Introduction
Tarmepitelet er en af de hurtigst prolifererende kropslige væv, hvilket har forårsaget den til at tiltrække bred interesse fra forskning i kræft og stamceller. I 2009 en teknik blev offentliggjort at generere langvarige kulturer af små tarm krypter i matrigel, bevare en 3 dimensional struktur 1. Disse strukturer, betegnet intestinale organoids, kan dyrkes under anvendelse af standardteknikker, med omgivende medium suppleret med en række definerede vækstfaktorer, herunder BMP-signalvejen inhibitor noggin (Nog), Wnt-signalvejen enhancer rspondin 1 (Rspo1) og epidermal vækstfaktor (EGF) alle at forbedre intestinal proliferation 2-4.
Organoids overgå traditionelle kræft cellelinjer i de aspekter, at de er ikke-muteret, har fastholdt stamceller hierarki, vise intakt cellulær polarisering og udviser differentiering i alle cellelinier, der findes i den spirende lille intestinal epitel. Da de kan transduceres til at bære transgener eller RNA-interferens konstruerer 5, bliver de brugt til at studere specifikke genetiske elementer, opvejer forsøg med transgene mus i facetter af omkostninger og hastighed. Transgen ekspression i organoids kan udføres under anvendelse af enten murin retroviral eller lentivirusvektorer 6,7. På grund af begrænsningerne af murine retrovira, der er i stand til at transducere mitotiske celler udelukkende 8 er lentiviral transduktion oftere anvendes til celler, der er vanskelige at inficere, såsom organoids.
Viralt transduceret og stabilt udtrykker transgene organoids kan bruges til et væld af downstream analyser, herunder kvantitative RNA analyser og immunhistokemi. Tilsammen har kultur organoids fra primære tarmepitelceller udviklet sig til en rutinemæssig teknik, der er let at gennemføre uden specifikke laboratorie krav, og er blevet den nye standard i cell kultur i forskning i tarmepitelet.
Teknikker til viral transduktion og efterfølgende downstream analyse organoids er trættende at udføre, og at hjælpe organoide eksperimenter vi genererede denne video protokol, der viser metoder til lentiviral transduktion af dyrkede organoids. Vi viser desuden, hvordan korrekt behandling af organoids kan øge udbyttet og dermed forbedre ydeevnen af downstream analyse ved hjælp RNA teknikker eller immunhistokemi. I protokollen blev organoids, der er afledt fra små tarm krypter udelukkende anvendes, selv om de teknikker, der er beskrevet kan anvendes på colon organoids så godt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Fremstilling af polyethylenimin (PEI) som Transfection Reagent
- Opløs ca. 150 mg PEI i 100 ml H 2 O.
- Indstil opløsning til pH 7,4 ved tilsætning af HCl indtil opløsningen er klar og rør indtil fuldstændig opløst. Dette kan tage mellem 10 og 60 minutter og tilsæt vand til en koncentration på 1 mg / ml ende.
- Når klar, filtrere PEI løsning gennem sterilt 0,22 um filter og opbevares i en -80 ° C fryser i portioner på 5 ml.
2. Produktion af Lentiviral Partikler
Dag 1:
- Split HEK293T celler til 60% -80% konfluens i 162 cm2 kolbe eller stor petriskål i cellelinie dyrkningsmedium (DMEM suppleret med 10% FCS, 1% penicillin / streptomycin og 2 mM glutamin supplement).
Dag 2:
- Forbered DNA-transfektion opløsning indeholdende 45 ug totalt plasmid-DNA ved at adderelentivirale pakkevektorer (7 ug af pVSVg; 5 ug pRSV rev; 13 ug af pMDL) og 20 ug lentivirale plasmid, der koder for genet af interesse eller shRNA af interesse. Juster til et volumen på 1 ml under anvendelse af DMEM.
- Forbered PEI transfektion ved tilsætning af 90 pi 1 mg / ml PEI til 930 pi DMEM og inkuberes i 5 minutter ved stuetemperatur.
- Tilføj DNA-transfektion løsning til PEI-opløsning. Vortex eller invertere et antal gange og inkuberes i 5 minutter ved stuetemperatur til opnåelse af DNA-transfektion opløsning.
- Dryp 2 ml af DNA-transfektion opløsningen på HEK293T celler og inkuberes i 4 timer i en befugtet cellekultur inkubator på 37 ° C.
- Efter 4 timer, opdatere dyrkningsmediet at fjerne PEI. Det er ikke nødvendigt at vaske cellerne før tilsætning af nyt medium.
