Introduction
往往在普通本科生物学课程，细胞周期调控和癌症的主题上眼，但没有详细探讨，因为内容在这些课程的广度留下一点时间深入。此外，本科学生的生物通常不会暴露在与动物细胞培养相关的先进技术。为了帮助学生养成对这些概念有了更深的了解，同时应用和分析所学，实验室活动是作为研究的沃尔特·里德陆军研究所 （WRAIR）扩展实验活动1的修改。实验室模块使用逐步的，实验策略，其包括生长和表征的癌细胞模型，开发和执行细胞计数的方法，确立最佳时间进程和剂量与抗增殖剂处理的细胞，并确定异常细胞信号传导途径。实验还允许开-ended询问。
大多数需要这种活动的技术可以实现在一个典型的生物学教学实验室。活动开始与学生表征的小鼠乳腺肿瘤（MMT）细胞系的形态和生长速率，模型为人类乳腺癌2。乳腺癌的选择，因为它的人口患病率，其熟悉大学年龄的学生，和现有的广泛的数据作为模型癌症。在MMT细胞系特别选择，因为它是容易获得的，良好表征的，具有短倍增时间，容易成长。此外，MMT细胞是雌激素依赖这与大多数女性乳癌一致。学生然后通过与化疗药物，其作用机理是很好的药物和的处理长度的确立。浓度改变允许学生处理细胞识别所述MMT细胞异常细胞信号传导途径评价这些变量对细胞分裂的速率的影响。重点分析了本次活动是细胞活力，它只是需要细胞计数，使用以下两种方法之一的决心。每种方法依赖于强大的显微镜技术。学生确定细胞存活率通过使用标准的，血球的方法和一种新的显微照相方法和建议。根据他们的研究结果，他们可以提出并测试修改的活性。然后学生表示他们的数据和解释结果，以完善他们的假设，并制定新的实验策略。
该实验室的活动适合于大一大二或水平的学生主修生物科学。它被冷凝成可在第一年完成，一般生物学或第二年，蜂窝/分子生物学过程的一周实验室模块。需要正确完成活动的技能包括基本的算术和代数，熟悉的C数组矿石实验室技能（ 例如 ，移液，溶液制作，无菌技术），数据分析，基本光镜和时间管理，以及细胞培养和电子表格软件的讲师知识。所需试剂包括的动物细胞系模型对癌症（ 例如 ，小鼠乳腺肿瘤细胞，MMT 2），化疗剂（ 例如 ，他莫昔芬，姜黄素，二甲双胍，和阿司匹林），台盼蓝和细胞培养基（ 例如，Eagle氏最低必需培养基 ; EMEM）用适当的补充剂（ 例如 ，供体马和牛胎儿血清）。所需仪器包括一个倒置光学显微镜用数码相机连接，计算机100毫米和24孔组织培养板，CO 2培养箱（或等效物），生物安全柜（BSC; II级），血球和数字显微镜软件。
也有特定的实验室活动依赖于动物细胞培养TEAC很好的例子^ h本科生约在细胞生物学3概念。然而，许多需要物资或技术是不容易（ 例如 ，放射性同位素，活的动物组织，先进的影像设备1,4,5），描述是相当先进（ 例如 ，适合400级课程6）协议，或需要多周或学期长的项目6,7。这里描述的实验活动很简单，可与常见的实验室设备一个星期进行。
综上所述，本实验模块有效地引入或增强细胞周期，细胞信号通路与肿瘤的概念，而教学的基本和高级技能实验室，实验数据分析，动物细胞培养的方法和科学的过程。该实验室模块简单，经济方便和开放式查询提供了灵活性和机会。该活动鼓励学生的创造力通过提供模板实验策略，作为一个指导，但不是一个配方。最重要的是，该活动满足了花开分类8所有学习领域，因为它需要记忆，理解，应用，分析，评估和创建通过参与学生在过程中，拉他们走出课本，走进科研的世界。
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Protocol
注：操守II级生物安全柜的所有工作与细胞和细胞培养试剂（BSC）9。 MMT细胞被列为生物安全I级，因为它们对低到中等风险的生物。应用适当的清洁和消毒程序到BSC用途（ 例如 ，紫外光，70％的乙醇擦拭）之间。
1.成长MMT细胞
- 生长的细胞在含有10ml补充有10％胎牛血清（FBS）的营养丰富的媒体，它由鹰最低基本培养基 （EMEM），2mM谷氨酰胺和1％抗真菌/抗菌10厘米组织培养皿（10个单位的青霉素，100微克链霉素，0.25微克两性霉素B）。培养的细胞在湿润的5％CO 2的室中，在37℃下。板的细胞在3.6×10 6个细胞/ cm 2的密度（参见步骤2细胞计数）。
