Introduction
Tarmepitelet er en av de mest raskt prolifererende kroppsvev, noe som har forårsaket den til å tiltrekke bred interesse fra forskning på kreft og stamceller. I 2009 en teknikk ble publisert for å generere langvarige kulturer av tynntarms krypter i matrigel, bevare en 3-dimensjonal struktur 1. Disse konstruksjoner, betegnet tarm organoids, kan dyrkes ved hjelp av standardteknikker, med omgivende medium supplert med et antall definerte vekstfaktorer, inkludert BMP-signalveien inhibitor noggin (Nog), Wnt-signalveien enhancer rspondin 1 (Rspo1) og epidermal vekstfaktor (EGF) alle funnet å forsterke tarm proliferasjon 2-4.
Organoids overgå tradisjonelle kreftcellelinjer i de aspektene som de er ikke-mutert, har opprettholdt stamcelle hierarki, viser intakt celle polarisering og utstillings differensiering i alle celle linjene som finnes i den begynnende lite intestinal epitel. Siden de kan bli omformet til å gjennomføre transgener eller RNA interferens konstruerer 5, blir de brukt til å studere spesifikke genetiske elementer, oppveier eksperimenter ved hjelp av transgene mus i fasetter av pris og hastighet. Transgene expression in organoids kan utføres ved hjelp av enten murint retrovirale eller lentivirale vektorer 6,7. På grunn av begrensninger i murine retrovirus, i stand til transducing mitotiske celler utelukkende 8, er lentiviral transduksjon oftere brukt for celler som er vanskelige å infisere, for eksempel organoids.
Viralt transdusert og stabilt uttrykker transgene organoids kan brukes til en rekke nedstrøms analyser, inkludert kvantitative RNA analyser og immunhistokjemi. Til sammen har kultur av organoids fra primær intestinale epitelceller utviklet seg til en rutinemessig metode som er lett å implementere uten spesielle laboratoriekrav, og er blitt den nye standard på cell kultur i forskning på tarm epitel.
Teknikker for viral transduksjon og påfølgende nedstrøms analyse i organoids er kjedelig å utføre og å hjelpe organoid eksperimenter vi genererte denne videoen protokollen, som viser metoder for lentiviral transduksjon av dyrkede organoids. Vi viser i tillegg hvor riktig behandling av organoids kan øke utbyttet og dermed forbedre ytelsen til nedstrøms analyse ved hjelp av RNA-teknikker eller immunhistokjemi. I protokollen, ble organoids som er avledet fra tynntarms krypter utelukkende brukt, selv om de teknikker som er beskrevet kan anvendes på colonic organoids også.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Utarbeidelse av polyetylenimin (PEI) som Transfeksjon Reagens
- Oppløs ca. 150 mg av PEI i 100 ml H 2 O.
- Juster løsningen til pH 7,4 ved å tilsette HCl inntil løsningen blir klar, og omrør inntil det er fullstendig oppløst. Dette kan ta fra 10 til 60 min og tilsett vann til en sluttkonsentrasjon på 1 mg / ml.
- Når klar, filtrere PEI løsning gjennom sterilt 0,22 mikrometer filter og oppbevar i en -80 ° C fryser i porsjoner av 5 ml.
2. Produksjon av Lentiviral Partikler
Dag 1:
- Split HEK293T celler til 60% -80% konfluens i 162 cm2 kolbe eller stor petriskål i cellelinje dyrkningsmedium (DMEM supplert med 10% FCS, 1% penicillin / streptomycin og 2 mM glutamin supplement).
Dag 2:
- Forbered DNA transfeksjon oppløsning inneholdende 45 ug av total-plasmid-DNA ved å adderelentivirale vektorer emballasje (7 ug av pVSVg; 5 ug av pRSV rev; 13 ug pMDL) og 20 ug av lentivirale plasmid som koder for genet av interesse eller shRNA av interesse. Juster til et volum på 1 ml ved å bruke DMEM.
