Introduction
אפיתל במעי הוא אחד מרקמות הגוף במהירות הרבה ביותר מתרבות, אשר גרמו לו למשוך עניין רחב ממחקר על תאי סרטן וגזע. בשינה 2009 פורסמה טכניקה ליצירת תרבויות לאורך זמן של מאורות מעי דקים בmatrigel, שימור מבנה ממדי 3 1. מבנים אלה, קרוי organoids מעיים, יכול להיות מתורבת באמצעות טכניקות סטנדרטיים, עם סובבים בתוספת בינונית עם מספר גורמי צמיחה מוגדרים, כולל הגולגולת של מעכב מסלול BMP-איתות (קולב), משפר מסלול Wnt-איתות rspondin 1 (Rspo1) ו גורם הגדילה באפידרמיס (EGF) כל מצא כדי לשפר את התפשטות מעיים 2-4.
Organoids לעלות שורות תאי הסרטן מסורתיות בהיבטים שהם-מוטציה שאינן, יש לשמור על היררכיה בתאי גזע, להציג קיטוב סלולארי ללא פגע ובידול תערוכה לכל תא השושלות שנמצאו בint הקטן המתהווהאפיתל estinal. שכן הם יכולים להיות transduced לבצע transgenes או התערבות RNA בונה 5, הם משמשים ללמוד אלמנטים גנטיים ספציפיים, להכריע ניסויים באמצעות עכברים הטרנסגניים בהיבטים של עלות ומהירות. ביטוי מהונדס בorganoids יכול להתבצע גם באמצעות retroviral העכברית או וקטורי lentiviral 6,7. בשל המגבלות של רטרווירוסים עכבריים, מסוגלים transducing תאי mitotic באופן בלעדי 8, התמרה lentiviral היא בתדירות גבוהה יותר בשימוש בתאים שקשה להדביק, כגון organoids.
באופן ויראלי transduced וorganoids המהונדס ביציבות להביע יכול לשמש למספר רב של ניתוחים במורד הזרם, כולל RNA ניתוחים כמותיים ואימונוהיסטוכימיה. יחדיו, התרבות של organoids מתאי אפיתל במעי עיקרי התפתחה טכניקה שגרתית שהיא קל ליישום ללא דרישות מעבדה ספציפיות, והפכה לסטנדרט ברומן ceתרבות ll במחקר על אפיתל במעי.
טכניקות של התמרה ויראלית וניתוח במורד הזרם שלאחר מכן בorganoids הן מייגע לבצע ולסייע לניסויי organoid נוצר פרוטוקול וידאו זה, המציג שיטות לתמרת lentiviral של organoids התרבותי. אנחנו בנוסף להראות כיצד נכונים עיבוד של organoids יכול להגדיל את התשואה ולכן לשפר את הביצועים של ניתוח במורד הזרם תוך שימוש בטכניקות RNA או אימונוהיסטוכימיה. בפרוטוקול, organoids שנגזרים ממאורות מעיים קטנים שימש באופן בלעדי, למרות שהטכניקות המתוארות ניתן להחיל organoids מעי הגס גם כן.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. הכנת Polyethylenimine (PEI) כTransfection מגיב
- לפזר כ -150 מ"ג של PEI לשל H 2 O. 100 מיליליטר
- התאם פתרון לpH 7.4 ידי הוספת HCl עד פתרון הופך ברור ומערבבים עד שהיא נמס לחלוטין. פעולה זו עשויה להימשך בין 10 ל 60 דקות ומוסיפה מים עד לריכוז סוף 1 מ"ג / מיליליטר.
- כאשר ברור, לסנן את פתרון PEI דרך מסנן 0.22 מיקרומטר סטרילי וחנות במקפיא -80 מעלות צלזיוס בaliquots של 5 מיליליטר.
