Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biology

Ett protokoll för Lentiviral Transduction och Nedströms Analys av Intestinal Organoids

doi: 10.3791/52531 Published: April 20, 2015

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Tarmepitelet är en av de mest snabbväxande kroppens vävnader, vilket har orsakat det att locka breda intresse från forskning om cancer och stamceller. Under 2009 en teknik publicerades generera långvariga kulturer av små intestinala kryptor i matrigel, bevara en 3 dimensionell struktur 1. Dessa strukturer, som kallas tarm organoids, kan odlas med användning av standardtekniker, med omgivande medium kompletterat med ett antal definierade tillväxtfaktorer, inklusive BMP-signaleringsvägen hämmare noggin (Nog), Wnt-signaleringsvägen förstärkare rspondin 1 (Rspo1) och epidermal tillväxtfaktor (EGF) alla visat sig förbättra tarm proliferation 2-4.

Organoids träffa traditionella cancercellinjer i de aspekter som de är icke-muterade, har upprätthållit stamcells hierarki, visa intakta cell polarisering och uppvisar differentiering till alla cellinjer som finns i den framväxande små intestinal epitel. Eftersom de kan transduceras att bära transgener eller RNA interferens konstruerar 5, de används för att studera specifika genetiska element, uppväger experiment använder transgena möss i aspekter av kostnad och snabbhet. Transgen expression i organoids kan utföras med användning antingen murint retroviralt eller lentivirusvektorer 6,7. På grund av begränsningarna hos murina retrovirus, som kan transducera mitotiska celler uteslutande 8, är lentivirala transduktion oftare används för celler som är svåra att infektera, exempelvis organoids.

Viralt transducerade och stabilt uttrycker transgena organoids kan användas för en mängd analyser nedströms, inklusive kvantitativa RNA analyser och immunohistokemi. Sammantaget har kultur av organoids från primära intestinala epitelceller utvecklats till en rutin teknik som är enkel att implementera utan specifika laboratoriekrav, och har blivit den nya standarden i cell kultur i forskning om tarmepitelet.

Tekniker för viral transduktion och efterföljande nedströms analys organoids är tråkiga att utföra och för att underlätta organoid experiment vi genererade den här videon protokoll, som visar metoder för lentiviral transduktion av odlade organoids. Vi visar dessutom hur korrekt behandling av organoids kan öka avkastningen och därmed öka prestanda för nedströms analys använder RNA tekniker eller immunohistokemi. I protokollet, var organoids som härrör från små intestinala kryptor uteslutande används, även om de tekniker som beskrivs kan appliceras på kolon organoids också.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. Framställning av Polyetylenimin (PEI) som transfektionsreagens

  1. Lös approximativt 150 mg av PEI i 100 ml H2O
  2. Justera lösningen till pH 7,4 genom tillsats av HCl tills lösningen blir klar och rör om tills den är helt upplöst. Detta kan ta mellan 10 och 60 min och tillsätt vatten till en slutkoncentration av 1 mg / ml.
  3. När klar, filtrera PEI lösningen genom sterilt 0,22 pm filter och förvara i en -80 ° C frys i portioner om 5 ml.

2. Produktion av Lentiviral Particles

Dag 1:

  1. Split HEK293T celler till 60% -80% konfluens i 162 cm 2 kolv eller stor petriskål i cellinjen odlingsmedium (DMEM med tillsats av 10% FCS, 1% penicillin / streptomycin och 2 mM glutamin tillägg).

