Introduction
Oft in Bachelor allgemeine Biologie Kurse werden die Themen der Regulation des Zellzyklus und Krebs berührt, aber nicht im Detail untersucht, da die Breite der Inhalte in diesen Kursen lässt wenig Zeit für die Tiefe. Außerdem Bachelor Biologie-Studenten sind normalerweise nicht zu den fortgeschrittenen Techniken mit tierischen Zellkultur ausgesetzt. Die Schüler entwickeln ein tieferes Verständnis dieser Konzepte, während der Anwendung und zu analysieren, was sie gelernt haben, wurde ein Labor-Aktivität als eine Modifikation des Walter Reed Army Institute of Research (WRAIR) erweitert Labortätigkeit 1 entwickelt. Das Labor-Modul verwendet eine stufenweise, experimentelle Strategie, die wachsen und Charakterisierung einer Krebszellmodell die Entwicklung und Durchführung der Zellzählung Methoden zur Einführung optimalen zeitlichen Verlauf und die Dosierungen für die Behandlung von Zellen, die mit anti-proliferative Mittel, und Identifizieren aberrante Zelle-Signalwege umfasst . Das Experiment ermöglicht auch offen-ended Anfrage.
Die meisten Techniken für diese Tätigkeit erforderlich ist, kann in einem typischen Biologie-Unterricht Labor durchgeführt werden. Die Aktivität beginnt mit Studenten Charakterisierung der Morphologie und Wachstumsrate des Maus-Mamma-Tumor (MMT) Zelllinie, ein Modell für die menschliche Brustkrebs-2. Brustkrebs wurde als Modell Krebs wegen seiner Verbreitung in der Bevölkerung, seine Bekanntheit bei den College-Alter Studenten, und den weit verbreiteten Daten ausgewählt. Die MMT-Zelllinie wurde speziell ausgewählt, weil es leicht erhältlich, gut charakterisierte, hat eine kurze Verdopplungszeit und ist einfach zu züchten. Außerdem MMT Zellen sind östrogenabhängigen die im Einklang mit den meisten weiblichen Brustkrebs ist. Studenten dann identifizieren aberrante Zelle-Signalwege in den MMT-Zellen durch Behandlung der Zellen mit Chemotherapeutika, deren Wirkungsmechanismus auch established.The Konzentration von Arzneimitteln und der Länge der Behandlung variiert werden, damit die Schülerum die Wirkung dieser Variablen auf die Geschwindigkeit der Zellteilung zu bewerten. Der Schlüssel-Assay für diese Aktivität ist die Bestimmung der Lebensfähigkeit der Zellen, die einfach erfordert Zellzählung unter Verwendung eines von zwei Verfahren. Jede Methode ist abhängig von starken Mikroskopie Fähigkeiten. Die Schüler bestimmen, die Lebensfähigkeit der Zellen unter Verwendung eines Standard Hämozytometer Verfahren und eine neue Photomikroskopie Verfahren und vorzuschlagen. Auf der Grundlage ihrer Erkenntnisse, sie schlagen und testen Sie Änderungen an der Aktivität. Studenten dann ihre Daten darstellen und die Ergebnisse zu interpretieren, um ihre Hypothese zu verfeinern und entwickeln neue experimentelle Strategien.
Dieses Labor-Aktivität ist für Erstsemester oder College-Student-Ebene Studenten im Hauptstudium der Biologie geeignet. Es ist in einem einwöchigen Labormodul, das in einem ersten Jahres abgeschlossen werden kann, allgemeine Biologie oder zweiten Jahr zellulären / molekularen Biologie natürlich kondensiert. Fähigkeiten für die ordnungsgemäße Beendigung der Tätigkeit erforderlich sind grundlegende Arithmetik und Algebra, Vertrautheit mit einer Reihe von core Labor Fähigkeiten (zB Pipettieren, Lösung Herstellung, steriler Technik), Datenanalyse, Grundlichtmikroskopie und Zeitmanagement, zusammen mit Instructor Wissen der Zellkultur und Tabellenkalkulationssoftware. Erforderliche Reagenzien gehören Tierzellinie Modell für Krebs (zB Maus-Brusttumorzellen, MMT 2), Chemotherapeutika (zB Tamoxifen, Curcumin, Metformin und Aspirin), Trypanblau und Zellkulturmedien (zB Eagles Minimum Essential Medium ; EMEM) mit entsprechenden Ergänzungen (zB Geber Pferd und fötales Rinderserum). Benötigte Instrumente umfassen einen invertierten Lichtmikroskop mit Digitalkamera Anlage, Computer, 100 mm und 24 Gewebekulturplatten, CO 2 Inkubator (oder gleichwertig), Biosicherheitswerkbank (BSC; Klasse II), Hämozytometer und digitale Mikroskopie-Software.
Es gibt gute Beispiele für spezifische Laboraktivitäten, die auf tierische Zellkultur verlassen, um TEACh Studenten über Konzepte in der Zellbiologie 3. Allerdings erfordern viele Lieferungen oder Techniken, die nicht leicht zugänglich sind (zB radioaktive Isotope, Live tierischem Gewebe, moderne bildgebende Geräte 1,4,5), beschreiben Protokolle, die recht weit fortgeschritten (zB für eine 400-Level-Kurs 6) sind, oder erfordern mehrwöchigen oder Semester lang Projekte 6,7. Die hier beschriebene Labortätigkeit ist einfach und kann in einer einzigen Woche mit gemeinsamen Laborausrüstung durchgeführt werden.
Zusammenfassend diese Labormodul effektiv führt oder stärkt die Konzepte der Zellzyklus, zelluläre Signalwege und Krebs beim Unterrichten grundlegende und erweiterte Laborkenntnisse, experimentellen Datenanalyse, die Methode der Tierzellkultur und den wissenschaftlichen Prozess. Das Labor-Modul ist einfach und wirtschaftlich erreichbar und bietet Flexibilität und Gelegenheit für offene Anfrage. Die Aktivität fördert Studenten Kreativitätdurch die Bereitstellung einer Vorlage experimentelle Strategie, die als Leitfaden, aber nicht ein Rezept wirkt. Am wichtigsten ist, die Aktivität erfüllt alle Lerndomänen von Blooms Taxonomie 8, wie es erfordert Erinnerung, Verständnis, Anwendung, Analyse, Bewertung und die Schaffung von durch die Gewinnung Studenten in einem Prozess, der sie aus dem Lehrbuch und in die Welt der wissenschaftlichen Forschung zieht.
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Protocol
Hinweise: Conduct alle Arbeiten mit Zellen und Zellkultur-Reagenzien in der Klasse II Biosicherheitswerkbank (BSC) 9. MMT Zellen als Biosafety Level I klassifiziert, da sie geringe bis mäßige biologische Risiko darstellen. Wenden Sie korrekte Reinigung und Dekontamination Verfahren im Rahmen der BSC zwischen Nutzungen (zB UV-Licht, 70% Ethanol abwischen).
1. Wachsen MMT Zellen
- Wachsen Zellen in 10 cm-Gewebekulturschalen mit 10 ml nährstoffreichen Medium, Eagles Minimum Essential Medium (EMEM) aus mit 10% fötalem Rinderserum (FBS), 2 mM Glutamin und 1% antimykotische / Antibiotika (Penicillin 10 Einheiten , 100 ug Streptomycin, 0,25 ug Amphotericin B). Kultivieren Zellen in einer befeuchteten 5% CO 2 Kammer bei 37 ° C. Platten Zellen in einer Dichte von 3,6 x 10 6 Zellen / cm 2 (siehe die Zellzählung im Schritt 2).