2. ייצור lentiviral החלקיקים
יום 1:
- פיצול תאי HEK293T 60% confluency -80% בבקבוק 162 סנטימטר 2 או צלחת פטרי גדולה במדיום תרבות שורת תאים (DMEM בתוספת 10% FCS, 1% פניצילין / סטרפטומיצין ותוספת גלוטמין 2 מ"מ).
יום 2:
- הכן פתרון transfection DNA המכיל 45 מיקרוגרם בסך הכל DNA פלסמיד על ידי הוספה ביחדוקטורי lentiviral אריזה (7 מיקרוגרם של pVSVg; 5 מיקרוגרם של rev pRSV; 13 מיקרוגרם של pMDL) ו -20 מיקרוגרם של פלסמיד lentiviral קידוד הגן של עניין או shRNA של עניין. התאם לנפח של 1 מיליליטר באמצעות DMEM.
- הכן פתרון transfection PEI על ידי הוספת 90 μl של 1 מ"ג / מיליליטר PEI לμl 930 של DMEM ודגירה של 5 דקות בטמפרטורת חדר.
- הוסף פתרון transfection DNA לפתרון PEI. מערבולת או להפוך מספר הפעמים ודגירה של 5 דקות בטמפרטורת חדר כדי להשיג פתרון transfection DNA.
- לטפטף 2 מיליליטר של פתרון transfection DNA על גבי תאי HEK293T ודגירה של 4 שעות בתרבית תאי חממת humidified על 37 מעלות צלזיוס.
- לאחר 4 שעות, לרענן את מדיום התרבות להסיר PEI. אין צורך לשטוף את התאים לפני הוספת מדיום חדש.
הערה: PEI הוא פעמים ציטוטוקסיות ודגירה ארוכות יותר מ -4 שעות עלולות לגרום נזק לתאי HEK293T.
יום 4:
- החלף Supernatant עם מדיום התרבות חדש. שמור supernatant (המכיל וירוס); זה ישמש בשלב 2.10.
- שים supernatant ב -15 בקבוק מיליליטר. כדי להסיר תאים מתים, צנטריפוגות במשך 5 דקות ב 500 x גרם.
- לדחוף supernatant באמצעות מסנן 0.45 מיקרומטר באמצעות מזרק 60 מיליליטר גדול. אחסן לילה ב 4 מעלות צלזיוס.
יום 5:
- לאסוף את המנה השנייה של supernatant; צנטריפוגה ומסנן כמו בשלבים 2.8-2.9.
- בריכת supernatants מצעדי 2.9 ו2.10 בצינורות ultracentrifuge ו צנטריפוגות ב 50,000 XG בultracentrifuge למשך 90 דקות.
- קח את כמוסות המכילות את צינורות ultracentrifuge מאוד בזהירות והכניס לתוך הזרימה למינרית, לזכור את הכיוון של הצינור בתוך צנטריפוגות.
- כמוסה פתוחה מחזיקה צינור ultracentrifuge ובינוני למזוג בזהירות באופן כזה שהגלולה היא בצד העליון של הצינור. מאז כדורים נגיפיים עלולים להיות קשים לדמיין, לזכור על מההצד של צינור גלולה תהיה יצרה. קח micropipette ולהסיר אחרון קצת בינוני תוך הקפדה שלא כדי להתסיס את הגושים חומים האטומים כי הוא גלוי בצד של החלק התחתון של צינור ultracentrifuge.
- Resuspend גלולה זו ב500 μl של מדיום תרבות organoid בתוספת 10 nicotinamide מ"מ, 10 מיקרומטר Chir99021, 10 מיקרומטר Y27632 ו8 מיקרוגרם / מיליליטר polybrene. Resuspension במדיום הזה הוא חשוב שכן וירוס גבוה כייל משמש לtransduct organoids ישירות.
- לחלופין: להקפיא את הווירוס במדיום זה aliquoted בשתי קבוצות של 250 μl ב-80 ° C.