Dag 2:

  1. Bered DNA-transfektion lösning innehållande 45 pg av total plasmid-DNA genom att adderalentivirala förpacknings vektorer (7 | ig av pVSVg; 5 ^ g av pRSV rev; 13 | ig av pMDL) och 20 ^ g av lentivirala plasmid som kodar för genen av intresse eller shRNA av intresse. Justera till en volym av 1 ml med hjälp DMEM.
  2. Bered PEI transfektion lösning genom att tillsätta 90 | il av 1 mg / ml PEI till 930 | il av DMEM och inkubera under 5 min vid rumstemperatur.
  3. Lägg DNA-transfektion lösning till PEI-lösningen. Vortex eller invertera ett antal gånger och inkubera under 5 min vid rumstemperatur för att erhålla DNA-transfektion lösning.
  4. Droppa 2 ml av DNA-transfektion lösningen på HEK293T celler och inkubera under 4 h i en fuktad cellodling inkubator på 37 ° C.
  5. Efter 4 timmar, uppdatera odlingsmediet för att avlägsna PEI. Det är inte nödvändigt att tvätta cellerna före tillsats nytt medium.
    OBS: PEI är cytotoxiska och inkubationstider längre än 4 timmar kan skada de HEK293T cellerna.

Dag 4:

  1. Ersätt supernatant med nya odlingsmedium. Behåll supernatanten (innehållande virus); detta kommer att användas i steg 2.10.
  2. Put supernatanten i 15 ml kolv. För att avlägsna döda celler, centrifug under 5 min vid 500 x g.
  3. Push supernatanten genom 0,45 ìm filter med hjälp av en stor 60 ml spruta. Förvara över natten vid 4 ° C.

Dag 5:

  1. Samla den andra omgången av supernatant; centrifug och filter som i steg 2,8-2,9.
  2. Pool supernatanterna från steg 2,9 och 2,10 i ultracentrifugrör och centrifugera vid 50000 xg i en ultracentrifug under 90 min.
  3. Ta ut kapslar innehållande ultracentrifugrör mycket noggrant och placerades i en huv med laminärt flöde, minnas orienteringen av röret inuti centrifugen.
  4. Öppen kapsel håller ultracentrifugrör och dekantera mediet försiktigt på ett sådant sätt att pelleten är på den övre sidan av röret. Eftersom virala pellets kan vara svårt att visualisera, kom ihåg vadsida av röret en pellet kommer ha bildats. Ta en mikropipett och ta bort sista biten av medel samtidigt noga med att inte röra om ogenomskinliga bruna pellets som är synlig på sidan av botten av ultracentrifugrör.
  5. Resuspendera denna pelleten i 500 | il organoid odlingsmedium kompletterat med 10 mM nikotinamid, 10 pM Chir99021, 10 pM Y27632 och 8 pg / ml polybren. Återsuspension i detta medium är viktig eftersom hög titer viruset används för att Transduct organoids direkt.
  6. Valfritt: frysa viruset i detta medium alikvoterades i två satser om 250 | il i -80 ° C.

3. Lentiviral Transduction av Organoids

Dag 0:

  1. Dela en fullständig 0,95 cm 2 väl av organoids två dagar före transduktion in i en ny brunn, som syftar till att erhålla cirka 50 små organoids. Split organoids enligt tidigare publicerade protokoll 1 (figur 3A, B).
  2. Komplettera organoida odlingsmedium med 10 iM Chir99021 och 10 mM nikotinamid att få cystisk hyper proliferativa kryptor (Figur 3C).
    OBS: Cystisk kryptor utvecklas bäst när nyligen delade organoids odlas i närvaro av Chir99021.

Dag 2:

  1. Harvest organoids genom att pipettera upp och ner på matrigel och mediet och därigenom störa blandningen med en P1000 mikropipett. Placera blandningen i en 15 ml tub.
  2. Disrupt ytterligare med Pasteurpipett i vilken den distala öppningen har minskats genom smältning. Centrifug organoids att pelle under 5 min vid 100 x g.
    OBS: Beroende på storleken av centrifugen, använda en annan centrifughastigheten. Det är nödvändigt att hitta den exakta hastigheten där störde organoids separeras från blandningen.
  3. Avlägsna supernatanten och tillsätt 500 l av förvärmda 1x trypsin (liknande 0,25% trypsin). Resuspendera organoids i trypsin och inkubera3 min i en 37 ° C vattenbad.
  4. Inaktivera trypsin genom tillsats 3,5 ml cellinje odlingsmedium (DMEM med tillsats av 10% FCS, 1% penicillin / streptomycin och glutamin). Centrifugera i 5 minuter vid 500 x g.
  5. Avlägsna supernatanten att lämna pelleten i cirka 20 | il medium. Överför organoids i denna sista lilla mängd av substratet i en brunn på en 48-brunnar platta.
  6. Lägg hög titer lentivirus i transduktion mediet som beskrivs i steg 2.14, resuspendera och fortsätt till steg 3.10. När stöter låg transduktion effektivitet, steg 3,9 sättas.
    OBS: För effektiv transduktion, vanligtvis lägga en alikvot av 250 pl hög titer lentivirus till en brunn i organoids. Detta motsvarar 50% av all skördad lentivirus från en enda produktion som beskrivs i steg 2 i detta protokoll.
  7. Eventuellt: att förbättra transduktion effektivitet, utföra spinoculation genom att sätta de 48 brunnar innehåller organoids i en förvärmda centrifug på 326; C och rotera vid 600 xg under en timme.
  8. Put organoid-virusblandningen i odlingsinkubator och inkubera i 1 timme vid 37 ° C i en odlingsinkubator för att möjliggöra transduktion.
  9. Valfritt: för att ytterligare förbättra transduktion effektivitet, inkubera organoids för ytterligare 3 h vid 37 ° C i en odlingsinkubator.
  10. Tillsätt 1 ml organoid odlingsmedium och resuspendera organoid-virusblandningen överförs i ett mikrocentrifugrör och centrifugera i en mikrocentrifug under 5 min vid 850 xg för att pelletera organoids.
  11. Avlägsna supernatanten och suspendera pelleten i 20 pl iskall matrigel. Eftersom materialet stelnar när det blir varmare, använd pipettspetsar som är kylda med pipettering upp och ned iskall PBS under ett antal gånger.
  12. Placera droppen i mitten av en brunn i en 48 brunnar platta och inkubera i odlingsinkubator vid 37 ° C under 15 min för att stelna.
  13. Efter 15 minuter, tillsätt försiktigt 250 il organoid odlingsmedium kompletterat med10 mM nikotinamid, 10 pM Chir99021 och 10 pM Y27632. Små avbrutna organoid fragment bildas i små cystisk organoids inom 24 timmar.

Dag 5:

  1. Uppdatera medium och komplettera med ett urval antibiotika (för puromycin, använd 4 ug / ml).

Dag 7:

  1. Byt medium för standard organoid odlingsmedium, kompletterat med urvals antibiotika.
    OBS: Spirande kommer att vara komplett 2-3 veckor efter Chir99021 tillbakadragande. Efter valet, kan organoids odlas utan urvals antibiotika.

4. organoid RNA Förberedelse för kvantitativ RT-PCR eller microarray

  1. För RNA-beredning, använda ett kommersiellt kit enligt tillverkarens protokoll. Ta bort mediet från organoids och lägga 350 pl buffert RLT, kompletterat med β-merkaptoetanol rakt på kupolen på Matrigel innehåller organoids. Resuspendera mateal i RLT genom att pipettera hjälp av P1000 mikropipett.
  2. Utför ytterligare RNA prep enligt tillverkarens protokoll.
  3. Eventuellt: öka RNA avkastning genom amplifiering med hjälp Ovation Pico WTA-systemet, som kräver initial effekt på 50 mikrogram totalt RNA enligt tillverkarens protokoll.
  4. Valfritt: för kvalitetskontroll före RNA microarray, köra prover på en 2100 bioanalyzer använder en eukaryot total RNA nano-chip, siktar på en RNA integritetsnummer (RIN) av 8,5 eller mer (Figur 5) enligt tillverkarens protokoll.