- Forbered PEI transfeksjon løsning ved å tilsette 90 ul av 1 mg / ml PEI til 930 ul DMEM og inkuberes i 5 minutter ved romtemperatur.
- Legg DNA transfeksjon løsning til PEI løsning. Vortex eller invertere en rekke ganger og inkuberes i 5 minutter ved romtemperatur for å oppnå DNA-transfeksjon løsning.
- Dryppe 2 ml av den DNA-transfeksjon oppløsningen på HEK293T cellene og inkuberes i 4 timer i en fuktig cellekulturinkubator på 37 ° C.
- Etter 4 timer, friske kulturmediet for å fjerne PEI. Det er ikke nødvendig å vaske cellene før tilsetning av nytt medium.
MERK: PEI er cytotoksiske og inkubasjonstid lengre enn 4 timer kan føre til skade på HEK293T celler.
Dag 4:
- Erstatte supernatant med nytt kulturmedium. Hold supernatanten (som inneholder virus); Dette vil bli brukt i trinn 2.10.
- Sett supernatanten i 15 ml kolbe. Å fjerne døde celler, sentrifuger i 5 min ved 500 x g.
- Push supernatant gjennom 0,45 mikrometer filter ved hjelp av en stor 60 ml sprøyte. Lagre natten ved 4 ° C.
Dag 5:
- Samle den andre parti av supernatant; sentrifuge og filter som i trinn 2.8 til 2.9.
- Pool supernatantene fra trinnene 2,9 og 2,10 i ultrasentrifuge-rør og sentrifuger ved 50 000 xg i en ultrasentrifuge i 90 min.
- Ta ut kapsler som inneholder ultrasentrifugen rørene svært nøye og sette inn en laminær hette, husker orienteringen av røret inne i sentrifugen.
- Åpen kapselhold ultrasentrifugerør og dekanter medium forsiktig på en slik måte at kulene er på oversiden av røret. Siden virale pellets kan være vanskelig å visualisere, å huske hvaside av røret en pellet vil ha dannet. Ta en mikropipette og fjerne siste bit av medium mens du tar vare ikke å agitere ugjennomsiktig brun pellet som er synlig på siden av bunnen av ultrasentrifugerør.
- Resuspender pellet i denne 500 ul av organoid dyrkningsmedium supplert med 10 mM nikotinamid, 10 uM Chir99021, 10 pM Y27632 og 8 pg / ml polybren. Resuspensjon i dette mediet er viktig siden høy titer virus brukes til å transduct organoids direkte.
- Eventuelt: fryse viruset i dette mediet alikvotert i to grupper av 250 mL i -80 ° C.
3. Lentiviral Transduksjon av Organoids
Dag 0:
- Splitte en hel 0.95 cm to godt av organoids to dager før transduksjon inn i en ny brønn, med formål å oppnå ca 50 små organoids. Splitte organoids henhold til tidligere utgitt protokoll 1 (figur 3A, B).
- Supplere organoid kultur medium med 10 mm Chir99021 og 10 mM nikotinamid å få cystisk hyper proliferativ krypter (Figur 3C).
MERK: Cystisk krypter vil utvikle best når ferske delt organoids dyrkes i nærvær av Chir99021.
Dag 2:
- Feie organoids ved å pipettere opp og ned i matrigel og medium, og derved avbryte blandingen med en P1000 mikropipette. Plasser blandingen i et 15 ml rør.
- Forstyrre ytterligere ved hjelp av Pasteur-pipette, hvor den distale åpningen er blitt redusert ved å smelte. Sentrifuger organoids til pellet i 5 min ved 100 x g.
MERK: Avhengig av størrelsen på sentrifugen, bruke en annen sentrifugehastighet. Det er nødvendig å finne den nøyaktige hastighet som forstyrret organoids blir separert fra blandingen. - Fjern supernatanten og tilsett 500 mL av forvarmet 1x trypsin (tilsvarende 0,25% trypsin). Suspender organoids i trypsin og inkuber3 minutter i et 37 ° C vannbad.