3. lentiviral התמרה של Organoids
יום 0:
- פיצול 0.95 סנטימטר 2 גם מלא organoids יומיים לפני התמרה לבאר חדשה, במטרה להשיג כ -50 organoids הקטן. פיצול organoids על פי פרוטוקול שפורסם בעבר 1 (איור 3 א ', ב').
- להשלים organoid מדיום תרבות עם 10 מיקרומטר Chir99021 ו -10 nicotinamide מ"מ להשיג מאורות היפר פיברוזיס שגשוג (איור 3 ג).
הערה: מאורות Cystic יפתחו הטובים ביותר כאשר organoids טרי לפצל גדלים בנוכחות Chir99021.
יום 2:
- organoids קציר על ידי pipetting מעלה ומטה matrigel והבינוני, ובכך לשבש את התערובת עם micropipette p1000. מניחים את התערובת בשפופרת 15 מיליליטר.
- לשבש נוסף באמצעות pipet פסטר שבפתיחת דיסטלי כבר ירד ב נמס. organoids צנטריפוגה לגלולה במשך 5 דקות ב 100 x גרם.
הערה: תלוי בגודל של צנטריפוגות, להשתמש במהירות צנטריפוגות שונה. זה הכרחי כדי למצוא את המהירות המדויקת שבו שיבש organoids מופרדים מהתערובת. - הסר את supernatant ולהוסיף 500 μl של טריפסין 1x מראש חימם (בדומה לטריפסין 0.25%). Resuspend organoids בטריפסין ודגירה3 דקות באמבט מים 37 מעלות צלזיוס.
- להשבית טריפסין ידי הוספת 3.5 מיליליטר של מדיום תרבות שורת התאים (DMEM בתוספת 10% FCS, 1% פניצילין / סטרפטומיצין וגלוטמין). צנטריפוגות במשך 5 דקות ב 500 x גרם.
- הסר את supernatant לעזוב גלולה בכ -20 μl של מדיום. העבר את organoids בכמות קטנה האחרונה של מדיום לתוך באר בצלחת 48-בארות.
- להוסיף lentivirus כייל גבוה במדיום התמרה כמתואר בשלב 2.14, resuspend והמשך לשלב 3.10. כאשר נתקל ביעילות התמרה נמוכה, צעד 3.9 ניתן להוסיף.
הערה: לתמרה יעילה, בדרך כלל להוסיף aliquot אחד של 250 μl של lentivirus כייל הגבוה ולאחת מorganoids. זה מייצג 50% מכל lentivirus שנקטפו מייצור יחיד כמתואר בשלב 2 של פרוטוקול זה. - לחלופין: כדי לשפר את יעילות התמרה, לבצע spinoculation על ידי הצבת 48 organoids הצלחת המכילה גם בצנטריפוגה מראש חיממה על 326; C ולסובב ב 600 XG במשך שעה 1.
- שים תערובת organoid-וירוס בתרבות חממת דגירה עבור שעה 1 ב 37 מעלות צלזיוס בחממה תרבות כדי לאפשר התמרה.
- לחלופין: כדי לשפר עוד יותר את יעילות התמרה, דגירה organoids במשך 3 שעות נוספות על 37 מעלות צלזיוס בחממה תרבות.
- הוסף 1 מיליליטר של מדיום תרבות organoid וresuspend תערובת organoid-הווירוס, להעביר לתוך צינור microcentrifuge ו צנטריפוגות בmicrocentrifuge למשך 5 דקות ב 850 XG כדי גלולה organoids.
- הסר את supernatant ו resuspend גלולה ב -20 μl של matrigel קר כקרח. מכיוון שהחומר מתמצק כאשר הוא הופך להיות חם יותר, להשתמש בטיפי פיפטה המקוררים על ידי pipetting מעלה ומטה קרח הקר PBS למספר פעמים.
- שים הטיפה באמצע גם בצלחת 48 בארות דגירה בחממת תרבות על 37 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות כדי לחזק.
- לאחר 15 דקות, בזהירות להוסיף 250 μl של מדיום תרבות organoid בתוספת10 nicotinamide מ"מ, 10 מיקרומטר Chir99021 ו -10 מיקרומטר Y27632. שברי organoid שיבשו קטנים יהוו לorganoids פיברוזיס הקטן בתוך 24 שעות.
יום 5:
- רענן בינוני ולהשלים עם אנטיביוטיקה בחירה (לpuromycin, להשתמש 4 מיקרוגרם / מיליליטר).
יום 7:
- החלף בינוני למדיום תרבות organoid הסטנדרטי, בתוספת אנטיביוטיקה בחירה.
הערה: הניצנים יהיו שלמים 2-3 שבועות לאחר נסיגת Chir99021. לאחר בחירה, organoids עשוי להיות מבוגר ללא אנטיביוטיקה בחירה.
4. Organoid RNA הכנה לכמותי RT-PCR או Microarray
- להכנת RNA, השתמש בערכה מסחרית על פי הפרוטוקול של היצרן. הוצא את המדיה מorganoids ולהוסיף 350 μl של RLT חיץ, בתוספת β-mercaptoethanol ישר על כיפת organoids matrigel מכיל. Resuspend materiאל בRLT ידי pipetting באמצעות micropipette p1000.
- לבצע את הכנות RNA נוספות על פי הפרוטוקול של היצרן.
- לחלופין: להגדיל את תשואת RNA על ידי הגברה שימוש במערכת Ovation הפיק WTA, הדורשים השקעה ראשונית של 50 מיקרוגרם RNA הכולל על פי הפרוטוקול של היצרן.
- לחלופין: לבקרת איכות לפני microarray RNA, דגימות מנוהלות על Bioanalyzer 2100 באמצעות שבב ננו RNA eukaryote כולל, מכוון למספר שלמות RNA (רין) של 8.5 או יותר (איור 5) על פי הפרוטוקול של היצרן.
5. Organoids העיבוד לפרפין הטבעה ואימונוהיסטוכימיה
- לפני תחילת organoid הטבעה מראש לחמם בלוק אלומיניום עם חורים בקוטר צינורות זכוכית מתאימים 12 מ"מ באינקובטור ב 70 ° C כדי לשמור על נוזל פרפין.
- קח גם אחת עם organoids מלא גדל ולהסיר את המדיום, ומשאיר את organoids המשובץ בשלמותה.
- הוסף 1 מיליליטרשל paraformaldehyde 4% ב- PBS ישר לטוב ולתקן על 4 מעלות צלזיוס בכל מקום בין שעות 1 עד הלילה.
- החלף paraformaldehyde עם 1 מיליליטר של PBS הקר כקרח.
לחלופין: לשמור organoids הקבוע בPBS עד השבוע 1 על 4 מעלות צלזיוס לאחר שלב זה. - Resuspend organoids הקבוע ב 1 מיליליטר של PBS ומקום לתוך בקבוקון זכוכית.
- בוא organoids לשקוע לתחתית דקות 1, למזוג PBS ולהחליף עם 70% אתנול שבכמה טיפות של תמיסת eosin הם מומסים על מנת לאפשר להדמיה של organoids לאורך כל תהליך ההטבעה.
- השאר organoids באתנול 70% בטמפרטורת חדר. לאחר 30 דקות, להסיר את אתנול 70% באמצעות אחסון בזהירות, להיות מסוגל לדמיין organoids לפי העין בגלל צבע ורדרד eosin קל. החלף פתרון הטבעה עם 96% אתנול.
- חזור על שלב 5.7, בכל פעם שמחליפה את פתרון ההטבעה עם הבא. עובר דרך organoids את הפתרונות הבאים לאחר מכן: 70% אתנול, 90% אתנול, 96% אתנול, etha 100%נול, אתנול 100%, קסילן, קסילן.
- למזוג לשטוף קסילן האחרון ולשפוך נפט לצינור. שים את הצינור מייד בבלוק האלומיניום מראש חימם על 70 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות ולהחליף פרפין עם פרפין הנקי החדש.