5. Bearbetnings Organoids för paraffininbäddning och immunohistokemi

  1. Innan behandling med organoid bädda förväg värma ett aluminiumblock med hål passande 12 mm diameter glasrören i inkubator vid 70 ° C för att hålla paraffinvätska.
  2. Ta en enda brunn med fullvuxna organoids och avlägsna mediet, vilket lämnar de inbäddade organoids intakt.
  3. Tillsätt 1 mlav 4% paraformaldehyd i PBS direkt till väl och fixera vid 4 ° C som helst från en timme till över natten.
  4. Ersätt paraformaldehyd med 1 ml iskall PBS.
    Eventuellt: håll fast organoids i PBS upp till 1 vecka vid 4 ° C efter detta steg.
  5. Resuspendera fasta organoids i 1 ml PBS och placera i glasflaska.
  6. Låt organoids sjunka till botten under 1 min, dekantera PBS och ersätta med 70% etanol, i vilken ett par droppar av eosin lösning löses för att möjliggöra visualisering av organoids hela inbäddning processen.
  7. Lämna organoids i 70% etanol vid rumstemperatur. Efter 30 minuter, ta bort 70% etanol genom att noggrant dekantering, att kunna visualisera organoids genom ögat på grund av svagt rosafärgad eosin färg. Ersätt inbäddning lösning med 96% etanol.
  8. Upprepa steg 5,7, varje gång ersätta den inbäddning lösningen med nästa en. Passera organoids genom följande lösningar därefter: 70% etanol, 90% etanol, 96% etanol, 100% Ethanol, 100% etanol, xylen, xylen.
  9. Dekantera den sista xylen tvätt och häll paraffin i röret. Placera sedan röret omedelbart i pre värmde aluminiumblock vid 70 ° C i 30 min och ersätta paraffinet med ny ren paraffin.
  10. Häll paraffin av och pipet organoids in i paraffin blocket mögel med en förvärmd Pasteurpipett med stor öppning. Håll Pasteurpipett varmt med hjälp av en bunsenbrännare. Placera alla organoids i paraffinblocket mögel i ett litet skikt av flytande paraffin.
  11. Så mycket som möjligt, försök att manipulera alla organoids mot mitten av paraffinblocket formen med hjälp av en uppvärmd dissektion nål. Håll dissektion nål varmt använder bunsenbrännare.
  12. När lokalisering av organoids i formen är tillfredsställande, kokill något stelna paraffinlagret.
  13. Avsluta blocket genom att hälla mer paraffin ovanpå och lägg till en vanlig histologisk inbäddning kassett.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Organoid lentivirala transduktion

Tekniken med organoid transduktion använder lentivirala partiklar beror på korrekt hantering av organoids före och under transduktion. Organoids (figur 3A) odlades och de stördes i enskilda kryptor (figur 3B). Som tidigare rapporterats, dessa ensamstående kryptor, när odlade i närvaro av GSK3 hämmaren Chir99021 blev cystisk kryptor 9 (figur 3C). Därefter organoids trypsiniserades att tillåta penetration av viruspartiklar till enskilda celler. När transducerande celler med Lentiviral partiklar, kan ett antal metoder prövas för att förbättra transduktion effektivitet såsom spinoculation eller långvarig inkubation. Hög titer PGK-eGFP lentivirus användes för att möjliggöra visualisering av transduktion effektivitet genom fluorescerande mikroskopi. Transduktion effekt av organoids med denna plasmid var hög och närmade 100% (Figure 4E, F). Förbättra effektiviteten med hjälp spinoculation (Figur 4A, B) eller långvarig inkubation med lentivirala partiklar (Figur 4C, D) har alltså inte ge ytterligare värde.

RNA-extraktion

Nästa organoids för RNA-extraktion odlades. Fullvuxna organoids skördades som utsattes för gammastrålning eller behandlingskontroll för att visa minskad RNA integritet (Figur 5). Vid bestrålning med 6 Gy, RNA bryts ned och jämfört med kontroll behandlade organoids är RNA integriteten nummer (RIN) reduceras.

Immunohistokemi på paraffin inbäddade organoids

Efter inkubering organoids under 2 timmar i odlingsmedium kompletterat med BrdU ades organoids i formalin fixeras och bearbetas för immunohistokemi (Figur 6). Använda musen anti BrdU kunde proliferativa celler observeras i kryptan-segmäldrar av organoids och inte i den differentierade facket.