- Ersetzen Sie die Hälfte der Zellkulturmedien durch frisches Medium alle 48 Stunden unless anders angegeben. Überprüfen Sie die Lebensfähigkeit der Zellen und Morphologie durch Untersuchung mit einem invertierten Phasenkontrastlichtmikroskop.
- Hinweis und zu charakterisieren Zellen für Größe, Struktur, Form, Organisation und geschätzte Zahl unter 100 - 200-facher Vergrößerung. Bei dieser Dichte sollten die Zellen in einer Ebene angezeigt werden, nicht übereinander und in großer Nähe verklumpt. Jede Zelle besteht aus einem dichten, kugelförmigen Kern mit dünnen, langen, zweigartigen Erweiterungen Erweiterung aus, die es zu einem Punkt zu kommen (siehe Abbildung 1).
- Zellen zu unterteilen, wenn sie eine Zelldichte von 7,2 x 10 6 Zellen / cm 2 zu erreichen. Zellen weisen eine Verdopplungsrate von 1,8 x 10 6 Zellen / cm 2 pro 24 Std. Bezeichnen Zellen Passage X (Px), die Anzahl der Zeiten, die sie aufgeteilt worden zu bezeichnen.
- An Generation 3 (dh nach drei Durchgängen, P3), der Ernte, zu zählen, und die Platte, die Zellen auf eine 24-Well-Gewebekulturplatte mit einer Dichte von 3,6 x 10 6 2.
- Ansicht Zellen jeden Tag und Rekord digitale Mikrofotografien. Hinweis und beschreiben Zellmorphologie (dh Größe, Form, Licht reflektierenden Eigenschaften). Bestimmen Sie Zellverdopplungszeit durch Zählen Zellen regelmäßig und über die verstrichene Zeit auf die Zellzahl.
2. Zählen MMT Cells
Hinweis: Zählen von Zellen zu bestimmen, ob Zellen müssen subkultiviert werden, um für ein Experiment einzurichten oder um die Lebensfähigkeit der Zellen zu bestimmen. Es gibt zwei Möglichkeiten vorgestellt.
- Verwendung einer Zählkammer, ein Standardverfahren, um Zellen zu zählen.
- Besorgen Sie sich eine hell-line Hämozytometer, eine 0,2% ige Lösung von Trypanblau, einer Verbindung Lichtmikroskop, sterile Reagenzgläser, Pipetten und einem manuellen Zellzähler.
- Unter dem BSC, verwenden Sie ein 10 ml-Pipette, um Zellen aus einer 10 cm Gewebekulturschale zu entfernen. Wenn die Zellen auf einer Platte mit 24 Vertiefungen gezüchtet Verwendung einer 1 ml Pipette oder 1.000 & mgr; l-Mikropipette, um das Medium zu entfernen.
- Legen Sie die resultierende Zellsuspension in ein 15 ml sterilen Röhrchen (oder 1 ml Mikrozentrifugen oder andere kleine Volumen Rohr). Ansonsten lassen Sie die Zellen in der ursprünglichen Gewebekulturplatte / well.
- Unter dem BSC kombinieren 10 ul der Zellsuspension mit 10 ul der Trypanblau-Lösung (Verhältnis 1: 1) in einem nicht-sterilen Mikrozentrifugen oder andere kleine Volumen Röhre.
Hinweis: Trypanblau ist ein Vitalfarbstoff, der nicht von gesunden lebenden Zellen aufgenommen wird. Wenn Zellen beschädigt oder tot, Trypanblau kann die Zelle so toten Zellen zu zählen, geben Sie (aka Farbausschlussverfahren). Daher unter dem Mikroskop, tote Zellen erscheinen dunkelviolett, während lebensfähige Zellen sind eine helle und hell in der Farbe. - Bebrütenbei RT für 5 min.
- Legen Sie das Deckglas auf der Zählkammer. Auftragen von 10 ul des Trypanblau-Zellsuspensionsmischung in die Nut. Sehen Sie sich die Zählkammer bei 100 - 200-facher Vergrößerung. Ein Vier-Ecken-Gitter ist offensichtlich (siehe Abbildung 2).
- Zählen Sie die Anzahl der lebensfähigen Zellen (ungefärbten) gegenüber Gesamtzellen in jeder Rasterfläche. Der Mittelwert der vier Gitter und multiplizieren mit 1 x 10 4 bis Zellen / ml zu erhalten.
- Zu extrapolieren, die Gesamtzahl der Zellen pro Schale (oder Zellen / cm 2). Verwenden Sie diese Nummer, um entweder zu bestimmen, das richtige Volumen der Zellsuspension zu verwenden, um eine neue Gewebekulturplatte mit der gewünschten Dichte von 3,6 x 10 6 Zellen / cm 2 Samen oder bestimmen Gesamtzahl der lebensfähigen Zellen auf der Platte oder in den Brunnen.
Hinweis: Weitere Leitlinien für die Verwendung von einem Hämocytometer, siehe 10.
- Zu extrapolieren, die Gesamtzahl der Zellen pro Schale (oder Zellen / cm 2). Verwenden Sie diese Nummer, um entweder zu bestimmen, das richtige Volumen der Zellsuspension zu verwenden, um eine neue Gewebekulturplatte mit der gewünschten Dichte von 3,6 x 10 6 Zellen / cm 2 Samen oder bestimmen Gesamtzahl der lebensfähigen Zellen auf der Platte oder in den Brunnen.
- Verwenden Software und eine Digitalkamera an lebensfähigen Zellen zu zählen.
- Besorgen Sie sich eine digital-Kamera, die dazugehörige Software, eine 0,4% ige Lösung von Trypanblau, einer Verbindung Lichtmikroskop, sterile Reagenzgläser, Pipetten und einem Computer.
Hinweis: Ein Moticam 2.000 Digitalkamera mit begleitenden Software Motic ist hier beschäftigt. Alle vergleichbaren Kamera und Software sollte ausreichend sein. Sicherzustellen, dass der Digitalkamera-Software wurde vorab (nach dem Protokoll des Herstellers) kalibriert. - Unter dem BSC, verwenden Sie ein 1 ml-Pipette oder 1000 ul-Mikropipette, um die Medien von den MMT Zellen wachsen in einem 24-Well-Gewebekulturschale zu entfernen. Waschen Sie die anhaftenden Zellen durch leichtes Anlegen einer geringen Menge (etwa 500 ul) der un-ergänzt (dh EMEM ohne Ergänzungen) frisches Medium auf die Platte dann entfernen. Direkt an den gut: Übernehmen 10 ul 0,2% Trypanblau (1 mit un-EMEM ergänzt durch Verdünnen von 1 gemacht).
- Die Platte bei Raumtemperatur für 5 min.
- Sehen Sie sich die Platte unter dem Mikroskop bei 100 - 200-facher Vergrößerung with eine Digitalkamera angeschlossen. Platte kann mit nicht ergänzten Medium gewaschen werden, wenn Färbung mit 2% Trypanblau ist zu dunkel.
- Öffnen Sie die Software auf dem Computer ein nd überprüfen, ob die Software mit dem Ziel, über die Registerkarte Einstellungen verwendet, kalibriert. Ein Bild von dem FOV sollte angezeigt werden.
- Wählen Sie das Gitter auf der Registerkarte Measure. Ein Raster aus Quadraten etwa 0,005 cm in der Breite wird angezeigt. Wählen Sie Grid Info, um die Fläche jedes Quadrat zu bestätigen.
- Wählen Sie einen bestimmten Bereich des Netzes, um Zellen zu zählen (dh 5 x 9 Quadrate Quadrate). Wählen Sie Rechteck auf der Registerkarte Measure. Klicken Sie auf die Ecke eines Quadrats und ziehen Sie den Cursor, um die Quadrate der Wahl umfassen.