- יוצקים organoids פרפין את וpipet לתוך תבנית בלוק פרפין באמצעות pipet פסטר מראש חימם עם פתח גדול. להתחמם pipet פסטר באמצעות מבער בונזן. מניחים את כל organoids בעובש בלוק פרפין בשכבה קטנה של פרפין הנוזלי.
- עד כמה שניתן, מנסה לתפעל את כל organoids לכיוון המרכז של עובש בלוק פרפין באמצעות מחט לנתיחה חיממה. להתחמם מחט לנתיחה באמצעות מבער בונזן.
- כאשר הלוקליזציה של organoids בעובש היא משביעת רצון, עובש צינה מעט כדי לחזק את שכבת הנפט.
- לסיים את הבלוק על ידי שפיכה יותר פרפין על גבי ולהוסיף הטבעת קלטת היסטולוגית סטנדרטית.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
התמרה lentiviral Organoid
הטכניקה של התמרה organoid באמצעות חלקיקי lentiviral תלוי בטיפול הנכון בorganoids לפני ובמהלך התמרה. Organoids (איור 3 א) היו בתרבית והם שובשו למאורות יחידים (איור 3). כפי שדווח בעבר, מאורות יחידים אלה, כאשר בתרבית בנוכחות מעכב GSK3 Chir99021 הפכו מאורות פיברוזיס 9 (איור 3 ג). בהמשך לכך organoids היו trypsinized כדי לאפשר חדיר של חלקיקי וירוס לתאים בודדים. כאשר transducing תאים עם חלקיקי lentiviral, במספר השיטות ניתן ניסה לשפר את יעילות התמרה כגון spinoculation או דגירה ממושכת. כייל גבוה lentivirus PGK-eGFP שימש כדי לאפשר ויזואליזציה של יעילות התמרה על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי. יעילות התמרה של organoids עם פלסמיד זה הייתה גבוהה והתקרבה 100% (figurהדואר 4E, F). שיפור יעילות באמצעות spinoculation (איור 4 א, ב) או דגירה ממושכת עם חלקיקי lentiviral (איור 4C, D) ולכן לא יניב ערך נוסף.
הפקת RNA
organoids הבא להפקת RNA גדל. organoids גדל מלא נקצרו שהיו נתונים לקרינת גמא או טיפול שליטה להראות שלמות מופחתת RNA (איור 5). על הקרנה עם 6 Gy, RNA הוא מושפל ולעומת שליטת organoids טופל, מספר שלמות RNA (רין) מצטמצם.
אימונוהיסטוכימיה על organoids פרפין המוטבע
לאחר דוגרים organoids למשך 2 שעות במדיום התרבות בתוספת BrdU, organoids בפורמלין היו קבוע ומעובד על אימונוהיסטוכימיה (איור 6). באמצעות BrdU אנטי עכבר, תאי שגשוג יכולים להיבחן בקריפטה-segmמציג של organoids ולא בתא המובחן.
איור 1:. סכמטי של ייצור lentivirus עבור התמרה organoid כפי שנכתב בפרוטוקול חלק 2, בסכמטית זו, השלבים הקריטיים ביותר של ייצור וירוס מיוצגים במספרי צעד פרוטוקול ועיתוי.
איור 2:. סכמטי של התמרה lentiviral של organoids כפי שנכתב בפרוטוקול חלק 3, בסכמטית זו, השלבים הקריטיים ביותר של התמרה organoid מיוצגים במספרי צעד פרוטוקול ועיתוי.
איור 3: Organoids לפני ובמהלך טראןsduction. organoids גדל בדרך כלל () מחולקים לorganoids צמח בצפיפות הקטנה (ב) שהפכו פיברוזיס לאחר דגירה עם Chir99021 למספר הימים (C). על הניתוק של organoids אלה באמצעות טריפסין, תאים בודדים וגושים קטנים של תאים נשארים (D) שtransduced לאחר מכן. בר סולם 100 מיקרומטר.