BEMÆRK: PEI er cytotoksisk og inkubation gange længere end 4 timer, kan forårsage skade på HEK293T celler.
Dag 4:
- Udskift Supernatant med ny dyrkningsmedium. Hold supernatant (indeholdende virus); dette vil blive anvendt i trin 2.10.
- Put supernatanten i 15 ml kolbe. At fjerne døde celler, centrifugeres i 5 minutter ved 500 x g.
- Skub supernatanten gennem 0,45 um filter ved hjælp af et stort 60 ml sprøjte. Opbevar natten over ved 4 ° C.
Dag 5:
- Saml det andet parti supernatant; centrifuge og filter som i trin 2,8-2,9.
- Pool supernatanterne fra trin 2.9 og 2.10 i ultracentrifugerør og centrifugeres ved 50.000 xg i en ultracentrifuge i 90 min.
- Tag kapsler indeholdende ultracentrifugerør meget omhyggeligt og anbringes i en laminær strømning, huske orienteringen af røret inde i centrifugen.
- Open kapsel omhyggeligt holde ultracentrifugerør, og der dekanteres medium på en sådan måde, at pelleten er på den øvre side af røret. Da virale pellets kan være svært at visualisere, huske på, hvadside af røret en pellet vil være dannet. Tag en mikropipette og fjern sidste bid af medium samtidig sørge for ikke at agitere den uigennemsigtige brun pille, der er synlig på den side af bunden af ultracentrifugerør.
- Resuspender denne pellet i 500 pi organoide dyrkningsmedium suppleret med 10 mM nicotinamid, 10 uM Chir99021, 10 uM Y27632 og 8 ug / ml polybren. Resuspendering i dette medium er vigtig, da høj titer virus anvendes til transduct organoids direkte.
- Eventuelt: fryse virus i dette medium i portioner i to portioner på 250 pi i -80 ° C.
3. Lentiviral Transduktion af Organoids
Dag 0:
- Split en fuld 0,95 cm2 brønd organoids to dage forud for transduktion ind i en ny brønd, der sigter mod at opnå ca. 50 små organoids. Split organoids ifølge tidligere offentliggjorte protokol 1 (figur 3A, B).
- Supplement organoide dyrkningsmedium med 10 pM Chir99021 og 10 mM nikotinamid at opnå cystisk hyper proliferative krypter (figur 3C).
BEMÆRK: Cystisk krypter vil udvikle bedst, når frisk delt organoids dyrkes i tilstedeværelse af Chir99021.
Dag 2:
- Harvest organoids ved at pipettere op og ned Matrigel og medium, derved forstyrre blanding med en P1000 mikropipette. Placer blandingen i et 15 ml rør.
- Sprænges yderligere under anvendelse af Pasteur-pipette, hvor den distale åbning er faldet ved smeltning. Centrifuger organoids at pelletere i 5 minutter ved 100 x g.
BEMÆRK: afhængig af størrelsen af centrifugen, bruge en anden centrifuge hastighed. Det er nødvendigt at finde den nøjagtige hastighed, hvor forstyrret organoids adskilles fra blandingen. - Fjern supernatanten og tilsæt 500 pi forvarmet 1x trypsin (svarende til 0,25% trypsin). Resuspendér organoids i trypsin og inkuberes3 min i et 37 ° C vandbad.
- Inaktivere trypsin ved tilsætning 3,5 ml cellelinie dyrkningsmedium (DMEM suppleret med 10% FCS, 1% penicillin / streptomycin og glutamin). Centrifuger i 5 minutter ved 500 x g.
- Fjern supernatanten at forlade pellet i ca. 20 pi medium. Overfør organoids i denne sidste lille mængde medium i en brønd på en 48-brøndsplade.
- Tilføj høj titer lentivirus i transduktion medium som beskrevet i trin 2.14, resuspender og fortsætte til trin 3.10. Når støder lav transduktion effektivitet, trin 3.9 kan tilføjes.
BEMÆRK: effektiv transduktion, typisk tilsættes en portion på 250 pi høj titer lentivirus til en brønd af organoids. Det svarer til 50% af alle høstede lentivirus fra en enkelt produktion som beskrevet i trin 2 i denne protokol. - Eventuelt: at styrke transduktion effektivitet, udføre spinoculation ved at sætte de 48 godt plade indeholdende organoids i en forvarmet centrifuge på 326 C og roterer ved 600 xg i 1 time.
- Put organoide-virus blandingen i kultur inkubator og inkuberes i 1 time ved 37 ° C i en kultur inkubator for at tillade transduktion.
