Introduction
आंतों उपकला यह कैंसर और स्टेम सेल पर शोध से व्यापक हित को आकर्षित करने का कारण बना है जो सबसे तेजी से proliferating शारीरिक ऊतकों में से एक है। 2009 में एक तकनीक के लिए एक तीन आयामी संरचना एक संरक्षण, Matrigel में छोटी आंतों तहखाने के लंबे समय तक चलने संस्कृतियों उत्पन्न करने के लिए प्रकाशित किया गया था। इन संरचनाओं, आंतों organoids, मध्यम बीएमपी संकेतन मार्ग अवरोध करनेवाला नोगिन (खूंटी) सहित परिभाषित वृद्धि कारकों में से एक नंबर, के साथ पूरक के आसपास के साथ, मानक तकनीक का उपयोग कर संवर्धित किया जा सकता करार दिया, 1 (Rspo1) rspondin Wnt-संकेतन मार्ग बढ़ाने और epidermal वृद्धि कारक (EGF) सभी आंतों प्रसार 2-4 बढ़ाने के लिए मिला।
Organoids, स्टेम सेल पदानुक्रम को बनाए रखा है, वे गैर उत्परिवर्तित हैं कि पहलुओं में पारंपरिक कैंसर कोशिका लाइनों को पार नवजात छोटे पूर्णांक में पाया सभी सेल प्रजातियों में बरकरार सेलुलर ध्रुवीकरण और प्रदर्शनी भेदभाव प्रदर्शितestinal उपकला। वे ट्रांसजीन ले जाने के लिए transduced किया जा सकता है या आरएनए हस्तक्षेप 5 constructs के बाद से, वे लागत और गति के पहलुओं में ट्रांसजेनिक चूहों का उपयोग प्रयोगों outweighing, विशिष्ट आनुवंशिक तत्वों का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल कर रहे हैं। Organoids में ट्रांसजेनिक अभिव्यक्ति murine रेट्रोवायरल या lentiviral वैक्टर 6,7 या तो उपयोग किया जा सकता है। कारण mitotic कोशिकाओं को विशेष रूप से 8 transducing में सक्षम murine रेट्रोवायरस की सीमाओं के कारण, lentiviral पारगमन अधिक बार ऐसे organoids के रूप में संक्रमित करने के लिए मुश्किल हो जाता है कि कोशिकाओं, के लिए प्रयोग किया जाता है।
Virally transduced और stably व्यक्त ट्रांसजेनिक organoids का विश्लेषण करती है और immunohistochemistry मात्रात्मक शाही सेना सहित बहाव के विश्लेषण के एक भीड़ के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। साथ में ले ली, प्राथमिक आंतों उपकला कोशिकाओं से organoids की संस्कृति विशिष्ट प्रयोगशाला आवश्यकताओं के बिना लागू करने के लिए आसान है कि एक नियमित तकनीक में विकसित किया गया है, और सीई में उपन्यास मानक बन गया हैआंतों उपकला पर अनुसंधान के क्षेत्र में करूँगा संस्कृति।
वायरल पारगमन और organoids में बाद में नीचे की ओर विश्लेषण की तकनीकों प्रदर्शन करने के लिए और हम सभ्य organoids की lentiviral पारगमन के लिए तरीकों दिखा रहा है, इस वीडियो प्रोटोकॉल उत्पन्न organoid प्रयोगों सहायता करने के लिए थकाऊ रहे हैं। हम साथ ही पैदावार बढ़ाने के लिए और इसलिए शाही सेना तकनीक या immunohistochemistry का उपयोग करते हुए नीचे की ओर विश्लेषण के प्रदर्शन को बढ़ा सकते हैं कि कैसे सही प्रसंस्करण organoids के दिखा। वर्णित तकनीक के रूप में अच्छी तरह से colonic organoids करने के लिए लागू किया जा सकता है, हालांकि प्रोटोकॉल में, छोटी आंतों तहखाने से निकाली गई है कि organoids विशेष रूप से, इस्तेमाल किया गया।
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Protocol
अभिकर्मक अभिकर्मक के रूप में Polyethylenimine (पी) के 1. तैयारी
- एच 2 ओ की 100 मिलीलीटर में पी के लगभग 150 मिलीग्राम भंग
- समाधान स्पष्ट हो जाता है और पूरी तरह से भंग कर दिया जब तक हलचल जब तक एचसीएल जोड़कर 7.4 पीएच का हल समायोजित करें। इस बीच 10 और 60 मिनट लेने के लिए और 1 मिलीग्राम / एमएल के एक छोर एकाग्रता के लिए पानी जोड़ सकते हैं।