- 更换一半的细胞培养基用新鲜培养基每48小时UNLESS的另外指出。检查细胞存活力和形态由检查用倒置相差光学显微镜。
- 注下在100的尺寸，结构，形状，组织和预计数量表征细胞 - 放大200倍。在此密度，细胞应该出现在一个平面上，而不是结块的顶上彼此接近。每个小区由一个厚，球形芯薄，长，分支状延伸，从它那来的点扩展（参见图1）。
- 细分细胞，当他们到达7.2×10 6个细胞/ cm 2的细胞密度。细胞表现出1.8×10 6个细胞/ cm 2的每24小时的倍增速率。指定细胞通道X（过氧化物酶）来表示的时候，他们已经被拆分的数量。
- 在第3代（ 即 ，经过三次传代，P3）收获，计数，和板的细胞到一个24孔组织培养板上以3.6×10 6的密度2。
- 每天记录的数字显微照片查看细胞。注意，描述细胞形态（ 即 ，大小，形状，光反射特性）。通过定期计数细胞并与经过的时间，以细胞数测定细胞倍增时间。
2.计数细胞MMT
注意：计数细胞，以确定是否细胞需要传代培养，以设置一个实验，或确定细胞活力。还有这里介绍两种方法。
- 使用血细胞计数器的，一个标准的技术来计数细胞。
- 获得光明行血细胞计数，台盼蓝染色，复合光显微镜，无菌试管，移液器和手动细胞计数0.2％的溶液。
- 根据BSC，用10毫升吸管从10cm的组织培养皿中取出的细胞。如果细胞生长在24孔板用1毫升吸管或1000微升微量去除媒体。
- 放置所得到的细胞悬浮液在一个15毫升无菌试管（或1毫升微离心机或其他小体积管）。否则，保留的细胞在原始组织培养板/孔。
- 下在BSC，结合10微升细胞悬浮液与10微升的台盼蓝溶液的：在一非无菌微量离心或其他小体积管（1比1的比例）。
注意：台盼蓝是不是由健康的活细胞吸收了活力染色。当细胞受损或死亡，台盼蓝可以进入细胞使死细胞计数（又名染色排除法 ）。因此，在显微镜下，死细胞出现暗紫色的，而活细胞是明亮，颜色浅。 - 孵化在RT 5分钟。
- 广场上的血球盖玻片。申请10微升台盼蓝细胞悬浮混合物的进入凹槽。查看血球在100 - 200倍。一个四角落网格是表观（见图2）。
- 计数存活的细胞（未染色）对细胞总数在每个网格区域的数量。平均四个网格和由1×10 4相乘，以获得细胞/ ml。
- 推断每皿的细胞（或细胞/ cm 2）的总数量。使用此号码或者确定所述细胞悬浮液的正确的卷使用的种子的新的组织培养板上以3.6×10 6个细胞/ cm 2的期望的密度或确定在平板上或者在井的活细胞的总数。
注：有关使用血球的更多指导，请参阅10。
- 推断每皿的细胞（或细胞/ cm 2）的总数量。使用此号码或者确定所述细胞悬浮液的正确的卷使用的种子的新的组织培养板上以3.6×10 6个细胞/ cm 2的期望的密度或确定在平板上或者在井的活细胞的总数。
- 使用软件和数字照相机计数活细胞。
- 获得二gital摄像头，与之配套的软件，台盼蓝染色，复合光显微镜，无菌试管，移液管和一台电脑一个0.4％的溶液。
注：Moticam 2000数码相机附带的软件麦克奥迪这里是就业。任何类似的相机和软件就足够了。确保数字相机软件已经校准提前（根据制造商的协议）。 - 根据BSC，用1毫升吸管或1000微升微量从MMT细胞的24孔组织培养皿成长取出介质。轻轻施加少量（约500微升）的未补充（即 EMEM无任何补充剂）的新鲜培养基到板然后除去它洗贴壁细胞。直接向好：应用10微升0.2％台盼蓝（1与联合国补充EMEM稀释制成1）。
- 孵育板在RT 5分钟。
- 查看在显微镜下100盘 - 200X倍率W¯¯第i个数字照相机附。板可以用未补充的媒体，如果用2％台盼蓝染色太暗。
- 在电脑上一打开软件ND验证软件校准通过设置选项卡中使用的目标。视野的图像应该会出现。
- 从测量选项卡的网格 。正方形的格子约为0.005Hz厘米宽将出现。选择网格信息以确认每平方米的面积。
- 选择网格的一个特定区域，计数细胞（ 即 ，5平方×9正方形）。从测量选项卡中选择矩形 。点击广场一角，并拖动光标涵盖选择的平方。
注意：绿色的灯罩将涵盖的选择，并且白框将显示在提供的宽度，高度，区域的拐角处，和所选择的网格的部分的周长的平方（ 见图3）。 - 算VIAB数所确定的区域内的文件的细胞。通过在显微镜下移动板做相同的同井或板2的其它位置。