Hinweis: Ein Schatten des Grüns wird die Quadrate der Auswahl und einem weißen Feld wird in der Ecke, die Breite, Höhe, Fläche bietet erscheinen und Umfang der Abschnitt des gewählten Gitterabdeckung (siehe Abbildung 3). - Die Anzahl der VIABle Zellen innerhalb der ermittelten Fläche. Machen Sie dasselbe für zwei weitere Standorte in der gleichen gut oder Platte durch Bewegen der Platte unter dem Mikroskop.
- Achten Sie darauf, dass der gemessene Bereich ist der gleiche und die Vergrößerung nicht geändert hat. Berechnung der durchschnittlichen Zahl der lebensfähigen Zellen innerhalb der Region. Verwendung der Fläche der Bohrung (für eine 24-Well-Platte besitzt eine Vertiefung eine Fläche von 2 cm 2, für eine 100-mm-Schale die Fläche 78,6 cm 2) zu extrapolieren, die Anzahl lebensfähiger Zellen, die aus dem Bereich, in dem Gitterrahmen abgegrenzt die Gesamtzahl von Zellen innerhalb des Bohrlochs (Zellen / cm 2).
- Besorgen Sie sich eine digital-Kamera, die dazugehörige Software, eine 0,4% ige Lösung von Trypanblau, einer Verbindung Lichtmikroskop, sterile Reagenzgläser, Pipetten und einem Computer.
3. Gönnen MMT Zellen, die mit anti-proliferative Agents
- Werden die Lösungen der ausgewählten antiproliferative therapeutische Mittel (Tamoxifen, Curcumin und Metformin) und optional Medikament, Aspirin unter der BSC.
- Aufzulösen Curcumin und Tamoxifen in 100% Ethanol, um eine Stammkonzentration von 27 mM zu erzeugen. Löse Metformin und Aspirin in unsupplemented EMEM, um eine Stammkonzentration von 500 mM und 15 mM zu erzeugen sind.
- Stellen Sie eine Dose Response.
- Gönnen MMT Zellen mit den drei antiproliferative therapeutische Mittel (Tamoxifen, Curcumin und Metformin) und optional Medikament (Aspirin) bei verschiedenen Konzentrationen für 96 Stunden, um eine Dosis-Wirkungskurve zu erzeugen. Zunächst verwalten alle Medikamente zu einem Bereich von Konzentrationen auf der Grundlage veröffentlichter Berichte 1,11-16 und dann in Konzentrationen größer oder kleiner als die veröffentlicht.
Anmerkung: Eine Dosis-Antwort bestimmt die minimale Konzentration eines Arzneimittels notwendig, um die gewünschten Ergebnisse zu erzielen. Hier kann die gewünschte Ergebnis ist eine Verringerung der Zellproliferation im Vergleich zu der Kontrolle.- Für Tamoxifen und Curcumin, benutzen Konzentrationen (und entsprechenden Volumina) von 0,054 mm (1 & mgr; l), 0.108 mm (2 ul), 0,162 mm (3 ul) und 0,216 mm (4 ul).
- Für Metformin, verwenden Konzentrationen (und entsprechenden Volumina) von 2 mm (2 & mgr;), 4 mm (4 & mgr; l), 6 mM (6 ul), 8 mM (8 ul) und 10 mM (10 & mgr; l).
- Aspirin, Anwendungskonzentrationen (und die entsprechenden Volumina) von 0,030 mm (1 ul), 0,060 mm (2 ul), 0,099 mM (3,3 ul), 0,150 mm (5 & mgr; l) und 0,216 mM (6,7 ul).
- Aufgeteilt MMT Zellen von der 10-cm-Schale auf eine Platte mit 24 Vertiefungen bei einer Konzentration von 3,6 x 10 6 Zellen / cm 2. Bestimmen anfänglichen Zellkonzentration von beiden Zell Zählverfahren (Schritt 2). Rufen Sie diese neue 24-Well-Platte von Zellen "Day Split".
- 24 h nach der Zell Plattieren, behandeln die MMT-Zellen mit jeder der antiproliferative therapeutische Mittel, Tamoxifen, Curcumin, Metformin und Aspirin, bei dem in Schritt 3.2.1 beschriebenen Konzentrationen. Bezeichnen dies als "Tag 0".
- Wie jede Vertiefung kann maximal 500 ul Medien, Nutzung Mikropipetten mit sterilen Mikropipettenspitzen und eine neue Spitze jedes Mal eine neue gut behandelt wird, um zu vermeiden, halten Sie cross Kontamination. Mit zwei Vertiefungen als Kontrolle: Zellen in der Abwesenheit einer Medikamentenbehandlung (Negativkontrolle) und Zellen in Gegenwart von 100% Ethanol (Lösungsmittel Kontrolle) gezüchtet gezüchtet.
- Wachsen Zellen und neu zu verwalten Drogen an den beschriebenen Konzentrationen, wenn die Zellen jeden zweiten Tag gefüttert (siehe Schritt 1.2) für 96 Stunden (bis zum Tag 4) an den Tagen 1 -. 4 der Behandlung, beachten Sie die Zellen unter dem Mikroskop und zählen mit das Verfahren in Schritt 2.2 (siehe Figur 4).
- Wiederhole den Versuch mindestens drei Mal.
- Bestimmen optimale Wirkstoffkonzentration, durch die grafische Darstellung der Beziehung zwischen Zelllebensfähigkeit und Medikamentendosierung über die Länge des Experiments (siehe Abbildung 5).
- Gönnen MMT Zellen mit den drei antiproliferative therapeutische Mittel (Tamoxifen, Curcumin und Metformin) und optional Medikament (Aspirin) bei verschiedenen Konzentrationen für 96 Stunden, um eine Dosis-Wirkungskurve zu erzeugen. Zunächst verwalten alle Medikamente zu einem Bereich von Konzentrationen auf der Grundlage veröffentlichter Berichte 1,11-16 und dann in Konzentrationen größer oder kleiner als die veröffentlicht.
- Stellen Sie den Zeitverlauf.
- Behandeln MMT Zellen mit den drei antiproliferative therapeutische Mittel (Tamoxifen, Curcumin und Metformin) bei einer festen Konzentration für verschiedene Zeitabstände. Verwenden Sie die optimale Konzentration identifdurch die Dose Response Experimente ied (siehe Schritt 3.2).
- Verwenden Sie die folgenden Konzentrationen: 0,216 mM Tamoxifen, 0,216 mM Curcumin und 10 mM Metformin.
Hinweis: Ein Zeitverlauf bestimmt die Menge an Zeit, die für ein Arzneimittel, ihre optimale gewünschte Ergebnis zu erzeugen. Hier ist das gewünschte Ergebnis eine Verringerung der Zellproliferation im Vergleich zu der Kontrolle.
- Verwenden Sie die folgenden Konzentrationen: 0,216 mM Tamoxifen, 0,216 mM Curcumin und 10 mM Metformin.
- Aufgeteilt MMT Zellen von der 10-cm-Schale auf eine Platte mit 24 Vertiefungen bei einer Konzentration von 3,6 x 10 6 Zellen / cm 2. Bestimmen anfänglichen Zellkonzentration von beiden Zell Zählverfahren (Schritt 2). Rufen Sie diese neue 24-Well-Platte von Zellen "Day Split".
- 24 h nach der Zell Plattieren, behandeln die MMT-Zellen mit jeder der antiproliferative therapeutische Mittel, Tamoxifen, Curcumin, Metformin und Aspirin an den optimalen Konzentrationen in Schritt 3.2 identifiziert. Bezeichnen dies als "Tag 0".