- जब स्पष्ट, 5 मिलीलीटर की aliquots में डिग्री सेल्सियस फ्रीजर में एक -80 बाँझ 0.22 माइक्रोन फिल्टर और दुकान के माध्यम से पी समाधान फ़िल्टर।
Lentiviral कणों की 2. उत्पादन
पहला दिन:
- 162 सेमी दो कुप्पी या सेल लाइन मध्यम संस्कृति में बड़े पेट्री डिश (10% एफसीएस, 1% पेनिसिलिन / स्ट्रेप्टोमाइसिन और 2 मिमी glutamine के पूरक के साथ पूरक DMEM) में 60% -80% confluency को स्प्लिट HEK293T कोशिकाओं।
दूसरा दिन:
- एक साथ जोड़कर कुल प्लास्मिड डीएनए के 45 माइक्रोग्राम प्रति युक्त डीएनए अभिकर्मक समाधान तैयारlentiviral पैकेजिंग वैक्टर (7 pVSVg की माइक्रोग्राम प्रति; pRSV फिरना के 5 माइक्रोग्राम प्रति, 13 pMDL की माइक्रोग्राम प्रति) ब्याज की ब्याज या shRNA के जीन एन्कोडिंग lentiviral प्लाज्मिड की और 20 माइक्रोग्राम प्रति। DMEM का उपयोग कर एक मिलीलीटर की मात्रा को समायोजित करें।
- DMEM के 930 μl के लिए 1 मिलीग्राम / एमएल पी के 90 μl जोड़कर पी अभिकर्मक समाधान तैयार है और कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए सेते हैं।
- पी समाधान के लिए डीएनए अभिकर्मक समाधान जोड़ें। भंवर कई बार पलटना और डीएनए अभिकर्मक समाधान प्राप्त करने के लिए कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए सेते हैं या।
- HEK293T कोशिकाओं पर डीएनए अभिकर्मक समाधान के 2 मिलीलीटर ड्रिप और 37 डिग्री सेल्सियस पर एक humidified सेल संस्कृति इनक्यूबेटर में 4 घंटे के लिए सेते हैं।
- 4 घंटे के बाद, पी दूर करने के लिए संस्कृति के माध्यम ताज़ा करें। यह नया माध्यम जोड़ने से पहले कोशिकाओं को धोने के लिए आवश्यक नहीं है।
नोट: 4 घंटे से अधिक समय तक पी है साइटोटोक्सिक और ऊष्मायन बार HEK293T कोशिकाओं को नुकसान हो सकता है।
4 दिन:
- Supe के बदलेंनई संस्कृति के माध्यम से rnatant। सतह पर तैरनेवाला (वायरस युक्त) रखें; इस कदम के 2.10 में इस्तेमाल किया जाएगा।
- 15 मिलीलीटर फ्लास्क में सतह पर तैरनेवाला रखो। 500 x जी पर 5 मिनट के लिए मृत कोशिकाओं, सेंट्रीफ्यूज को दूर करने के लिए।
- एक बड़े 60 मिलीलीटर सिरिंज का उपयोग कर 0.45 माइक्रोन फिल्टर के माध्यम से सतह पर तैरनेवाला पुश। 4 डिग्री सेल्सियस पर रातोंरात स्टोर।
दिन 5:
- सतह पर तैरनेवाला के दूसरे बैच लीजिए; चरणों 2.8-2.9 में के रूप में सेंट्रीफ्यूज और फिल्टर।
- 90 मिनट के लिए एक ultracentrifuge में 50,000 XG पर चरणों 2.9 और ultracentrifuge ट्यूबों में 2.10 और सेंट्रीफ्यूज से supernatants पूल।
- बहुत सावधानी से ultracentrifuge ट्यूब युक्त कैप्सूल बाहर ले जाओ और सेंट्रीफ्यूज के अंदर ट्यूब के उन्मुखीकरण को याद कर, एक लामिना का प्रवाह हुड में डाल दिया।
- गोली ट्यूब के ऊपरी तरफ है कि इस तरह के एक फैशन में ध्यान से ultracentrifuge ट्यूब और निथारना मध्यम पकड़े ओपन कैप्सूल। वायरल छर्रों कल्पना करने के लिए मुश्किल हो सकता है, पर क्या यादट्यूब की ओर एक गोली का गठन किया जाएगा। एक micropipette ले लो और ultracentrifuge ट्यूब के नीचे की तरफ दिख रहा है कि अपारदर्शी ब्राउन गोली आंदोलन के लिए नहीं ख्याल रख रही है, जबकि मध्यम के अंतिम बिट को हटा दें।
- 10 मिमी निकोटिनामाइड, 10 माइक्रोन Chir99021, 10 माइक्रोन Y27632 और 8 माइक्रोग्राम प्रति मिलीग्राम / polybrene के साथ पूरक organoid संस्कृति के माध्यम से 500 μl में इस गोली Resuspend। उच्च अनुमापांक वायरस सीधे organoids transduct करने के लिए प्रयोग किया जाता है के बाद से इस माध्यम में मेजबान महत्वपूर्ण है।
