level biology laboratories. Advances in Physiology Education. 36, 154-157 (2012).
  7. Mozdziak, P. E. P., James, N., Carson, S. usanD. An Introductory Undergraduate Course Covering Animal Cell Culture Techniques. Biochemistry and Molecular Biology Education. 32 (5), 319-322 (2004).
  8. Anderson, L. W., et al. A taxonomy for learning, teaching and assessing: A revision of Bloom's Taxonomy of educational objectives (Complete Edition). , Longman, London, England. (2001).
  9. Centers for Disease Contol and Prevention. Appendix A - Primary Containment for Biohazards: Selection, Installation and Use of Biological Safety Cabinets. , (2014).
  10. Davis, J. M. Basic Cell Culture: A Practical Approach. , 2nd edn, Oxford University Press. Oxford, UK. (2002).
  11. Algra, A. M., Rothwell, P. M. Effects of regular aspirin on long-term cancer incidence and metastasis: a systematic comparison of evidence from observational studies versus randomised trials. Lancet Oncol. 13 (5), 518-527 (2012).
  12. Anand, P., Sundaram, C., Jhurani, S., Kunnumakkara, A. B., Aggarwal, B. B. Curcumin and cancer: an 'old-age' disease with an 'age-old' solution. Cancer Lett. 267 (1), 133-164 (2008).
  13. Ararat, E., Sahin, I., Altundag, K. Mechanisms behind the aspirin use and decreased breast cancer incidence. J BUON. 16 (1), 180 (2011).
  14. Ararat, E., Sahin, I., Altundag, K. Aspirin intake may prevent metastasis in patients with triple-negative breast cancer. Med Oncol. 28 (4), 1308-1310 (2011).
  15. Blandino, G., et al. Metformin elicits anticancer effects through the sequential modulation of DICER and c-MYC. Nat Commun. 3, 865 (2012).
  16. Kunnumakkara, A. B., Anand, P., Aggarwal, B. B. Curcumin inhibits proliferation, invasion, angiogenesis and metastasis of different cancers through interaction with multiple cell signaling proteins. Cancer Lett. 269 (2), 199-225 (2008).
  17. Burstein, D. E., Blumberg, P. M., Greene, L. A. Nerve growth factor-induced neuronal differentiation of PC12 pheochromocytoma cells: lack of inhibition by a tumor promoter. Brain Res. 247 (1), 115-119 (1982).
  18. Nazarali, S. A., Narod, S. A. Tamoxifen for women at high risk of breast cancer. Breast Cancer (Dove Med Press). 6, 29-36 (2014).
  19. Cui, J., et al. Cross-talk between HER2 and MED1 regulates tamoxifen resistance of human breast cancer cells). Cancer Res. 72 (21), 5625-5634 (2012).
  20. Komm, B. S., Mirkin, S. An overview of current and emerging SERMs. J Steroid Biochem Mol Biol. 143C, 207-222 (2014).
  21. Kaplan, R. M., Satterfield, J. M., Kington, R. S. Building a better physician--the case for the new MCAT. N Engl J Med. 366 (14), 1265-1268 (2012).

Tags

Cancer Biology Utgåva 100 cellcykel cellsignalering cancer laboratoriemodul mus brösttumörceller MMT-celler grund- med öppna ändar förfrågan bröstcancer cellräkning cellviabilitet mikroskopi vetenskaplig utbildning cellodling undervisning labb
Använda musbrösttumör celler att undervisa Kärn Biologi Concepts: En enkel Lab Modul
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

McIlrath, V., Trye, A., Aguanno, A.More

McIlrath, V., Trye, A., Aguanno, A. Using Mouse Mammary Tumor Cells to Teach Core Biology Concepts: A Simple Lab Module. J. Vis. Exp. (100), e52528, doi:10.3791/52528 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter