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Biology

Usando o rato do mamárias Células Tumorais para ensinar Biologia Conceitos Básicos: A Módulo Lab Simples

Published: June 18, 2015 doi: 10.3791/52528
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Natural Sciences, Marymount Manhattan College

Introduction

Muitas vezes, nos cursos de graduação de biologia geral, os temas da regulação do ciclo celular e câncer são aflorados, mas não explorados em detalhe porque a amplitude do conteúdo nestes cursos deixa pouco tempo para a profundidade. Além disso, alunos de graduação de biologia não são normalmente expostos a técnicas avançadas associadas com a cultura de células animais. Para ajudar os alunos a desenvolver uma compreensão mais profunda destes conceitos, ao aplicar e analisar o que aprenderam, uma atividade de laboratório foi desenvolvido como uma modificação do Walter Reed Army Institute of Research (WRAIR) estendeu atividade laboratorial 1. O módulo de laboratório utiliza, uma estratégia experimental passo a passo que inclui a crescer e caracterizar um modelo celular de cancro, desenvolvimento e execução de métodos de contagem de células, é claro, que estabelece o tempo óptimo e dosagens para o tratamento de células com agentes anti-proliferativos, e identificação de vias de sinalização celular aberrante . O experimento também permite aberta-ended inquérito.

A maioria das técnicas necessárias para esta actividade pode ser realizado num laboratório-ensinando biologia típico. A actividade inicia-se com os alunos que caracterizam a taxa de crescimento e morfologia da linha celular de tumor mamário de ratinho (MMT), um modelo de cancro da mama humano 2. O câncer de mama foi escolhido como o câncer de modelo por causa de sua prevalência na população, sua familiaridade aos estudantes em idade universitária, e os dados difundidos disponíveis. A linha de células MMT foi especificamente seleccionada porque é facilmente obtido, bem caracterizado, tem um curto tempo de duplicação e é fácil de cultivar. Além disso, as células MMT são o que é consistente com a maioria dos cancros da mama dependente de estrogénio do sexo feminino. Depois, os estudantes identificar vias de sinalização celular aberrante nas células MMT por tratamento das células com drogas de quimioterapia cujo mecanismo de acção é bem established.The concentração dos fármacos e duração dos tratamentos são variados permitindo que os alunospara avaliar o efeito destas variáveis ​​na taxa de divisão celular. O ensaio de chave para esta actividade é a determinação da viabilidade das células, o que requer simplesmente a contagem das células, utilizando um dos dois métodos. Cada método depende das habilidades de microscopia fortes. Estudantes determinar a viabilidade celular, utilizando um padrão, método hemocit�etro e um método microfotografia romance e propor. Baseado em seus resultados, eles podem propor e testar modificações para a atividade. Os alunos, então, representar seus dados e interpretar os resultados para refinar a sua hipótese e elaborar novas estratégias experimentais.

Esta atividade de laboratório é adequado para caloiro ou nível de estudante de segundo ano estudantes que se formam nas ciências biológicas. Ele é condensado em um módulo de laboratório de uma semana, que pode ser completada em um primeiro ano, biologia geral ou no segundo ano, curso de biologia celular / molecular. Habilidades necessárias para a boa execução da atividade incluem aritmética básica e álgebra, a familiaridade com uma variedade de chabilidades laboratoriais de minério (por exemplo, pipetagem, a tomada de solução, uma técnica estéril), análise de dados, microscopia de luz e tempo de gestão de base, juntamente com o conhecimento instrutor de cultura de células e software de planilha. Reagentes requeridos incluem um modelo de linha de células de animais para o cancro (por exemplo, células de mamário de ratinho de tumor, MMT 2), agentes quimioterapêuticos (por exemplo, tamoxifeno, a curcumina, a metformina, e aspirina), tripano meios de cultura azul e células (por exemplo, Meio Essencial Mínimo de Eagle ; EMEM) com suplementos apropriados (por exemplo, cavalos doador e soro fetal bovino). Instrumentos necessários incluem um microscópio invertido luz com apego câmera digital, computador, 100 mm e 24 placas de cultura de tecidos, incubadora de CO2 (ou equivalente), cabine de segurança biológica (BSC; Classe II), hemocitômetro, e software de microscopia digital.

Existem bons exemplos de atividades de laboratório específicos que dependem de cultura de células animais para TEACestudantes de graduação h sobre conceitos em biologia celular 3. No entanto, muitos requerem fontes ou técnicas que não são facilmente acessíveis (por exemplo, isótopos radioativos, tecido animal vivo, equipamentos avançados de imagem 1,4,5), descrever os protocolos que são bastante avançada (por exemplo, adequado para um curso de nível 6 400), ou exigem multi-semana ou semestrais longas projetos 6,7. A atividade de laboratório descrito aqui é simples e pode ser realizado em uma única semana com equipamento de laboratório comum.

Em resumo, este módulo de laboratório efetivamente introduz ou reforça os conceitos de ciclo celular, vias de sinalização celular e câncer, enquanto o ensino de habilidades básicas e avançadas de laboratório, análise de dados experimentais, o método de cultura de células animais e do processo científico. O módulo de laboratório é simples e economicamente acessível e fornece a flexibilidade ea oportunidade para o inquérito aberto. A atividade incentiva a criatividade dos estudantesfornecendo uma estratégia modelo experimental que actua como uma guia, mas não uma receita. Mais importante ainda, os satisfaz todos os domínios de actividade de aprendizagem de flores Taxonomia 8, pois requer lembrando, compreensão, aplicação, análise, avaliação e criação de envolver os alunos em um processo que os puxa para fora do livro didático e para o mundo da pesquisa científica.