- वैकल्पिक: -80 डिग्री सेल्सियस में 250 μl के दो बैचों में aliquoted इस माध्यम में वायरस फ्रीज।
Organoids 3. Lentiviral पारगमन
दिवस 0:
- लगभग 50 छोटे organoids प्राप्त करने के लिए लक्ष्य है, एक नए कुएं में पारगमन के लिए दो दिन पहले organoids की पूरी 0.95 सेमी दो अच्छी तरह से विभाजित है। पहले प्रकाशित प्रोटोकॉल एक (चित्रा 3 ए, बी) के अनुसार organoids विभाजित।
- सिस्टिक हाइपर प्रफलन तहखाने (चित्रा -3 सी) प्राप्त करने के लिए 10 माइक्रोन Chir99021 और 10 मिमी निकोटिनामाइड के साथ संस्कृति के माध्यम organoid अनुपूरक।
नोट: हौसले से विभाजित organoids Chir99021 की उपस्थिति में बड़े हो रहे हैं जब सिस्टिक तहखाने सबसे अच्छा विकास होगा।
दूसरा दिन:
- जिससे एक P1000 micropipette के साथ मिश्रण में खलल न डालें, ऊपर pipetting और Matrigel और मध्यम नीचे से हार्वेस्ट organoids। एक 15 मिलीलीटर ट्यूब में मिश्रण रखें।
- बाहर का उद्घाटन पिघलने की कमी की गई है, जिसमें पाश्चर pipet का उपयोग आगे बाधित। अपकेंद्रित्र organoids 100 x जी पर 5 मिनट के लिए गोली।
नोट: सेंट्रीफ्यूज के आकार पर निर्भर करता है, एक अलग अपकेंद्रित्र गति का उपयोग करें। यह organoids मिश्रण से अलग हो रहे हैं बाधित जिसमें सटीक गति को खोजने के लिए आवश्यक है। - सतह पर तैरनेवाला निकालें और (0.25% trypsin के समान) पूर्व गर्म 1x trypsin के 500 μl जोड़ें। ट्रिप्सिन में organoids Resuspend और सेतेएक 37 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में 3 मिनट।
- सेल लाइन संस्कृति के माध्यम से 3.5 मिलीलीटर जोड़कर trypsin निष्क्रिय (DMEM के 10% एफसीएस, 1% पेनिसिलिन / स्ट्रेप्टोमाइसिन और glutamine के साथ पूरक)। 500 x जी पर 5 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र।
- मध्यम से लगभग 20 μl में गोली छोड़ने के लिए सतह पर तैरनेवाला निकालें। एक 48 कुओं थाली पर एक कुएं में मध्यम के इस अंतिम छोटी राशि में organoids स्थानांतरण।
- कदम 2.14, resuspend में वर्णित है और 3.10 कदम के लिए जारी के रूप में पारगमन के माध्यम में उच्च अनुमापांक lentivirus जोड़ें। कम पारगमन प्रभावकारिता का सामना करते हैं, तो 3.9 जोड़ा जा सकता है कदम।
नोट: कुशल पारगमन के लिए, आम तौर पर organoids की एक अच्छी तरह से करने के लिए उच्च अनुमापांक lentivirus के 250 μl के एक विभाज्य जोड़ें। इस प्रोटोकॉल के चरण 2 में वर्णित के रूप में यह एक एकल उत्पादन से सभी काटा lentivirus के 50% का प्रतिनिधित्व करता है। - वैकल्पिक: 32 पर एक पूर्व गर्म अपकेंद्रित्र में 48 अच्छी तरह से थाली युक्त organoids डाल द्वारा spinoculation प्रदर्शन, पारगमन प्रभावकारिता को बढ़ाने के लिए6, सी और 1 घंटे के लिए 600 XG पर बारी बारी से।
- संस्कृति इनक्यूबेटर में organoid वायरस मिश्रण डालो और पारगमन की अनुमति के लिए एक संस्कृति इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे के लिए सेते हैं।
- वैकल्पिक: इसके अलावा, पारगमन प्रभावकारिता को बढ़ाने के लिए एक संस्कृति इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस पर अतिरिक्त 3 घंटे के लिए organoids सेते हैं।