- Eventuelt: for yderligere at forbedre transduktion effektivitet, inkuberes organoids i yderligere 3 timer ved 37 ° C i en kultur inkubator.
- Der tilsættes 1 ml organoide dyrkningsmedium og resuspender organoide-virus blandingen overføres til et mikrocentrifugerør og centrifugeres i en mikrocentrifuge i 5 minutter ved 850 xg for at pelletere organoids.
- Fjern supernatanten og pellet resuspenderes i 20 pi iskold matrigel. Da materialet størkner, når det bliver varmere, bruge pipettespidserne, der er kølet ved at pipettere op og ned iskold PBS for et antal gange.
- Sæt dråbe i midten af en brønd i en 48 brønde plade og inkuber i kultur inkubator ved 37 ° C i 15 minutter for at størkne.
- Efter 15 minutter tilsættes forsigtigt 250 pi organoide dyrkningsmedium suppleret med10 mM nikotinamid, 10 uM Chir99021 og 10 uM Y27632. Små forstyrret organoide fragmenter vil danne i små cystiske organoids indenfor 24 timer.
Dag 5:
- Opdater medium og supplere med et udvalg antibiotikum (for puromycin, bruge 4 pg / ml).
Dag 7:
- Erstat medium for standard organoide dyrkningsmedium suppleret med valg antibiotikum.
BEMÆRK: Spirende vil være komplet 2-3 uger efter Chir99021 tilbagetrækning. Efter udvælgelsen kan organoids dyrkes uden selektion antibiotikum.
4. organoide RNA Forberedelse til kvantitativ RT-PCR eller Microarray
- For RNA-fremstilling, anvende et kommercielt kit ifølge producentens protokol. Fjern mediet fra organoids og tilsæt 350 pi buffer RLT suppleret med β-mercaptoethanol lige på kuplen Matrigel indeholder organoids. Opslem materiaal i RLT ved pipettering hjælp P1000 mikropipette.
- Udfør yderligere RNA prep ifølge producentens protokol.
- Eventuelt: øge RNA udbytte ved amplifikation ved anvendelse af Ovation Pico WTA system kræver indledende effekt på 50 ug totalt RNA ifølge producentens protokol.
- Eventuelt: for kvalitetskontrol før RNA microarray, køre prøver på en 2100 Bioanalyzer anvendelse af en eukaryot total RNA nano chip, sigter mod en RNA integritet nummer (RIN) på 8,5 eller mere (figur 5) ifølge producentens protokol.
5. Behandling Organoids for Paraffin Indlejring og Immunohistokemi
- Inden initiering af organoide indlejring pre-opvarme en aluminiumblok med huller fittingen 12 mm diameter glasrør i inkubator ved 70 ° C for at holde paraffin væske.
- Tag et enkelt godt med fuldvoksne organoids og fjern mediet, efterlader de indlejrede organoids intakt.
- Tilføj 1 ml4% paraformaldehyd i PBS og lige godt og løse ved 4 ° C alt fra 1 time til natten over.
- Erstat paraformaldehyd med 1 ml iskold PBS.
Eventuelt: holde fast organoids i PBS op til 1 uge ved 4 ° C efter dette trin. - Resuspendér faste organoids i 1 ml PBS og anbringes i hætteglas.
- Lad organoids synke til bunden for 1 min, dekanteres PBS og erstatte med 70% ethanol, hvor et par dråber af eosin opløsning opløses for at muliggøre visualisering af organoids hele indlejring processen.
- Efterlad organoids i 70% ethanol ved stuetemperatur. Efter 30 minutter fjernes 70% ethanol ved omhyggeligt dekantering, være i stand til at visualisere organoids af øjet på grund af svag rosa eosin farve. Erstat indlejring opløsning med 96% ethanol.
- Gentag trin 5.7, hver gang erstatte indlejring løsning med den næste. Pass organoids gennem følgende efterfølgende opløsninger: 70% ethanol, 90% ethanol, 96% ethanol, 100% EthAnol, 100% ethanol, xylen, xylen.
- Hæld den sidste xylen vask og hæld paraffin ind i røret. Anbringes derefter omgående i præ opvarmet aluminium blok ved 70 ° C i 30 minutter og erstatte paraffin med ny ren paraffin.
- Hæld paraffin off og pipette organoids i paraffinblokken formen under anvendelse af en forvarmet Pasteur-pipette med stor åbning. Hold Pasteur pipette varme ved hjælp af en bunsenbrænder. Læg alle organoids i paraffin blokstøbeformen i et lille lag af flydende paraffin.