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Protocol

Notas: Conduta todo o trabalho com células e reagentes de cultura de células em uma cabine de segurança biológica Classe II (BSC) 9. Células MMT são classificados como Nível de Biossegurança eu, como eles representam baixo risco biológico a moderada. Aplicar os procedimentos de limpeza e descontaminação adequados para o BSC entre os usos (por exemplo, luz ultravioleta, 70% de etanol limpar).

1. Cultivar células MMT

  1. Cultivar células em placas de 10 cm de cultura de tecidos contendo 10 ml de meio nutriente rico que consiste em Eagles Minimum Essential Médium (EMEM) suplementado com 10% de soro fetal de bovino (FBS), glutamina 2 mM e 1% antimicótica / antibiótica (10 unidades de penicilina , 100 ug de estreptomicina, 0,25 mg de anfotericina B). Cultivar as células numa atmosfera humidificada com 5% de CO 2 da câmara, a 37 ° C. As células em placas a uma densidade de 3,6 x 10 6 células / cm2 (ver contagem de células no passo 2).
  2. Substituir metade do meio de cultura celular por meio fresco a cada 48 horas UNLess indicado de outra forma. Verificar a viabilidade celular e morfologia, através de exame com uma fase invertida luz contraste microscópio.
    1. Nota e caracterizar células para o tamanho, estrutura, forma, organização e número estimado sob a 100 - aumento de 200x. Neste densidade, as células devem aparecer em um plano, não aglutinadas em cima uns dos outros e em estreita proximidade. Cada célula é composta por um núcleo de espessura, esférica, com, extensões ramo-like longas e finas em expansão a partir dele que chegar a um ponto (veja a Figura 1).
  3. Subdivide células quando atingem uma densidade celular de 7,2 x 10 6 células / cm2. As células exibem uma taxa de duplicação de 1,8 x 10 6 células / cm 2 por 24 horas. Designar células Passage X (Px) a identificar o número de vezes que eles foram divididas.
    1. Na geração de 3 (isto é, depois de três passagens, P3), colheita, contagem, e a placa para as células de uma placa de cultura de tecido de 24 poços a uma densidade de 3,6 x 10 6 2.
  4. Veja as células a cada dia e fotomicrografias digitais recordes. Nota e descrever a morfologia das células (isto é, tamanho, forma, luz propriedades reflexivas). Determinar tempo de duplicação celular por contagem de células regularmente e relacionando o tempo decorrido para o número de células.

2. Contagem de Células MMT

Nota: Contagem de células para determinar se as células precisam ser repicadas, para configurar para um experimento ou para determinar a viabilidade celular. Existem dois métodos aqui apresentados.

  1. A utilização de um hemocitómetro, uma técnica padrão de contagem de células.
    1. Obter um hemocitômetro brilhante-line, uma solução 0,2% de corante azul de tripano, um composto microscópio de luz, tubos de ensaio estéreis, pipetas e um contador de células manual.
    2. Sob o BSC, utilizar uma pipeta de 10 mL para remover as células a partir de uma cultura de tecidos de 10 centímetros prato. Se as células são cultivadas numa placa de 24 poços utilizar uma pipeta de 1 ml ou 1000 micropipeta ul para remover os meios de comunicação.
    3. Coloque a suspensão de células, resultando em um tubo de 15 ml estéril (ou 1 ml de centrífuga de micro ou outro tubo pequeno volume). Caso contrário, deixa as células em placa de cultura de tecido original / poço.
    4. Sob o BSC, combinar 10 ul da suspensão celular com 10 ul da solução de azul de tripano (proporção 1: 1) numa micro centrífuga não-estéril ou outro tubo de pequeno volume.
      Nota: azul de tripano é um corante vital que não é absorvida por células viáveis ​​saudáveis. Quando as células são danificadas ou, azul tripano mortos podem entrar na célula permitindo que as células mortas, para ser contado (aka tingir método de exclusão). Por isso sob um microscópio, células mortas aparecem roxo escuro, enquanto as células viáveis ​​são um brilhante e de cor clara.
    5. Incubarà TA durante 5 min.
    6. Coloque a tampa de deslizamento no hemocitômetro. Aplicar 10 ul da mistura de tripano azul suspensão de células para dentro da ranhura. Ver o hemocit�etro a 100 - 200X ampliação. Uma grade dos quatro cantos é aparente (ver Figura 2).
    7. Contar o número de células viáveis ​​(não coradas) versus o número total de células em cada superfície reticulada. Calcular a média dos quatro grelhas e multiplicar por 1 x 10 4 para obter células / ml.
      1. Extrapolar o número total de células por placa (ou células / cm2). Use este número para determinar tanto o volume correcto da suspensão de células a ser usada para semear uma nova placa de cultura de tecidos a uma densidade desejada de 3,6 x 10 6 células / cm 2 ou a determinar o número total de células viáveis ​​na placa ou no poço.
        Nota: Para informações adicionais sobre o uso de um hemocitômetro, consulte 10.
  2. Use software e uma câmera digital para contar células viáveis.
    1. Obter um digital de câmara, que acompanha o seu software, uma solução de 0,4% de corante azul de tripano, um composto microscópio de luz, tubos de ensaio estéreis, pipetas e um computador.
      Nota: Uma câmera digital Moticam 2000 com acompanhamento Motic Software é empregado aqui. Qualquer câmera e software comparável deve ser suficiente. Certifique-se de que o software da câmera digital foi calibrado com antecedência (de acordo com o protocolo do fabricante).
    2. Sob o BSC, use uma pipeta de 1 ml ou 1.000 ul micropipeta para remover a mídia a partir das células MMT que crescem em um 24 bem prato de cultura de tecidos. Lave as células aderentes, aplicando suavemente uma pequena quantidade (aproximadamente 500 ul) de suplementado-un (isto é, sem quaisquer suplementos de EMEM) meio fresco para a placa, em seguida, removê-lo. Aplicar 10 ul de 0,2% de azul de tripano (preparada por diluição 1: 1, com un-EMEM suplementado) directamente para o poço.
    3. Incubar a placa a temperatura ambiente durante 5 min.
    4. Veja a placa sob o microscópio em 100 - 200X ampliação wom uma câmera digital ligada. Placa pode ser lavado com mídia não suplementadas se coloração com 2% de azul de tripano está muito escura.
    5. Abra o software no computador de um nd verificar se o software está calibrado para o objectivo usado através do separador de definições. Uma imagem do FOV deve aparecer.
    6. Selecione a grade da guia Medida. Uma grade de quadrados com cerca de 0,005 centímetros de largura aparece. Selecione Grade Informações para confirmar a área de cada quadrado.
    7. Escolha uma área específica da grelha para contar as células (ou seja, 5 quadrados x 9 quadrados). Selecione Retângulo na guia Medida. Clique no canto de um quadrado e arrastar o cursor para abranger as praças de escolha.
      Nota: Um tom de verde vai cobrir as praças de escolha e uma caixa branca aparece no canto que fornece a largura, altura, área e perímetro da seção do grid escolhido (veja a Figura 3).
    8. Contar o número de VIABle células dentro da área determinada. Faça o mesmo para dois outros locais no mesmo poço ou placa, movendo a placa sob o microscópio.
    9. Certifique-se de que a área de medição é a mesma e a ampliação não mudou. Calcula-se a média do número de células viáveis ​​no âmbito da área. Utilizando a área do poço (para uma placa de 24 poços, um poço tem uma área de 2 cm 2, para um prato de 100 mm, a área é 78,6 centímetros 2), extrapolar o número de células viáveis ​​a partir da zona delimitada na grade para o número total de células no interior do poço (células / cm2).

