Introduction
Часто в бакалавриата Общая биология, темы регулирования и рака цикла затронуты, но не детально изучены, потому что широта содержания в этих курсах, оставляет мало времени для глубины. Кроме того, студенты биологии обычно не подвергаются передовых методов, связанных с животным клеточной культуре. Чтобы помочь студентам развить глубокое понимание этих понятий, в то время как применение и анализа, что они узнали, лаборатория активность была разработана как модификация Уолтера Рида Армии института исследований (WRAIR) расширенной деятельности лаборатории 1. Модуль Лаборатория использует поэтапный, экспериментальные стратегии, которая включает растет и характеризующие модель раковых клеток, разработке и реализации методов подсчета клеток, установления оптимального времени курс и дозировки для лечения клетки с анти-пролиферативных агентов, и выявление аберрантных клеток-сигнальных путей , Эксперимент также позволяет открыт-ended запрос.
Большинство методов, необходимых для этой активности может быть достигнуто в типичной биологии-преподавательский лаборатории. Занятие начинается со студентами, характеризующих морфологию и скорости роста опухоли молочной железы мыши (ММТ) клеточной линии, модель человеческого рака молочной железы 2. Рак молочной железы был выбран в качестве модели рака из-за его распространенности в популяции, его знакомство для студентов колледжа возраста, и широко распространенных имеющихся данных. Клеточная линия ММТ был специально выбран потому, что это легко доступны, хорошо изученным, имеет короткое время удвоения и легко выращивать. Кроме того, ММТ клетки эстроген-зависимыми, что согласуется с большинством женщин рака молочной железы. Студенты затем определить аномальные клетки-сигнальных путей в клетках ММТ обработкой клеток с химиотерапевтических препаратов, механизм действия которых хорошо established.The концентрация препаратов и продолжительности лечения разнообразны позволяет студентамоценить влияние этих переменных на скорость деления клеток. Ключ анализа этой деятельности является определение жизнеспособности клеток, который просто требует подсчета клеток, с помощью одного из двух методов. Каждый метод зависит от сильных навыков микроскопии. Студенты определяют жизнеспособность клеток с помощью стандарта, метод гемоцитометре и новый способ фотомикроскопии и предложить. Основываясь на своих выводах, они могут предложить и проверить изменения в деятельности. Затем студенты представляют свои данные и интерпретировать результаты для уточнения своей гипотезы и разрабатывать новые экспериментальные стратегии.
Эта лаборатория деятельность подходит для новичка или на уровне второкурсника студентов, специализирующихся в области биологических наук. Он конденсируется в одну неделю модуля лаборатории, которые могут быть завершены в течение первого года, общая биология или второй год, клеточный / Молекулярная биология курс. Навыки, необходимые для правильного завершения деятельности включают в себя основные арифметические и алгебра, знакомство с массивом Cруды лабораторные навыки (например, пипетки, делая решение, метод стерильных), анализ данных, основной световой микроскопии и управление временем, вместе с инструктором знаний культуры клеток и электронными таблицами. Реагенты, необходимые включают животной модели клеточной линии рака (например, молочной железы мыши опухолевые клетки ММТ 2), химиотерапевтическими агентами (например, тамоксифен, куркумин, метформин, и аспирин), трипанового синего и среда культуры клеток (например, минимальную поддерживающую среду Игла ; ЕМЕМ) с соответствующими дополнениями (например, донор лошадей и эмбриональной бычьей сыворотки). Инструменты, необходимые включают перевернутый оптический микроскоп с цифровой камеры привязанности, компьютер, 100 мм и 24-луночных планшетах для культивирования тканей, СО 2 инкубатора (или эквивалент), биобезопасности кабинета (BSC; Класс II), гемоцитометр и программного обеспечения цифровой микроскопии.
Есть хорошие примеры конкретных лабораторных видов деятельности, которые полагаются на животных клеток культуры TEACСтуденты бакалавриата ч около концепций в области клеточной биологии. 3 Однако многие требуют расходных материалов или методов, которые не легко доступны (например, радиоактивные изотопы, живая ткань животных, современное оборудование изображений 1,4,5), описывают протоколы, которые являются довольно продвинутый (например, подходит для 400 уровня, конечно 6), или требует нескольких неделю или семестр проектов 6,7. Лабораторная работа описана здесь проста и может быть проведена в течение одной недели с общим лабораторного оборудования.
В целом, эта лаборатория модуль эффективно вводит или укрепляет концепции клеточного цикла, клеточных сигнальных путей и рака, а уча основные и дополнительные навыки лаборатории, экспериментальный анализ данных, метод животных клеток культуры и научного процесса. Лабораторный модуль является простым и экономически доступными и обеспечивает гибкость и возможность для открытого состава запрос. Деятельность поощряет студентов творчествопутем предоставления шаблона экспериментальную стратегию, которая действует в качестве руководства, но не рецепт. Самое главное, что деятельность удовлетворяет всех учебных областях таксономии водорослей 8, как это требует запоминания, понимания, применения, анализа, оценки и создания путем привлечения студентов в процесс, который тянет их из учебника и в мире научных исследований.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Примечания: Проведение всех работ с клетками и клеточной культуры реагентов в шкафу биобезопасности класса II (BSC) 9. MMT клетки классифицируются как уровень биологической безопасности I, как они представляют низкой до умеренной биологическим риском. Применить надлежащие Очистка и обеззараживание процедуры КБС между использования (например, ультрафиолетовый свет, 70% этанола протереть).
1. Grow ММТ клеток
- Рост клеток в 10 см чашках для тканевых культур, содержащих 10 мл питательного мультимедиа, который состоит из орлов минимальная поддерживающая среда (EMEM) с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS), 2 мМ глутамина и 1% противогрибкового / антибиотик (10 единиц пенициллина , 100 мкг стрептомицина, 0,25 мкг амфотерицина). Выращивают клетки в увлажненной 5% CO 2 камеры, при 37 ° С. Пластина клеток при плотности 3,6 х 10 6 клеток / см 2 (см Подсчет клеток в шаге 2).
- Заменить половина клеточной культуральной среде со свежей средой и так каждые 48 часов UnlESS не указано иное. Проверьте жизнеспособность клеток и морфологию путем осмотра с перевернутой фазового контраста светового микроскопа.