- Så meget som muligt, så prøv at manipulere alle organoids mod midten af den paraffin blokstøbeformen ved hjælp af en opvarmet dissektion nål. Hold dissektion nål varm hjælp bunsenbrænder.
- Når lokalisering af organoids i formen er tilfredsstillende, chill skimmel lidt for at størkne paraffin lag.
- Afslut blok ved at hælde mere paraffin på toppen og tilføje en standard histologisk indlejring kassette.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Organoide lentiviral transduktion
Teknikken med organoide transduktion hjælp lentivirale partikler afhænger korrekt håndtering af organoids før og under transduktion. Organoids (figur 3A) blev dyrket, og de blev afbrudt i enkelte krypter (figur 3B). Som tidligere rapporteret, disse enlige krypter, når de dyrkes i nærværelse af GSK3 inhibitor Chir99021 blev cystisk krypter 9 (figur 3C). Efterfølgende organoids blev trypsinbehandlet at tillade gennemtrængning af viruspartikler til enkeltceller. Når transduktion celler med lentivirale partikler, kan et antal metoder forsøger at forbedre transduktion effekt såsom spinoculation eller langvarig inkubation. High titer PGK-eGFP lentivirus blev anvendt til at muliggøre visualisering af transduktion effektivitet ved fluorescensmikroskopi. Transduktion effektivitet organoids med dette plasmid var høj, og nærmede sig 100% (Figure 4E, F). Bedre effekt ved brug spinoculation (figur 4A, B) eller langvarig inkubation med lentivirale partikler (figur 4C, D) har således ikke give yderligere værdi.
RNA-ekstraktion
Næste organoids til RNA-ekstraktion blev dyrket. Fuldvoksne organoids blev høstet, der blev udsat for gamma-bestråling eller kontrol behandling til at vise reduceret RNA integritet (figur 5). Efter bestråling med 6 Gy, RNA nedbrydes og sammenlignet for at kontrollere behandlet organoids er RNA integritet nummer (RIN) reduceret.
Immunhistokemi på paraffinindlejrede organoids
Efter inkubering organoids i 2 timer i dyrkningsmedium suppleret med BrdU blev organoids i formalin fast og forarbejdet til immunohistokemi (figur 6). Brug af mus anti BrdU kunne proliferative celler iagttages i krypt-segmentetents af organoids og ikke i den differentierede rum.
Figur 1:. Skematisk af lentivirus produktion for organoide transduktion Som skrevet i protokol del 2, i denne skematiske, er de mest kritiske trin i virus produktion repræsenteret med protokol trin tal og timing.
Figur 2:. Skematisk af lentiviral transduktion af organoids Som skrevet i protokol del 3, i denne skematiske, er de mest kritiske trin i organoide transduktion repræsenteret med protokol trin tal og timing.
Figur 3: Organoids før og under transduction. Normalt voksende organoids (A) er opdelt i tæt voksende små organoids (B), der træder cystisk efter inkubation med Chir99021 for et antal dage (C). Ved dissociation af disse organoids anvendelse af trypsin, enkelte celler og små klumper af celler forbliver (D), der transduceres efterfølgende. Scale bar 100 pm.
. Figur 4: Transduktion af organoids hjælp lentivirale ekspressionsvektorer lysfelt billeder (A, C, E, G) og fluorescerende billeder (B, D, F, H) fra organoids der blev transficeret med enten PGK-eGFP lentivirus (A - F) eller kontrollere lentivirus (G,
Figur 5:. Repræsentant resultat af RNA preps fra organoids på Bioanalyzer Bemærk stærk afgrænsning af bands, der repræsenterer høj RNA integritet i bane 2-4 og smøre rundt bands på banerne 5-7 repræsenterer log RNA integritet. RNA integritet nummer (RIN) af bånd 2-4 er 8,7, 9,2 og 9, mens than RIN af bånd 5-7 er 6,4, 6,6 og 5,5.