3. tratar células MMT com agentes anti-proliferativa

  1. Prepare soluções dos agentes seleccionados anti-proliferativas terapêuticos (tamoxifeno, curcumina e metformina) e droga opcional, aspirina sob o BSC.
    1. Dissolver curcumina e tamoxifeno em 100% de etanol para gerar uma concentração estoque de 27 mM. Dissolver metformina e aspirina em unsupplemented EMEM para gerar uma concentração de estoque de 500 mM e 15 mM, respectivamente.
  2. Estabelecer uma resposta à dose.
    1. Tratar as células MMT com os três agentes anti-proliferativos terapêuticos (tamoxifeno, curcumina e metformina) e opcional droga (aspirina) em várias concentrações durante 96 horas para gerar uma curva de resposta à dose. Inicialmente, todos os fármacos em administrar uma gama de concentrações com base em relatórios publicados 1,11-16 e, em seguida, em concentrações maiores ou menores do que os publicados.
      Nota: Uma resposta à dose determina a concentração mínima de uma droga necessária para produzir os resultados desejados. Aqui, o resultado desejado é uma diminuição na proliferação celular em comparação com o controlo.
      1. Para tamoxifeno e curcumina, usar concentrações (e correspondentes volumes) de 0,054 mm (1 ul), 0,108 mM (2 mL), 0,162 mM de (3 mL) e 0,216 mm (4 ul).
      2. Para metformina, usar concentrações (e correspondentes volumes de 2 mM) (2 ul), 4 mM (4 ul), 6 mM (6 ul), 8 mM (8 uL) e 10 mM (10 ul).
      3. Para a aspirina, usar concentrações (e correspondentes volumes) de 0,030 mm (1 ul), 0,060 mM (2 mL), 0,099 mM (3,3 mL), 0,150 mM (5 mL), e 0,216 mM (6,7 mL).
    2. Dividir células MMT da placa de 10 cm para uma placa de 24 poços a uma concentração de 3,6 x 10 6 células / cm2. Determine a concentração celular inicial por ambos os métodos de contagem de células-(etapa 2). Chame esta nova placa de 24 poços de células "Dia Dividir".
    3. 24 horas após o plaqueamento de células, as células MMT tratar com cada um dos agentes terapêuticos anti-proliferativos, o tamoxifeno, a curcumina, a metformina e a aspirina, nas concentrações descritas no Passo 3.2.1. Referem a isso como "Dia 0".
      1. Como cada poço pode conter um máximo de 500 mL de mídia, use micropipetas com pontas de micropipeta estéril e uma nova dica cada vez que um novo poço é tratado para evitar cross contaminação. Usar dois poços como controlos: células cultivadas na ausência de qualquer tratamento medicamentoso (controlo negativo) e células cultivadas na presença de etanol a 100% (controlo de solvente).
    4. Cultivar células e re-administrar drogas nas concentrações descritas quando as células são alimentadas a cada dois dias (ver Passo 1.2), durante 96 horas (até o dia 4) nos dias 1 -. 4 de tratamento, observação das células ao microscópio e contagem usando o método descrito no Passo 2.2 (ver Figura 4).
    5. Repita a experiência pelo menos três vezes.
    6. Determinar a concentração óptima de cada droga representando graficamente a relação entre a viabilidade celular e a dosagem da droga ao longo do comprimento da experiência (ver Figura 5).
  3. Estabelecer um curso de tempo.
    1. Tratar as células MMT com os três agentes terapêuticos anti-proliferativos (tamoxifeno, curcumina e metformina) a uma concentração fixa de diferentes intervalos de tempo. Utilizar a identif concentração óptimaIED através das experiências de resposta à dose (ver Passo 3.2).
      1. Use as seguintes concentrações: tamoxifeno mM 0,216, 0,216 curcumina mM e 10 mM de metformina.
        Nota: Um curso de tempo determina a quantidade de tempo necessária para um medicamento para produzir o seu melhor resultado desejado. Aqui, o resultado desejado é uma diminuição na proliferação celular em comparação com o controlo.
    2. Dividir células MMT da placa de 10 cm para uma placa de 24 poços a uma concentração de 3,6 x 10 6 células / cm2. Determine a concentração celular inicial por ambos os métodos de contagem de células-(etapa 2). Chame esta nova placa de 24 poços de células "Dia Dividir".
    3. 24 horas após o plaqueamento de células, as células MMT tratar com cada um dos agentes terapêuticos anti-proliferativos, o tamoxifeno, a curcumina, a metformina e a aspirina, nas concentrações óptimas identificadas na etapa 3.2. Referem a isso como "Dia 0".
      1. Como cada poço pode conter um máximo de 500 mL de mídia, nóse micropipetas com pontas de micropipeta estéril e uma nova dica cada vez que um novo poço é tratado para evitar a contaminação cruzada.
      2. Usar dois poços como controlos: células cultivadas na ausência de qualquer tratamento medicamentoso (controlo negativo) e células cultivadas na presença de etanol a 100% (controlo de solvente).
  4. Cultivar células e re-administrar medicamentos, na concentração escolhida quando as células são alimentadas a cada dois dias (ver Passo 1.2), durante 96 horas (até o dia 4). Nos Dias 1-4 do tratamento, observação das células ao microscópio e contar usando o método descrito no Passo 2.2 (ver Figura 4).
  5. Repita a experiência pelo menos três vezes.
  6. Determine o tempo de exposição óptimo das células MMT para cada droga representando graficamente a relação entre a viabilidade celular e duração (tempo) de tratamento de droga na concentração seleccionada (ver Figura 6).