- Organoids गोली 850 XG पर 5 मिनट के लिए एक microcentrifuge में एक microcentrifuge ट्यूब और अपकेंद्रित्र में स्थानांतरण, organoid संस्कृति के माध्यम से 1 मिलीलीटर जोड़ें और organoid वायरस मिश्रण resuspend।
- सतह पर तैरनेवाला निकालें और ठंडा Matrigel के 20 μl में गोली resuspend। यह गर्म हो जाता है जब सामग्री solidifies के बाद से, समय की एक नंबर के लिए ठंड पीबीएस ऊपर pipetting द्वारा और बर्फ के नीचे ठंडा कर रहे हैं कि पिपेट सुझावों का उपयोग करें।
- एक 48 कुओं थाली में एक अच्छी तरह से बीच में छोटी बूंद रखो और जमना करने के लिए 15 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर संस्कृति इनक्यूबेटर में सेते हैं।
- 15 मिनट के बाद, ध्यान के साथ पूरक organoid संस्कृति के माध्यम से 250 μl जोड़ने10 मिमी निकोटिनामाइड, 10 माइक्रोन Chir99021 और 10 माइक्रोन Y27632। लघु बाधित organoid टुकड़े 24 घंटा के भीतर छोटे सिस्टिक organoids में बनेगी।
दिन 5:
- मध्यम ताज़ा करे और एक चयन एंटीबायोटिक के साथ पूरक (puromycin के लिए, चार माइक्रोग्राम प्रति / एमएल) का उपयोग करें।
दिन 7:
- चयन एंटीबायोटिक के साथ पूरक मानक organoid संस्कृति के माध्यम से, के लिए मध्यम बदलें।
नोट: उभरते Chir99021 वापसी के बाद 2-3 सप्ताह पूरा हो जाएगा। चयन के बाद, organoids चयन एंटीबायोटिक के बिना विकसित किया जा सकता है।
मात्रात्मक आरटी पीसीआर या माइक्रोएरे के लिए 4. Organoid आरएनए तैयारी
- शाही सेना तैयार करने के लिए, निर्माता प्रोटोकॉल के अनुसार एक वाणिज्यिक किट का उपयोग करें। Organoids से मध्यम निकालें और सीधे Matrigel युक्त organoids के गुंबद पर β-mercaptoethanol के साथ पूरक बफर RLT के 350 μl, जोड़ें। Materi के ResuspendP1000 micropipette का उपयोग pipetting द्वारा RLT में अल।
- निर्माता प्रोटोकॉल के अनुसार आगे शाही सेना तैयार करने का कार्य करें।
- वैकल्पिक: निर्माता प्रोटोकॉल के अनुसार 50 माइक्रोग्राम प्रति कुल शाही सेना के प्रारंभिक इनपुट की आवश्यकता होती है, तालियाँ पिको डब्ल्यूटीए प्रणाली का उपयोग प्रवर्धन द्वारा शाही सेना उपज में वृद्धि।
- वैकल्पिक: शाही सेना माइक्रोएरे करने से पहले गुणवत्ता नियंत्रण के लिए, निर्माता प्रोटोकॉल के अनुसार 8.5 या अधिक (चित्रा 5) के एक शाही सेना अखंडता संख्या (Rin) के लिए लक्ष्य, एक यूकेरियोट कुल शाही सेना नैनो चिप का उपयोग कर एक 2100 Bioanalyzer पर चलाने के नमूने हैं।
आयल embedding और immunohistochemistry के लिए 5. प्रसंस्करण Organoids
- पहले embedding organoid की दीक्षा के लिए आयल तरल रखने के लिए 70 डिग्री सेल्सियस पर छेद के साथ इनक्यूबेटर में ढाले 12 मिमी व्यास ग्लास ट्यूब एक एल्यूमीनियम ब्लॉक पूर्व गर्म।
- बरकरार एम्बेडेड organoids छोड़ रहा है, पूर्ण विकसित organoids के साथ एक एकल अच्छी तरह से ले लो और मध्यम हटा दें।
- 1 मिलीलीटर जोड़ें4% पीबीएस में paraformaldehyde के सीधे करने के लिए अच्छी तरह से और एक घंटा से कहीं भी चार डिग्री सेल्सियस पर करने के लिए रात को ठीक।
- बर्फ के ठंडे पीबीएस के 1 एमएल के साथ paraformaldehyde बदलें।
वैकल्पिक: इस कदम के बाद 4 डिग्री सेल्सियस पर एक सप्ताह के लिए पीबीएस में तय organoids रहते हैं। - पीबीएस के 1 मिलीलीटर में तय organoids Resuspend और कांच की शीशी में जगह है।
- , Organoids 1 मिनट के लिए नीचे सिंक चलो पीबीएस छानना और eosin समाधान की बूंदों के एक जोड़े एम्बेडिंग प्रक्रिया के दौरान organoids के दृश्य सक्षम करने के लिए भंग कर रहे हैं, जिसमें से 70% इथेनॉल के साथ बदलें।