Figur 6:. Immunhistokemisk analyse af formalin paraffinindstøbte organoids fikseret i formalin paraffinindlejret 4 um sektion af organoids dyrket i nærværelse af BrdU i to timer og derefter fast. Afdeling farvet med anti-BrdU antistof. Scale bar 100 um. Klik her for at se en større udgave af dette tal.
| Basisk medium | Tilgang | |
| Cellelinie dyrkningsmedium | DMEM | 10% FCS |
| 1% penicillin / streptomycin | ||
| 2 mM Glutamine | ||
| Organoide dyrkningsmedium | Avanceret DMEM F12 | HEPES |
| 1% penicillin / streptomycin | ||
| 1x glutamax | ||
| 1% N2 Supplement | ||
| 2% B27 supplement | ||
| 125 nM n-acetylcystein | ||
| muse EGF (50 ng / ml) | ||
| 10% Nog-Fc konditioneret medium (svarende til 100 ng / ml) | ||
| 10% Rspo1-Fc konditioneret medium (svarende til 500 ng / ml) |
Tabel 1: Dyrkningsmedium sammensætning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den aktuelle video protokol beskriver lentiviral transduktion af organoids fra primær tarmepitelet og nedstrøms analyse af disse organoids der anvender kvantitative RNA teknikker og immunhistokemi.
Lentiviral transduktion udføres ofte i vedhængende eller flydende celler i kultur plader. Da tredimensionelle struktur af organoids gør dem vanskelige at trænge af virale partikler, anvendes en række af metoder til at øge effekten. Forbehandling af organoids hjælp Chir99021 øger proliferation og dermed levedygtigheden efter transduktion. Det er vigtigt at opretholde små celleklynger efter trypsinisering, da enkelte celler har nedsat overlevelse. I modsætning til virale transduktioner anvendelse af murine retrovirus, er mere effektive lentivirale transduktioner og sædvanligvis ikke kræver spinoculation, en teknik kendt til stigninger transduktion effekt i ES-celler 10. Ved anvendelse af murine retrovira eller WHen lentivirale transduktion udbytter lav effektivitet kan spinoculation eventuelt anvendes til at øge transduktion sats. Vi har ikke løbende vurdere virustiter, da alle tilgængelige virus fra en enkelt runde af produktionen til transduktion af organoids afledt af maksimalt to 0,95 cm 2 brønde blev brugt. Desuden generelt bruge antibiotisk selektion for fjernelse af ikke-transducerede celler. Vurdering af viral titer kan dog være af værdi, når de møder problemer med transduktion effektivitet.
Identisk med adhærente celler, kan niveauet af udvælgelse antibiotikum øge antallet af virale integrationer og dermed ekspression af transgenet. Brug højt niveau puromycin (10 ug / ml) for at opnå en høj transgene udtryk og effektiv knockdown, men når organoids udviser tegn på toksicitet, kan lavere niveauer anvendes (minimalt 1 pg / ml). Endvidere kan alternative udvælgelse antibiotika anvendes eller udvælgelse kan udelades, selvom transduktion sandsynligvisat være ufuldstændig, og det kan ikke føre til en langsigtet stabil ekspression. Eftersom lentiviral integration i genomet er heterogen gennem en population af celler, ekspression af transgenet kan undertrykke ændringer efter dyrkning af celler i en længere tid. Dette kan skyldes selektivt pres ved ekspression af transgenet. Selv antibiotisk selektion begrænser disse ændringer, kan de forblive, især i tilfælde af konstitutiv ekspression af transgener. Denne ulempe kan overvindes ved celle kloning af organoids enkelt, men denne teknik er tidskrævende. Lentiviral transduktion kan udføres med en bred række plasmider, som resulterer i enten stabil eller inducerbar ekspression af transgener. Disse transgener er normalt udtrykkes fra allestedsnærværende promotorer, såsom CMV eller PGK-promotoren og kan resultere i overnaturlig udtryk. Ligner transgene overekspression i cancer cellelinjer eller model dyr, der udvises forsigtighed, fortolkning af resultater from overekspression.
For eksperimenter, der kræver RNA, det lave antal levedygtige celler, der normalt dyrkes i en enkelt 0,95 cm2 godt (standard areal 48 brønd) i modsætning til adhærente celler, der let kan dyrkes i store kolber er hastighedsbegrænsende faktor for kvalitet og mange downstream analyse. Vi finder, at normalt en enkelt brønd på ca. 50 fuldt udvokset organoids udbytter mellem 0,4 ug og 1 pg total RNA, er tilstrækkelig til kvantitativ RT-PCR og RNA microarray uden yderligere amplifikation. Visse behandlingsplaner eller genetiske ændringer kan reducere RNA indhold væsentligt dog. Et første skridt til at øge den samlede RNA samle af flere brønde.
