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Biology

Um Protocolo de Transdução Lentivirus e Análise de Downstream da Intestinal Organóides

Published: April 20, 2015 doi: 10.3791/52531

Introduction

O epitélio intestinal é um dos tecidos corporais mais proliferam rapidamente, o que fez com que ele atrair grande interesse da pesquisa sobre as células cancerosas e tronco. Em 2009, uma técnica foi publicado para gerar culturas de longa duração de pequenas criptas intestinais em matrigel, conservando uma estrutura dimensional 3 1. Estas estruturas, denominado Organóides intestinal, pode ser cultivado usando técnicas convencionais, com áreas meio suplementado com um número de factores de crescimento definidas, incluindo a BMP-inibidor da via de sinalização noggin (nog), o intensificador de via de sinalização Wnt-1 rspondin (RSPO1) e factor de crescimento epidérmico (EGF) todos encontrados para aumentar a proliferação intestinal 2-4.

Organóides superar tradicionais linhas celulares de cancro nos aspectos que são não mutado, mantiveram hierarquia de células-tronco, exibir polarização celular intacto e diferenciação exposição em todas as linhagens de células encontradas na nascente pequeno intepitélio estinal. Uma vez que podem ser transduzidas para transportar transgenes ou interferência de ARN constrói 5, eles são utilizados para estudar os elementos genéticos específicos, compensando experiências utilizando ratinhos transgénicos em facetas de custo e de velocidade. A expressão transgénica em Organóides pode ser realizada utilizando retrovírus murino ou vectores lentivirais 6,7. Devido às limitações de retrovírus murino, capazes de transdução de células mitóticas exclusivamente 8, transdução lentiviral é mais frequentemente usado para células que são difíceis de infectar, como Organóides.

Viralmente e transduzidas que expressam estavelmente Organóides transgénicas podem ser usadas para uma multiplicidade de análises a jusante, incluindo ARN análises quantitativa e imuno-histoquímica. Tomados em conjunto, a cultura de Organóides de células epiteliais do intestino primárias evoluiu para uma técnica de rotina que é fácil de implementar, sem requisitos laboratoriais específicos, e tornou-se o novo padrão em cecultura ll em pesquisas sobre o epitélio intestinal.

Técnicas de transdução viral e análise jusante subsequente em Organóides são entediantes para executar e para ajudar experimentos organóide geramos este protocolo de vídeo, mostrando métodos para a transdução de lentivírus de Organóides cultivadas. Nós, adicionalmente, mostrar como correto processamento de Organóides pode aumentar o rendimento e, portanto, melhorar o desempenho da análise a jusante, utilizando técnicas de RNA ou imuno-histoquímica. No protocolo, Organóides que são derivados a partir de pequenas criptas intestinais foram utilizados exclusivamente, embora as técnicas descritas podem ser aplicadas a Organóides do cólon, bem.

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Protocol

1. Preparação de polietilenimina (PEI) como Reagente de Transfecção

  1. Dissolve-se cerca de 150 mg de PEI em 100 ml de H 2 O.
  2. Ajuste a solução para pH 7,4 pela adição de HCl até que a solução torna-se clara e mexa até dissolver completamente. Isto pode levar entre 10 e 60 min e adicionar água a uma concentração final de 1 mg / ml.
  3. Quando clara, filtrar a solução PEI através estéril filtro de 0,22 um e armazenar em um freezer -80 ° C em alíquotas de 5 ml.

2. Produção de Lentivirus Particles

Dia 1:

  1. Células HEK293T Dividir a 60% -80% de confluência em 162 cm2 de frasco ou placa de petri grande em linha de células de meio de cultura (DMEM suplementado com 10% de FCS, 1% de penicilina / estreptomicina e glutamina 2 mM).

Dia 2:

  1. Preparar a solução de transfecção de DNA contendo 45? G de DNA total do plasmídeo adicionando juntosvectores lentivirais de embalagem (7 ug de pVSVg; 5 ug de pRSV rev; 13 ug de pMDL) e 20 ug de plasmídeo de lentivírus que codificam o gene de interesse ou shRNA de interesse. Ajustar para um volume de 1 ml, utilizando meio DMEM.
  2. Preparar a solução de transfecção PEI por adição de 90 ul de 1 mg / ml de PEI a 930 ul de DMEM e incubar durante 5 min à temperatura ambiente.
  3. Adicionar solução de transfecção de ADN a uma solução de PEI. Vortex ou inverter um número de vezes e incubar durante 5 min à temperatura ambiente para se obter a solução de transfecção de ADN.
  4. Gotejamento 2 ml da solução de transfecção de ADN para as células HEK293T e incubar durante 4 horas numa incubadora de cultura de células em humidificada a 37 ° C.
  5. Após 4 horas, atualize o meio de cultura para remover PEI. Não é necessário lavar as células antes da adição de meio novo.
    NOTA: PEI é citotóxico e incubação vezes mais do que 4 horas pode causar danos às células HEK293T.

Dia 4:

  1. Substitua supernatant com o novo meio de cultura. Manter sobrenadante (contendo vírus); este vai ser utilizado no passo 2.10.
  2. Coloque sobrenadante em 15 ml frasco. Para remover as células mortas, centrifugar durante 5 minutos a 500 x g.
  3. Empurrar sobrenadante através de 0,45 um filtro usando um grande seringa de 60 mL. Armazenar durante a noite a 4 ° C.

Dia 5:

  1. Recolhe-se o segundo lote do sobrenadante; centrifugar e filtrar tal como nos passos 2,8-2,9.
  2. Reúnem-se os sobrenadantes dos passos 2.9 e 2.10 em tubos de ultracentrífuga e centrifugar a 50000 xg numa ultracentrífuga durante 90 min.
  3. Retire cápsulas contendo os tubos de ultracentrífuga muito cuidadosamente e colocados numa câmara de fluxo laminar, lembrando-se a orientação do tubo para dentro da centrífuga.
  4. Abrir de retenção da cápsula e tubo de ultracentrífuga meio decantar cuidadosamente, de tal forma que o pelete é no lado superior do tubo. Desde pelotas virais podem ser difíceis de visualizar, para o que se lembrarlado do tubo, um sedimento terá formado. Tomar uma micropipeta e remover último bit de meio, tendo cuidado para não agitar o sedimento castanha opaca que é visível do lado da parte inferior do tubo de ultracentrífuga.
  5. Ressuspender este sedimento em 500 ul de meio de cultura organ�de suplementadas com 10 mM de nicotinamida, 10 uM Chir99021, 10 uM Y27632 e 8 ug / mL de polibreno. A ressuspensão neste meio é importante já que o vírus de título elevado é usado para transduct Organóides directamente.
  6. Opcionalmente: congelar o vírus neste meio aliquotadas em dois lotes de 250 ul em -80 ° C.

3. Transdução Lentivirus de Organóides

Dia 0:

  1. Dividir uma completa 0,95 centímetros 2 poço de Organóides dois dias antes transdução em um novo poço, com o objetivo de obter cerca de 50 pequenas Organóides. Dividir Organóides acordo com o protocolo previamente publicado 1 (Figura 3A, B).
  2. Suplemento organ�de meio de cultura com 10 uM Chir99021 e 10 mM de nicotinamida para obter hiper cística criptas proliferativas (Figura 3C).
    NOTA: criptas cística irá desenvolver melhor quando Organóides recém divididas são cultivadas na presença de Chir99021.

Dia 2:

  1. Organóides colheita por pipetagem cima e para baixo do matrigel e médio, interrompendo assim a mistura com uma micropipeta P1000. Coloque a mistura em um tubo de 15 ml.
  2. Perturbar ainda mais usando pipeta Pasteur em que a abertura distal foi diminuído por fusão. Organóides Centrifugar para sedimentar durante 5 min a 100 x g.
    NOTA: Dependendo do tamanho da centrífuga, centrífuga de usar uma velocidade diferente. É necessário encontrar a velocidade exacta em que interrompeu Organóides são separadas da mistura.
  3. Remover o sobrenadante e adicionar 500 ul de tripsina (semelhante à tripsina 0,25%) pré-aquecida 1x. Ressuspender Organóides em tripsina e incubar3 min num banho de água a 37 ° C.
  4. Inactivar a tripsina por adição de 3,5 ml de meio de cultura de linha celular (DMEM suplementado com 10% de FCS, 1% de penicilina / estreptomicina e glutamina). Centrifugar durante 5 minutos a 500 x g.
  5. Remover o sobrenadante para deixar o granulado em cerca de 20 ul de meio. Transferir os Organóides neste último pequena quantidade de meio para um poço numa placa de 48-poços.
  6. Adicionar alta lentivírus título na forma de transdução, tal como descrito no passo 2.14, ressuspender e continuar para o passo 3.10. Ao encontrar baixa eficácia de transdução, passo 3.9 podem ser adicionados.
    NOTA: Para a transdução eficiente, tipicamente adicionar uma alíquota de 250 ul de elevado título de lentivírus para um poço de Organóides. Isso representa 50% de todo o lentivírus colhidas a partir de uma única unidade de produção, tal como descrito no passo 2 deste protocolo.
  7. Opcionalmente: para aumentar a eficácia de transdução, execute spinoculation colocando os 48 poços contendo Organóides em uma pré-aquecido centrífuga em 326; C e gire a 600 g durante 1 hora.
  8. Coloque a mistura organ�de-vírus em cultura incubadora e incubar durante 1 hora a 37 ° C numa incubadora de cultura para permitir a transdução.
  9. Opcionalmente, para melhorar ainda mais a eficácia de transdução, Organóides incubar durante 3 horas adicionais a 37 ° C numa incubadora de cultura.
  10. Adicionar 1 ml de meio de cultura organ�de e ressuspender a mistura organ�de-vírus, transferir para um tubo de microcentrifugação e centrifuga-se numa microcentrífuga durante 5 min a 850 xg para sedimentar Organóides.
  11. Remover o sobrenadante e ressuspender o sedimento em 20 mL de matrigel arrefecido com gelo. Uma vez que o material solidifica quando se torna mais quente, usar as pontas de pipeta que são refrigerados por pipetagem para cima e para baixo PBS gelado para um número de vezes.
  12. Coloque a gota no meio de um poço numa placa de 48 poços e incuba-se a cultura numa estufa a 37 ° C durante 15 minutos para solidificar.
  13. Após 15 min, adicionar cuidadosamente 250 ul de meio de cultura suplementado com organ�de10 mM de nicotinamida, 10 uM e 10 uM Chir99021 Y27632. Pequenos fragmentos organ�de rompidas vai formar em pequenas Organóides císticas dentro de 24 horas.

Dia 5:

  1. Actualizar médio e completar com um antibiótico de selecção (por puromicina, utilizar 4 ug / ml).

Dia 7:

  1. Substituir médio por meio de cultura organóide standard, complementada com a seleção do antibiótico.
    NOTA: brotamento será completa de 2-3 semanas após a suspensão Chir99021. Após selecção, Organóides podem ser cultivadas sem selecção de antibiótico.

4. organ�de Preparação do RNA para RT-PCR quantitativo ou Microarray

  1. Para a preparação de ARN, utilizar um kit comercial de acordo com o protocolo do fabricante. Retirar o meio de Organóides e adicionar 350 mL de tampão RLT, suplementadas com β-mercaptoetanol em frente a cúpula da matrigel contendo Organóides. Volte a suspender as materiai em RLT pipetando usando p1000 micropipeta.
  2. Realize mais prep RNA de acordo com o protocolo do fabricante.
  3. Opcionalmente: aumentar a produção de RNA por amplificação utilizando o sistema Ovation Pico WTA, exigindo a entrada inicial de 50 mg de RNA total de acordo com o protocolo do fabricante.
  4. Opcionalmente: para controle de qualidade antes de RNA microarray, as amostras são executados em um Bioanalyzer 2100 usando um chip nano RNA eukaryote totais, apontando para um número de integridade do RNA (RIN) de 8,5 ou mais (Figura 5), de acordo com o protocolo do fabricante.