4. O módulo de laboratório

Nota: A seguinte é uma 5-diacronograma laboratório para laboratório módulo. A Figura 7 é um diagrama de fluxo do que o calendário implicaria dentro dos 5 dias. Para esta actividade deve ser completado em cinco dias ou um curso de tempo, ou uma curva de resposta à dose é gerado. Não há tempo suficiente para gerar ambas as curvas. A experiência de resposta à dose é descrito abaixo. A experiência ao longo do tempo pode ser facilmente intercambiáveis

  1. Dividir a classe em grupos: um grupo ter estabelecer uma resposta à dose e o outro um campo de tempo escolhendo uma concentração no meio de as concentrações de resposta à dose propostos.
    1. Manter culturas suficientes e estoques de drogas em concentrações adequadas. Salvo disposição em contrário, realizar todo o trabalho sob o BSC.
  2. Dia 1
    1. Os estudantes devem fazer mídia e cultivar células (como no passo 1).
    2. Como estudantes obter um stock de células MMT em uma placa de 10 cm dirigir os estudantes para preparar meios de cultura de células e dar um tutorial no uso do hemocytomeTer, microscopia digital e software de microscopia câmara digital (como no passo 2).
    3. Calibrar o software para os objectivos utilizados no microscópio (por exemplo, 4X, 10X, 20X) agora usando o protocolo do fabricante.
  3. Dia 2
    1. Já estudantes confirmar o número total de células e a viabilidade das células (tal como no passo 2).
    2. Já estudantes contar as células na placa de 100 mm, utilizando tanto o software de microscopia e os métodos hemocitómetro, para confirmar se obtêm resultados semelhantes.
    3. Alunos para obter uma placa 24 e de divisão de células assim a placa de 100 mm, para as placas de 24 poços à densidade de revestimento a partir de células desejado (como na etapa 1). Este é considerado o Dia Split. Coloque a placa de 24 poços numa incubadora de cultura de células durante 24 horas.
  4. Dia 3
    1. Cultivar células MMT durante 24 horas sobre uma placa de 24 poços. Peça aos alunos observar células ao microscópio e contagem usando software microscopia (como no passo 2).
    2. Dê o aluno / tesou amostras de stocks de medicamentos de tratamento do câncer. Peça-lhes para preparar e diluir a solução estoque inicial (como no passo 3). Adicionar as diversas concentrações das drogas às suas células para estabelecer uma curva de resposta à dose. Isto é chamado Dia 0.
    3. Incubar as células (passo 1.2), com os medicamentos para o máximo de 48 horas.
  5. Dia 4
    1. Peça aos alunos observar células tratadas após 24 horas. Este é o Dia 1.
    2. Conte cada software microscopia bem usando. Fotografias da ficha de modo a que cada poço de contagem pode ser realizada fora do laboratório (como no passo 2).
    3. Incubar as células (passo 1.2), com as drogas durante mais 24 horas.
      Nota: Instrutor fornece tutoriais e comentários de análise de dados e apresentação gráfica adicionais. Os alunos aprendem a criar figuras, gráficos e análise estatística para o dia seguinte de coleta de dados.
  6. Dia 5
    1. Peça aos alunos que trataram células após 48 horas, do dia 2.
    2. Conte cadabem usando microscopia de software. Fotografias da ficha de modo a que cada poço de contagem pode ser realizada fora do laboratório (como no passo 2).
    3. Colheita e recolher células para contagem de hemocitómetro pelo método tradicional como um meio de verificar a capacidade do estudante para utilizar eficazmente o método de software microscopia (como no passo 2).
      Nota: Recolha de dados e tirar conclusões ou revisar hipóteses, em conformidade.