- 可以肯定的测量面积是相同的，并且放大倍率也没有改变。计算面积内的活细胞的平均数量。使用井的区域（24孔板，一个孔具有2 cm 2的面积，对于100mm培养皿面积78.6平方厘米 ），推断活细胞的数量从划定在网格中的区域内的孔（细胞/ cm 2）的细胞的总数。
- 获得二gital摄像头，与之配套的软件，台盼蓝染色，复合光显微镜，无菌试管，移液管和一台电脑一个0.4％的溶液。
3.治疗MMT细胞具有抗增殖剂
- 制备所选择的抗增殖治疗剂（他莫昔芬，姜黄素和二甲双胍）和任选的药物，阿司匹林在BSC下的解决方案。
- 溶解姜黄素和他莫昔芬在100％乙醇，以产生一个库存浓度为27毫摩尔。溶解二甲双胍和阿司匹林unsupplement编EMEM以产生原料浓度500mM的和15mM的分别。
- 建立剂量反应。
- 治疗MMT细胞与三个抗增殖治疗剂（他莫昔芬，姜黄素和二甲双胍）和任选的药物（阿司匹林）在不同浓度的96小时，以产生剂量反应曲线。最初管理所有药物在一个范围的基础上发表的报告1,11-16浓度，然后在浓度比出版更大或更小。
注意：剂量反应确定需要产生所期望的结果的药物的最低浓度。这里所期望的结果作为相对于对照中的细胞增殖的减少。- 对于他莫昔芬和姜黄素，使用0.054毫米（1微升），0.108毫米（2微升），0.162毫米（3微升）和0.216毫米（4微升）的浓度（以及相应的卷）。
- 对于二甲双胍，使用2mM的浓度（和相应的体积）（2微升），4mM的（4微升），6毫（6微升），8毫（8微升）和10mM（10微升）。
- 为阿司匹林，使用0.030毫摩尔（1微升），0.060毫（2微升），0.099毫（3.3微升），0.150毫（5微升）和0.216毫米（6.7微升）浓度（和相应的卷）。
- 分割从10cm皿MMT细胞到24孔板中以3.6×10 6个细胞/ cm 2的浓度。确定由这两个细胞计数的方法（步骤2）初始细胞浓度。呼叫细胞这种新的24孔板“ 日拆分”。
- 24小时细胞铺板后，治疗的MMT细胞与每个抗增殖治疗剂，他莫昔芬，姜黄素，二甲双胍和阿司匹林，在步骤3.2.1中描述的浓度。称此为“0天 ”。
- 由于每口井可以容纳最多的新井进行处理，以避免CR每次500微升介质，使用微量用无菌微管提示和技巧的新OSS污染。使用两个井作为对照：在没有任何药物治疗（阴性对照）和细胞中存在的100％的乙醇（溶剂对照）生长的细胞生长。
- 生长细胞并在所描述的浓度重新给予药物时，供给细胞每隔一天（参见步骤1.2）96小时（直到第4天）在天1 - 4治疗，观察细胞的显微镜下，并使用计数在步骤2.2中所述的方法（参见图4）。
- 重复实验至少三次。
- 通过作图在实验的长度细胞活力和药物剂量之间的关系确定每种药物的最佳浓度（参见图5）。
- 治疗MMT细胞与三个抗增殖治疗剂（他莫昔芬，姜黄素和二甲双胍）和任选的药物（阿司匹林）在不同浓度的96小时，以产生剂量反应曲线。最初管理所有药物在一个范围的基础上发表的报告1,11-16浓度，然后在浓度比出版更大或更小。
- 建立一个时间过程。
- 治疗MMT细胞与三个抗增殖治疗剂（他莫昔芬，姜黄素和二甲双胍）在一个固定的浓度对不同时间段。使用最佳浓度IDENTIF通过剂量反应实验IED（见步骤3.2）。
- 使用下列浓度：0.216毫三苯氧胺，0.216毫姜黄素和10mM二甲双胍。
注意：时间过程确定的必要时间量的药物，以产生其最佳期望的结果。这里，所期望的结果作为相对于对照中的细胞增殖的减少。
- 使用下列浓度：0.216毫三苯氧胺，0.216毫姜黄素和10mM二甲双胍。
- 分割从10cm皿MMT细胞到24孔板中以3.6×10 6个细胞/ cm 2的浓度。确定由这两个细胞计数的方法（步骤2）初始细胞浓度。呼叫细胞这种新的24孔板“ 日拆分”。
- 24小时细胞铺板后，治疗的MMT细胞与每个抗增殖治疗剂，他莫昔芬，姜黄素，二甲双胍和阿司匹林，在步骤3.2中确定的最佳浓度。称此为“0天”。
- 由于每口井可以容纳最多500微升的媒体，美国Ë微量用无菌微量的技巧和新井进行处理，以避免交叉污染，每次一个新的提示。
- 使用两个井作为对照：在没有任何药物治疗（阴性对照）和细胞中存在的100％的乙醇（溶剂对照）生长的细胞生长。