- Примечание и охарактеризовать клетки по размеру, структуре, форме, организации и расчетного числа в при 100 - 200-кратное увеличение. При такой плотности, клетки должны появляться в одной плоскости, не слипаются друг с другом на вершине и в непосредственной близости. Каждая ячейка состоит из толстого, сферической ядра с тонкими, длинными, отраслевых, как расширений расширения от него, что прийти к точке (рисунок 1).
- Разделите клетки, когда они достигают плотности клеток 7,2 × 10 6 клеток / см 2. Клетки обладают удвоения скорости 1,8 × 10 6 клеток / см 2 за 24 часов. Назначить клетки Прохождение X (ПВ), чтобы обозначить количество раз они были расщеплены.
- При генерации 3 (то есть после трех проходов, P3), урожай, рассчитывать, и пластины клеток на 24 и планшета для культуры ткани в при плотности 3,6 х 10 6 2.
- Посмотреть клетки каждый день и записывать цифровые микрофотографии. Примечание и описать морфологию клеток (например, размер, форма, световозвращающими свойствами). Определить время удвоения клеток путем подсчета клеток регулярно касающийся прошедшее время количество клеток.
2. Граф ММТ клеток
Примечание: Граф клеток, чтобы определить, клетки должны быть пересевают, чтобы создать для эксперимента или для определения жизнеспособности клеток. Есть два способа, представленные здесь.
- Использование гемоцитометра, стандартный метод для подсчета клеток.
- Получить яркие строки гемоцитометр, 0,2% раствор трипанового синего красителя, соединение светового микроскопа, стерильных пробирках, пипеток и ручной счетчик клеток.
- Под BSC, использовать 10 мл пипетки, чтобы удалить клетки от 10 см блюдо культуры ткани. Если клетки выращивают на 24-луночного планшета используют пипетки 1 мл или 1000 мкл микропипетки для удаления информации.
- Поместите полученную клеточную суспензию в 15 мл стерильной пробирке (или 1 мл микро центрифуги или другой небольшой объем труб). В противном случае оставьте клеток в исходной культуры ткани пластины / хорошо.
- Под BSC, объединить 10 мкл клеточной суспензии с 10 мкл трипанового синий раствор (1: 1) в нестерильной микро центрифуги или другого малого объема трубки.
Примечание: Трипановый синий жизненно пятно, которое не поглощается здоровых жизнеспособных клеток. Когда клетки повреждены или мертвы, трипанового синего может войти в клетку, позволяющую мертвые клетки, которые будут учитываться (ака красить метод исключения). Поэтому под микроскопом, мертвые клетки появляются темно-фиолетовый, а жизнеспособные клетки яркий и светлый цвет. - Высиживатьпри комнатной температуре в течение 5 мин.
- Поместите покровное на гемоцитометре. Применение 10 мкл трипанового синего смесь суспензии клеток в паз. Просмотр гемоцитометр на 100 - 200-кратное увеличение. Четыре угла сетки очевидно (см рисунок 2).
- Подсчитайте число жизнеспособных клеток (неокрашенных) по отношению к общей клеток в каждой сетке области. Нормальное четыре сетки и умножить на 1 х 10 4 для получения клеток / мл.
- Экстраполировать общее число клеток на чашку (или клеток / см 2). Используйте этот номер либо определить правильный объем клеточной суспензии, чтобы использовать, чтобы отобрать новый планшет для тканевых культур в требуемой плотности 3,6 х 10 6 клеток / см 2 или определить общее количество жизнеспособных клеток на пластине или в хорошо.
Примечание: Для дополнительные указания по использованию гемоцитометре см 10.
- Экстраполировать общее число клеток на чашку (или клеток / см 2). Используйте этот номер либо определить правильный объем клеточной суспензии, чтобы использовать, чтобы отобрать новый планшет для тканевых культур в требуемой плотности 3,6 х 10 6 клеток / см 2 или определить общее количество жизнеспособных клеток на пластине или в хорошо.
- Используйте программное обеспечение и цифровой фотоаппарат рассчитывать жизнеспособных клеток.
- Получить диgital камеры, сопровождающих его программное обеспечение, 0,4% -ный раствор трипанового синего красителя, соединение световым микроскопом, стерильные пробирки, пипетки и компьютером.
Примечание: Moticam 2000 цифровая камера с сопровождающей Motic программного обеспечения используется здесь. Любая сравнимая камера и программное обеспечение должно быть достаточно. Убедитесь, что программное обеспечение цифрового камера была откалибрована заранее (в соответствии с протоколом производителя). - Под BSC, использовать 1 мл пипетки или 1000 мкл микропипетки удалить СМИ из клеток ММТ, растущих в культуре ткани блюдо 24 а. Вымойте прилипшие клетки осторожно нанести небольшое количество (примерно 500 мкл) ООН-дополняется (то есть, без каких-либо ЕМЕМ добавок) свежей среды к пластине, то ее удаления. Применение 10 мкл 0,2% трипанового синего (путем разбавления 1: 1 с не-дополнена ЕМЕМ) непосредственно в скважину.
- Инкубируют планшет при комнатной температуре в течение 5 мин.
- Просмотр пластины под микроскопом при 100 - 200-кратное увеличение жIth цифровая камера прилагается. Плита может быть промывают пищевую добавку СМИ, если окрашивания 2% трипанового синего слишком темный.
- Откройте программное обеспечение на компьютере а-я убедиться, что программное обеспечение будет настроен на цели, используемого на вкладке настроек. Должен появиться изображение поля зрения.
- Выберите сетку на вкладке Измерение. Примерно появится сетка из квадратов 0,005 см в ширину. Выберите сетки информация для подтверждения площадь каждого квадрата.
- Выберите удельную сетки рассчитывать клетки (то есть, 5 х 9 квадратов квадратов). Выберите прямоугольник на вкладке Измерение. Щелкните угол квадрата, и перетащите курсор, чтобы охватить квадраты выбора.