Figur 1
Figur 1:. Schematisk bild av lentivirus produktion för organoid transduktion Som skrivet i protokoll del 2, i denna schematiska, är de mest kritiska stegen i virusproduktion representerade med protokollstegnummer och timing.

Figur 2
Figur 2:. Schematisk bild av Lentiviral transduktion av organoids Som skrivet i protokoll del 3, i denna schematiska, är de mest kritiska stegen i organoid transduktion representerad med protokollstegnummer och timing.

Figur 3
Figur 3: Organoids före och under transduction. växer normalt organoids (A) delas upp i tätt växande små organoids (B) som blir cystisk efter inkubation med Chir99021 för ett antal dagar (C). Vid dissociation av dessa organoids använder trypsin, enskilda celler och små klumpar av celler kvar (D) som är omvandlade senare. Scale bar 100 | im.

Figur 4
. Figur 4: Transduktion av organoids använder lentivirala expressionsvektorer bright bilder (A, C, E, G) och fluorescerande bilder (B, D, F, H) från organoids som transfekterades med antingen PGK-eGFP lentivirus (A - F) eller kontrollera lentivirus (G, (A, B), spinoculation endast (C, D) eller inga ytterligare åtgärder för att öka transduktion effekt (E, F), jämfört med kontrollvektor omvandlade organoids, som inte gör det uttrycka EGFP (G, H). Observera att du använder PGK-eGFP lentiviral konstruktion, transduktion effekt inte kraftigt ökade med ytterligare steg. Scale bar 100 | im.

Figur 5 Figur 5:. Representant resultat av RNA preps från organoids på bioanalyzer Notera stark avgränsning av band som representerar hög RNA integritet i körfält 2-4 och smeta runt band på körfält 5-7 representerar log RNA integritet. RNA integritet nummer (RIN) av band 2-4 är 8,7, 9,2 respektive 9, medan tHan RIN band 5-7 är 6,4, 6,6 och 5,5.

Figur 6
Figur 6:. Immunohistokemisk analys av formalinfixerade paraffin inbäddade organoids formalinfixerade paraffininbäddade 4 um sektion av organoids odlade i närvaro av BrdU i två timmar och fixerades därefter. Avsnitt färgas med anti-BrdU antikropp. Skala bar 100 nm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Basiskt medium Tillägg
Cellinje odlingsmedium DMEM 10% FCS
1% penicillin / streptomycin
2 mM Glutamine
Organoid odlingsmedium Avancerad DMEM F12 HEPES
1% penicillin / streptomycin
1x glutamax
1% N2 tillägg
2% B27 tillägg
125 nM N-acetyl cystein
mus-EGF (50 ng / ml)
10% nogen-Fc-konditionerat medium (ekvivalent med 100 ng / ml)
10% Rspo1-Fc-konditionerat medium (ekvivalent med 500 ng / ml)

Tabell 1: Odlingsmedium kompositionen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Den aktuella video protokollet beskriver lentiviral transduktion av organoids från primär tarmepitel och nedströms analys av dessa organoids med kvantitativa RNA tekniker och immunohistokemi.

Lentiviral transduktion utförs ofta i vidhäftande eller flytande celler i odlingsplattor. Eftersom tre-dimensionella strukturen hos organoids gör dem svåra att penetrera genom virala partiklar, är ett antal metoder för att öka effekten används. Förbehandling av organoids använder Chir99021 ökar proliferation och därigenom viabilitet efter transduktion. Det är viktigt att behålla små cellkluster efter trypsinisering, eftersom enskilda celler har minskat överlevnad. I motsats till virus transduktioner använder murina retroviruset, lentivirala transduktioner är mer effektiva och vanligtvis inte kräver spinoculation, en teknik som är känd till ökningar transduktion effekt i ES-celler 10. Vid användning av murina retrovirus eller whsv lentivirala transduktion avkastningen låg effekt, kan spinoculation eventuellt användas för att öka transduktion takt. Vi vet inte regelbundet utvärdera virustiter, eftersom alla tillgängliga virus från en enda runda av produktion för transduktion av organoids härrör från maximalt två 0,95 cm 2 brunnar användes. Dessutom, i allmänhet använder antibiotika val för borttagning av icke-omvandlade celler. Bedömning av viral titer kan dock vara av värde när de stöter på problem med transduktion effektivitet.