5. O tratamento Organóides para inclusão em parafina e imuno-histoquímica

  1. Antes do início da organ�de incorporação pré-aquecer um bloco de alumínio com furos de ajuste 12 milímetros tubos de vidro de diâmetro em estufa a 70 ° C para manter a parafina líquida.
  2. Tome um único bem com Organóides adultas e remover o meio, deixando as Organóides embutidos intacta.
  3. Adicionar 1 mlde 4% de paraformaldeído em PBS e linear para fixar bem a 4 ° C em qualquer lugar a partir de 1 hora até durante a noite.
  4. Substituir paraformaldeído com 1 ml de PBS gelado.
    Opcionalmente: Organóides manter fixos em PBS até 1 semana a 4 ° C, após este passo.
  5. Ressuspender Organóides fixos em 1 ml de PBS e colocar em frascos de vidro.
  6. Deixe Organóides afundar para baixo durante 1 min, decanta-se PBS e substituir com etanol a 70%, em que um par de gotas de solução de eosina são dissolvidos para permitir a visualização de Organóides todo o processo de incorporação.
  7. Deixar Organóides em etanol a 70% à temperatura ambiente. Após 30 min, remover o etanol 70% por decantação com cuidado, ser capaz de visualizar os Organóides por olho por causa de cor ligeiramente rosada eosina. Substituir a incorporação de solução com 96% de etanol.
  8. Repetir o passo 5.7, substituindo cada vez que a incorporação da solução com o seguinte. Organóides passar através das seguintes soluções: posteriormente, etanol a 70%, etanol 90%, etanol 96%, 100% ethanol, etanol a 100%, xileno, xileno.
  9. Decantar a última lavagem xileno e despeje parafina para dentro do tubo. Colocar imediatamente o tubo no bloco de alumínio pré aquecido a 70 ° C durante 30 min e substituir com parafina nova limpeza da parafina.
  10. Despeje parafina off e pipeta Organóides no molde bloco de parafina usando um pré-aquecido pipeta Pasteur com grande abertura. Mantenha Pasteur pipeta morna usando um bico de Bunsen. Coloque todos os Organóides no molde de bloco de parafina em uma pequena camada de parafina líquida.
  11. Tanto quanto possível, tentar manipular todas Organóides para o centro do molde de bloco de parafina, utilizando uma agulha de dissecção aquecido. Mantenha dissecção agulha quente usando bico de Bunsen.
  12. Quando localização de Organóides no molde é satisfatória, molde a chill ligeiramente para solidificar a camada de parafina.
  13. Termine o bloco derramando mais de parafina na parte superior e adicione uma cassete incorporação histológica convencional.

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Representative Results

Transdução lentiviral organóide

A técnica de transdução organóide utilizando partículas de lentivírus depende manipulação correta de Organóides antes e durante a transdução. Organóides (Figura 3A) foram cultivadas e foram interrompidas em criptas individuais (Figura 3B). Como relatado anteriormente, estes criptas individuais, quando cultivadas na presença do inibidor de GSK3 Chir99021 tornou criptas císticas 9 (Figura 3C). Subsequentemente Organóides foram tripsinizadas para permitir a penetração de partículas do vírus a células individuais. Quando a transdução de células com partículas de lentivírus, uma série de métodos pode ser tentado a aumentar a eficácia de transdução, tais como spinoculation ou incubação prolongada. Título elevado PGK-eGFP lentivírus foi usado para permitir a visualização de eficácia de transdução por microscopia fluorescente. Eficácia de transdução Organóides com este plasmídeo foi elevada e aproximou-se de 100% (Figure 4E, F). Melhorar a eficácia usando spinoculation (Figura 4A, B) ou com incubação prolongada partículas lentivirais (Figura 4C, D), por conseguinte, não deu um valor adicional.

Extração de RNA

Próxima Organóides para extração de RNA foram cultivadas. Organóides maduros foram colhidos que foram submetidos a irradiação gama ou tratamento de controlo para mostrar reduzida a integridade de ARN (Figura 5). Após irradiação com 6 Gy, o ARN é degradada e comparadas para controlar Organóides tratados, o número de integridade do RNA (NIR) é reduzida.

Imunohistoquímica em parafina Organóides

Após incubação durante 2 horas Organóides em meio de cultura suplementado com BrdU, Organóides em formalina foram fixadas e processadas para imuno-histoquímica (Figura 6). Usando o mouse anti BrdU, as células de proliferação poderia ser observado em cripta-segmentos de Organóides e não no compartimento diferenciado.

Figura 1
Figura 1:. Esquemática da produção lentivírus para a transdução organóide Como escrito no protocolo parte 2, neste esquema, os passos mais críticos da produção de vírus são representados com números de etapa de protocolo e timing.

Figura 2
Figura 2:. Esquemático de transdução de lentivírus de Organóides Como escrito no protocolo parte 3, neste esquema, os passos mais críticos de transdução organóide são representados com números de etapa de protocolo e timing.

Figura 3
Figura 3: Organóides antes e durante a transduction. Organóides Normalmente crescimento (A) são divididos em densamente crescentes pequenas Organóides (B) que se tornam cística após incubação com Chir99021 para um número de dias (C). Após a dissociação de estes Organóides utilizando tripsina, as células simples e os pequenos aglomerados de células permanecem (D) que são subsequentemente transduzida. A barra de escala 100? M.