Примечание: оттенок зеленого будет охватывать квадратов выбора и белой коробке появится в углу, что обеспечивает ширину, высоту, площадь и периметр сечения сетки выбранной (рисунок 3). - Подсчитайте количество viabле клетки в определенной области. Сделайте то же самое для двух других местах в той же скважине или пластины, перемещая пластину под микроскопом.
- Будьте уверены, что измеряется площадь же и увеличения не изменилась. Рассчитайте среднее количество жизнеспособных клеток в этой области. Использование зону скважины (на 24-луночный планшет, одна скважина имеет площадь 2 см 2, в течение 100 мм чашку область 78,6 см 2), экстраполировать число жизнеспособных клеток из района, определенного в сетке Общее количество клеток в лунке (клеток / см 2).
- Получить диgital камеры, сопровождающих его программное обеспечение, 0,4% -ный раствор трипанового синего красителя, соединение световым микроскопом, стерильные пробирки, пипетки и компьютером.
3. Лечить ММТ клеток с антипролиферативным агентов
- Готовят растворы выбранных антипролиферативных терапевтических агентов (тамоксифен, куркумин и метформин) и дополнительным препарата, аспирин при КБС.
- Растворите куркумин и тамоксифен в 100% этанола, чтобы создать концентрацию акций 27 мм. Растворите метформин и аспирин в unsupplementред ЕМЕМ для создания концентрации акций 500 мм и 15 мм, соответственно.
- Установите дозу ответ.
- Лечить ММТ клетки с тремя антипролиферативных терапевтических агентов (тамоксифен, куркумин и метформин) и дополнительным наркотиков (аспирин) в различных концентрациях в течение 96 часов, чтобы создать кривую. Первоначально администрирование всех наркотиков в диапазоне концентраций, основанных на опубликованных отчетов 1,11-16, а затем в концентрации больше или меньше, чем тех, кто опубликован.
Примечание: Ответ на дозу определяет минимальную концентрацию препарата, необходимого для получения желаемых результатов. Здесь желаемый результат является снижение клеточной пролиферации по сравнению с контролем.- Для тамоксифена и куркумин, используйте концентрации (и соответствующие объемы) от 0,054 мм (1 мкл), 0,108 мм (2 мкл), 0,162 мм (3 мкл) и 0,216 мм (4 мкл).
- Для метформина, используйте концентрации (и соответствующие объемы) 2 мм (2 мкл), 4 мМ (4 мкл), 6 мМ (6 мкл), 8 мМ (8 мкл) и 10 мМ (10 мкл).
- Для аспирина, использовать концентрации (и соответствующие объемы) от 0,030 мм (1 мкл), 0,060 мм (2 мкл), 0,099 мМ (3,3 мкл), 0,150 мм (5 мкл) и 0,216 мМ (6,7 мкл).
- Разделение ММТ клеток из 10-см чашку на 24-луночный планшет в концентрации 3,6 × 10 6 клеток / см 2. Определить начальную концентрацию клеток обоих методов клеточной подсчета (шаг 2). Назовите этот новый 24-луночного планшета клеток "День Split".
- 24 ч после посева клеток, лечения клетки ММТ с каждым из антипролиферативные терапевтических агентов, тамоксифен, куркумин, метформин и аспирин, в концентрациях, описанных в шаге 3.2.1. Относятся к этому как "день 0".
- Поскольку каждый хорошо может держать максимум 500 мкл среды, использование микропипеток с стерильных советы микропипетки и новый наконечник каждый раз новый колодец обработке, чтобы избежать крзагрязнение ОС. Использование двух скважин в качестве контролей: клетки, выращенные в отсутствие какого-либо медикаментозного лечения (отрицательный контроль) и клеток, выращенных в присутствии 100% -ного этанола (контроль растворителя).
- Рост клеток и повторно вводить лекарства в описанных концентрациях, когда клетки кормили каждый день (этап 1.2) в течение 96 часов (до 4-й день) в дни 1 - 4. Лечения, наблюдать клетки под микроскопом и с помощью рассчитывать Метод в шаге 2.2 (рисунок 4).
- Повторите эксперимент, по крайней мере три раза.
- Определить оптимальную концентрацию каждого препарата путем построения графика отношения между жизнеспособностью клеток и дозы наркотиков в течение продолжительности эксперимента (рисунок 5).
- Лечить ММТ клетки с тремя антипролиферативных терапевтических агентов (тамоксифен, куркумин и метформин) и дополнительным наркотиков (аспирин) в различных концентрациях в течение 96 часов, чтобы создать кривую. Первоначально администрирование всех наркотиков в диапазоне концентраций, основанных на опубликованных отчетов 1,11-16, а затем в концентрации больше или меньше, чем тех, кто опубликован.
- Установите курс времени.
- Treat ММТ клетки с трех антипролиферативным терапевтических агентов (тамоксифен, куркумин и метформина) при фиксированной концентрации для различных периодов времени. Используйте оптимальной концентрации IDENTIFIED через экспериментах доза ответ (см Шаг 3.2).
- Используйте следующие концентрации: 0,216 мМ тамоксифен, 0,216 ммоль куркумин и 10 мМ метформина.
Примечание: время, конечно, определяет количество времени, необходимого для производства лекарственного средства для его оптимального желаемого результата. Здесь, желаемый результат является снижение клеточной пролиферации по сравнению с контролем.
- Используйте следующие концентрации: 0,216 мМ тамоксифен, 0,216 ммоль куркумин и 10 мМ метформина.
- Разделение ММТ клеток из 10-см чашку на 24-луночный планшет в концентрации 3,6 × 10 6 клеток / см 2. Определить начальную концентрацию клеток обоих методов клеточной подсчета (шаг 2). Назовите этот новый 24-луночного планшета клеток "День Split".
- 24 ч после посева клеток, лечения клетки ММТ с каждым из антипролиферативные терапевтических агентов, тамоксифен, куркумин, метформин и аспирин, в оптимальных концентрациях, указанных в пункте 3.2. Относятся к этому как "день 0".
- Поскольку каждый хорошо может держать максимум 500 мкл среды, насе микропипетки со стерильным советы микропипетки и новым наконечником каждый раз новый колодец обработке, чтобы избежать перекрестного загрязнения.