- Da jeder kann auch ein Maximum von 500 ul Medium zu halten, unse-Mikropipetten mit sterilen Mikropipettenspitzen und eine neue Spitze jedes Mal eine neue gut behandelt wird, um eine Kreuzkontamination zu vermeiden.
- Mit zwei Vertiefungen als Kontrolle: Zellen in der Abwesenheit einer Medikamentenbehandlung (Negativkontrolle) und Zellen in Gegenwart von 100% Ethanol (Lösungsmittel Kontrolle) gezüchtet gezüchtet.
- Behandeln MMT Zellen mit den drei antiproliferative therapeutische Mittel (Tamoxifen, Curcumin und Metformin) bei einer festen Konzentration für verschiedene Zeitabstände. Verwenden Sie die optimale Konzentration identifdurch die Dose Response Experimente ied (siehe Schritt 3.2).
- Wachsen Zellen und neu zu verwalten Drogen in der gewählten Konzentration, wenn die Zellen jeden zweiten Tag gefüttert (siehe Schritt 1.2) für 96 Stunden (bis zum Tag 4). An den Tagen 1 - 4 von Behandlung, beachten Sie die Zellen unter dem Mikroskop zu zählen und mit der Methode in Schritt 2.2 (siehe Abbildung 4).
- Wiederhole den Versuch mindestens drei Mal.
- Bestimmen, optimalen Belichtungszeit von MMT Zellen miteinander Arzneimittels durch die grafische Darstellung der Beziehung zwischen der Lebensfähigkeit der Zellen und die Länge (Zeit) der medikamentösen Behandlung in der gewählten Konzentration (siehe Abbildung 6).
4. Die Lab-Modul
Hinweis: Das Folgende ist eine 5-Tage-lab Zeitplan für Labor-Modul. 7 ist ein Flußdiagramm, was der Zeitplan würden innerhalb der 5 Tage bringen. Für diese Tätigkeit in fünf Tagen abgeschlossen sein entweder ein Zeitverlauf oder eine Dosis-Wirkungskurve erzeugt wird. Es ist nicht ausreichend Zeit, um die beiden Kurven zu erzeugen. Eine Dosis-Antwort-Experiment wird nachstehend beschrieben. Ein Zeitverlauf Experiment kann leicht ausgetauscht werden
- Teilen Sie die Klasse in Gruppen: haben eine Gruppe stellen Sie eine Dosis-Wirkung und die andere eine zeitliche Verlauf der Wahl einer Konzentration in der Mitte der vorgeschlagenen Dosis-Wirkungs-Konzentrationen.
- Achten Sie auf ausreichende Kulturen und Pharma-Aktien in geeigneten Konzentrationen. Wenn nicht anders angegeben, führen alle Arbeiten im Rahmen des BSC.
- Tag 1
- Direkter Schüler Medien machen und wachsen Zellen (wie in Schritt 1).
- Als Studenten erhalten einen Bestand von MMT Zellen auf einer 10 cm Platte, leiten die Schüler zu Zellkulturmedien vorbereiten und ein Tutorial in der Verwendung des hemocytometer, digitale Mikroskopie und die Digitalkamera Mikroskopie-Software (wie in Schritt 2).
- Kalibrieren der Software auf die auf dem Mikroskop verwendet Ziele (zB, 4X, 10X, 20X) nun mit dem Protokoll des Herstellers.
- Tag 2
- Lassen Sie die Schüler bestätigen, Gesamtzellzahl und Zelllebensfähigkeit (wie in Schritt 2).
- Lassen Sie die Schüler zählen Zellen auf der 100 mm-Schale unter Verwendung sowohl der Mikroskopie-Software und die Zählkammer Methoden, um zu bestätigen, ähnliche Ergebnisse erzielt werden.
- Direkter Schüler eine Platte mit 24 Vertiefungen und Split-Zellen aus der 100-mm-Schale, um den 24-Well-Platten auf die gewünschte Ausgangszelle Beschichtungs-Dichte (wie in Schritt 1) zu erhalten. Dies wird als Tag Split. Legen Sie die Platte mit 24 Vertiefungen in einem Zellkulturbrutschrank für 24 Stunden.
- Tag 3
- Wachsen MMT Zellen für 24 Stunden auf einer 24-Well-Platte. Lassen Sie die Schüler Zellen unter dem Mikroskop beobachten und zählen mit Mikroskopie-Software (wie in Schritt 2).
- Geben Sie dem Schüler / tebin Proben der Krebsbehandlung Drogenbestände. Haben sie vorbereiten und verdünnen das ursprüngliche Stammlösung (wie in Schritt 3). Hinzufügen der verschiedenen Konzentrationen der Wirkstoffe, ihre Zellen, um eine Standardkurve herzustellen. Dies wird als Tag 0.
- Inkubiere Zellen (Schritt 1.2) mit den Medikamenten für maximal 48 Stunden.
- Tag 4
- Lassen Sie die Schüler behandelten Zellen beobachten, nach 24 Stunden. Dies ist Tag 1.
- Zählen Sie jeden gut mit Mikroskopie-Software. Record Fotografien jedes gut, so dass das Zählen kann außerhalb des Labors (wie in Schritt 2) durchgeführt werden.
- Inkubieren Zellen (Schritt 1.2) mit den Medikamenten für weitere 24 Stunden.
Hinweis: Instructor bietet zusätzliche Tutorials und Bewertungen der Datenanalyse und grafische Darstellung. Die Studierenden lernen, Zahlen, Grundstücke, und die statistische Analyse für den nächsten Tag der Datensammlung zu erstellen.
- Tag 5
- Lassen Sie die Schüler behandelten Zellen nach 48 Stunden, Tag 2.
- Zählen Sie jeweilsauch mit Hilfe der Mikroskopie-Software. Record Fotografien jedes gut, so dass das Zählen kann außerhalb des Labors (wie in Schritt 2) durchgeführt werden.
- Ernte und sammeln Zellen zum Zählen von der traditionellen Hämozytometer Verfahren als Mittel zur Überprüfung der Student Fähigkeit, effektiv zu nutzen die Mikroskopie-Software-Methode (wie in Schritt 2).
Hinweis: Sammeln von Daten und Schlussfolgerungen zu ziehen oder zu revidieren, Hypothesen, entsprechend.
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Representative Results
Wachsende MMT Zellen und Vergleichen Zählverfahren.
Mäusebrusttumorzellen wurden erfolgreich gezüchtet und charakterisiert (Figur 1) und ein neues Verfahren der Zellzählung unter Verwendung Motic Software, eine Digitalkamera-assoziierten Softwareprogramm für ein Mikroskop entwickelt. Diese neue Zell Zählverfahren wurde zu einem traditionellen Zählverfahren unter Verwendung eines Hämocytometers (Abbildung 2) verglichen, und es zeigte ebenso genaue Bestimmung der Zellzahl (Tabelle 1) zu sein. Um irgendwelche Wirkungen auf die Zellzahl aufgrund verschiedener Wachstumsbedingungen oder Zelltyp zu steuern, wurde der Vergleich zwischen den beiden Zell Zählverfahren in Anwesenheit und Abwesenheit von Anti-Proliferationsmitteln und mit einer anderen Zelllinie, die neuronale PC12 Modell 17 durchgeführt.
Abbildung 3 zeigt die Abgrenzung von der Umgebung für die Zellzählung mit diesem Verfahren unter Verwendung eines überlagerten Raster von defined Dimensionen. Das Gitter wird über das Sichtfeld (FOV) gelegt und ein grüner Rahmen wird dann an eine bestimmte Länge und Breite des Gitters (also 9x5 Quadrate) aufgetragen. Die Zellen werden im grünen Rahmen gezählt und die Anzahl von Zellen, extrapoliert wird, wie in dem Protokoll beschrieben.