- Inaktivere trypsin ved å tilsette 3,5 ml av cellelinje dyrkningsmedium (DMEM supplert med 10% FCS, 1% penicillin / streptomycin og glutamin). Sentrifuger i 5 min ved 500 x g.
- Fjern supernatanten til å forlate pellet på ca. 20 ul medium. Overfør organoids i denne siste liten mengde medium i en brønn på en 48-brønner plate.
- Legg høytiter lentivirus i transduksjon medium som beskrevet i trinn 2.14, resuspender og fortsette til trinn 3.10. I møte med lav transduksjon effekt, steg 3,9 kan bli lagt til.
MERK: For effektiv transduksjon, vanligvis legge til en delmengde av 250 mL av høy titer lentivirus til ett godt av organoids. Dette representerer 50% av alle høstet lentivirus fra en enkelt produksjons som beskrevet i trinn 2 av denne protokoll. - Eventuelt: å forbedre transduksjon effekt, utføre spinoculation ved å sette de 48 brønners plate som inneholder organoids i en forvarmet sentrifuge på 326, C og roterer ved 600 x g i 1 time.
- Sett organoid-virus-blandingen i kultur inkubator og inkuberes i 1 time ved 37 ° C i et kulturinkubator å tillate transduksjon.
- Eventuelt: å ytterligere forbedre transduksjon effekt, ruge organoids for ytterligere 3 timer ved 37 ° C i en kulturinkubatoren.
- Tilsett 1 ml organoid kulturmedium og resuspender organoid-virusblandingen, overføres til et mikrosentrifugerør og sentrifuger i en mikrosentrifuge i 5 min ved 850 x g for å pelletere organoids.
- Fjern supernatanten og resuspender pelleten i 20 ul iskald matrigel. Siden materialet størkner når det blir varmere, bruker pipettespisser som er kjølt ved å pipettere opp og ned iskald PBS i en rekke ganger.
- Sett dråpen i midten av en brønn i en plate 48 brønner og inkuber i kulturinkubator ved 37 ° C i 15 min for å stivne.
- Etter 15 minutter, tilsett forsiktig 250 ul av organoid kulturmedium supplert med10 mM nikotinamid, 10 mikrometer Chir99021 og 10 mikrometer Y27632. Små forstyrret organoid fragmenter vil danne i små cystisk organoids innen 24 timer.
Dag 5:
- Oppdatere medium og supplere med et utvalg antibiotika (for puromycin, bruker 4 mikrogram / ml).
Dag 7:
- Erstatte medium for standard organoid kultur medium, supplert med valg antibiotika.
MERK: Spirende vil være komplett 2-3 uker etter Chir99021 tilbaketrekking. Etter valget, kan organoids dyrkes uten utvalg antibiotika.
4. Organoid RNA Forberedelse til kvantitativ RT-PCR eller Mikromatrise
- For RNA forberedelse, bruker et kommersielt kit i henhold til produsentens protokoll. Ta ut mediet fra organoids og legge 350 mL buffer RLT, supplert med β-mercaptoetanol rett på kuppelen av Matrigel inneholder organoids. Resuspender maal i RLT ved å pipettere hjelp P1000 mikropipette.
- Utføre ytterligere RNA prep i henhold til produsentens protokoll.
- Eventuelt: øke RNA avkastning ved forsterkning hjelp Ovation Pico WTA-system, som krever innledende innspill på 50 mikrogram total RNA i henhold til produsentens protokoll.
- Eventuelt: for kvalitetskontroll før RNA microarray, kjøre prøver på en 2100 Bioanalyzer ved hjelp av en RNA nano chip eukaryote total, sikter til en RNA integritet nummer (RIN) på 8,5 eller mer (figur 5) i henhold til produsentens protokoll.