- Использование двух скважин в качестве контролей: клетки, выращенные в отсутствие какого-либо медикаментозного лечения (отрицательный контроль) и клеток, выращенных в присутствии 100% -ного этанола (контроль растворителя).
- Treat ММТ клетки с трех антипролиферативным терапевтических агентов (тамоксифен, куркумин и метформина) при фиксированной концентрации для различных периодов времени. Используйте оптимальной концентрации IDENTIFIED через экспериментах доза ответ (см Шаг 3.2).
- Рост клеток и повторно вводить лекарства в выбранном концентрации, когда клетки кормили каждый день (этап 1.2) в течение 96 часов (до 4-й день). В дни 1 - 4 лечения, наблюдать клетки под микроскопом и рассчитывать методом в шаге 2.2 (рисунок 4).
- Повторите эксперимент, по крайней мере три раза.
- Определить оптимальное время экспозиции ММТ клеток в каждой препарата путем построения графика отношения между жизнеспособности клеток и длины (времени) лекарственного лечения в выбранной концентрации (рисунок 6).
4. Модуль Лаборатория
Примечание: Ниже 5 днейГрафик лаборатории для лабораторного модуля. Фиг.7 представляет собой блок-схему, что повлекло бы за собой график течение 5 дней. Для этого деятельность должна быть завершена в течение пяти дней либо время курса или кривую генерируется. Существует не достаточно времени, чтобы генерировать обе кривые. Эксперимент доза-ответ описано ниже. Эксперимент время курс может быть легко поменять местами
- Сплит класс на группы: у одной группы установить реакцию дозы и другой ход времени, выбирая концентрацию в середине предлагаемых концентрации дозы.
- Поддержание достаточного культур и запасов наркотиков в соответствующих концентрациях. Если не указано иное, выполнять все работы в соответствии с BSC.
- День 1
- Прямые студентам сделать средства массовой информации и роста клеток (как в шаге 1).
- Как студенты получают запас ММТ клеток на 10 см пластины, прямые студенты, чтобы подготовить для культивирования клеток и дать учебник в использовании hemocytomeтер, цифровой микроскопии и цифровой программное обеспечение камеры микроскопии (как в шаге 2).
- Калибровка программного обеспечения целям, используемых на микроскопе (например, 4X, 10X, 20X) в настоящее время, используя протокол изготовителя.
- День 2
- Пусть студенты подтверждают общее количество клеток и жизнеспособность клеток (как в шаге 2).
- Студентам рассчитывать клеток на 100 мм чашку с использованием как программное обеспечение микроскопии и методы гемоцитометра, чтобы подтвердить, аналогичные результаты получены.
- Прямые студентам получить 24-луночного планшета и раскол клетки от 100 мм блюдо к 24-луночных планшетах до желаемой исходной плотности клеток покрытия (как в шаге 1). Это считается день Сплит. Поместите луночный планшет в инкубаторе для клеточных культур 24 в течение 24 часов.
- День 3
- Выращивают ММТ клеток в течение 24 часов на 24-луночный планшет. Попросите учащихся наблюдать клетки под микроскопом и с помощью микроскопии рассчитывать программное обеспечение (как в шаге 2).
- Дайте студент / TEЯ образцы запасов лечения рака наркотиков. Попросите их подготовить и разбавить оригинальную маточного раствора (как в шаге 3). Добавьте различных концентраций препаратов в камеры, чтобы установить кривую. Это называется день 0.
- Инкубируйте клетки (шаг 1.2) с препаратами для максимум 48 часов.
- День 4
- Попросите учащихся наблюдать обработанные клетки через 24 часов. Это день 1.
- Граф каждый хорошо, используя программное обеспечение микроскопии. Запись фотографий каждой лунки так, что подсчет может проводиться вне лаборатории (как в шаге 2).
- Инкубируйте клетки (шаг 1.2) с препаратами для еще 24 часов.
Примечание: Инструктор обеспечивает дополнительные учебные пособия и отзывы анализа данных и графического представления. Студенты учатся создавать рисунки, графики и статистический анализ на следующий день сбора данных.
- День 5
- Студентам обработанных клеток после 48 часов, день 2.
- Граф друга с помощью микроскопии программного обеспечения. Запись фотографий каждой лунки так, что подсчет может проводиться вне лаборатории (как в шаге 2).
- Урожай и сбора клеток для подсчета традиционным методом гемоцитометре как средство проверки студент способность эффективно использовать метод микроскопии программного обеспечения (как в шаге 2).
Примечание: Сбор данных и сделать выводы или пересмотреть гипотезы, соответственно.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Рост ММТ клетки и сравнивая методы подсчета.
Молочной железы мыши опухолевые клетки были успешно выращены и характеризуется (рисунок 1) и новый метод подсчета клеток, разработанный с помощью программного обеспечения Motic, цифровая камера связанный программу для микроскопа. Этот новый метод подсчета клеток по сравнению с традиционным методом подсчета с использованием гемоцитометра (рисунок 2) и было показано, что в равной степени точным при определении количества клеток (таблица 1). Для контроля любых эффектов на количество клеток из-за различных условий роста или типа клеток, сравнение между этими двумя методами подсчета клеток проводили в присутствии и в отсутствие антипролиферативным агентами и с другой клеточной линией, нейронной модели PC12 17.
Рисунок 3 показывает разграничение области для подсчета клеток с помощью этого метода, используя наложенную сетку definЭд размеры. Сетка накладывается на поле зрения (FOV) и зеленый кадр затем применяется к указанной длины и ширины сетки (например, 9x5 квадраты). Клетки подсчитывали в зеленой рамке, и количество клеток экстраполируется, как описано в протоколе.
Лечение ММТ клеток: Определение реакции от дозы ММТ клеток на анти-пролиферативных агентов.
Исследования зависимости от дозы (рис 4) были проведены для каждого антипролиферативным агентом. На протяжении этих данных эксперименты постоянно собрались, рассмотрены и проанализированы, чтобы увидеть, если возможные поправки к протоколу были оправданными. Эксперимент проводили трижды, каждый исследовании аналогичных результатов. Эксперименты продолжались, пока все клетки не были мертвы или эффекты препаратов были плато. Цифровые микрофотографии Результаты представлены на рисунке 4, и графический анализ этих результатов представленана рисунке 5. Эффективные диапазоны концентрации, как сообщается в легенде о рисунке 4, на X-оси рисунке 5 и в разделе протокола.