- 治疗MMT细胞与三个抗增殖治疗剂（他莫昔芬，姜黄素和二甲双胍）在一个固定的浓度对不同时间段。使用最佳浓度IDENTIF通过剂量反应实验IED（见步骤3.2）。
- 生长细胞并在所选择的浓度重新给予药物时，供给细胞每隔一天（参见步骤1.2）96小时（直到第4天）。关于天1 - 4治疗，观察细胞的显微镜下，使用该方法在步骤2.2中（ 见图4）计数。
- 重复实验至少三次。
- 通过作图在所选浓度细胞活力和药物治疗的长度（时间）之间的关系确定MMT细胞每种药物的最佳曝光时间（参见图6）。
4.实验室模块
注：以下是5天为实验室模块。 图7实验室时间表是什么样的时间表将内5天带来的流程图。对于此活动到五天内完成任一时间过程或剂量响应曲线被产生。没有足够的时间来生成曲线。下方的剂量反应实验说明。时程实验可容易地互换
- 分裂类分组：有一组建立剂量响应和其它的时间过程中选择在建议的剂量反应浓度的中间浓度。
- 保持足够的文化和药物库存在适当的浓度。除非另有说明，执行BSC下的所有工作。
- 第1天
- 直接学生作出媒体和生长的细胞（如在步骤1）。
- 由于学生获得MMT细胞的股票在10厘米板，引导学生准备细胞培养基，并给一个教程中使用hemocytome的之三，数码显微镜和数码相机显微镜软件（如步骤2）。
- 校准软件（ 例如，4X，10X，20X）现在使用的制造商的协议在显微镜中使用的目标。
- 第2天
- 有学生确认总细胞数目和细胞存活力（如在步骤2）。
- 有学生计数细胞上同时使用显微镜软件和血球的方法，确认了类似的结果，得到的100mm培养皿。
- 直接学生获得从100mm培养皿于24孔板，以所希望的起始细胞铺板密度24孔板和分裂的细胞（如在步骤1）。这被认为是节分割 。将24孔板中的细胞培养孵化24小时。
- 3天
- 生长MMT细胞上24孔板24小时。让学生观察细胞的显微镜下，用显微镜软件（如步骤2）计算。
- 给学生/ TE是癌症治疗药物的股票样本。让他们准备和稀释原始股票的解决方案（如步骤3）。各种浓度的药物添加到其细胞以建立剂量响应曲线。这被称为第0天 。
- 孵育细胞（步骤1.2）与药物最多48小时。
- 4天
- 让学生在24小时后观察治疗的细胞。这是第1天 。
- 每个计数采用公显微镜软件。每个记录的照片以及使计数可以在实验室外进行（如在步骤2）。
- 孵育细胞（步骤1.2）与药物另外24小时。
注：教师提供额外的指南和评论数据分析和图形演示。学生们学习如何创建人物，情节，以及统计分析数据收集的第二天。
- 第5天
- 已经48小时后，2日的学生处理的细胞。
- 每个计用好显微镜软件。每个记录的照片以及使计数可以在实验室外进行（如在步骤2）。
- 收获和收集细胞用于通过传统的血细胞计数方法验证有效地利用显微镜软件方法学生能力的手段计数（如步骤2）。
注：收集数据，并得出结论或修改假设，相应。
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Representative Results
成长MMT细胞和比较计数方法 。
小鼠乳腺肿瘤细胞成功地生长和特征（ 图1），并使用麦克奥迪软件，用于显微镜的数码相机相关的软件程序开发了一种新的细胞计数法。这种新的细胞计数法进行比较采用血细胞计数器（ 图2）传统的计数方法，被证明是同样准确确定细胞数目（ 表1）。为了控制由于不同的生长条件或细胞类型上的细胞数之间的任何影响，这两个细胞计数的方法之间的比较中的抗增殖剂的存在和不存在，并具有不同的细胞系，神经元模型的PC12 17进行。
图3示出的区域的圈定使用defin的叠加的网格用这种方法计数细胞编尺寸。网格铺设在的视角（FOV）的场和一个绿色帧然后被施加到指定的长度和宽度的网格（即，9X5正方形）。将细胞绿色帧内计数和细胞的数量被外推，如在该协议中讨论。
处理MMT细胞：确定MMT细胞的剂量响应于抗增殖剂。
剂量反应研究（ 图4）进行了对每个抗增殖剂。纵观这些实验数据被不断收集，审查和分析，看看是否有可能修改协议中必要的。该实验进行三次，每次研究产生了类似的结果。实验持续到所有的细胞死亡或药物的作用已趋于稳定。结果的数字显微照片示于图4中 ，以及这些结果的图形分析，提出在图5中，有效的浓度范围列于图4的说明，在图5的X轴和在协议部分。