- कमरे के तापमान पर 70% इथेनॉल में organoids छोड़ दें। 30 मिनट के बाद, ध्यान से, क्योंकि मामूली गुलाबी eosin रंग की आंख से organoids कल्पना करने में सक्षम किया जा रहा है, decanting से 70% इथेनॉल को हटा दें। 96% इथेनॉल के साथ embedding समाधान बदलें।
- दोहराएँ कदम 5.7, अगले एक साथ embedding समाधान की जगह हर बार। 70% इथेनॉल, 90% इथेनॉल, 96% इथेनॉल, 100% etha: बाद में निम्नलिखित समाधान के माध्यम से organoids दर्राNol, 100% इथेनॉल, xylene xylene।
- पिछले xylene धोने छानना और ट्यूब में आयल डालना। 30 मिनट के लिए 70 डिग्री सेल्सियस पर पूर्व गरम एल्यूमीनियम ब्लॉक में तुरंत ट्यूब रखो और नई स्वच्छ आयल के साथ तेल की जगह।
- बड़े खोलने के साथ एक पूर्व गर्म पाश्चर pipet का उपयोग आयल ब्लॉक मोल्ड में बंद आयल और pipet organoids डालो। एक लेम्प बर्नर का उपयोग कर पाश्चर pipet गर्म रखें। तरल आयल के एक छोटे से परत में पैराफिन ब्लॉक मोल्ड में सभी organoids रखें।
- जितना संभव हो, एक गर्म विच्छेदन सुई का उपयोग आयल ब्लॉक मोल्ड के केंद्र की ओर सभी organoids में हेरफेर करने की कोशिश करते हैं। लेम्प बर्नर का उपयोग कर विच्छेदन सुई गर्म रखें।
- सांचे में organoids का स्थानीयकरण संतोषजनक है, जब सर्द ढालना थोड़ा आयल परत जमना करने के लिए।
- शीर्ष पर अधिक आयल गिरने से ब्लॉक खत्म और एक मानक ऊतकीय एम्बेडिंग कैसेट जोड़ें।
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Representative Results
Organoid lentiviral पारगमन
lentiviral कणों का उपयोग कर organoid पारगमन की तकनीक से पहले और पारगमन के दौरान organoids का सही से निपटने पर निर्भर करता है। Organoids (चित्रा 3A) सुसंस्कृत थे और वे एक तहखाने (3B चित्रा) में खलल डाल रहे थे। जैसा कि पहले बताया, GSK3 अवरोध करनेवाला Chir99021 की उपस्थिति में जब सुसंस्कृत इन एकल तहखाने, सिस्टिक तहखाने 9 (चित्रा -3 सी) बन गया। इसके बाद organoids एकल कक्षों के लिए वायरस कणों के प्रवेश की अनुमति देने के trypsinized थे। Lentiviral कणों के साथ कोशिकाओं transducing करते हैं, तरीकों की एक संख्या में इस तरह के spinoculation या लंबे समय तक ऊष्मायन के रूप में पारगमन प्रभावकारिता को बढ़ाने की कोशिश की जा सकती है। उच्च अनुमापांक PGK-EGFP lentivirus फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी द्वारा पारगमन प्रभावकारिता के दृश्य सक्षम करने के लिए इस्तेमाल किया गया था। इस प्लाज्मिड के साथ organoids के पारगमन प्रभावकारिता उच्च था और 100% का दरवाजा खटखटाया (Figurई 4E, एफ)। Lentiviral कणों (चित्रा 4C, डी) के साथ प्रभावकारिता का उपयोग कर spinoculation (चित्रा -4 ए, बी) या लंबे समय तक ऊष्मायन में सुधार इसलिए अतिरिक्त मूल्य उपज नहीं था।
शाही सेना निकासी
शाही सेना निकासी के लिए अगला organoids बड़े हो रहे थे। पूर्ण विकसित organoids कम आरएनए अखंडता (चित्रा 5) को दिखाने के लिए गामा विकिरण या नियंत्रण उपचार के अधीन थे कि काटा गया। GY, आरएनए अपमानित और इलाज organoids नियंत्रित करने के लिए तुलना में है 6 के साथ विकिरण पर, आरएनए अखंडता संख्या (Rin) कम हो जाता है।
आयल एम्बेडेड organoids पर immunohistochemistry