. איור 4: התמרה של organoids באמצעות וקטורי ביטוי lentiviral תמונות Brightfield (A, C, E, G) ותמונות ניאון (B, D, F, H) מorganoids שהיו transfected גם עם lentivirus PGK-eGFP (- F) או לשלוט lentivirus (G,
איור 5:. תוצאת נציג preps RNA מorganoids על bioanalyzer הערה תיחום חזק של להקות המייצגות את שלמות RNA גבוהה בנתיבי 2-4 ולמרוח סביב להקות על נתיבי 5-7 מייצגים שלמות RNA היומן. מספר שלמות RNA (רין) של להקות 2-4 הוא 8.7, 9.2 ו -9 בהתאמה, ואילו tהוא רין של להקות 5-7 הוא 6.4, 6.6 ו -5.5.
איור 6:. ניתוח אימונוהיסטוכימיים של organoids פרפין המוטבע פורמלין קבוע פרפין הקבוע פורמלין מוטבע 4 מיקרומטר סעיף של organoids תרבית בנוכחות של BrdU במשך שעות וקבועות לאחר מכן. סעיף מוכתם עם נוגדן אנטי BrdU. בר סולם 100 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
| בינוני בסיסי | תוספות | |
| מדיום תרבות קו התא | DMEM | 10% FCS |
| 1% פניצילין / סטרפטומיצין | ||
| 2 מ"מ Glutamine | ||
| מדיום תרבות Organoid | מתקדם DMEM F12 | HEPES |
| 1% פניצילין / סטרפטומיצין | ||
| Glutamax 1x | ||
| 1% תוספת N2 | ||
| 2% תוספת B27 | ||
| ציסטאין n-אצטיל 125 ננומטר | ||
| העכבר EGF (50 ng / ml) | ||
| 10% בינוני הקולב-Fc מותנה (שווה ערך ל מיליליטר / 100 ng) | ||
| 10% בינוניים Rspo1-Fc מותנה (שווה ערך ל מיליליטר / 500 ng) |
טבלת 1: הרכב בינוני תרבות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
פרוטוקול הווידאו הנוכחי מתאר התמרה lentiviral של organoids מאפיתל במעי ראשוני וניתוח במורד הזרם של organoids אלה תוך שימוש בטכניקות RNA כמותי ואימונוהיסטוכימיה.
התמרה lentiviral מבוצעת לעתים קרובות בתאים חסיד או צפים בצלחות תרבות. מכיוון שהמבנה התל-ממדי של organoids הופך אותם קשה לחדור ידי חלקיקים נגיפיים, במספר השיטות כדי להגדיל את היעילות בשימוש. טיפול מקדים של organoids באמצעות Chir99021 מגדיל התפשטות ובכך כדאיות לאחר התמרה. זה חשוב לשמור על אשכולות תאים קטנים לאחר trypsinization, מאז תאים בודדים ירדו הישרדות. בניגוד לtransductions הנגיפי באמצעות רטרו-וירוס עכברי, transductions lentiviral הם יעילים יותר ובדרך כלל אינו דורש spinoculation, טכניקה ידועה ליעילות התמרה עליות בתאי הגזע העובריים 10. בעת השימוש ברטרו-וירוסים או ש"ש העכברייםen יעילות נמוכה תשואות התמרה lentiviral, spinoculation יכול לחלופין להיות מנוצל כדי להגדיל את שיעור התמרה. אנחנו לא להעריך באופן קבוע כייל נגיף, שכן כל הווירוס זמין מסיבוב אחד של ייצור עבור התמרה של organoids נגזר מבארות מקסימאלי שני 0.95 סנטימטר 2 היה בשימוש. בנוסף, בדרך כלל להשתמש בבחירת אנטיביוטיקה להסרת תאים-transduced שאינם. הערכה של כייל נגיף עלולה עם זאת להיות בעל ערך כאשר נתקלו בבעיות עם יעילות התמרה.