5. Processing Organoids for parafin Inkludering og Immunohistokjemi
- Før initiering av organoid innstøping forvarme en aluminiumblokk med hull monterings 12 mm diameter glassrør i inkubator ved 70 ° C for å holde parafinvæske.
- Ta en enkelt brønn med fullvoksne organoids og fjern medium, forlater de innebygde organoids intakt.
- Tilsett 1 ml4% paraformaldehyd i PBS direkte til brønnen og feste ved 4 ° C alt fra 1 time til over natten.
- Erstatt formaldehydet med 1 ml iskald PBS.
Eventuelt: holde fast organoids i PBS opp til en uke ved 4 ° C etter dette trinnet. - Suspender faste organoids i 1 ml PBS og fyll i hetteglass.
- La organoids synke til bunnen i 1 min, dekanter PBS og erstatte med 70% etanol, hvor et par dråper av eosin-løsning oppløses for å muliggjøre visualisering av organoids hele innstøping prosessen.
- La organoids i 70% etanol ved romtemperatur. Etter 30 min, fjerne 70% etanol ved nøye dekantering, være i stand til å visualisere organoids ved øyet på grunn av svak rosa eosin farge. Erstatt embedding løsning med 96% etanol.
- Gjenta trinn 5.7, hver gang du skifter ut innebygging løsning med den neste. Passere organoids gjennom følgende løsninger hvorpå: 70% etanol, 90% etanol, 96% etanol, 100% Ethanol, 100% etanol, xylen, xylen.
- Dekanter den siste vaske xylen og hell parafin inn i røret. Sett røret umiddelbart i pre varme aluminiumblokk ved 70 ° C i 30 minutter og erstatte parafin med ny ren parafin.
- Hell parafin av og pipettes organoids inn i parafin blokk mold ved hjelp av en forvarmet Pasteur pipette med stor åpning. Hold Pasteur pipette varm ved hjelp av en Bunsen-brenner. Legg alle organoids i parafin blokk mold i et lite lag med flytende parafin.
- Så mye som mulig, prøv å manipulere alle organoids mot sentrum av parafin blokk mold ved hjelp av en varmet disseksjon nål. Hold disseksjon nål varm ved hjelp Bunsen-brenner.
- Ved lokalisering av organoids i formen er tilfredsstillende, kokille svakt for å størkne parafinlaget.
- Avslutt blokken ved å helle mer parafin på toppen og legg til en standard histologisk embedding kassett.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Organoid lentiviral transduksjon
Teknikken med organoid transduksjon hjelp lentiviral partikler avhenger korrekt håndtering av organoids før og under transduksjon. Organoids (figur 3A) ble dyrket, og de ble forstyrret til enkle krypter (Figur 3B). Som tidligere rapportert, disse enkelt krypter, når de ble dyrket i nærvær av GSK3p-inhibitor Chir99021 ble cystiske krypter 9 (figur 3C). Deretter organoids ble trypsinisert for å tillate inntrengning av viruspartikler til enkeltceller. Når transduse celler med lentivirale partikler, kan en rekke metoder bli forsøkt å forbedre transduksjon effekt som spinoculation eller langvarig inkubering. Høy titer PGK-EGFP lentivirus ble anvendt for å muliggjøre visualisering av transduksjon effekt av fluorescerende mikroskopi. Transduksjon effekt av organoids med dette plasmid var høy og nærmet seg 100% (Figure 4E, F). Forbedre effektiviteten ved hjelp spinoculation (Figur 4A, B) eller langvarig inkubasjon med lentiviral partikler (Figur 4C, D) fikk derfor ikke gi ytterligere verdi.
RNA ekstraksjon
Neste organoids for RNA ekstraksjon ble dyrket. Fullvoksne organoids ble høstet som ble utsatt for gammastråling eller kontroll behandling for å utvise redusert RNA integritet (Figur 5). Ved bestråling med 6 Gy, RNA brytes ned og sammenlignet med kontroll behandlede organoids, blir RNA integritet nummer (RIN) reduseres.