在他莫昔芬的最低浓度，0.054毫，当与未经处理的细胞（ 图4A）相比有健壮抑制细胞生长的，大约83％。细胞存活率继续下降与浓度三苯氧胺增加（ 图5A）。他莫昔芬的最佳剂量确定为0.216毫米，因为48小时后完整的细胞死亡发生在该浓度（ 图4A）。有趣的是，这些减少细胞增殖显露任何迹象表明他莫昔芬蜂窝性的，因为会基于文献18,19强调， 在体外系统模型中预期，但并不总是完全代表体内的事件。此外，当具有最低特雷对比atment浓度的姜黄素（ 图4B和图5A）和二甲双胍（ 图4C和图5B），他莫昔芬的最低浓度为9％和50％的更有效地阻止细胞分裂，分别。
姜黄素对展出细胞分裂抑制浓度依赖性的效果好。随着浓度的增加，出现了在细胞活力（ 图4D和图5A）一个显著降低。姜黄素的最佳剂量测定为0.216毫因为后48小时，如他莫昔芬，有完整的细胞死亡在该浓度。
二甲双胍治疗产生在MMT细胞活力的至少显着降低，从而导致降低了33％，在最低浓度。由此所伴随的减少细胞存活力随二甲双胍浓度观察到（ 图4C和图5B）。二甲双胍的最佳剂量确定要在测试的最高浓度（10毫米）。相比于他莫昔芬和姜黄素，既常规用作化疗剂，二甲双胍是30-40％少有效地抑制细胞周期。有趣的是，在二甲双胍细胞分裂的影响是与阿司匹林的管理（ 图4D和5A），水杨酸药物，没有明确的细胞生长抑制机制取得一致。
处理MMT细胞：确定到抗增殖剂的MMT细胞反应的时间过程。
时程研究，也对各抗增殖剂进行，因为有效剂量的施用的药物可以通过暴露的时间受到影响。如本模块测定细胞活力，它首先确定该细胞如何快速分裂（倍增时间），所以对时间的细胞暴露于能够选择的药物的长度的逻辑窗口是非常重要的。它是必不可少的，因此，MMT细胞的倍增时间是最初的时候表征细胞确定。纵观这些实验中，数据被不断收集，审查和分析，看看是否有可能修改协议中必要的。该实验进行三次，每次研究产生了类似的结果。实验继续，直到所有的细胞都死了或影响已经趋于稳定。
时间过程研究显示，治疗MMT细胞与每种抗增殖药物的最佳浓度（他莫昔芬0.216毫姜黄素0.216毫二甲双胍10毫摩尔）96小时导致完全的细胞死亡或流平关的药物治疗的效果（ 图6）。虽然阿司匹林，在“可选”的药，确实影响细胞活力在我们的剂量反应研究中，影响是次要的，因此不被列入时间过程的研究。
图1. MMT细胞。在3.6×10 6个细胞/ cm 2在改性鹰极限必需培养基 （EMEM）.100X，标度=0.2毫米生长“健康的”，未处理小鼠乳腺肿瘤（MMT）细胞的数字显微照片中，由白条。 请点击此处查看该图的放大版本。
图2。 血球电网。血球格的显微照片，100倍。在圆（FOV）显示整个电网部分。 请点击此处查看该图的放大版本。
尔斯/ ftp_upload / 52528 / 52528fig3.jpg“/>
图3。指定用的Motic软件的计数区域。 在FOV电网覆盖和定义的区域计数与麦克奥迪软件建立MMT细胞通过显微镜看到的图像。 100X，规模= 0.2毫米，用白条表示。 请点击此处查看该图的放大版本。
MMT细胞抗增殖剂的图4的剂量反应。生长在抗增殖剂存在下，在不同浓度的96小时MMT细胞的数字显微照片。他莫昔芬：（A1）0.054毫（A2）0.108毫（A3）0.162毫米（A4）的0.216毫;姜黄素：（B1）0.054毫（B2）的0.108毫（B3）0.162毫（B4）0.216毫米;二甲双胍：（C1）2mM的（C2），4mM的（C3）的6毫米（C4）的8毫米（C5）的10mM;阿司匹林：（D1）0.030毫米（D 2）0.060毫（D3）0.099毫（D4）0.150毫（D5）0.216毫;乙醇（100％）和未经处理的均控制。 100X，规模为0.1毫米，由蓝色线条组成的网格内的每个方块表示。 请点击此处查看该图的放大版本。
的MMT细胞的剂量响应实验图5的图形表示到抗增殖剂。增加的抗增殖剂（A）的他莫昔芬，姜黄素，阿司匹林，和（B）上MMT细胞活力二甲双胍浓度的影响。结果重新表示为48小时后治疗的对照的百分比，虽然细胞治疗持续96小时。 N = 3，STD表示。