זהה לתאים חסיד, רמת האנטיביוטיקה בחירה יכולה להגדיל את מספר האינטגרציות נגיפיות ובכך מבטא את transgene. השתמש puromycin ברמה גבוהה (10 מיקרוגרם / מיליליטר) כדי להשיג ביטוי מהונדס גבוה ומציאה יעילה, אך כאשר סימני תערוכת organoids של רעילות, ניתן להשתמש ברמות נמוכות יותר (מינימאלי 1 מיקרוגרם / מיליליטר). בנוסף, ניתן להשתמש באנטיביוטיקת בחירה חלופית או בחירה עשויה להיות מושמטת, למרות שהתמרה היא סבירהלהיות שלם וזה לא יכול לגרום לביטוי יציב לטווח ארוך. יתר על כן, מאז האינטגרציה lentiviral בגנום היא הטרוגנית בכל אוכלוסייה של תאים, ביטוי של transgene ניתן להכניע לשינויים לאחר culturing תאים לזמן ממושך. זה יכול לנבוע מלחץ סלקטיבי על ידי ביטוי של transgene. למרות שבחירת אנטיביוטיקה מגבילה את השינויים האלה, הם עשויים להישאר, במיוחד במקרה של ביטוי המכונן של transgenes. חסרון זה ניתן להתגבר על ידי שיבוט תא בודד של organoids, אבל טכניקה זו היא זמן רב. התמרה lentiviral יכולה להתבצע במגוון רחב של פלסמידים שיגרמו גם ביטוי יציב או מושרה של transgenes. transgenes אלה בדרך כלל באים לידי ביטוי מיזמים בכל מקום, כגון CMV או אמרגן PGK ועלול לגרום לביטוי טבעי. בדומה לביטוי יתר מהונדס בשורות תאי סרטן או בעלי חיים מודל, יש לנקוט זהירות פירוש תוצאות לכאן ולכאןביטוי יתר מ '.
לניסויים הדורשים RNA, המספר הנמוך של תאי קיימא בדרך כלל גדל ב0.95 סנטימטר בודד 2 היטב (אזור סטנדרטי פני השטח של 48 היטב) בניגוד לתאים חסיד שיכול בקלות להיות מבוגר בצלוחיות גדולות הוא הגורם מגביל-השיעור לאיכות ושפע של ניתוח במורד הזרם. אנו מוצאים כי בדרך כלל, גם אחת של כ -50 תשואות מלאים גדלו organoids בין 0.4 מיקרוגרם ו1 מיקרוגרם רנ"א הכל, להיות מספיק עבור RT-PCR וmicroarray RNA ללא הגברה נוספת. משטרי טיפול מסוימים או שינויים גנטיים יכולים להפחית את תוכן RNA עם זאת באופן משמעותי. צעד ראשון כדי להגדיל את RNA הכולל איגום של בארות מרובות.
להטבעת פרפין של organoids, זה קריטי להשגת חומר מספיק כדי להמחיש organoids במהלך התהליך. תוספת של כמויות זעירות של eosin לorganoids קבוע מאפשרת הדמיה של organoids במשך כלהתהליך, אך לא נדרש להטבעה רגילה ועשוי להיות מושמט כאשר צעד זה מפריע לניתוח נוסף. בדרך כלל, קלטות הטבעה-פרפין יש בהם חורים כדי לאפשר זרימה של פתרונות מקבע ותהליך לרקמה בקלטת.