Behandeln MMT Zellen: Bestimmung der Dosis-Antwort von MMT Zellen antiproliferative Mittel.
Dosis-Wirkungs-Studien (4) wurden für jede antiproliferativen Mittel durchgeführt. In diesen Experimenten wurde Daten kontinuierlich erfasst, überprüft und analysiert werden, um festzustellen, ob etwaige Änderungen des Protokolls gerechtfertigt waren. Der Versuch wurde dreimal durchgeführt, wobei jeder Studie, die ähnliche Ergebnisse. Die Experimente wurden fortgesetzt, bis alle Zellen tot waren oder die Wirkungen der Medikamente ein Plateau hat. Digitale Mikrophotographien der Ergebnisse sind in Abbildung 4 dargestellt, und eine graphische Analyse der Ergebnisse dieser Studie wird vorgestelltin Fig. 5 Effektive Konzentrationsbereiche sind in der Legende von Figur 4 auf der X-Achse von Figur 5 und in der Protokollabschnitt gemeldet.
Tamoxifen bei der niedrigsten Konzentration, 0,054 mM, gab es robust Hemmung von Zellwachstum, die ungefähr 83%, wenn sie mit unbehandelten Zellen (4A) verglichen. Lebensfähigkeit der Zellen weiter mit steigenden Konzentrationen von Tamoxifen (5A) verringern. Die optimale Dosierung von Tamoxifen war entschlossen, 0,216 mM, denn nach 48 Stunden komplett Zelltod trat bei dieser Konzentration (4A) sein. Interessant ist, dass diese Kürzungen in Zellvermehrung zeigen keine Anzeichen einer zellulären Resistenz gegen Tamoxifen, wie es auf der Grundlage der Literatur 18,19 unterstreicht, dass die in vitro-Systeme Modell erwartet werden aber nicht immer voll in vivo Ereignisse darstellen. Ferner wird, wenn mit der niedrigsten tre kontrasatment Konzentrationen von Curcumin (4B und 5A) und Metformin (4C und 5B) wurde Tamoxifen die niedrigste Konzentration von 9% und 50% wirksamer bei der Unterbindung der Zellteilung sind.
Curcumin zeigte eine konzentrationsabhängige Wirkung auf die Inhibierung der Zellteilung als auch. Mit steigenden Konzentrationen gab es eine signifikante Abnahme der Lebensfähigkeit der Zellen (Abbildung 4D und 5A). Die optimale Dosierung von Curcumin wurde zu 0.216 mM, denn nach 48 Stunden, wie Tamoxifen, gab es vollständige Zelltod bei dieser Konzentration.
Metformin-Behandlung ergab die mindestens dramatischen Rückgang der MMT die Lebensfähigkeit der Zellen, was zu 33% Reduktion bei niedrigsten Konzentration. Eine gleichzeitige Abnahme in der Zelllebensfähigkeit mit zunehmender Metformin Konzentration beobachtet (4C und 5B). Die optimale Dosierung von Metformin war entschlossen, die höchste Konzentration getestet werden (10 mM). Im Vergleich zu Tamoxifen und Curcumin sowohl routinemßig als Chemotherapeutika eingesetzt, war Metformin 30-40% weniger wirksam bei der Hemmung des Zellzyklus. Interessanterweise war die Wirkung von Metformin auf die Zellteilung konsistent mit denen, die durch Verabreichung von Aspirin (4D und 5A), eine Salicylsäure Medikament ohne eindeutig identifiziert Mechanismus der Hemmung des Zellwachstums erhalten.
Behandeln MMT Zellen: Bestimmung des zeitlichen Verlaufs der MMT zelluläre Antwort auf antiproliferative Mittel.
Eine Zeitverlaufsstudie wurde auch für jeden antiproliferativen Mittel durchgeführt, da die wirksame Dosis eines verabreichten Arzneimittels kann durch Zeit der Belichtung beeinträchtigt. Da dieses Modul Assays zur Zelllebensfähigkeit, ist es wichtig, zuerst festzustellen, wie schnell sich die Zellen teilen (Verdopplungszeit) so ein logisches Fenster für die Länge der Zeit, die Zellen werden auf die Medikamente ausgewählt werden belichtet. Es ist daher wesentlich, dass MMT Zellverdopplungszeit seinfeststellen, wenn diese anfänglich Charakterisierung der Zellen. In diesen Experimenten wurde Daten kontinuierlich erfasst, überprüft und analysiert werden, um festzustellen, ob etwaige Änderungen des Protokolls gerechtfertigt waren. Der Versuch wurde dreimal durchgeführt, wobei jeder Studie, die ähnliche Ergebnisse. Die Experimente wurden fortgesetzt, bis alle Zellen tot waren oder die Auswirkungen Plateau hatte.
Zeitverlaufsstudien zeigten, dass die Behandlung der Zellen mit MMT optimierten Konzentrationen jedes antiproliferativen Medikaments (Tamoxifen 0,216 mM, 0,216 mM Curcumin, Metformin 10 mM) für 96 Stunden führte zu einer vollständigen Zelltod oder eine Abflachung der Wirkungen des Arzneimittels ( Abbildung 6). Obwohl Aspirin, das "optional" Droge, hat Auswirkungen auf die Lebensfähigkeit der Zellen in unserem Dosis-Wirkungs-Studien war die Wirkung gering und daher nicht rechtzeitig Verlaufsstudien enthalten.
Abbildung 1. MMT Zellen. Digitale Mikrophotographie "gesunden", unbehandelte Mäuse-Brusttumor (MMT) Zellen bei 3,6 × 10 6 Zellen / cm 2 in modifiziertem Eagles Minimum Essential Medium (EMEM) .100X, scale = 0,2 mm gewachsen ist, angezeigt durch white bar. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 2. Hämozytometer Netz. Mikroskopische Aufnahme Hämozytometer Gitter 100x. Gesamte im Kreis (FOV) gezeigt Gitterabschnitt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
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Abbildung 3. Bezeichnet man die Zählung Bereich mit Motic Software. Foto von Grid-Overlay auf FOV und definierten Bereich zum Zählen MMT Zellen mit dem Motic Software etabliert wie durch Mikroskop gesehen. 100X, scale = 0,2 mm, mit weißem Balken angezeigt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Figur 4 Dosis-Wirkungs-MMT Zellen antiproliferative Mittel. Digitale Mikrophotographien von MMT-Zellen in Gegenwart von anti-proliferative Mittel bei verschiedenen Konzentrationen für 96 Stunden gezüchtet. Tamoxifen: (A1) 0,054 mM (A2) .108 mM (A3) 0,162 mM (A4) .216 mM; Curcumin: (B1) 0,054 mM (B2) .108 mM (B3) .162 mM (B4) .216 mM; Metformin: (C1) 2 mM (C2) 4 mM (C3) 6 mM (C4) 8 mM (C5) 10 mM; Aspirin: (D1) 0,030 mM (D2) 0,060 mM (D3) 0,099 mM (D4) .150 mM (D5) .216 mM; Ethanol (100%) und unbehandelt sind beide Kontrollen. 100X, scale = 0,1 mm, durch blaue Linien, die jedes Quadrat im Raster angezeigt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 5. Graphische Darstellung Dosis-Antwort-Experimente MMT Zellen antiproliferative Mittel. Effekte von zunehmenden Konzentrationen von antiproliferativen Substanzen (A) Tamoxifen, Curcumin, Aspirin, und (B) Metformin auf die Lebensfähigkeit der Zellen MMT. Ergebnisse awieder als ein Prozentsatz der Kontrolle nach 48 Stunden der Behandlung ausgedrückt, obwohl Zellbehandlung für 96 Stunden fortgesetzt. n = 3, STD ist angegeben.