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Representative Results

Crescer células MMT e comparando métodos de contagem.

Células de tumor mamário foram cultivadas com sucesso e caracterizado (Figura 1) e um método de contagem de células novo desenvolvido usando Motic Software, um programa digital de software associado a câmara por um microscópio. Este novo método de contagem de células foi comparada com um método de contagem tradicional utilizando um hemocitómetro (Figura 2) e mostrou-se igualmente eficaz na determinação do número de células (Tabela 1). Para controlar quaisquer efeitos sobre o número de células em função de condições de crescimento diferentes, ou tipo de célula, a comparação entre os dois métodos de contagem de células foi conduzida na presença e na ausência de agentes anti-proliferativos e com uma linha celular diferente, o modelo neuronal PC12 17.

A Figura 3 mostra a delimitação da área para a contagem de células com este método que utiliza uma grelha sobreposta de defindimensões ed. A grelha é colocada sobre o campo de visão (FOV) e uma moldura verde é então aplicado a um comprimento designado e largura da malha (isto é, quadrados 9x5). As células são contadas no interior da moldura verde e o número de células é extrapolada, como discutido no protocolo.

O tratamento de células MMT: Determinar a resposta à dose de células MMT para agentes anti-proliferativos.

Os estudos de resposta a dose (Figura 4) foram realizados para cada agente anti-proliferativo. Ao longo destes dados experimentos foi continuamente se reuniram, revistos e analisados ​​para ver se estavam garantidos possíveis revisões do protocolo. O experimento foi conduzido por três vezes, com cada estudo produzir resultados semelhantes. As experiências foram continuados até que todas as células estavam mortas ou os efeitos das drogas tinha estagnado. Fotomicrografias digitais dos resultados são apresentados na Figura 4, e uma análise gráfica destes resultados é apresentadona Figura 5. gamas de concentração eficazes são relatados na legenda da Figura 4, no eixo X da Figura 5 e na secção de Protocolo.

Na concentração mais baixa do tamoxifeno, 0,054 mM, houve inibição do crescimento celular robusto, cerca de 83% quando comparada com células não tratadas (Figura 4A). A viabilidade das células continuou a diminuir com concentrações crescentes de tamoxifeno (Figura 5A). A dosagem óptima do tamoxifeno foi determinada como sendo 0,216 mM, porque depois de 48 h a morte celular completa ocorreu em que a concentração (Figura 4A). Curiosamente, estas reduções na propagação de células não revelaram qualquer indicação de uma resistência celular ao tamoxifeno, como seria de esperar com base na literatura 18,19 ressaltando que in vitro modelo de sistemas, mas nem sempre representam plenamente em eventos vivo. Além disso, quando comparada com o menor Treatment concentrações de curcumina (Figura 4B e 5A) e metformina (Figura 4C e 5B), a mais baixa concentração do tamoxifeno foi de 9% e 50% mais eficaz em parar a divisão de células, respectivamente.

Curcumina exibiu um efeito dependente da concentração na inibição da divisão celular bem. Com concentrações crescentes, houve uma diminuição significativa da viabilidade celular (Figura 4D e 5A). A dosagem óptima da curcumina foi determinada como sendo 0,216 mM, porque depois de 48 horas, como o tamoxifeno, não havia morte celular completa a essa concentração.

O tratamento com metformina originou menos a diminuição dramática na MMT viabilidade celular, levando a uma redução de 33% na concentração mais baixa. Uma diminuição concomitante da viabilidade celular com o aumento da concentração de metformina foi observado (Figura 4C e 5B). A dose óptima de metformina foi determinada a ser a maior concentração testada (10 mM). Em comparação com o tamoxifeno e a curcumina, tanto rotineiramente utilizados como agentes de quimioterapia, metformina foi 30-40% menos eficaz na inibição do ciclo celular. Curiosamente, os efeitos da metformina sobre a divisão celular foram consistentes com os obtidos através da administração de aspirina (Figura 4D e 5A), uma droga salicílico com nenhum mecanismo claramente identificada de inibição do crescimento celular.

O tratamento de células MMT: Determinar o curso de tempo da resposta celular MMT para agentes anti-proliferativos.

Um estudo ao longo do tempo também foi realizado para cada agente anti-proliferativo, porque a dose eficaz de uma droga administrada pode ser influenciado pelo tempo de exposição. À medida que este módulo de ensaios de viabilidade celular, é importante identificar primeiro a rapidez com que as células se dividem (tempo de duplicação) para uma janela lógico para a duração do tempo que as células são expostas às drogas podem ser escolhidas. É, portanto, essencial que MMT tempo de duplicação celular serverificada quando inicialmente caracterizar as células. Ao longo destes experimentos, os dados foram reunidos continuamente, revistos e analisados ​​para ver se estavam garantidos possíveis revisões do protocolo. O experimento foi conduzido por três vezes, com cada estudo produzir resultados semelhantes. Os experimentos foram continuou até que todas as células estavam mortas ou os efeitos tinha estagnado.

Estudos de curso de tempo revelou que o tratamento de células com concentrações MMT optimizadas de cada droga anti-proliferativa (tamoxifeno 0,216 mM, 0,216 mM de curcumina, metformina 10 mM) durante 96 horas resultou na morte da célula completa ou um nivelamento dos efeitos da droga ( A Figura 6). Embora a aspirina, a droga "opcional", afetou a viabilidade celular em nossos estudos de dose-resposta, o impacto foi menor e, portanto, não foi incluído em estudos do curso de tempo.