В низкой концентрации тамоксифена в, 0,054 мМ, было надежным ингибирование роста клеток, примерно 83% по сравнению с необработанными клетками (фиг.4А). Жизнеспособность клеток продолжает снижаться с увеличением концентрации тамоксифена (рис 5А). Оптимальная доза тамоксифена была определена в 0,216 мМ, потому что после 48 ч смерть клеток происходит полное по этой концентрации (фиг.4А). Интересно, что эти сокращения распространения клеток не обнаружено никаких признаков клеточной резистентности к тамоксифена, как можно было бы ожидать, исходя литературе 18,19 подчеркнув, что пробирке модельных систем в России, но не всегда в полной мере представлять в естественных событий. Кроме того, если сравнить с самой низкой Treatment концентрации куркумин (фиг.4В и 5А) и метформина (фиг.4С и 5B), низкая концентрация тамоксифена была 9% и 50% более эффективно останавливает клеточное деление, соответственно.
Куркумин выставлены зависимое от концентрации воздействие на ингибирование клеточного деления, а также. С увеличением концентрации, наблюдалось значительное снижение жизнеспособности клеток (рис 4D и 5A). Оптимальная доза куркумина было определено, 0,216 мМ, потому что после 48 ч, как тамоксифен, была полная гибель клеток в этой концентрации.
Лечение метформином дали наименьшее резкое снижение жизнеспособности клеток ММТ, что приводит к снижению на 33% в низкой концентрации. Сопутствующее снижение жизнеспособности клеток с увеличением концентрации метформина наблюдается (рис 4C и 5B). Оптимальная доза метформина было определено быть высокая концентрация испытания (10 мм). По сравнению с тамоксифеном и куркумин, и обычно используются в качестве химиотерапевтических агентов, метформин 30-40% менее эффективными в ингибировании клеточного цикла. Интересно, что эффект метформина на деление клеток согласуются с результатами, полученными при введении аспирина (рис 4D и 5A), салициловая препарат, не четкий механизм ингибирования роста клеток.
Лечение ММТ клеток: Определение временной ход клеточного ответа ММТ к антипролиферативным агентов.
Курс обучения время также проводится для каждого антипролиферативным агентом, потому что эффективная доза вводимого препарата может быть влияние времени воздействия. Как этого модуля анализов для жизнеспособности клеток, важно, чтобы сначала определить, как быстро клетки делятся (время удвоения), поэтому логический окно для длины времени клетки подвергаются препаратов могут быть выбраны. Это имеет важное значение, поэтому, что ПТМ время удвоения клеток будетУстановлено, когда изначально характеризующих клетки. На протяжении всех этих экспериментов, данные постоянно собирались, рассмотрены и проанализированы, чтобы увидеть, если возможные поправки к протоколу были оправданными. Эксперимент проводили трижды, каждый исследовании аналогичных результатов. Эксперименты продолжались, пока все клетки не были мертвы или эффекты уже стабилизировался.
Исследования курс Время показало, что лечение ММТ клеток с оптимизированной концентрации каждого антипролиферативным препарата (тамоксифен 0,216 мм, куркумин 0,216 мМ, 10 мМ метформин) в течение 96 ч привело к полному гибели клеток или выравнивание эффектов препарата ( Рисунок 6). Хотя аспирин, "дополнительный" наркотиков, повлияли на жизнеспособность клеток в наших исследованиях доза-ответ, влияние было незначительным, и поэтому не был включен в исследованиях конечно время.
Рисунок 1. MMT клетки. Цифровой микрофотография "здоровым", лечить опухоль молочной железы мыши (ММТ) клеток, выращенных при 3,6 х 10 6 клеток / см 2 в модифицированной орлы минимальная поддерживающая среда (ЕМЕМ) .100X, масштаб = 0,2 мм, обозначается белая полоса. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2. Гемоцитометре сетки. Микрофотография гемоцитометре сетки, 100x. Вся секция сетки показано на окружности (FOV). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Иль / ftp_upload / 52528 / 52528fig3.jpg "/>
Рисунок 3. Обозначая подсчета площади с программным обеспечением Motic. Изображение сетки наложения на ПЗ и определенной области для подсчета клеток ММТ, установленные с программным обеспечением Motic как видно через микроскоп. 100X, масштаб = 0,2 мм, обозначается белой полосой. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 4. Доза отклика ММТ клеток к антипролиферативным агентов. Цифровые микрофотографии ММТ клеток, растущих в присутствии анти-пролиферативных агентов при различных концентрациях в течение 96 часов. Тамоксифен: (А1) 0,054 мм (A2) .108 мм (А3) .162 мм (А4) 0,216 мМ; Куркумин: (В1) 0,054 мм (В2) .108 мм (В3) .162 мм (B4) .216 мм; Метформин: (С1) 2 мм (С2) 4 мм (С3) 6 мм (С4) 8 мм (С5) 10 мм; Аспирин: (D1) .030 мм (D2) 0,060 мм (D3) .099 мм (D4) .150 мм (D5) 0,216 мМ; Этанол (100%) и необработанных оба управления. 100X, масштаб = 0,1 мм, обозначены синими линиями, составляющих каждый квадрат внутри сетки. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 5. Графическое представление экспериментов доза-ответ ММТ клеток антипролиферативных агентов. Воздействие повышения концентрации анти-пролиферативных агентов () тамоксифен, куркумин, аспирин, и (Б) метформин на ММТ жизнеспособности клеток. Результатыповторно выражена как процент от контроля через 48 ч после обработки, хотя обработка клеток продолжали в течение 96 часов. п = 3, ЗППП указывается.
Рисунок 6. Графическое представление хода времени анализа ММТ клеточного ответа на анти-пролиферативных агентов. Время Конечно исследование эффектов тамоксифена (0.216mM), куркумин (0.216mM), и метформин (10 мм) на ММТ жизнеспособности клеток более 96 ч. Результаты выражали в процентах от контроля через 48 ч после обработки. Здесь показаны результаты репрезентативного эксперимента, N = 1.