Abbildung 6. Graphische Darstellung des Zeitverlaufsanalyse von MMT zelluläre Antwort auf antiproliferative Mittel. Zeitverlaufsstudie der Wirkung von Tamoxifen (0.216mM), Curcumin (0.216mM) und Metformin (10 mM) auf die Lebensfähigkeit der Zellen über MMT 96 hrs. Die Ergebnisse sind als Prozentsatz der Kontrolle nach 48 Stunden der Behandlung ausgedrückt. Hier dargestellt sind die Ergebnisse eines repräsentativen Experiments, n = 1.
Abbildung 7. Flussdiagramm der 5-Tage-Labormodul.
| Zellen-Art | Drug Administered | Day of Experiment | Wirkstoffkonzentration | Zellzahl mit Motic | Zellzahl mit Hämozytometer |
| MMT | Unbehandelt | Tag 2 | - | 7.8x10 4 Zellen / cm 2 | 8.0x10 4 Zellen / cm 2 |
| MMT | Ethanol | Tag 2 | 10 mM | 7.1x10 4 Zellen / cm 2 | 7.2x10 4 Zellen / cm 2 |
| MMT | Tamoxifen | Tag 2 | 0,216 MM | 0 Zellen / cm 2 | 0 Zellen / cm 2 |
| MMT | Tamoxifen | Tag 2 | 0,054 mM | 1.3x10 4 Zellen / cm 2 | 1.5x10 4 Zellen / cm 2 |
| MMT | Curcumin | Tag 2 | 0,054 mM | 1.9x10 4 cEllen / cm 2 | 2,0x10 4 Zellen / cm 2 |
| MMT | Curcumin | Tag 2 | 0,216 mM | 0 Zellen / cm 2 | 0 Zellen / cm 2 |
| MMT | Metformin | Tag 2 | 2 mM | 5.1x10 4 Zellen / cm 2 | 5.2x10 4 Zellen / cm 2 |
| MMT | Metformin | Tag 2 | 6 mM | 3.4x10 4 Zellen / cm 2 | 3.5x10 4 Zellen / cm 2 |
| MMT | Aspirin | Tag 2 | 0,099 mM | 2.8x10 4 Zellen / cm 2 | 3,0x10 4 Zellen / cm 2 |
| PC12 | Unbehandelt | Teilt | - | 2.5x10 4 Zellen / cm 2 | 2.1x10 4 Zellen / cm 2 |
Tabelle 1. Vergleich von Hämozytometer und Motic Software Zählen Methoden. Die Ergebnisse der Zellzählung von MMT Zellen, entweder mit Motic Software oder die Zählkammer Methoden. Sowohl unbehandelte und behandelte Zellen wurden gezählt, ebenso wie eine andere Zellinie PC12, als Kontrolle.
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Discussion
Ein Labormodul vorgestellt, um eine Vielzahl von Themen in der Zellbiologie durch die fortgeschrittene Techniken der Tierzellkulturen lehren sollen. Das Modul erreicht dies durch die Analyse der Wirkung einer Reihe von anti-proliferative Chemikalien auf die Vermehrung von Zellen, die menschliche Brustkrebsmodell. Der primäre Assay beruht auf der grundlegenden Technik der Zellzählung und stellt einen neuen Weg, um Zellen mittels Mikroskopie-Software zählen. Die Aktivitäten, die das Modul kann mit Instrumenten und Geräten in den meisten Biologieprogramme durchgeführt werden. Das Modul kann in einem 5-Tage-Zeitplan mit Lieferungen, die preiswert und leicht zu erhalten sind umgesetzt werden. Obwohl eine bestimmte Marke von digitalen Mikroskopkamera und Mikroskopie-Software wird hier (Motic Software) sollte jede vergleichbare Kamera und Software ausreichen.
Dieses Labor-Modul nutzt MMT Zellen als Modell für menschlichen Brustkrebs. Die Schüler werden zunächst lernen, zu wachsen und zu charakterisieren dieseZellen in Kultur. Es ist wichtig, dass die erfolgreiche Abschluss dieser Labormodul unterstreichen erfordert die Ermittler (aka Studenten) gut mit dem Erscheinungsbild und das Verhalten des gesunden MMT Zellen vertraut sein, zumal unbehandelten MMT Zellen als Kontrollen zu dienen. Daher gründliche Charakterisierung der Zellwachstumsmuster, Verdopplungszeit und allgemeine Morphologie der MMT Zellen ist wichtig, wenn die entsprechenden Dosis-Wirkungs-und Zeitverlaufsdaten erzeugt werden sollen.
Sobald gekennzeichnet, die MMT Zellen wurden dann auf ihre Reaktion auf verschiedene antiproliferative Mittel als Mittel zur Vermittlung der Themen der Zellteilung, Zellzyklusregulation, Zellsignalisierung und Krebs getestet. Zelllebensfähigkeit wird verwendet, um die Wirkung dieser Arzneimittel auf die Zellen zu verstehen. Ein neuartiges Verfahren zum Zählen von Zellen, unter Verwendung von Software mit einem Mikroskop montierten Digitalkamera verbunden ist, durchgeführt wird, und im Vergleich zu einer herkömmlichen Zähl- Hämozytometer-basiertes Verfahren um seine Richtigkeit zu überprüfen. This neues Verfahren bietet zwei Vorteile, die besonders erwähnenswert sind, weil sie in grundständigen Lehre Labors verwendet wird. Erstens, da die Zellen brauchen nicht aus der Gewebekulturplatte zum Zählen entfernt werden, wird weniger Zeit benötigt, um die Haupt experimentellen Test durchzuführen. Dies erlaubt eine große Anzahl von experimentellen Variablen, die auf einmal und in einem begrenzten Zeitraum getestet werden. Zweitens bietet das Verfahren eine digitale Aufzeichnung der zellulären Antwort auf die experimentelle Behandlung ermöglicht den Studenten, um die Ergebnisse zu bewerten und zu verfeinern, ihre experimentelle Strategie außerhalb des Labors.
Es gibt einige Probleme zu beachten, bei der Umsetzung dieser beiden Zählverfahren. Zuerst wird vor dem Zählen der Zellen mit beiden Verfahren werden die Zellen mit Trypanblau inkubiert, um zwischen einer lebensfähigen Zellen und die toten Zellen zu unterscheiden. Tote Zellen werden durch den Farbstoff durchdrungen und erscheinen dunkelblau, während lebensfähige Zellen sind strahlend weiß. Wenn jedoch die Zellen mit dy inkubierte über die empfohlene Inkubationszeit, werden sie in überfärbt und schwer zu unterscheiden. Zweitens kann MMT Zellen auf dem Hämozytometer oder der Gewebekulturplatte verklumpen und schwierig sein, einzeln zu zählen. Daher wird ein "Klumpen" bezeichnet, um eine bestimmte Anzahl von Zellen (beispielsweise 10 Zellen / clump) und jedes Büschel auf dem Gitter vorhanden ist, wird dann von dieser Zahl bei der Auszählung multipliziert enthalten. Schließlich MMT Zellen an der Oberfläche von Gerichten, in der sie aufgewachsen sind. Es ist daher notwendig, um die Spitze der Pipette direkt auf die Platte berühren, wenn das Entfernen der Zellen und wenden Gewalt an, um Zellklumpen, und entfernen Sie so viele Zellen von der Platte wie möglich. Als Ergebnis ist es mein nehmen mehrere Versuche, eine genaue Zählung bei Verwendung der herkömmlichen Hämozytometer Verfahren zu erhalten.