Figura 1
Figura 1. As células MMT. Fotomicrografia digital de células "saudáveis", tumor mamário de rato não tratada (MMT) cultivadas a 3,6 x 10 6 células / cm2 em Eagles modificado Meio Essencial Mínimo (EMEM) .100X, escala = 0,2 mM, indicado pela barra branca. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2

Grade Figura 2. Hemocitómetro. Fotomicrografia de grade hemocitómetro, 100x. Seção grade completa mostrada no círculo (FOV). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 3. A designação de área de contagem com o software Motic.   Imagem de sobreposição de grade em FOV e área definida para a contagem de células MMT estabelecidas com o software Motic como pode ser visto através do microscópio. 100X, escala = 0,2 milímetros, indicado pela barra branca. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4
Figura 4. Resposta à dosagem de células MMT para agentes anti-proliferativos. Fotomicrografias digitais de células MMT cultivadas na presença de agentes anti-proliferativos em concentrações variando de 96 horas. O tamoxifeno: (a1) 0,054 mM (A2) 0,108 mM (A3) 0,162 mM (A4) 0,216 mM; Curcumina: (B1) 0,054 mM (B2) 0,108 mM (B3) 0,162 mM (B4) 0,216 mm; Metformina: (C1) 2 mM (C2) 4 mM (C3) 6 mM (C4) 8 mM (C5) 10 mM; Aspirina: (D1), 030 mM (D2) 0,060 mM (D3) 0,099 mM (D4) 0,150 mM (D5) 0,216 mM; O etanol (100%) e não tratada são ambos os controles. 100X, escala = 0,1 milímetros, indicada por linhas azuis que compõem cada quadrado dentro da grade. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 5 Um

Figura 5 B

Figura 5. Representação gráfica de experiências de resposta à dose de células MMT para agentes anti-proliferativos. Efeitos do aumento de concentrações de agentes anti-proliferativos (A) o tamoxifeno, a curcumina, a aspirina, e (B) da metformina sobre a viabilidade das células MMT. Os resultados de umestá expresso como uma percentagem do controlo após 48 horas de tratamento, embora o tratamento de células prosseguiu por 96 horas. n = 3, é indicado DST.

Figura 6
Figura 6. Representação gráfica do decurso de tempo da análise MMT resposta celular a agentes anti-proliferativos. Curso de tempo de estudo os efeitos do tamoxifeno (0.216mM), curcumina (0.216mM) e metformina (10 mM) sobre a viabilidade das células MMT mais de 96 hrs. Os resultados são expressos como uma percentagem do controlo após 48 horas de tratamento. Mostrado aqui são resultados de uma experiência representativa, n = 1.

Figura 7
Figura 7. Diagrama de fluxo do módulo do laboratório de 5 dias.

Tipo celular Drogas Administered Dia da Experiência Concentração da Droga Contagem de Células com Motic Contagem de Células com hemocit�etro
MMT Não tratada Dia 2 - 4 7,8x10 células / cm 2 4 8.0x10 células / cm2
MMT Etanol Dia 2 10 mM 4 7.1x10 células / cm2 4 7.2x10 células / cm2
MMT Tamoxifen Dia 2 0,216 MM 0 células / cm2 0 células / cm2
MMT Tamoxifen Dia 2 0,054 mM 4 1.3x10 células / cm2 4 1,5x10 células / cm 2
MMT A curcumina Dia 2 0,054 mM 1.9x10 4 cells / cm 2 4 2,0x10 células / cm 2
MMT A curcumina Dia 2 0,216 mM 0 células / cm2 0 células / cm2
MMT Metformina Dia 2 2 mM 4 5.1x10 células / cm2 4 5.2x10 células / cm2
MMT Metformina Dia 2 6 mM 4 3.4x10 células / cm2 4 3.5x10 células / cm2
MMT Aspirina Dia 2 0,099 mM 4 2.8x10 células / cm2 4 3,0x10 células / cm 2
PC12 Não tratada Dividido - 4 2,5x10 células / cm 2 4 2.1x10 células / cm2

Tabela 1. Comparação de hemocitómetro e software Motic contando métodos. Os resultados da contagem celular de células MMT, usando software Motic ou os métodos hemocitómetro. Tanto as células não tratadas e tratadas foram contadas, bem como uma linha celular diferente, PC12, como um controlo.

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Discussion

Um módulo de laboratório é apresentado que tem como objetivo ensinar uma variedade de tópicos em biologia celular através das avançadas técnicas de cultura de células animais. O módulo realiza esta análise dos efeitos de uma série de produtos químicos anti-proliferativos sobre a replicação de células que modelo de cancro da mama humano. O ensaio primário se baseia na técnica fundamental da contagem de células e introduz uma nova maneira de contar as células utilizando software de microscopia. As actividades que compreendem o módulo pode ser realizado com instrumentos e equipamentos disponíveis na maioria dos programas de biologia. O módulo pode ser implementado num esquema de 5 dias com as fontes que são baratos e facilmente obtido. Apesar de uma determinada marca de câmera microscópio e microscopia software digital é usado aqui (Software Motic), qualquer câmera e software comparável deve ser suficiente.

Este módulo laboratório utiliza células MMT como um modelo para o câncer de mama humano. Os alunos são ensinados a crescer primeiro e caracterizar estesAs células em cultura. É importante ressaltar que a conclusão deste módulo de laboratório exige que os investigadores (aka estudantes) ser bem familiarizados com a aparência eo comportamento das células MMT saudáveis, particularmente desde que as células MMT não tratados servem como controles. Portanto completa caracterização dos padrões de crescimento celular, tempo de duplicação e morfologia geral das células MMT é essencial para que os dados do curso de resposta dose adequada e tempo são para ser geradas.