Рисунок 7. Блок-схема 5-дневный модуль лаборатории.
| Тип клетки | Наркотиков Administered | День эксперимента | Концентрация препарата | Сотовый граф с Motic | Сотовый граф с гемоцитометре |
| ММТ | Необработанный | День 2 | - | 7.8x10 4 клеток / см 2 | 8.0x10 4 клеток / см 2 |
| ММТ | Этанол | День 2 | 10 мм | 7.1x10 4 клеток / см 2 | 7.2x10 4 клеток / см 2 |
| ММТ | Тамоксифен | День 2 | 0,216 ММ | 0 клеток / см 2 | 0 клеток / см 2 |
| ММТ | Тамоксифен | День 2 | 0,054 мМ | 1.3x10 4 клеток / см 2 | 1.5x10 4 клеток / см 2 |
| ММТ | Куркумин | День 2 | 0,054 мМ | 1.9x10 4 грлоктей / см 2 | 2.0x10 4 клеток / см 2 |
| ММТ | Куркумин | День 2 | 0,216 мМ | 0 клеток / см 2 | 0 клеток / см 2 |
| ММТ | Метформин | День 2 | 2 мм | 5.1x10 4 клеток / см 2 | 5.2x10 4 клеток / см 2 |
| ММТ | Метформин | День 2 | 6 мм | 3.4x10 4 клеток / см 2 | 3.5x10 4 клеток / см 2 |
| ММТ | Аспирин | День 2 | .099 ММ | 2.8x10 4 клеток / см 2 | 3.0x10 4 клеток / см 2 |
| PC12 | Необработанный | Трещина | - | 2.5x10 4 клеток / см 2 | 2.1x10 4 клеток / см 2 |
Таблица 1. Сравнение гемоцитометре и Motic программного обеспечения в расчете методы. Результаты подсчета клеток ММТ клеток, используя либо Motic программное обеспечение или методы гемоцитометре. Оба необработанные и обработанные клетки подсчитывали, а также различные линии клеток, РС12, в качестве контроля.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Модуль Лаборатория представлены, который направлен преподавать различные темы в области клеточной биологии с помощью развитых методов животных культуры клеток. Модуль достигает этого путем анализа последствий ряда антипролиферативных химических веществ на репликацию клеток, которые моделируют рака молочной железы человека. Первичный анализ основан на фундаментальном технике подсчета клеток и вводит новый способ подсчета клеток с использованием микроскопии программное обеспечение. Деятельность, содержащие модуль может быть проведена с инструментами и оборудованием, имеющимся в большинстве программ биологии. Модуль может быть реализован в 5-дневный график с материалами, которые являются недорогими и легко получены. Хотя конкретный бренд цифровой микроскоп камеры и программного обеспечения микроскопии используется здесь (Motic программное обеспечение), либо сравнимая камера и программное обеспечение должно быть достаточно.
Этот модуль использует лаборатория ММТ клеток в качестве модели для рака молочной железы человека. Студенты сначала учили расти и охарактеризовать ихклетки в культуре. Важно подчеркнуть, что успешное завершение этого лабораторного модуля требуется следователям (ака студентов) быть хорошо знакомы с внешний вид и поведение здоровых клеток ММТ, особенно с необработанные MMT клетки служат в качестве контроля. Поэтому тщательное характеристика моделей роста клеток, время удвоения и вообще морфология клеток ММТ является существенным, если данные курс надлежащего реагирования и время доза должны генерироваться.
После того, как характеризуется клетки ММТ затем испытывали на их ответ на различные анти-пролиферативных агентов в качестве средства преподавания темы деления клеток, регуляцию клеточного цикла, клеточной сигнализации и рак. Жизнеспособность клеток используется, чтобы понять влияние этих препаратов на клетки. Новый способ подсчета клеток, используя программное обеспечение, связанное с микроскопом монтажа цифровой камеры, проводится и по сравнению с традиционной процедурой гемоцитометра основе подсчета, чтобы проверить его достоверность. ТхиМетод с новым предоставляет два преимущества, которые особенно примечательно, потому что он используется в учебных лабораториях студентов. Во-первых, так как клетки не должны быть удалены из культуры ткани пластины для подсчета, меньше времени, необходимые для выполнения основной экспериментальный анализ. Это позволяет большое количество экспериментальных переменных, которые будут проверены за один раз, и в течение ограниченного периода времени. Во-вторых, метод обеспечивает цифровую запись клеточного ответа на экспериментальное лечение, позволяющей студентам оценить результаты и результаты их экспериментального стратегии за пределами лаборатории.
Есть несколько вопросов, чтобы отметить при реализации обоих этих методов подсчета. Во-первых, до подсчета клеток с любым методом, клетки инкубируют с трипановым синим различать жизнеспособную и клетки мертвой клетки. Мертвые клетки проникли красителя и появляются темно-синий, в то время как жизнеспособные клетки яркий белый. Однако, если клетки инкубируют с Dyе вне рекомендованного инкубационного периода, они будут более окрашенных и трудно отличить. Во-вторых, ММТ клетки могут группироваться на гемоцитометре или планшета для культуры ткани и трудно рассчитывать индивидуально. Таким образом, "скопление" предназначен, чтобы содержать определенное количество клеток (например, клеток / 10) и скопление каждый комок, присутствующие на сетке затем умножается на это число при подсчете. Наконец, ММТ клетки прилипают к поверхности посуды, в которой их выращивают. Поэтому необходимо, чтобы коснуться кончиком пипетки непосредственно на пластине при удалении клетки и применить силу, чтобы разбить скопления клеток и удалить как можно больше клеток от пластины, как это возможно. В результате моих занять несколько попыток, чтобы получить точный подсчет при использовании традиционного метода гемоцитометре.
С клетки также характеризуется и методы подсчета проверяется, два различных экспериментов проводятся; Исследование доза-ответ последствий различных концентрацияханти-пролиферативных лекарственных средств на ММТ деления клеток и эксперимента курс времени, чтобы выяснить оптимальное время воздействия этих препаратов. Они представляют собой весьма поучительные опыты, как методом проб и ошибок, необходимо и применение первичной литературе необходим для успешного эксперимента. Например, первоначальные попытки выяснения ответа дозы ММТ клеток в этих антипролиферативных агентов показало, что проверенные концентрации были слишком высоки, так как смерть 100% клеток в течение 24 часов введения препарата. Расширен обзор литературы привело к пересмотру диапазоне концентраций лечения. Это эффективно учит студентов, как использовать базы данных литературы, читать, анализировать и критиковать первичных статей литературы и подчеркивает, как эти навыки необходимы для научного процесса.