Wobei die Zellen gut charakterisiert und Zählen Methoden überprüft werden zwei verschiedene Versuche durchgeführt; eine Dosis-Wirkungs-Studie der Wirkungen von verschiedenen Konzentrationenanti-proliferative Wirkstoffe an MMT Zellteilung und ein Zeitverlaufsexperiment, um die optimale Zeit der Exposition gegenüber diesen Medikamenten aufzuklären. Dies sind sehr lehr Experimente empirisch erforderlich und die Anwendung des Primärliteratur ist für einen erfolgreichen Versuch erforderlich ist. B. Erste Versuche zur Erläuterung einer Dosiswirkung von MMT-Zellen auf diese antiproliferative Mittel offenbart, dass die getesteten Konzentrationen waren zu hoch ist, da es 100% Zelltod innerhalb von 24 Stunden der Verabreichung des Arzneimittels. Eine erweiterte Überprüfung der Literatur führte zu einer überarbeiteten Palette von Behandlungskonzentrationen. Diese Studenten lehrt, wie man effektiv Literaturdatenbanken zu verwenden, zu lesen, zu analysieren und zu kritisieren Primärliteratur Artikel und unterstreicht, wie diese Fähigkeiten sind unerlässlich für den wissenschaftlichen Prozess.
Ergebnisse der Dosis-Antwort-Studien zeigten, dass Tamoxifen die stärkste anti-proliferative Wirkung bei allen getesteten Konzentrationen. Tamoxifen, ein Anti-mitotic Droge, speziell als ein Anti-Östrogen-Therapie für Estrogen sensitiven Tumoren typischerweise in der Postmenopause, hormonsensitiven Patienten 18-20 verwendet. Das Arzneimittel wird derzeit als Behandlung von Brustkrebs eingesetzt. Tamoxifen konkurriert mit Östrogen für die intrazelluläre und als Östrogenrezeptor gebunden ist, nach unten reguliert die Expression von Cyclin D und B, zwei wichtige Regulatoren des Zellzyklus. Ergebnisse der Tätigkeit wurden, lassen vermuten, dass Tamoxifen erfolgreich an den Östrogen-Rezeptor gebunden ist, und verhindert das Fortschreiten der Zelle durch den Zellzyklus, die die beobachtete verminderte Zellproliferation. Interessanterweise ist die Reduktion der MMT Zellausbreitungsraten in allen Konzentrationen von Tamoxifen, zeigen kein Anzeichen von zellulären Resistenz gegenüber Tamoxifen, wie dies basierend auf der Literatur erwartet werden (siehe zum Beispiel 19). Diese dient als gute Erinnerung daran, dass die in vitro Bedingungen, unter denen das Experiment durchgeführt wurde nicht vollständig Modell in vivo Umständen.
Curcumin Behandlung von MMT Zellen auch zu einer Reduzierung der Lebensfähigkeit der Zellen führte. Curcumin ist eine Verbindung aus der Kurkumawurzel und wirkt als Zellwachstumsinhibitor 12,16 ableiten. Es funktioniert durch Herunterregulierung der NF-kappa B-Weg und Ornithindecarboxylase (ODC) -Aktivität. NF-kappa B ist ein Proteinkomplex, der die Transkription der anti-apoptotischen Gene wie TRAF1 und TRAF2, die für Proteine kodieren, die die Apoptose hemmen steuert. ODC ist ein Enzym, das die Herstellung von Polyaminen, Proteine, die Krebszellen mit erhöhter Nährstoffquellen was zu einer verbesserten Zellwachstum katalysiert. Das Medikament ist in der aktuellen Nutzung als Behandlung von Brustkrebs. Die antiproliferativen Wirkungen von Curcumin zeigt deutlich die Wirkung, dass die Verordnung nach unten der Zelle Signalweg mit NF-kappa B und Ornithindecarboxylase hat auf die Zellteilung.
Reduziert die Lebensfähigkeit der Zellen wurde in ähnlicher Weise mit Metformin treatme beobachtetnt. Metformin, ein Medikament, das in der Regel verabreicht wird, um Typ-II-Diabetikern, wurde gewählt, da veröffentlichte Berichte deuten auf eine Korrelation zwischen Patienten, die Metformin und eine geringere Inzidenz von Brustkrebs 15 zu nehmen. Es wird angenommen, dass das Mittel moduliert das c-myc-Gens und damit Abwärts reguliert die Aktivität von Cyclin D. Hochregulierung von Cyclinen, Moleküle, die als Kontrollpunkt innerhalb des Zellzyklus zu dienen, erlaubt den Zellen, den Zyklus mit einer höheren Geschwindigkeit fortschreiten was zu einer erhöhten Zellteilung und Wachstum. Die Wirkungen von Metformin auf MMT Zellen zeigt, wie die Modulation der c-myc-Gens führt zu Herabregulierung von Cyclin D und eine Reduktion der Zellteilung. Die Metformin Daten veranschaulicht weiter, wie ein Medikament, das für eine Konditionierung in diesem Fall Diabetes- kann einen Wirkungsmechanismus für andere abweichende physiologische Ereignisse konzipiert. Darüber hinaus ist es wichtig zu unterstreichen, daß, obwohl Tamoxifen, Curcumin und Metformin alle verzögern anormalen zellulären prolifmenarbeit durch unterschiedliche Mechanismen, erfolgreich verringert jede Zellpopulationen und störte die Zellteilung in vitro.
Dieses Modul ermöglicht auch die offene Anfrage in dieser anderen Medikamente, pflanzliche Heilmittel oder Mittel geprüft werden. Aspirin, ein Over-the-counter schmerzlindernd, fiebersenkend und entzündungshemmende Medikament, das zur leichten Schmerzen zu lindern und reduzieren Fieber wurde in diesem Modul entschieden. Aspirin die Fähigkeit zur Verringerung der Entzündung kann das Tumorwachstum durch die Verlangsamung der Entwicklung neuer Blutgefäße, die sie nähren und zu stören Stammzellen, die ihr Wachstum 11,13,14 Kraftstoff zu verhindern. Interessant ist, dass Verabreichung von Aspirin, um Zellen MMT in gewissen Verringerung der Lebensfähigkeit der Zellen führen. Wenig ist über die Rolle von Aspirin in der Krebsprävention und Behandlung bekannt, obwohl viele korrelativen Studien berichtet, 13,14 und bietet ein hervorragendes Beispiel für Korrelat gegen ursächliche Beziehungen.
Die ZeitNatürlich Studien zeigten, dass, wenn bei optimierten Dosen verabreicht, sind die anti-proliferative Medikamente sehr effektiv bei der Störung der Zellteilung innerhalb von 4 Tagen der ersten Exposition. Diese Studien liefern auch eine Chance für die Studenten zu nutzen, was sie über MMT Zellwachstumseigenschaften gelernt, bei der Entwicklung einer experimentellen Strategie für die Durchführung dieser Experimente. In der Tat, durch und durch Charakterisierung der Zellwachstumsmuster, Verdopplungszeit und allgemeine Zellmorphologie von MMT Zellen ist wichtig für beide genaue Dosis-Wirkung und Zeitverlaufsdaten.