BrdU के साथ पूरक मध्यम संस्कृति में 2 घंटे के लिए organoids incubating के बाद, formalin में organoids तय किया गया और immunohistochemistry (चित्रा 6) के लिए कार्रवाई की। माउस विरोधी BrdU का प्रयोग, proliferative कोशिकाओं तहखाना-SEGM में मनाया जा सकता हैorganoids की और नहीं विभेदित डिब्बे में पिता।
चित्रा 1:। Organoid पारगमन के लिए lentivirus के उत्पादन के योजनाबद्ध इस योजना में, प्रोटोकॉल भाग 2 में लिखा है के रूप में, वायरस उत्पादन का सबसे महत्वपूर्ण कदम प्रोटोकॉल कदम संख्या और समय के साथ प्रतिनिधित्व कर रहे हैं।
चित्रा 2:। Organoids की lentiviral पारगमन के योजनाबद्ध इस योजना में, प्रोटोकॉल भाग 3 में लिखा है के रूप में, organoid पारगमन के सबसे महत्वपूर्ण कदम प्रोटोकॉल कदम संख्या और समय के साथ प्रतिनिधित्व कर रहे हैं।
चित्रा 3: Organoids पहले और ट्रॅन के दौरानsduction। आम तौर पर बढ़ रही organoids (ए) के दिनों की संख्या (सी) के लिए Chir99021 साथ ऊष्मायन के बाद पित्ताशय बन कि घनी बढ़ रही है छोटे organoids (बी) में विभाजित हैं। ट्रिप्सिन का उपयोग कर इन organoids की हदबंदी करने पर, एकल कक्षों और कोशिकाओं के छोटे गुच्छों बाद में transduced रहे हैं कि (डी) रहते हैं। स्केल बार 100 माइक्रोन।
। चित्रा 4: lentiviral अभिव्यक्ति वैक्टर का उपयोग organoids के पारगमन Brightfield छवियों (ए, सी, ई, जी) और फ्लोरोसेंट छवियों (बी, डी, एफ, एच) PGK-EGFP lentivirus के साथ या तो ट्रांसफ़ेक्ट थे कि organoids से (ए - एफ) या, (जी lentivirus पर नियंत्रण
चित्रा 5:। Bioanalyzer पर organoids से शाही सेना preps के प्रतिनिधि परिणाम गलियों 2-4 में उच्च आरएनए अखंडता का प्रतिनिधित्व बैंड की मजबूत सीमांकन नोट और प्रवेश आरएनए अखंडता का प्रतिनिधित्व गलियों 5-7 पर बैंड के आसपास धब्बा। बैंड 2-4 की शाही सेना अखंडता संख्या (Rin) टी, जबकि क्रमश: 8.7, 9.2 और 9बैंड 5-7 की वह RIN 6.4, 6.6 और 5.5।
चित्रा 6:। Formalin तय आयल एम्बेडेड organoids के immunohistochemical विश्लेषण formalin तय आयल दो घंटे के लिए BrdU की उपस्थिति में सुसंस्कृत organoids के 4 माइक्रोन खंड एम्बेडेड और बाद में तय की। धारा विरोधी BrdU एंटीबॉडी के साथ दाग है। स्केल बार 100 माइक्रोन। इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
| बेसिक मध्यम | परिवर्धन | |
| सेल लाइन मध्यम संस्कृति | DMEM | 10% एफसीएस |
| 1% पेनिसिलिन / स्ट्रेप्टोमाइसिन | ||
| 2 मिमी जीएलutamine | ||
| Organoid संस्कृति के माध्यम से | उन्नत DMEM के लिए F12 | HEPES |
| 1% पेनिसिलिन / स्ट्रेप्टोमाइसिन | ||
| 1x glutamax | ||
| 1% N2 के पूरक | ||
| 2% B27 पूरक | ||
| 125 एनएम एन एसिटाइल सिस्टीन | ||
| माउस EGF (50 एनजी / एमएल) | ||
| (100 एनजी / एमएल के बराबर) 10% खूंटी-एफसी वातानुकूलित मध्यम | ||
| (500 एनजी / एमएल के बराबर) 10% Rspo1-एफसी वातानुकूलित मध्यम |
तालिका 1: संस्कृति के माध्यम रचना।
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Discussion
वर्तमान वीडियो प्रोटोकॉल प्राथमिक आंतों उपकला और मात्रात्मक आरएनए तकनीक और immunohistochemistry का उपयोग कर इन organoids के बहाव के विश्लेषण से organoids की lentiviral पारगमन का वर्णन है।