Uma vez caracterizado, as células MMT foram então testados quanto à sua resposta a vários agentes anti-proliferativos, como um meio de ensinar os tópicos da divisão celular, regulação do ciclo celular, a sinalização celular e cancro. A viabilidade das células é utilizado para compreender o efeito destas drogas nas células. Um novo método de contagem das células, utilizando o software associado com uma câmara digital montada no microscópio, é realizado e comparado com um procedimento à base de contagem em hemocitómetro tradicional para verificar a sua precisão. This novo método proporciona duas vantagens, que são particularmente notável porque é usado em laboratórios universitários de ensino. Em primeiro lugar, uma vez que as células não necessitam de ser removidos da placa de cultura de tecidos para a contagem, é necessário menos tempo para realizar o principal ensaio experimental. Isto permite um grande número de variáveis ​​experimentais para ser testado de uma só vez e num período de tempo limitado. Em segundo lugar, o método fornece um registo digital da resposta celular ao tratamento experimental permitindo que os estudantes para avaliar os resultados e refinar a sua estratégia experimental fora do laboratório.

Há várias questões a serem observados na implementação de ambos os métodos de contagem. Em primeiro lugar, antes da contagem de células com o método, as células são incubadas com azul de tripano para distinguir entre uma célula viável e uma célula morta. As células mortas são penetradas pelo corante e aparecem azul escuro, enquanto que as células viáveis ​​são branco brilhante. No entanto, se as células forem incubadas com dye para além do período de incubação recomendado, eles vão ser mais manchado e difíceis de distinguir. Em segundo lugar, as células MMT podem aglutinar-se no hemocitómetro ou a placa de cultura de tecido e ser difícil contar individualmente. Por conseguinte, um "aglomerado" é designada para conter um certo número de células (por exemplo, 10 células / clump) e cada tufo presentes na grelha é então multiplicado por esse número durante a contagem. Finalmente, as células MMT aderir à superfície de pratos em que eles são cultivadas. Por conseguinte, é necessário encostar a ponta da pipeta directamente para a placa ao remover as células e aplicar a força para quebrar aglomerados de células e remover tantas células a partir da placa quanto possível. Como resultado, meu levar várias tentativas para obter uma contagem precisa ao usar o método tradicional hemocitômetro.

Com as células bem caracterizadas e métodos de contagem verificada, duas experiências diferentes são conduzidas; um estudo de resposta à dose dos efeitos de várias concentraçõesde fármacos anti-proliferativos sobre a divisão celular e MMT numa experiência ao longo do tempo para elucidar o tempo óptimo de exposição a esses fármacos. Estas experiências são altamente instrutivos como é necessário tentativa e erro e aplicação da literatura primária é necessário para uma experiência de sucesso. Por exemplo, as tentativas iniciais de elucidar uma resposta à dose de células MMT a estes agentes anti-proliferativos revelou que as concentrações testadas eram demasiado elevados, como havia 100% de morte de células dentro de 24 horas da administração do medicamento. Uma revisão da literatura expandida conduzido a uma gama de concentrações de tratamento revisto. Isso efetivamente ensina os alunos a usar bancos de dados da literatura, ler, analisar e criticar artigos da literatura primárias e ressalta como essas habilidades são essenciais para o processo científico.

Os resultados dos estudos de dose-resposta revelaram que o tamoxifeno exibe mais forte efeito anti-proliferativa em todas as concentrações testadas. O tamoxifeno, um anti-mitotic droga, é usado especificamente como uma terapia anti-estrogénio para cancros estrogênio sensíveis, geralmente na pós-menopausa, os pacientes sensíveis a hormônios 18-20. A droga é atualmente utilizada como um tratamento de câncer de mama. Tamoxifeno compete com estrogénio para o receptor de estrogénio e intracelular quando ligado, se regula a expressão de ciclinas D e B, dois importantes reguladores do ciclo celular. Os resultados obtidos na actividade sugere que o tamoxifeno ligado com êxito ao receptor de estrogénio e inibiu a progressão da célula através do ciclo celular, resultando na diminuição da proliferação celular observada. Interessantemente, a redução das taxas de propagação de células MMT em todas as concentrações de tamoxifeno administrado não revelam qualquer indicação de resistência celular ao tamoxifeno, como seria de esperar com base na literatura (ver por exemplo 19). Isto serve como um bom lembrete de que as condições in vitro em que o experimento foi conduzido fazer i não totalmente modelon vivo circunstâncias.

Curcumina tratamento de células MMT também resultou numa redução da viabilidade das células. A curcumina é um composto derivado da raiz curcuma e actua como um inibidor do crescimento celular 12,16. Ela funciona por down-regulação da via NF-kappa B e ornitina descarboxilase (ODC) atividade. NF-kappa B é um complexo de proteína que controla a transcrição de genes anti-apoptóticos, como TRAF1 e TRAF2, que codificam para proteínas que inibem a apoptose. ODC é uma enzima que catalisa a produção de poliaminas, proteínas que fornecem células cancerosas com fontes elevados de nutrição que conduzem a crescimento celular aumentada. O medicamento é de uso corrente como um tratamento de câncer de mama. Os efeitos anti-proliferativos de curcumina mostra claramente o efeito que a regulação negativa da via de sinalização celular que envolve NF-kappa B e ornitina descarboxilase tem sobre a divisão celular.