Результаты исследований показали доза-ответ, что тамоксифен проявляет сильное антипролиферативное действие на всех испытанных концентрациях. Тамоксифен, анти-mitotiС наркотиками, используется специально в качестве анти-эстрогена терапии эстрогена чувствительных видов рака, как правило, в постменопаузе, гормон чувствительных пациентов 18-20. Препарат в настоящее время используется для лечения рака молочной железы. Тамоксифен конкурирует с эстрогеном для внутриклеточного рецептора эстрогена и при связывании, вниз регулирует экспрессию циклинов D и B, двух важных регуляторов клеточного цикла. Результаты, полученные в активности предполагают, что тамоксифен успешно соединены с рецептором эстрогена и ингибирует развитие ячейки через клеточного цикла, что приводит к пониженной пролиферации клеток наблюдалось. Интересно, что снижение темпов распространения ММТ клеток во всех концентрациях тамоксифена, вводимых не обнаруживают никаких признаков клеточной резистентности к тамоксифена, как и следовало ожидать на основании литературе (смотри, например, 19). Это служит хорошим напоминанием, что условия в пробирке, в которой было проведено эксперимент не в полной мере Модель Iп Vivo обстоятельства.
Куркумин лечение ММТ клеток также приводит к снижению жизнеспособности клеток. Куркумин соединение получают из корня Tumeric и действует как ингибитор роста клеток 12,16. Он работает путем снижения регуляции путь NF-каппа-B и орнитиндекарбоксилаза (ODC) деятельности. NF-каппа-B является белковый комплекс, который управляет транскрипцией антиапоптотических генов, таких TRAF1 и TRAF2, которые кодируют белки, которые ингибируют апоптоз. ODC является ферментом, который катализирует производства полиаминов, белков, которые обеспечивают раковые клетки с повышенной источников питания ведущих к повышению роста клеток. Препарат в текущем использовании в лечении рака молочной железы. В антипролиферативное действие куркумина ясно показывает, что эффект вниз регулирования сигнального пути клеток с участием NF-каппа B и орнитиндекарбоксилазу имеет на деление клеток.
Снижение жизнеспособности клеток аналогично наблюдаются с метформином очистныхнт. Метформин, препарат обычно вводят Введите диабетиков II, был выбран потому, что опубликованные отчеты показывают, корреляцию между пациентами, которые принимают метформин и нижнюю заболеваемости раком молочной железы 15. Считается, что агент модулирует с-mус ген и тем самым вниз регулирует активность циклин Д. повышающей регуляции циклинов, молекулы, которые служат в качестве контрольной точки в клеточном цикле, позволяет клеткам прохождения цикла с более высокой скоростью что приводит к увеличению клеточного деления и роста. Эффекты метформина лечения на ММТ клетках показывает, как модуляция гена с-Мус также приводит к понижающей регуляции циклин D и снижение клеточного деления. Данные метформин дальше пример того, как лекарства предназначены для одного Состояние- В этом случае Диабет может иметь механизм действия, подходящего для других аберрантных физиологических событий. Кроме того, важно подчеркнуть, что, хотя тамоксифен, куркумин, и метформина все замедлить аномальной клеточной Пролифчества с помощью различных механизмов, каждый успешно снизить клеточных популяций и мешал деления клеток в пробирке.
Этот модуль также позволяет открытого запроса в этой другой препарат, травяные средства правовой защиты, или агент может быть проверена. Аспирин, более-внебиржевом обезболивающее, жаропонижающее и противовоспалительным препарат, используемый для облегчения умеренной боли и снижения температуры был выбран в данном модуле. Способность аспирина, чтобы уменьшить воспаление может подавлять рост опухоли, замедляя развитие новых кровеносных сосудов, которые питают их и препятствуя стволовых клеток, которые питают их рост 11,13,14. Интересно, что введение аспирина ММТ клеток было привести к некоторому снижению жизнеспособности клеток. Мало что известно о роли аспирина в профилактике и лечении рака, хотя многие коррелятивные исследования сообщили 13,14, обеспечивая превосходный пример корреляционная против возбудителей отношений.
Времякурс исследования показали, что при введении в дозах оптимизированными, что антипролиферативные лекарственные препараты высоко эффективны при мешая деления клеток в течение 4 дней после первоначального контакта. Эти исследования также дают возможность для студентов, чтобы использовать то, что они узнали о ММТ характеристик роста клеток при разработке экспериментального стратегии проведения этих экспериментов. На самом деле, тщательно характеризующих динамику роста клеток, времени и общего числа клеток морфологию клеток ММТ удвоения имеет важное значение для обеих точных данных доза-ответ и время, конечно.
Оба ответа и время доза исследования курс определить взаимосвязь между концентрацией наркотиков и времени воздействия, соответственно, и эффект наркотиков в биологической системе. Это отличный способ получить студентов думать о межмолекулярных взаимодействий и других основополагающих понятий в области биохимии при проведении приводом запрос, научно-исследовательской деятельности. Стоит отметить, что, поскольку многие бигии специальностей планируют посетить медицинскую школу, эта лаборатория модуль также выравнивает вновь возбужденному изменений в медицинской школе требованиям 21.
Этот модуль лаборатории может быть реализован так, как описано, или могут легко служить в качестве шаблона. Множество вариаций могут быть включены в эту деятельность, например, как выбор антипролиферативного агента, типа клеток или питательной модификации в ростовой среде. Пока гипотеза разрабатывается, который проверяет основные и передовые концепции в клетке или общей биологии, перестановки данного модуля многочисленны. Независимо от перестановки, реализация этой деятельности, естественно, направляет студента, чтобы узнать большой массив лабораторных методов и ознакомиться с различными оборудования и приборов.