Figura 4
. Figura 4: Transdução de Organóides utilizando vectores de expressão de lentivírus imagens de campo claro (A, C, E, G) e as imagens fluorescentes (B, D, F, H) a partir de Organóides que foram transfectadas quer com lentivírus PGK-eGFP (A - F) ou controlar lentivírus (G, (A, B), spinoculation apenas (C, D) ou não medidas adicionais para aumentar a eficácia de transdução (E, F), em relação ao controle de vetores transduced Organóides, que não o fazem expressar eGFP (G, H). Note que a utilização PGK-eGFP lentivírus construção, a eficácia de transdução não é muito maior por etapas adicionais. A barra de escala 100? M.

Figura 5 Figura 5:. Resultado Representante da preps RNA de Organóides sobre Bioanalyzer Nota forte demarcação de bandas que representam integridade RNA alta nas pistas 2-4 e esfregaço em torno de faixas nas pistas 5-7 representam integridade RNA log. Número de integridade do RNA (RIN) de bandas 2-4 é de 8,7, 9,2 e 9, respectivamente, enquanto que tele RIN de bandas 5-7 é de 6,4, 6,6 e 5,5.

Figura 6
Figura 6:. A análise imuno-histoquímica de formalina e embebidos em parafina fixado em formalina Organóides parafina fixado incorporado 4 mm de secção da Organóides cultivadas na presença de BrdU durante duas horas e subsequentemente fixa. Seção está manchado com o anticorpo anti-BrdU. Bar Scale 100 um. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Meio de base Adições
A linha celular meio de cultura DMEM 10% de FCS
1% de penicilina / estreptomicina
Gl 2 mMutamine
Meio de cultura organ�de Avançado DMEM F12 HEPES
1% de penicilina / estreptomicina
1x glutamax
1% de suplemento N2
2% de suplemento B27
125 nM n-acetilcisteína
rato de EGF (50 ng / ml)
10% nog-Fc meio condicionado (equivalente a 100 ng / ml)
10% RSPO1-Fc meio condicionado (equivalente a 500 ng / ml)

Tabela 1: Composição do meio de cultura.

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Discussion

O protocolo de vídeo actual descreve transdução lentiviral de Organóides de epitélio intestinal primária e análise a jusante destas Organóides RNA utilizando técnicas quantitativas e imuno-histoquímica.

Transdução de lentivírus é freqüentemente realizada em células aderentes ou flutuantes em placas de cultura. Uma vez que a estrutura tridimensional de Organóides torna difícil de penetrar por partículas virais, um número de métodos para aumentar a eficácia são utilizados. O pré-tratamento de Organóides usando Chir99021 aumenta a proliferação e viabilidade, assim, após a transdução. É importante manter pequenos aglomerados de células após tripsinização, uma vez que as células individuais diminuiu a sobrevivência. Em contraste com transduções virais utilizando retrovírus murino, transduções lentivirais são mais eficientes e normalmente não requerem spinoculation, uma técnica conhecida para a eficácia de transdução de aumentos em células ES 10. Ao usar retrovírus murino ou when rendimentos de transdução de lentivírus baixa eficácia, spinoculation pode, opcionalmente, ser utilizados para aumentar a taxa de transdução. Nós não avaliar regularmente título do vírus, uma vez que todos os vírus disponível a partir de uma única rodada de produção para a transdução de Organóides derivados do máximo dois 0,95 centímetros 2 poços foi usado. Além disso, em geral, usar selecção de antibiótico para a remoção das células não transduzidas. Avaliação do título viral pode, contudo, ser de valor quando se deparam com problemas com a eficácia de transdução.

Idênticas às células aderentes, o nível de selecção de antibiótico pode aumentar o número de integrações víricas e assim a expressão do transgene. Use puromicina de alto nível (10 ng / ml) para obter uma elevada expressão transgénica e knockdown eficaz, mas quando os sinais de Organóides exibem toxicidade, níveis mais baixos podem ser utilizados (minimamente 1 ug / ml). Além disso, os antibióticos de selecção alternativos pode ser utilizada ou a selecção pode ser omitida, embora seja provável a transduçãoa ser incompleta e isso pode não resultar na expressão estável a longo prazo. Além disso, uma vez que a integração no genoma de lentivírus não é homogénea ao longo de uma população de células, a expressão do transgene pode ser subjugar a alterações após a cultura de células durante um tempo prolongado. Isto pode resultar de pressão selectiva por expressão do transgene. Embora a selecção de antibiótico limita estas alterações, que podem permanecer, em especial no caso da expressão constitutiva de transgenes. Esta desvantagem pode ser superada através da clonagem de célula única de Organóides, mas esta técnica é demorada. Lentivirus transdução pode ser realizada com uma grande variedade de plasmídeos que resultaria uma expressão estável ou induzível de transgenes. Estes transgenes são usualmente expressos a partir de promotores ubíquos, tais como o CMV ou o promotor de PGK e podem resultar em expressão sobrenatural. Semelhante a superexpressão transgênica em linhas celulares de cancro ou animais modelo, recomenda-se precaução interpretação dos resultados from superexpressão.