Immunhistokjemi på parafin innebygd organoids
Etter inkubering organoids i 2 timer i dyrkningsmedium supplert med BrdU ble organoids i formalin fiksert og prosessert for immunhistokjemi (figur 6). Ved hjelp av mus anti BrdU, kan proliferative celler observeres i krypten-segmentene av organoids og ikke i den differensierte rommet.
Fig. 1: Skjematisk fremstilling av lentivirus produksjon for organoid transduksjon Som skrevet i protokollen del 2, i denne skjematiske, er de mest kritiske trinn av virusproduksjon representert med protokollen trinnumrene og timing.
Figur 2:. Skjematisk av lentiviral transduksjon av organoids Som skrevet i protokollen del 3, i dette skjematisk, er de mest kritiske trinnene organoid transduksjon representert med protokollen vise tall og timing.
Figur 3: Organoids før og under transduction. Normalt voksende organoids (A) er delt inn i tett voksende små organoids (B) som blir cystisk etter inkubasjon med Chir99021 i flere dager (C). Ved dissosiasjon av disse organoids bruker trypsin, enkeltceller og små klumper av celler forblir (D) som er omformet senere. Skala bar 100 mikrometer.
. Figur 4: Transduksjon av organoids ved hjelp av lentivirale ekspresjonsvektorer Lysfelt bilder (A, C, E, G), og fluorescerende bilder (B, D, F, H) fra organoids som ble transfektert med enten PGK-EGFP lentivirus (A - F) eller kontrollere lentivirus (G,
Figur 5:. Representant resultat av RNA forbereder fra organoids på Bioanalyzer Merk sterk avgrensning av band som representerer høy RNA integritet i baner 2-4 og smøre rundt band på baner 5-7 representerer log RNA integritet. RNA integritet nummer (RIN) band 2-4 er 8,7, 9,2 og 9 henholdsvis, mens than RIN band 5-7 er 6.4, 6.6 og 5.5.
Figur 6:. Immunhistokjemisk analyse av formalinfiksert parafin innebygd organoids Formalin fast parafin innebygd 4 mikrometer delen av organoids dyrket i nærvær av BrdU i to timer og fikset senere. Seksjonen er farget med anti-BrdU antistoff. Skala bar 100 mikrometer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
| Grunnleggende medium | Tilgang | |
| Cellelinje kultur medium | DMEM | 10% FCS |
| 1% penicillin / streptomycin | ||
| 2mM Glutamine | ||
| Organoid kultur medium | Avansert DMEM F12 | HEPES |
| 1% penicillin / streptomycin | ||
| 1x Glutamax | ||
| 1% N2 supplement | ||
| 2% B27 supplement | ||
| 125 nM N-acetyl cystein | ||
| Egf mus (50 ng / ml) | ||
| 10% Nog-Fc-kondisjonert medium (tilsvarende 100 ng / ml) | ||
| 10% Rspo1-Fc-kondisjonert medium (tilsvarende 500 ng / ml) |
Tabell 1: Kulturmedium sammensetning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den nåværende video protokollen beskriver lentiviral transduksjon av organoids fra primær intestinal epitel og nedstrøms analyse av disse organoids benyttet kvantitative RNA teknikker og immunhistokjemi.