В целом, модуль лаборатории описано здесь позволяет студентам в полной мере участвовать в процессе науки, развивать свои способности, чтобы получать, анализировать и графически ReprESENT данные, и отточить свое время управление и совместные навыки. Модуль предназначен для облегчения открытый запрос, и легко адаптируется к различным графикам курсов и уровней квалификации. Следует отметить, что первые два авторы этой работы являются бакалавриата биологии специальностей, ясно показывая, что этот лабораторный модуль подходит для этой популяции.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не получают никакой финансовой или сравнимую поддержку от Motic.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tissue Culture Hood | ESCO Labculture Reliant | Class II Type A2 Biological Safety Cabinet | |
| Waterjactor CO2 Incubator | CEDCO | Model 1510 | |
| Bright-line Hemocytometer | American Optical | with two separate grids | |
| Motic Images Plus | Mac OSX Verison 2.0 or higher | ||
| Gilson Pipetman | Rainin instrument co. inc | P-20D, P-200D, P-1000D | |
| CK30/CK40 Culture Microscope | Olympus | 4 objective inverted light microscope with camera | |
| 200 μl Pipet tips | MidSci | 40200C | |
| 1,000 μl Pipet tips | MidSci | AVR4 | |
| 10 ml Seriological Pipets | TPP | TP94010 | |
| 24 well plates | CoStar- Tissue Culture Cluster | 3524 | 24 wells, 16 mm well diameter, radiation sterilized |
| Trypan Blue Solution 0.4% | Sigma | T8154 | 100 ml, cell culture tested non-haz |
| Bright-line Hemacytometer replacement coverslip, non-haz | Sigma | Z375357 | |
| Mouse Mammary Tumor(MMT) cells | ATCC | CCL-51 | |
| Eagle Minimum Essentail Medium (EMEM) | ATCC | 30-2003 | 500 ml |
| Fetal Bovine Serum | Sigma | F0926 | 500 ml |
| Metformin Hydrochloride | Sigma | PHR1084 | 500 mg |
| Tamoxifen | Sigma | T5648 | white or white-yellow powder |
| Curmumin | Sigma | C1386 | yellow-orange powder |
| Aspirin | Sigma | A2093 | meets USP testing specifications |
References
- Hammamieh, R., et al. Students investigating the antiproliferative effects of synthesized drugs on mouse mammary tumor cells. Cell Biol Educ. 4 (3), 221-234 (2005).
- Sykes, J. A., Whitescarver, J., Briggs, L. Observations on a cell line producing mammary tumor virus. J Natl Cancer Inst. 41 (6), 1315-1327 (1968).
- Palombi, P. S. J., Snell, K. Learning about Cells as Dynamic Entities: An Inquiry-Driven Cell Culture Project. Bioscene: Journal of College Biology Teaching. 33, 27-33 (2008).
- Ledbetter, M. L. S., Lippert, M. J. Glucose Transport in Cultured Animal Cells: An Exercise for the Undergraduate Cell Biology Laboratory. Cell Biology Education. 1 (3), 76-86 (2002).
- Weaver, D. Cardiac Cells Beating in Culture: A Laboratory Exercise. American Biology Teacher. 69, 407-410 (2007).
- Marion, R. E., Gardner, G. E., Parks, L. D. Multiweek cell culture project for use in upper-level biology laboratories. Advances in Physiology Education. 36, 154-157 (2012).
- Mozdziak, P. E. P., James, N., Carson, S. usanD. An Introductory Undergraduate Course Covering Animal Cell Culture Techniques. Biochemistry and Molecular Biology Education. 32 (5), 319-322 (2004).
- Anderson, L. W., et al. A taxonomy for learning, teaching and assessing: A revision of Bloom's Taxonomy of educational objectives (Complete Edition). , Longman, London, England. (2001).
- Centers for Disease Contol and Prevention. Appendix A - Primary Containment for Biohazards: Selection, Installation and Use of Biological Safety Cabinets. , (2014).
- Davis, J. M. Basic Cell Culture: A Practical Approach. , 2nd edn, Oxford University Press. Oxford, UK. (2002).
- Algra, A. M., Rothwell, P. M. Effects of regular aspirin on long-term cancer incidence and metastasis: a systematic comparison of evidence from observational studies versus randomised trials. Lancet Oncol. 13 (5), 518-527 (2012).
- Anand, P., Sundaram, C., Jhurani, S., Kunnumakkara, A. B., Aggarwal, B. B. Curcumin and cancer: an 'old-age' disease with an 'age-old' solution. Cancer Lett. 267 (1), 133-164 (2008).
- Ararat, E., Sahin, I., Altundag, K. Mechanisms behind the aspirin use and decreased breast cancer incidence. J BUON. 16 (1), 180 (2011).
- Ararat, E., Sahin, I., Altundag, K. Aspirin intake may prevent metastasis in patients with triple-negative breast cancer. Med Oncol. 28 (4), 1308-1310 (2011).
- Blandino, G., et al. Metformin elicits anticancer effects through the sequential modulation of DICER and c-MYC. Nat Commun. 3, 865 (2012).
- Kunnumakkara, A. B., Anand, P., Aggarwal, B. B. Curcumin inhibits proliferation, invasion, angiogenesis and metastasis of different cancers through interaction with multiple cell signaling proteins. Cancer Lett. 269 (2), 199-225 (2008).
- Burstein, D. E., Blumberg, P. M., Greene, L. A. Nerve growth factor-induced neuronal differentiation of PC12 pheochromocytoma cells: lack of inhibition by a tumor promoter. Brain Res. 247 (1), 115-119 (1982).
- Nazarali, S. A., Narod, S. A. Tamoxifen for women at high risk of breast cancer. Breast Cancer (Dove Med Press). 6, 29-36 (2014).
- Cui, J., et al. Cross-talk between HER2 and MED1 regulates tamoxifen resistance of human breast cancer cells). Cancer Res. 72 (21), 5625-5634 (2012).
- Komm, B. S., Mirkin, S. An overview of current and emerging SERMs. J Steroid Biochem Mol Biol. 143C, 207-222 (2014).
- Kaplan, R. M., Satterfield, J. M., Kington, R. S. Building a better physician--the case for the new MCAT. N Engl J Med. 366 (14), 1265-1268 (2012).