MMT到抗增殖剂的细胞反应的时间过程分析的图6的图 形表示。时间当然他莫昔芬对蒙脱土细胞活力的影响（0.216mM），姜黄素（0.216mM）和二甲双胍（10毫米）超过96研究小时。结果表示为对照的48小时后治疗的百分比。这里示出的是一个代表性实验的结果中，n = 1。
图7流程图的5天的实验室模块。
| 电池类型 | 药品AdministereD | 实验当天 | 药物的浓度 | 细胞计数与麦克奥迪 | 细胞计数与血球 |
| MMT | 未处理 | 第2天 | - | 7.8×10 4个细胞/ cm 2的 | 8.0×10 4个细胞/ cm 2的 |
| MMT | 乙醇 | 第2天 | 10毫 | 7.1×10 4个细胞/ cm 2的 | 7.2×10 4个细胞/ cm 2的 |
| MMT | 他莫昔芬 | 第2天 | 0.216 MM | 0个/厘米2 | 0个/厘米2 |
| MMT | 他莫昔芬 | 第2天 | 0.054毫米 | 1.3×10 4个细胞/ cm 2的 | 1.5×10 4个细胞/ cm 2的 |
| MMT | 姜黄素 | 第2天 | 0.054毫米 | 1.9×10 4℃ELLS / cm 2的 | 2.0×10 4个细胞/ cm 2的 |
| MMT | 姜黄素 | 第2天 | 0.216毫米 | 0个/厘米2 | 0个/厘米2 |
| MMT | 二甲双胍 | 第2天 | 2毫米 | 5.1×10 4个细胞/ cm 2的 | 5.2x10 4个细胞/ cm 2的 |
| MMT | 二甲双胍 | 第2天 | 6毫米 | 3.4×10 4个细胞/ cm 2的 | 3.5×10 4个细胞/ cm 2的 |
| MMT | 阿司匹林 | 第2天 | 0.099毫米 | 2.8×10 4个细胞/ cm 2的 | 3.0×10 4个细胞/ cm 2的 |
| PC12 | 未处理 | 分裂 | - | 2.5×10 4个细胞/ cm 2的 | 2.1×10 4个细胞/ cm 2的 |
表1。血球麦克奥迪软件计数的方法。MMT细胞的细胞计数的结果，无论是使用软件麦克奥迪或血球方法的比较 。未经处理的和处理的细胞进行计数，以及一个不同的细胞系，PC12，作为对照。
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Discussion
实验室模块提出，旨在通过动物细胞培养的先进技术传授细胞生物学的各种话题。模块通过分析若干抗增殖化学品对细胞模拟人类乳腺癌的复制的效果达到这一点。主要检测依赖于细胞计数的基本技术，并引入了一种新的方法来计算使用显微镜的软件单元。包括该模块的活动可以与仪器和设备，在大多数生物学程序可用来进行。该模块可在5天的日程与用品是廉价且容易地得到实现。虽然数码显微镜照相机和显微镜软件将特定的品牌在这里（麦克奥迪软件）使用，任何类似的摄像头和软件就足够了。
本实验模块采用MMT细胞为模型对人类乳腺癌。学生先教增长，这些特点培养中的细胞。重要的是要强调的是，成功完成该实验室模块需要调查（又名学生）被非常熟悉健康MMT细胞的外观和行为，特别是因为未处理的MMT细胞作为对照。因此彻底表征的细胞生长模式，倍增时间和MMT细胞的一般形态是必不可少的，如果适当的剂量反应和时间过程数据要被生成的。
一旦其特征处，MMT细胞然后测试它们响应于各种抗增殖剂如教学细胞分裂，细胞周期调控，细胞信号和癌的课题的手段。细胞活力是用来理解这些药物对细胞的作用。计数细胞，采用用显微镜式数字照相机相关联的软件的新方法，是进行与相对于传统计数血球的基于过程来验证其准确性。 THI小说的方法有两个好处，因为它采用的是本科教学实验室这是尤其值得关注。首先，由于细胞不需要从组织培养板进行计数除去，更短的时间是必要的，以进行主实验测定。这使得大量的实验变量来一次，并在有限的时间内进行测试。第二，该方法提供的实验治疗，允许学生评估结果和完善其实验策略实验室外的细胞应答的数字记录。