Lentiviral transduksjon er ofte utført i tilhenger eller flytende celler i kultur plater. Siden den tredimensjonale strukturen av organoids gjør dem vanskelig å trenge gjennom av virale partikler, anvendes en rekke metoder for å øke effekten. Forbehandling av organoids bruker Chir99021 øker spredning og dermed levedyktighet etter transduksjon. Det er viktig å opprettholde små celleklynger etter trypsinering, siden enkeltceller har redusert overlevelse. I motsetning til virus transductions hjelp murine retrovirus, lentivirale transductions er mer effektiv og vanligvis ikke krever spinoculation, en teknikk kjent til økninger transduksjon effekt i ES-celler 10. Når du bruker murine retrovirus eller whno lentivirale transduksjon utbytter lav effekt, kan spinoculation eventuelt benyttes for å øke hastigheten transduksjon. Vi har ikke jevnlig vurdere virustiter, siden alle tilgjengelige virus fra en enkelt runde av produksjon for transduksjon av organoids avledet fra maksimalt to 0,95 cm to brønner ble brukt. I tillegg, bruker vanligvis antibiotika seleksjon for fjerning av ikke-transduserte celler. Vurdering av viral titer kan imidlertid være av verdi når det oppdages problemer med transduksjon effekt.
Identisk med adherente celler, kan nivået av valget antibiotikum øke antallet virale integreringer og derved ekspresjon av transgenet. Bruk av høy-nivå puromycin (10 ug / ml) for å oppnå høy transgen ekspresjon og effektiv knockdown, men når organoids viser tegn på toksisitet, kan lavere nivåer brukes (minimalt 1 pg / ml). I tillegg kan alternative valg antibiotika brukes eller valg kan utelates, selv om det er sannsynlig transduksjonå være ufullstendig, og dette kan ikke føre til langsiktig stabil uttrykk. Videre, siden lentiviral integrering i genomet er heterogen gjennom en populasjon av celler, ekspresjon av transgenet kan undertrykke til endringer etter dyrkning av celler i en lengre tid. Dette kan resultere fra selektivt trykk ved ekspresjon av transgenet. Selv om antibiotika utvalg begrenser disse endringene, kan de forbli, spesielt i tilfelle av konstitutiv ekspresjon av transgener. Denne ulempe kan overvinnes ved enkelt celle kloning av organoids, men denne teknikk er tidkrevende. Lentiviral transduksjon kan utføres med en rekke forskjellige plasmider som resulterer i enten stabil eller induserbar ekspresjon av transgener. Disse transgener er vanligvis uttrykt fra allestedsnærværende promotorer, slik som CMV eller PGK-promoteren og kan resultere i overnaturlig uttrykk. I likhet med transgen overekspresjon i kreftcellelinjer eller modelldyr, utvises forsiktighet tolke resultater from overekspresjon.
For eksperimentene som krever RNA, det lave antall av levedyktige celler som normalt dyrkes i et enkelt 0,95 cm2 brønn (standard flateareal på 48 brønn) i motsetning til adherente celler som lett kan dyrkes i store kanner er det hastighetsbegrensende faktor for kvaliteten og mylder av genetisk analyse. Vi finner som normalt, en enkelt brønn på ca 50 fullvoksen organoids avkastning mellom 0,4 mikrogram og 1 mikrogram total RNA, som er tilstrekkelig for kvantitativ RT-PCR og RNA microarray uten ytterligere forsterkning. Enkelte behandlingsregimer eller genetiske endringer kan redusere RNA innhold betydelig imidlertid. Et første skritt for å øke total RNA er pooling av flere brønner.
For parafin innebygging av organoids, er det avgjørende å få tilstrekkelig materiale for å visualisere organoids under prosessen. Tilsetning av små mengder av eosin til faste organoids tillater visualisering av organoids under heleprosessen, men er ikke nødvendig for normal koblingen og kan utelates når dette trinnet forstyrrer videre analyse. Vanligvis parafin-innstøping kassetter har hull i dem for å tillate strømning av festing og prosessløsninger til vevet i kassetten.