Lentiviral पारगमन अक्सर संस्कृति प्लेटों में पक्षपाती या अस्थायी कोशिकाओं में किया जाता है। Organoids के तीन आयामी संरचना वायरल कणों से घुसना करने के लिए उन्हें कठिन बना देता के बाद से, प्रभावकारिता को बढ़ाने के लिए तरीकों की एक संख्या में इस्तेमाल किया जाता है। Chir99021 का उपयोग कर organoids की pretreatment पारगमन के बाद प्रसार और इस तरह व्यवहार्यता बढ़ जाती है। यह एकल कक्षों अस्तित्व में कमी आई है, के बाद से trypsinization के बाद छोटे सेल समूहों को बनाए रखने के लिए महत्वपूर्ण है। Murine रेट्रोवायरस का उपयोग कर वायरल transductions के विपरीत, lentiviral transductions अधिक कुशल होते हैं और आमतौर पर spinoculation, ES कोशिकाओं 10 में बढ़ जाती है पारगमन प्रभावकारिता के लिए जाना जाता है एक तकनीक की आवश्यकता नहीं है। Murine रेट्रोवायरस या क का उपयोग करते समयlentiviral पारगमन की पैदावार कम प्रभावकारिता एन, spinoculation वैकल्पिक रूप से पारगमन की दर को बढ़ाने के लिए उपयोग किया जा सकता है। हम नियमित रूप से इस्तेमाल किया गया था ज़्यादा से ज़्यादा दो 0.95 सेमी दो कुओं से व्युत्पन्न organoids के पारगमन के लिए उत्पादन का एक भी गोल से सभी उपलब्ध वायरस के बाद से, वायरस अनुमापांक का आकलन नहीं करते। इसके अलावा, आम तौर पर गैर-transduced कोशिकाओं को हटाने के लिए एंटीबायोटिक चयन का उपयोग करें। पारगमन प्रभावकारिता के साथ समस्याओं का सामना जब वायरल अनुमापांक का आकलन हालांकि मूल्य का हो सकता है।
समान पक्षपाती कोशिकाओं को, चयन एंटीबायोटिक का स्तर वायरल एकीकरण की संख्या और transgene की जिससे अभिव्यक्ति बढ़ा सकते हैं। उच्च ट्रांसजेनिक अभिव्यक्ति और प्रभावी पछाड़ना प्राप्त करने के लिए उच्च स्तरीय puromycin (10 माइक्रोग्राम प्रति / एमएल) का प्रयोग करें, लेकिन विषाक्तता के organoids प्रदर्शनी लक्षण, निचले स्तर (न्यूनतम एक माइक्रोग्राम प्रति / एमएल) के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। पारगमन की संभावना है, हालांकि इसके अलावा, वैकल्पिक चयन एंटीबायोटिक दवाओं का इस्तेमाल किया जा सकता है या चयन छोड़ा जा सकता हैअधूरा हो सकता है और यह लंबे समय तक स्थिर अभिव्यक्ति में परिणाम नहीं हो सकता। जीनोम में lentiviral एकीकरण कोशिकाओं की आबादी के दौरान विषम है, क्योंकि इसके अलावा, transgene की अभिव्यक्ति एक लंबे समय के लिए संवर्धन कोशिकाओं के बाद परिवर्तन करने के वश में किया जा सकता है। इस transgene की अभिव्यक्ति से चयनात्मक दबाव से हो सकता है। एंटीबायोटिक चयन इन परिवर्तनों को सीमित करता है, वे विशेष रूप से transgenes की विधान अभिव्यक्ति के मामले में रह सकती है। इस नुकसान organoids की एकल कोशिका क्लोनिंग द्वारा दूर किया जा सकता है, लेकिन इस तकनीक का समय लगता है। Lentiviral पारगमन transgenes की स्थिर या inducible अभिव्यक्ति या तो में परिणाम है कि प्लास्मिड की एक विस्तृत विविधता के साथ प्रदर्शन किया जा सकता है। ये ट्रांसजीन आमतौर पर इस तरह के सीएमवी या PGK प्रमोटर के रूप में सर्वव्यापी प्रमोटर से व्यक्त कर रहे हैं और अलौकिक अभिव्यक्ति में हो सकता है। कैंसर सेल लाइनों या मॉडल पशुओं में ट्रांसजेनिक overexpression के लिए इसी प्रकार, सावधानी से fro परिणामों की व्याख्या warranted हैएम overexpression।
शाही सेना की आवश्यकता है कि प्रयोगों के लिए, व्यवहार्य कोशिकाओं की कम संख्या आम तौर पर आसानी से बड़ी बोतल में उगाया जा सकता है कि पक्षपाती कोशिकाओं के विपरीत एक भी 0.95 सेमी दो अच्छी तरह से अच्छी तरह से (48 के मानक सतह क्षेत्र) में उगाया गुणवत्ता के लिए दर-सीमित कारक है और नीचे की ओर विश्लेषण की भीड़। हम पाते हैं कि आम तौर पर, आगे प्रवर्धन बिना 0.4 माइक्रोग्राम प्रति और एक माइक्रोग्राम प्रति कुल शाही सेना, मात्रात्मक आरटी पीसीआर के लिए पर्याप्त जा रहा है और शाही सेना माइक्रोएरे के बीच लगभग 50 पूर्ण विकसित organoids पैदावार की एक भी अच्छी तरह से। कुछ उपचार परहेज या आनुवंशिक परिवर्तन काफी हालांकि शाही सेना की मात्रा को कम कर सकते हैं। एक पहला कदम कुल शाही सेना कई कुओं की पूलिंग है बढ़ाने के लिए।