Para experiências que requeiram ARN, o baixo número de células viáveis ​​normalmente cultivadas num 0,95 centímetros 2 poço (área de superfície padrão de 48 poços) em contraste com as células aderentes que podem ser facilmente cultivadas em grandes frascos é o factor limitante da velocidade para a qualidade ea multidão de análise a jusante. Descobrimos que, normalmente, um único poço de aproximadamente 50 cheios cultivadas Organóides rendimentos entre 0,4 ug e 1 ug de ARN total, sendo suficiente para a RT-PCR quantitativa de ARN de microarray e sem amplificação posterior. Alguns regimes de tratamento ou alterações genéticas podem reduzir o teor de RNA significativamente no entanto. Um primeiro passo para aumentar o ARN total é a partilha de múltiplos poços.

Por imersão em parafina de Organóides, é crítico para obter material suficiente para permitir a visualização Organóides durante o processo. A adição de pequenas quantidades de eosina para Organóides fixos permite a visualização de Organóides durante todoprocesso, mas não é necessária para a incorporação normal e pode ser omitido quando este passo interfere com a posterior análise. Normalmente, as cassetes de incorporação de parafina apresentam furos para permitir o fluxo de soluções fixadoras e processo para o tecido na cassete.

Transdução organóide lentivírus e preparação para as técnicas padrão jusante aumenta potencial científico dessas culturas e eleva o padrão em cultura de células de técnicas tridimensionais a partir de epitélio intestinal primária. A gama de experiências jusante a ser realizado no entanto não limitam a técnicas descritas no protocolo de corrente e pode abranger todas as técnicas realizadas em linhas celulares ou ratinhos, dada a quantidade de material celular gerada por cultura é suficiente. Em pesquisa sobre elementos específicos genéticos e sua função no epitélio intestinal, técnicas de recombinação homóloga em modelos animais, principalmente ratos, sendo o padrão-ouro. Culturas de Organóides fazernão contêm mesenquimais ou nicho imunológica células e criptas cultivadas são sempre em expansão, contrastando a situação verificada in vivo. No entanto, essas culturas têm levantado a qualidade dos resultados in vitro muito e tendo em conta as técnicas de jusante inúmeras que podem ser realizadas, a cultura organóide tem e vai melhorar muito a pesquisa sobre o epitélio intestinal.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Polyethylene imine Polysciences 23966-2
DMEM medium Lonza BE12-614F
Fetal calf serum Lonza DE14-801F
Penicillin-streptomycin Invitrogen 15140-122
Glutamin Invitrogen 25030-024
matrigel BD BD 356231
Advanced DMEM-F12 Gibco 12634-010
N2 Invitrogen 17502-048
B27 Invitrogen 17504-044
N-acetyl cysteine Sigma A9165-1G
mouse Egf Invitrogen PMG8045
Hepes 1 M Invitrogen 15630-056
glutamax 100x Invitrogen 35050-038
Chir 99021 Axon 1386
Y27632  Sigma Y0503-5MG
polybrene Sigma 107689
nicotinamide Sigma N0636
Trypsin Lonza BE02-007E
puromycin Sigma P 7255
Rneasy mini kit Qiagen 74106
β-mercaptoethanol Merck 8,057,400,250
Ovation Pico WTA system NuGen 3300-12
paraformaldehyde Sigma 252549-1L
glass vial conical 12 mm x 75 mm 5 ml VWR LSUKM12
Eosin Yellowish VWR 1,159,350,025

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
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  10. Bahnson, A. B., et al. Centrifugal enhancement of retroviral mediated gene transfer. Journal Of Virological Methods. 54 (2-3), 131-143 (1995).

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Van Lidth de Jeude, J. F.,More

Van Lidth de Jeude, J. F., Vermeulen, J. L. M., Montenegro-Miranda, P. S., Van den Brink, G. R., Heijmans, J. A Protocol for Lentiviral Transduction and Downstream Analysis of Intestinal Organoids. J. Vis. Exp. (98), e52531, doi:10.3791/52531 (2015).

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