Lentiviral organoid transduksjon og forberedelse for nedstrøms standard teknikker øker vitenskapelige potensialet i disse kulturene og hever standarden i cellekultur til tredimensjonale teknikker fra primær intestinal epitel. Utvalget av nedstrøms forsøk som skal utføres er imidlertid ikke begrenset til, teknikker beskrevet i den aktuelle protokoll, og kan omfatte alle metoder som utføres på cellelinjer eller mus, gitt mengden av cellematerialet som genereres av kulturen er tilstrekkelig. I forskning på spesifikke genetiske elementer og deres funksjon i tarm epitel, homolog rekombinasjon teknikker i modell dyr, særlig mus, forblir gullstandarden. Kulturer av organoids gjøreikke inneholder mesenchymale eller immunologiske nisje celler og dyrkede krypter er stadig voksende, kontrast situasjonen funnet in vivo. Likevel har disse kulturene hevet kvaliteten på in vitro funn sterkt, og tar hensyn til de utal nedstrøms teknikker som kan utføres, har organoid kultur og vil i stor grad øke forskning på tarm epitel.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Polyethylene imine | Polysciences | 23966-2 | |
| DMEM medium | Lonza | BE12-614F | |
| Fetal calf serum | Lonza | DE14-801F | |
| Penicillin-streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | |
| Glutamin | Invitrogen | 25030-024 | |
| matrigel | BD | BD 356231 | |
| Advanced DMEM-F12 | Gibco | 12634-010 | |
| N2 | Invitrogen | 17502-048 | |
| B27 | Invitrogen | 17504-044 | |
| N-acetyl cysteine | Sigma | A9165-1G | |
| mouse Egf | Invitrogen | PMG8045 | |
| Hepes 1 M | Invitrogen | 15630-056 | |
| glutamax 100x | Invitrogen | 35050-038 | |
| Chir 99021 | Axon | 1386 | |
| Y27632 | Sigma | Y0503-5MG | |
| polybrene | Sigma | 107689 | |
| nicotinamide | Sigma | N0636 | |
| Trypsin | Lonza | BE02-007E | |
| puromycin | Sigma | P 7255 | |
| Rneasy mini kit | Qiagen | 74106 | |
| β-mercaptoethanol | Merck | 8,057,400,250 | |
| Ovation Pico WTA system | NuGen | 3300-12 | |
| paraformaldehyde | Sigma | 252549-1L | |
| glass vial conical 12 mm x 75 mm 5 ml | VWR | LSUKM12 | |
| Eosin Yellowish | VWR | 1,159,350,025 |
References
- Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
- Al-Nafussi, A. I., Wright, N. A. The effect of epidermal growth factor (EGF) on cell proliferation of the gastrointestinal mucosa in rodents. Virchows Archiv. B, Cell Pathology Including Molecular Pathology. 40 (1), 63-69 (1982).
- Haramis, A. P., et al. De novo crypt formation and juvenile polyposis on BMP inhibition in mouse intestine. Science. 303 (5664), 1684-1686 (2004).
- Zhao, J., et al. R-spondin1, a novel intestinotrophic mitogen, ameliorates experimental colitis in mice. Gastroenterology. 132 (4), 1331-1343 (2007).
- Schwank, G., Andersson-Rolf, A., Koo, B. K., Sasaki, N., Clevers, H. Generation of BAC transgenic epithelial organoids. PLoS One. 8 (10), e76871 (2013).
- Koo, B. K., et al. Controlled gene expression in primary Lgr5 organoid cultures. Nature Methods. 9 (1), 81-83 (2012).
- Heijmans, J., et al. ER stress causes rapid loss of intestinal epithelial stemness through activation of the unfolded protein response. Cell Rep. 3 (4), 1128-1139 (2013).
- Roe, T., Reynolds, T. C., Yu, G., Brown, P. O. Integration of murine leukemia virus DNA depends on mitosis. The EMBO Journal. 12 (5), 2099-2108 (1993).
- Lau, W., et al. Lgr5 homologues associate with Wnt receptors and mediate R-spondin signalling. Nature. 476 (7360), 293-297 (2011).
- Bahnson, A. B., et al. Centrifugal enhancement of retroviral mediated gene transfer. Journal Of Virological Methods. 54 (2-3), 131-143 (1995).