For paraffin indlejring af organoids, er det afgørende at opnå tilstrækkeligt materiale for at visualisere organoids under processen. Tilsætning af små mængder af eosin til faste organoids tillader visualisering af organoids under heleproces, men er ikke påkrævet for normal indlejring og kan udelades, hvis dette trin interfererer med yderligere analyse. Normalt paraffin-indlejring kassetter har huller i dem for at tillade strømning af fastgørelse og procesløsninger til vævet i kassetten.
Lentiviral organoide transduktion og forberedelse til downstream standardteknikker øger videnskabelige potentiale i disse kulturer og hæver standarden i cellekultur til tredimensionelle teknikker fra primær tarmepitelet. Rækken af downstream eksperimenter, der skal udføres er imidlertid ikke begrænset til teknikker beskrevet i den nuværende protokol, og kan omfatte alle teknikker udføres på cellelinjer eller mus, da mængden af cellemateriale genereret af kultur er tilstrækkelig. I forskning i specifikke genetiske elementer og deres funktion i tarmepitelet, homologe rekombinationsteknikker i model dyr, især mus, fortsat guldstandarden. Kulturer af organoids gøreikke indeholder mesenkymale eller immunologisk niche celler og dyrkede krypter er stadigt stigende, kontrasterende den situation in vivo. Ikke desto mindre har disse kulturer hævet kvaliteten af in vitro-resultater meget, og under hensyntagen til de talrige downstream teknikker, der kan udføres, organoide kultur har og vil øge forskning tarmepitelet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Polyethylene imine | Polysciences | 23966-2 | |
| DMEM medium | Lonza | BE12-614F | |
| Fetal calf serum | Lonza | DE14-801F | |
| Penicillin-streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | |
| Glutamin | Invitrogen | 25030-024 | |
| matrigel | BD | BD 356231 | |
| Advanced DMEM-F12 | Gibco | 12634-010 | |
| N2 | Invitrogen | 17502-048 | |
| B27 | Invitrogen | 17504-044 | |
| N-acetyl cysteine | Sigma | A9165-1G | |
| mouse Egf | Invitrogen | PMG8045 | |
| Hepes 1 M | Invitrogen | 15630-056 | |
| glutamax 100x | Invitrogen | 35050-038 | |
| Chir 99021 | Axon | 1386 | |
| Y27632 | Sigma | Y0503-5MG | |
| polybrene | Sigma | 107689 | |
| nicotinamide | Sigma | N0636 | |
| Trypsin | Lonza | BE02-007E | |
| puromycin | Sigma | P 7255 | |
| Rneasy mini kit | Qiagen | 74106 | |
| β-mercaptoethanol | Merck | 8,057,400,250 | |
| Ovation Pico WTA system | NuGen | 3300-12 | |
| paraformaldehyde | Sigma | 252549-1L | |
| glass vial conical 12 mm x 75 mm 5 ml | VWR | LSUKM12 | |
| Eosin Yellowish | VWR | 1,159,350,025 |
References
- Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
- Al-Nafussi, A. I., Wright, N. A. The effect of epidermal growth factor (EGF) on cell proliferation of the gastrointestinal mucosa in rodents. Virchows Archiv. B, Cell Pathology Including Molecular Pathology. 40 (1), 63-69 (1982).
- Haramis, A. P., et al. De novo crypt formation and juvenile polyposis on BMP inhibition in mouse intestine. Science. 303 (5664), 1684-1686 (2004).
- Zhao, J., et al. R-spondin1, a novel intestinotrophic mitogen, ameliorates experimental colitis in mice. Gastroenterology. 132 (4), 1331-1343 (2007).
- Schwank, G., Andersson-Rolf, A., Koo, B. K., Sasaki, N., Clevers, H. Generation of BAC transgenic epithelial organoids. PLoS One. 8 (10), e76871 (2013).
- Koo, B. K., et al. Controlled gene expression in primary Lgr5 organoid cultures. Nature Methods. 9 (1), 81-83 (2012).
- Heijmans, J., et al. ER stress causes rapid loss of intestinal epithelial stemness through activation of the unfolded protein response. Cell Rep. 3 (4), 1128-1139 (2013).
- Roe, T., Reynolds, T. C., Yu, G., Brown, P. O. Integration of murine leukemia virus DNA depends on mitosis. The EMBO Journal. 12 (5), 2099-2108 (1993).
- Lau, W., et al. Lgr5 homologues associate with Wnt receptors and mediate R-spondin signalling. Nature. 476 (7360), 293-297 (2011).
- Bahnson, A. B., et al. Centrifugal enhancement of retroviral mediated gene transfer. Journal Of Virological Methods. 54 (2-3), 131-143 (1995).