有几个问题要注意实现这两种方法计算的时候。首先，在用任一方法计数细胞，将细胞与台盼蓝活细胞和死细胞之间进行区分。死细胞被染料渗透和出现暗蓝色，而存活的细胞是明亮的白色。然而，如果细胞与镝Ë超过推荐的潜伏期，他们将过染色，很难区分。第二，MMT细胞可能聚集在血球或组织培养板和难以单独计数。因此，“丛”被指定给包含一定数目的细胞（ 例如，10个细胞/丛）和每丛出现在网格然后由该数字的计数期间相乘的。最后，MMT细胞粘附的菜肴在它们所生长的表面上。因此，有必要以除去细胞时直接触摸吸管的尖端到板并施加力到拆散细胞团，并从板尽可能除去尽可能多的细胞。因此，它需要我多次尝试使用传统的方法，血球时获得准确的数目。
与细胞充分表征和计数的方法验证，两种不同的实验进行;的不同浓度的影响的剂量响应研究的抗增殖药物对蒙脱土细胞分裂和时程实验以阐明暴露于这些药物的最佳时间。这些都是很有启发性实验，试验和错误是必要的和应用的主要文学需要一个成功的实验。例如，初始的尝试在阐明MMT细胞的剂量响应这些抗增殖剂表明测试的浓度太高，因为没有内给药24小时100％的细胞死亡。文学的扩展审查导致治疗浓度的修订范围。这有效地教导学生如何使用文献数据库，阅读，分析和批判主要文献的文章，并强调这些技能是如何进行科学的过程是必不可少的。
剂量响应研究的结果表明，他莫昔芬表现出在所有测试浓度的最强的抗增殖作用。他莫昔芬，抗mitoti肝炎药物，是专门用来作为抗雌激素治疗的雌激素敏感的癌症，通常在绝经后，激素敏感患者18-20。该药物是目前使用作为乳腺癌的治疗。三苯氧胺竞争与雌激素对细胞内的雌激素受体和结合时，下调细胞周期蛋白D和B，细胞周期的两个重要的调节剂的表达。在活动中获得的结果表明，他莫昔芬成功结合到雌激素受体，并通过细胞周期抑制细胞的进展，导致所观察到的降低的细胞增殖。有趣的是，在整个给药他莫昔芬的所有浓度MMT细胞增殖率的降低揭示没有指示他莫昔芬的细胞抗性的，因为将根据文献中预期的（参见例如19）。这是一个很好的提醒， 在体外条件，使实验进行不完全的模型我ñ体内的情况。
MMT细胞的姜黄素治疗还导致减少的细胞生存力。姜黄素是从姜黄根并作为细胞增殖抑制剂12,16衍生的化合物。它的工作原理是下调的NF-κB的途径和鸟氨酸脱羧酶（ODC）的活性。的NF-kappa B是蛋白质复合体，其控制的抗凋亡基因如TRAF1和TRAF2，其编码的蛋白质抑制凋亡的转录。 ODC是催化生产多胺，蛋白质，提供癌症细胞营养的，导致增强的细胞生长提高来源的酶。该药物是目前使用的作为乳腺癌的治疗。姜黄素的抗增殖作用清楚地表明，走在细胞信号传导途径，涉及的NF-kappa B和鸟氨酸脱羧酶的调控已经对细胞分裂的效果。
降低细胞活力，同样二甲双胍treatme观察NT。二甲双胍，一种药物通常给予II型糖尿病患者，被选中，是因为已发表 的报告表明谁采取二甲双胍和乳腺癌15的发生率较低的患者之间的相关性。据认为，该代理调制的c-MYC基因，从而下调的细胞周期蛋白D。上调细胞周期蛋白，充当细胞周期内检查点的分子的活性，允许细胞通过循环以更快的速度前进从而增加了细胞分裂和生长。上MMT细胞二甲双胍治疗的效果显示了c-myc基因的调节也导致下调细胞周期蛋白D和细胞分裂的减少。二甲双胍数据进一步举例说明怎样药物设计一个条件 - 在此情况下Diabetes-可以具有适合于其它异常生理事件的作用机制。另外，它强调的是，虽然他莫昔芬，姜黄素，和二甲双胍所有延迟的异常细胞prolif是重要通过不同的机制关合作，所有的成功降低细胞群，并干扰细胞分裂体外 。
该模块还允许开放式探究在另一种药物，草药，或代理可以进行测试。阿司匹林，过度的非处方镇痛，解热，以及用于缓解轻度疼痛和退烧消炎药物被选为该模块中。阿司匹林的减轻炎症的能力可能抑制肿瘤生长通过减慢滋养他们新血管发展和干细胞助长其生长11,13,14干扰。有趣的是，阿司匹林MMT细胞的施用并导致细胞活力有所减少。鲜为人知的是，阿司匹林在预防和治疗癌症的作用，虽然很多相关的研究报告13,14，提供相关的病因与关系一个很好的例子。
时间当然研究表明，当在优化的剂量施用，所述抗增殖药物是在与细胞分裂4天内初始曝光的干扰非常有效。这些研究还提供了一个机会，让学生用他们制定的实验策略进行这些实验中，当得知MMT细胞的生长特性。事实上，彻底表征细胞的生长模式，倍增时间和MMT细胞的细胞一般形态是既准确剂量反应和时间进程数据至关重要。
两个剂量反应和时间过程研究确定药物浓度和曝光，分别时间，并在生物系统中的药物具有的效果之间的关系。这是一个很好的方式让学生思考分子间的相互作用等基本概念生物化学，同时进行询问驱动，研究活动。值得注意的是，由于许多BI易学专业计划参加医学院，本实验模块，非常符合中医学院要求21的新设立的变化。