A viabilidade celular foi reduzido de forma semelhante observada com metformina tratamennt. Metformina, um medicamento administrado tipicamente para diabéticos tipo II, foi escolhido porque os relatórios publicados sugerem uma correlação entre pacientes que tomam metformina e uma menor incidência de câncer de mama 15. Acredita-se que o agente modula o gene c-MYC e, desse modo, regula negativamente a actividade de ciclina D. A regulação das ciclinas, moléculas que servem como ponto de verificação dentro do ciclo celular, permite que as células para o progresso através do ciclo a uma taxa mais rápida resultando num aumento da divisão celular e crescimento. Os efeitos do tratamento com metformina em células MMT mostra como a modulação do gene c-MYC também leva a sub-regulação da ciclina D e uma redução na divisão celular. Os dados de metformina exemplifica ainda mais como um medicamento concebido para um condicionamento neste caso a diabetes pode ter um mecanismo de acção adequado para outros eventos fisiológicos aberrantes. Além disso, é importante ressaltar que, embora o tamoxifeno, a curcumina, e metformina tudo retardar prolif celular anormalração por meio de diferentes mecanismos, cada diminuiu com sucesso populações de células e interferiu com a divisão celular in vitro.

Este módulo também permite a pergunta open-ended em que outro medicamento, remédio herbal ou agente pode ser testada. A aspirina, um analgésico over-the-counter, antipirético, e medicação anti-inflamatório usado para aliviar a dor leve e reduzir a febre foi escolhido neste módulo. A capacidade da aspirina para reduzir a inflamação pode inibir o crescimento tumoral, retardando o desenvolvimento de novos vasos sanguíneos que alimentam eles e interferindo com células estaminais que alimentam a sua 11,13,14 crescimento. Curiosamente, a administração da aspirina em células MMT deu origem a uma certa redução na viabilidade das células. Pouco se sabe sobre o papel da aspirina na prevenção e tratamento do câncer, embora muitos estudos correlativos são relatados 13,14, proporcionando um excelente exemplo de correlativa contra as relações causais.

O tempocurso estudos revelaram que, quando administrada em doses optimizada, os fármacos anti-proliferativos são altamente eficaz em interferir com a divisão celular dentro de 4 dias após a exposição inicial. Esses estudos também proporcionar uma oportunidade para os alunos a usar o que aprenderam sobre características de crescimento de células MMT quando da elaboração de uma estratégia experimental para a realização desses experimentos. De fato, caracterizando completamente os padrões de crescimento celular, tempo e morfologia celular geral de células MMT duplicação é essencial tanto para dados de resposta à dose e tempo de curso precisos.

Ambos os estudos de resposta à dose e cursos de tempo determinam a relação entre a concentração de droga e do tempo de exposição, respectivamente, e o efeito de uma droga tem num sistema biológico. Esta é uma excelente maneira de fazer os alunos a pensar sobre interações intermoleculares e outros conceitos fundamentais em bioquímica durante a realização de investigação orientada, actividades de investigação. É interessante notar que uma vez que muitos bimajors ology pretende frequentar a escola médica, este módulo laboratório alinha bem com as mudanças recém-instituídas nos requisitos da escola de medicina 21.

Este módulo de laboratório pode ser implementado exactamente como descrito, ou pode facilmente servir como um modelo. Um grande número de variações pode ser incorporado esta actividade, tal como a escolha do agente anti-proliferativo, tipo de célula ou modificação de nutrientes no meio de crescimento. Contanto que uma hipótese é desenvolvida que testa conceitos fundamentais e avançados em biologia celular ou geral, as permutações deste módulo são numerosos. Independentemente da permutação, a implementação dessa atividade naturalmente dirige aluno a aprender uma grande variedade de técnicas de laboratório e se familiarizar com uma variedade de equipamentos e instrumentação.

Em resumo, o módulo de laboratório descrito aqui permite que os alunos a participar plenamente no processo de ciência, desenvolver suas habilidades para adquirir, analisar e graficamente ReprESENT dados e aprimorar a gestão do tempo e habilidades colaborativas. O módulo é projetado para facilitar a pergunta em aberto e é facilmente adaptável a vários agenda de cursos e níveis de habilidade. Deve notar-se que os dois primeiros autores deste artigo são cursos de graduação de biologia, demonstrando claramente que este módulo de laboratório é adequado para que a população.

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Disclosures

Os autores não receberam qualquer apoio financeiro ou comparável de Motic.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Tissue Culture Hood ESCO Labculture Reliant Class II Type A2 Biological Safety Cabinet
Waterjactor CO2 Incubator CEDCO Model 1510
Bright-line Hemocytometer American Optical with two separate grids
Motic Images Plus Mac OSX Verison 2.0 or higher
Gilson Pipetman Rainin instrument co. inc P-20D, P-200D, P-1000D
CK30/CK40 Culture Microscope Olympus 4 objective inverted light microscope with camera
200 μl Pipet tips MidSci 40200C
1,000 μl Pipet tips MidSci AVR4
10 ml Seriological Pipets TPP TP94010
24 well plates CoStar- Tissue Culture Cluster 3524 24 wells, 16 mm well diameter, radiation sterilized
Trypan Blue Solution 0.4% Sigma T8154 100 ml, cell culture tested non-haz
Bright-line Hemacytometer replacement coverslip, non-haz Sigma Z375357
Mouse Mammary Tumor(MMT) cells ATCC CCL-51
Eagle Minimum Essentail Medium (EMEM) ATCC 30-2003 500 ml
Fetal Bovine Serum Sigma F0926 500 ml
Metformin Hydrochloride Sigma PHR1084 500 mg
Tamoxifen Sigma T5648 white or white-yellow powder
Curmumin Sigma C1386 yellow-orange powder
Aspirin Sigma A2093 meets USP testing specifications

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References

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McIlrath, V., Trye, A., Aguanno, A. Using Mouse Mammary Tumor Cells to Teach Core Biology Concepts: A Simple Lab Module. J. Vis. Exp. (100), e52528, doi:10.3791/52528 (2015).

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