Beide Dosisantwort und Zeitverlaufsstudien bestimmen die Beziehung zwischen der Arzneimittelkonzentration und Zeit der Belichtung sind, und der Wirkung ein Medikament in einem biologischen System. Dies ist eine hervorragende Möglichkeit, Schüler denken über intermolekulare Wechselwirkungen und andere grundlegende Konzepte in der Biochemie, während der Durchführung Anfrage angetrieben, Forschungsaktivitäten zu erhalten. Es ist erwähnenswert, dass, da viele biology Majors planen, medizinische Schule zu besuchen, richtet diese Labor-Modul auch mit den neu eingeleitet Veränderungen in der medizinischen Schule Anforderungen 21.
Dieses Labor-Modul kann genau durchgeführt werden, wie beschrieben, oder können leicht als Vorlage dienen. Eine Vielzahl von Variationen in diese Aktivität, wie der Wahl der antiproliferativen Mittel, Zelltyp oder Nährstoff Änderung in den Wachstumsmedien aufzunehmen. Solange eine Hypothese entwickelt, die grundlegende und fortgeschrittene Konzepte der Zelle oder allgemeine Biologie testet, sind die Permutationen von diesem Modul zahlreiche. Unabhängig von der Permutation, die Umsetzung dieser Aktivität natürlich leitet Schüler, um eine große Palette von Labortechniken lernen und sich mit einer Vielzahl von Geräten und Instrumenten vertraut.
Zusammenfassend ermöglicht die hier beschriebene Labormodul Studenten vollständig in den Prozess der Wissenschaft zu beteiligen, ihre Fähigkeiten zu erwerben, zu analysieren und grafisch reprESENT Daten und trainieren ihre Zeitmanagement und kollaborative Fähigkeiten. Das Modul wurde entwickelt, um offene Untersuchung zu erleichtern und ist leicht anpassbar an verschiedene Termine, Spielstärken. Es sei darauf hingewiesen, dass die ersten beiden Autoren dieses Beitrags sind Bachelor Biologie Majors, was deutlich zeigt, dass dieses Labor Modul eignet sich für die Bevölkerung werden.
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Disclosures
Die Autoren erhielten keine finanzielle oder vergleichbare Unterstützung von Motic.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tissue Culture Hood | ESCO Labculture Reliant | Class II Type A2 Biological Safety Cabinet | |
| Waterjactor CO2 Incubator | CEDCO | Model 1510 | |
| Bright-line Hemocytometer | American Optical | with two separate grids | |
| Motic Images Plus | Mac OSX Verison 2.0 or higher | ||
| Gilson Pipetman | Rainin instrument co. inc | P-20D, P-200D, P-1000D | |
| CK30/CK40 Culture Microscope | Olympus | 4 objective inverted light microscope with camera | |
| 200 μl Pipet tips | MidSci | 40200C | |
| 1,000 μl Pipet tips | MidSci | AVR4 | |
| 10 ml Seriological Pipets | TPP | TP94010 | |
| 24 well plates | CoStar- Tissue Culture Cluster | 3524 | 24 wells, 16 mm well diameter, radiation sterilized |
| Trypan Blue Solution 0.4% | Sigma | T8154 | 100 ml, cell culture tested non-haz |
| Bright-line Hemacytometer replacement coverslip, non-haz | Sigma | Z375357 | |
| Mouse Mammary Tumor(MMT) cells | ATCC | CCL-51 | |
| Eagle Minimum Essentail Medium (EMEM) | ATCC | 30-2003 | 500 ml |
| Fetal Bovine Serum | Sigma | F0926 | 500 ml |
| Metformin Hydrochloride | Sigma | PHR1084 | 500 mg |
| Tamoxifen | Sigma | T5648 | white or white-yellow powder |
| Curmumin | Sigma | C1386 | yellow-orange powder |
| Aspirin | Sigma | A2093 | meets USP testing specifications |
References
- Hammamieh, R., et al. Students investigating the antiproliferative effects of synthesized drugs on mouse mammary tumor cells. Cell Biol Educ. 4 (3), 221-234 (2005).
- Sykes, J. A., Whitescarver, J., Briggs, L. Observations on a cell line producing mammary tumor virus. J Natl Cancer Inst. 41 (6), 1315-1327 (1968).
- Palombi, P. S. J., Snell, K. Learning about Cells as Dynamic Entities: An Inquiry-Driven Cell Culture Project. Bioscene: Journal of College Biology Teaching. 33, 27-33 (2008).
- Ledbetter, M. L. S., Lippert, M. J. Glucose Transport in Cultured Animal Cells: An Exercise for the Undergraduate Cell Biology Laboratory. Cell Biology Education. 1 (3), 76-86 (2002).
- Weaver, D. Cardiac Cells Beating in Culture: A Laboratory Exercise. American Biology Teacher. 69, 407-410 (2007).
- Marion, R. E., Gardner, G. E., Parks, L. D. Multiweek cell culture project for use in upper-level biology laboratories. Advances in Physiology Education. 36, 154-157 (2012).
- Mozdziak, P. E. P., James, N., Carson, S. usanD. An Introductory Undergraduate Course Covering Animal Cell Culture Techniques. Biochemistry and Molecular Biology Education. 32 (5), 319-322 (2004).
- Anderson, L. W., et al. A taxonomy for learning, teaching and assessing: A revision of Bloom's Taxonomy of educational objectives (Complete Edition). , Longman, London, England. (2001).
- Centers for Disease Contol and Prevention. Appendix A - Primary Containment for Biohazards: Selection, Installation and Use of Biological Safety Cabinets. , (2014).
- Davis, J. M. Basic Cell Culture: A Practical Approach. , 2nd edn, Oxford University Press. Oxford, UK. (2002).
- Algra, A. M., Rothwell, P. M. Effects of regular aspirin on long-term cancer incidence and metastasis: a systematic comparison of evidence from observational studies versus randomised trials. Lancet Oncol. 13 (5), 518-527 (2012).
- Anand, P., Sundaram, C., Jhurani, S., Kunnumakkara, A. B., Aggarwal, B. B. Curcumin and cancer: an 'old-age' disease with an 'age-old' solution. Cancer Lett. 267 (1), 133-164 (2008).
- Ararat, E., Sahin, I., Altundag, K. Mechanisms behind the aspirin use and decreased breast cancer incidence. J BUON. 16 (1), 180 (2011).
- Ararat, E., Sahin, I., Altundag, K. Aspirin intake may prevent metastasis in patients with triple-negative breast cancer. Med Oncol. 28 (4), 1308-1310 (2011).
- Blandino, G., et al. Metformin elicits anticancer effects through the sequential modulation of DICER and c-MYC. Nat Commun. 3, 865 (2012).
- Kunnumakkara, A. B., Anand, P., Aggarwal, B. B. Curcumin inhibits proliferation, invasion, angiogenesis and metastasis of different cancers through interaction with multiple cell signaling proteins. Cancer Lett. 269 (2), 199-225 (2008).
- Burstein, D. E., Blumberg, P. M., Greene, L. A. Nerve growth factor-induced neuronal differentiation of PC12 pheochromocytoma cells: lack of inhibition by a tumor promoter. Brain Res. 247 (1), 115-119 (1982).
- Nazarali, S. A., Narod, S. A. Tamoxifen for women at high risk of breast cancer. Breast Cancer (Dove Med Press). 6, 29-36 (2014).
- Cui, J., et al. Cross-talk between HER2 and MED1 regulates tamoxifen resistance of human breast cancer cells). Cancer Res. 72 (21), 5625-5634 (2012).
- Komm, B. S., Mirkin, S. An overview of current and emerging SERMs. J Steroid Biochem Mol Biol. 143C, 207-222 (2014).
- Kaplan, R. M., Satterfield, J. M., Kington, R. S. Building a better physician--the case for the new MCAT. N Engl J Med. 366 (14), 1265-1268 (2012).