如所述此实验室模块可以精确实现或可以容易地用作模板。主机变化可掺入此活动，如抗增殖剂的选择，细胞类型或养分修饰生长培养基中。只要一个假设开发，测试细胞或普通生物学基础和先进的理念，这个模块的排列是多不胜数。无论置换，本次活动的执行，自然引导学生学习大阵的实验室技术和熟悉各种设备和仪器仪表。
总之，这里所描述的实验模块，让学生充分参与科学的过程中，发展自己的能力，以获取，分析和图形再版ESENT数据，并磨练自己的时间管理和协作能力。该模块旨在促进开放式查询，很容易适应不同的课程安排和技能水平。应当指出的是，本文的前两个作者都是本科专业生物，清楚地表明，这个实验模块适用于人口。
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Disclosures
作者没有收到来自麦克奥迪财务或类似的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tissue Culture Hood | ESCO Labculture Reliant | Class II Type A2 Biological Safety Cabinet | |
| Waterjactor CO2 Incubator | CEDCO | Model 1510 | |
| Bright-line Hemocytometer | American Optical | with two separate grids | |
| Motic Images Plus | Mac OSX Verison 2.0 or higher | ||
| Gilson Pipetman | Rainin instrument co. inc | P-20D, P-200D, P-1000D | |
| CK30/CK40 Culture Microscope | Olympus | 4 objective inverted light microscope with camera | |
| 200 μl Pipet tips | MidSci | 40200C | |
| 1,000 μl Pipet tips | MidSci | AVR4 | |
| 10 ml Seriological Pipets | TPP | TP94010 | |
| 24 well plates | CoStar- Tissue Culture Cluster | 3524 | 24 wells, 16 mm well diameter, radiation sterilized |
| Trypan Blue Solution 0.4% | Sigma | T8154 | 100 ml, cell culture tested non-haz |
| Bright-line Hemacytometer replacement coverslip, non-haz | Sigma | Z375357 | |
| Mouse Mammary Tumor(MMT) cells | ATCC | CCL-51 | |
| Eagle Minimum Essentail Medium (EMEM) | ATCC | 30-2003 | 500 ml |
| Fetal Bovine Serum | Sigma | F0926 | 500 ml |
| Metformin Hydrochloride | Sigma | PHR1084 | 500 mg |
| Tamoxifen | Sigma | T5648 | white or white-yellow powder |
| Curmumin | Sigma | C1386 | yellow-orange powder |
| Aspirin | Sigma | A2093 | meets USP testing specifications |
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