התמרה lentiviral organoid והכנה לטכניקות סטנדרטית במורד הזרם מגבירים של תרבויות אלה פוטנציאל מדעי ומעלה את הרמה בתרבית תאים לטכניקות תלת-ממדיות מאפיתל במעי העיקרי. מגוון של ניסויים במורד הזרם שיש לבצע הוא אולם אינו מוגבל לטכניקות מתוארות בפרוטוקול הנוכחי ועלול להקיף את כל הטכניקות המבוצעות על שורות תאים או עכברים, בהתחשב בכמות החומר תאי שנוצר על ידי התרבות הוא מספיק. במחקר על אלמנטים ספציפיים גנטיים ותפקודם באפיתל במעי, טכניקות רקומבינציה הומולוגיות בבעלי חיים מודל, בעיקר עכברים, להישאר תקן הזהב. תרבויות של organoids לעשותלא מכילים תאי mesenchymal או נישה חיסונית ומאורות תרבותיים אי פעם מרחיבים, מנוגדים המצב מצא in vivo. עם זאת, תרבויות אלה העלו את האיכות של ממצאים במבחנה מאוד ולוקחות בחשבון את הטכניקות במורד הזרם עצום שניתן לבצע, יש תרבות organoid וישפרו במידה רבה על מחקר אפיתל במעי.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Polyethylene imine | Polysciences | 23966-2 | |
| DMEM medium | Lonza | BE12-614F | |
| Fetal calf serum | Lonza | DE14-801F | |
| Penicillin-streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | |
| Glutamin | Invitrogen | 25030-024 | |
| matrigel | BD | BD 356231 | |
| Advanced DMEM-F12 | Gibco | 12634-010 | |
| N2 | Invitrogen | 17502-048 | |
| B27 | Invitrogen | 17504-044 | |
| N-acetyl cysteine | Sigma | A9165-1G | |
| mouse Egf | Invitrogen | PMG8045 | |
| Hepes 1 M | Invitrogen | 15630-056 | |
| glutamax 100x | Invitrogen | 35050-038 | |
| Chir 99021 | Axon | 1386 | |
| Y27632 | Sigma | Y0503-5MG | |
| polybrene | Sigma | 107689 | |
| nicotinamide | Sigma | N0636 | |
| Trypsin | Lonza | BE02-007E | |
| puromycin | Sigma | P 7255 | |
| Rneasy mini kit | Qiagen | 74106 | |
| β-mercaptoethanol | Merck | 8,057,400,250 | |
| Ovation Pico WTA system | NuGen | 3300-12 | |
| paraformaldehyde | Sigma | 252549-1L | |
| glass vial conical 12 mm x 75 mm 5 ml | VWR | LSUKM12 | |
| Eosin Yellowish | VWR | 1,159,350,025 |
References
- Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
- Al-Nafussi, A. I., Wright, N. A. The effect of epidermal growth factor (EGF) on cell proliferation of the gastrointestinal mucosa in rodents. Virchows Archiv. B, Cell Pathology Including Molecular Pathology. 40 (1), 63-69 (1982).
- Haramis, A. P., et al. De novo crypt formation and juvenile polyposis on BMP inhibition in mouse intestine. Science. 303 (5664), 1684-1686 (2004).
- Zhao, J., et al. R-spondin1, a novel intestinotrophic mitogen, ameliorates experimental colitis in mice. Gastroenterology. 132 (4), 1331-1343 (2007).
- Schwank, G., Andersson-Rolf, A., Koo, B. K., Sasaki, N., Clevers, H. Generation of BAC transgenic epithelial organoids. PLoS One. 8 (10), e76871 (2013).
- Koo, B. K., et al. Controlled gene expression in primary Lgr5 organoid cultures. Nature Methods. 9 (1), 81-83 (2012).
- Heijmans, J., et al. ER stress causes rapid loss of intestinal epithelial stemness through activation of the unfolded protein response. Cell Rep. 3 (4), 1128-1139 (2013).
- Roe, T., Reynolds, T. C., Yu, G., Brown, P. O. Integration of murine leukemia virus DNA depends on mitosis. The EMBO Journal. 12 (5), 2099-2108 (1993).
- Lau, W., et al. Lgr5 homologues associate with Wnt receptors and mediate R-spondin signalling. Nature. 476 (7360), 293-297 (2011).
- Bahnson, A. B., et al. Centrifugal enhancement of retroviral mediated gene transfer. Journal Of Virological Methods. 54 (2-3), 131-143 (1995).