Identisk med vidhäftande celler, kan nivån av urvals antibiotikum öka antalet virala integrationer och därmed expression av transgenen. Använda högnivå puromycin (10 | ig / ml) för att erhålla hög transgent uttryck och effektiv knockdown, men när organoids uppvisar tecken på toxicitet, kan lägre halter användas (minimalt 1 | ig / ml). Dessutom kan alternativa antibiotika urvals användas eller val kan utelämnas, även om transduktion sannoliktatt vara ofullständig och det får inte leda till en långsiktig stabil uttryck. Eftersom Lentiviral integration i genomet är heterogen under hela en population av celler, uttryck av transgenen kan dämpa till förändringar efter odling celler för en förlängd tid. Detta kan vara resultatet av selektivt tryck genom uttryck av transgenen. Fastän antibiotikaselektion begränsar dessa förändringar, kan de kvar, i synnerhet i fallet med konstitutivt uttryck av transgener. Denna nackdel kan övervinnas genom enkelcellkloning av organoids, men denna teknik är tidsödande. Lentiviral Transduction kan utföras med en mängd olika plasmider som resulterar i antingen stabila eller inducerbart uttryck av transgener. Dessa transgener uttrycks vanligen från ubiquitous promotorer, såsom CMV eller PGK-promotorn och kan resultera i naturligt uttryck. Liknar transgen uttryck i cancercellinjer eller modelldjur, försiktighet befogat att tolka resultaten tillbakam överuttryck.

För experiment som kräver RNA, det låga antalet livskraftiga celler som normalt odlas i en enda 0,95 cm 2 väl (standard ytarea av 48 brunn) i motsats till vidhäftande celler som lätt kan odlas i stora kolvar är den hastighetsbegränsande faktorn för kvaliteten och mängd nedströms analys. Vi finner att normalt, en enda brunn av ungefär 50 fullvuxna organoids utbyten mellan 0,4 | ig och 1 | ig totalt RNA, som är tillräcklig för kvantitativ RT-PCR och RNA-microarray, utan ytterligare förstärkning. Vissa regimer behandling eller genetiska förändringar kan minska RNA halten betydligt dock. Ett första steg för att öka den totala RNA sammanslagning av flera brunnar.

För paraffininbäddning av organoids, är det viktigt att få tillräckligt material för att visualisera organoids under processen. Tillsats av små mängder av eosin till fasta organoids möjliggör visualisering av organoids under helaprocessen, men krävs inte för normal inbäddning och kan utelämnas när detta steg stör vidare analys. Vanligtvis paraffin inbäddning kassetter har hål i dem för att tillåta flöde av fixermedel och processlösningar till vävnaden i kassetten.