Organoids की आयल embedding के लिए, यह प्रक्रिया के दौरान organoids कल्पना करने के क्रम में पर्याप्त सामग्री प्राप्त करने के लिए महत्वपूर्ण है। तय organoids को eosin के मिनट मात्रा के अलावा पूरे दौरान organoids के दृश्य की अनुमति देता हैप्रक्रिया है, लेकिन सामान्य embedding के लिए आवश्यक नहीं है और इस कदम आगे के विश्लेषण के साथ हस्तक्षेप जब हटाया जा सकता है। आमतौर पर, आयल-embedding कैसेट उन में छेद कैसेट में ऊतकों को लगानेवाला और प्रक्रिया के समाधान के प्रवाह की अनुमति है।
बहाव के मानक तकनीक के लिए lentiviral organoid पारगमन और तैयारी इन संस्कृतियों की वैज्ञानिक क्षमता बढ़ जाती है और प्राथमिक आंतों उपकला से तीन आयामी तकनीक को सेल संस्कृति में मानक उठाती है। बहाव के प्रयोगों की श्रृंखला के लिए पर्याप्त है संस्कृति द्वारा उत्पन्न सेलुलर सामग्री की राशि दी, हालांकि वर्तमान प्रोटोकॉल में वर्णित तकनीकों तक सीमित नहीं है प्रदर्शन किया जाएगा और सेल लाइनों या चूहों पर प्रदर्शन सभी तकनीकों धरना सकता है। विशिष्ट आनुवंशिक तत्वों और आंतों उपकला में उनके कार्य, मॉडल पशुओं में मुताबिक़ पुनर्संयोजन तकनीक, सबसे विशेष रूप से चूहों पर शोध में, सोने के मानक रहते हैं। Organoids की संस्कृतियों करनाmesenchymal या प्रतिरक्षाविज्ञानी आला कोशिकाओं और सुसंस्कृत तहखाने शामिल नहीं कभी विवो में पाया स्थिति विषम विस्तार कर रहे हैं। बहरहाल, इन संस्कृतियों बहुत इन विट्रो निष्कर्षों की गुणवत्ता उठाया और खाते में, organoid संस्कृति है निष्पादित किया जा सकता है और बहुत आंतों उपकला पर अनुसंधान में वृद्धि होगी कि असंख्य डाउनस्ट्रीम तकनीक ले रही है।
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Polyethylene imine | Polysciences | 23966-2 | |
| DMEM medium | Lonza | BE12-614F | |
| Fetal calf serum | Lonza | DE14-801F | |
| Penicillin-streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | |
| Glutamin | Invitrogen | 25030-024 | |
| matrigel | BD | BD 356231 | |
| Advanced DMEM-F12 | Gibco | 12634-010 | |
| N2 | Invitrogen | 17502-048 | |
| B27 | Invitrogen | 17504-044 | |
| N-acetyl cysteine | Sigma | A9165-1G | |
| mouse Egf | Invitrogen | PMG8045 | |
| Hepes 1 M | Invitrogen | 15630-056 | |
| glutamax 100x | Invitrogen | 35050-038 | |
| Chir 99021 | Axon | 1386 | |
| Y27632 | Sigma | Y0503-5MG | |
| polybrene | Sigma | 107689 | |
| nicotinamide | Sigma | N0636 | |
| Trypsin | Lonza | BE02-007E | |
| puromycin | Sigma | P 7255 | |
| Rneasy mini kit | Qiagen | 74106 | |
| β-mercaptoethanol | Merck | 8,057,400,250 | |
| Ovation Pico WTA system | NuGen | 3300-12 | |
| paraformaldehyde | Sigma | 252549-1L | |
| glass vial conical 12 mm x 75 mm 5 ml | VWR | LSUKM12 | |
| Eosin Yellowish | VWR | 1,159,350,025 |
References
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