Lentiviral organoid transduktion och förberedelse för efterföljande standardtekniker ökar den vetenskapliga potentialen i dessa kulturer och höjer standarden i cellkultur till tredimensionella tekniker från primär tarmepitelet. Utbudet av experiment nedströms som ska utföras är dock inte begränsad till tekniker som beskrivs i det nuvarande protokollet och kan omfatta alla tekniker som utförs på cellinjer eller möss, med tanke på mängden cellmaterial som genereras av kultur är tillräckligt. I forskning om specifika genetiska element och deras funktion i tarmepitelet, homolog rekombination tekniker i modelldjur, främst möss, förblir guldmyntfoten. Kulturer av organoids görainte innehåller mesenkymala eller immunologisk nischceller och odlade kryptor är ständigt expanderande, kontrasterande den situation som in vivo. Icke desto mindre har dessa kulturer höjt kvaliteten på fynd in vitro mycket och med hänsyn till de otaliga nedströms tekniker som kan utföras, har organoid kultur och kommer att kraftigt förbättra forskningen på tarmepitelet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Polyethylene imine Polysciences 23966-2
DMEM medium Lonza BE12-614F
Fetal calf serum Lonza DE14-801F
Penicillin-streptomycin Invitrogen 15140-122
Glutamin Invitrogen 25030-024
matrigel BD BD 356231
Advanced DMEM-F12 Gibco 12634-010
N2 Invitrogen 17502-048
B27 Invitrogen 17504-044
N-acetyl cysteine Sigma A9165-1G
mouse Egf Invitrogen PMG8045
Hepes 1 M Invitrogen 15630-056
glutamax 100x Invitrogen 35050-038
Chir 99021 Axon 1386
Y27632  Sigma Y0503-5MG
polybrene Sigma 107689
nicotinamide Sigma N0636
Trypsin Lonza BE02-007E
puromycin Sigma P 7255
Rneasy mini kit Qiagen 74106
β-mercaptoethanol Merck 8,057,400,250
Ovation Pico WTA system NuGen 3300-12
paraformaldehyde Sigma 252549-1L
glass vial conical 12 mm x 75 mm 5 ml VWR LSUKM12
Eosin Yellowish VWR 1,159,350,025

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459, (7244), 262-265 (2009).
  2. Al-Nafussi, A. I., Wright, N. A. The effect of epidermal growth factor (EGF) on cell proliferation of the gastrointestinal mucosa in rodents. Virchows Archiv. B, Cell Pathology Including Molecular Pathology. 40, (1), 63-69 (1982).
  3. Haramis, A. P., et al. De novo crypt formation and juvenile polyposis on BMP inhibition in mouse intestine. Science. 303, (5664), 1684-1686 (2004).
  4. Zhao, J., et al. R-spondin1, a novel intestinotrophic mitogen, ameliorates experimental colitis in mice. Gastroenterology. 132, (4), 1331-1343 (2007).
  5. Schwank, G., Andersson-Rolf, A., Koo, B. K., Sasaki, N., Clevers, H. Generation of BAC transgenic epithelial organoids. PLoS One. 8, (10), e76871 (2013).
  6. Koo, B. K., et al. Controlled gene expression in primary Lgr5 organoid cultures. Nature Methods. 9, (1), 81-83 (2012).
  7. Heijmans, J., et al. ER stress causes rapid loss of intestinal epithelial stemness through activation of the unfolded protein response. Cell Rep. 3, (4), 1128-1139 (2013).
  8. Roe, T., Reynolds, T. C., Yu, G., Brown, P. O. Integration of murine leukemia virus DNA depends on mitosis. The EMBO Journal. 12, (5), 2099-2108 (1993).
  9. Lau, W., et al. Lgr5 homologues associate with Wnt receptors and mediate R-spondin signalling. Nature. 476, (7360), 293-297 (2011).
  10. Bahnson, A. B., et al. Centrifugal enhancement of retroviral mediated gene transfer. Journal Of Virological Methods. 54, (2-3), 131-143 (1995).
Ett protokoll för Lentiviral Transduction och Nedströms Analys av Intestinal Organoids
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Van Lidth de Jeude, J. F., Vermeulen, J. L. M., Montenegro-Miranda, P. S., Van den Brink, G. R., Heijmans, J. A Protocol for Lentiviral Transduction and Downstream Analysis of Intestinal Organoids. J. Vis. Exp. (98), e52531, doi:10.3791/52531 (2015).More

Van Lidth de Jeude, J. F., Vermeulen, J. L. M., Montenegro-Miranda, P. S., Van den Brink, G. R., Heijmans, J. A Protocol for Lentiviral Transduction and Downstream Analysis of Intestinal Organoids. J. Vis. Exp. (98), e52531, doi:10.3791/52531 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter