Abstract
الخلايا السرطانية تستجيب إلى matrix صلابة ميكانيكية بطريقة معقدة باستخدام، نظام هرمي للتنسيق والميكانيكية والكيميائية تتألف من مستقبلات الالتصاق والبروتينات المرتبطة الغشاء نقل الإشارة، والهندسة المعمارية هيكل الخلية، والمحركات الجزيئية 1 و 2. Mechanosensitivity الخلايا السرطانية المختلفة في المختبر ل التحقيق في المقام الأول مع خطوط الخلايا خلد أو الفئران المستمدة الخلايا الأولية، وليس مع خلايا سرطانية بشرية الأولية. وبالتالي، لا يعرف إلا القليل عن mechanosensitivity من خلايا سرطان القولون الإنسان الأساسية في المختبر. هنا، تم تطوير بروتوكول الأمثل الذي يصف عزل الخلايا القولون الإنسان الأساسية من العمليات الجراحية عينات الأنسجة البشرية السليمة والسرطانية. خلايا القولون معزولة ثم يتم تربيتها بنجاح في الناعمة (2 كيلو باسكال صلابة) وقاسية (10 كيلو باسكال صلابة) الهلاميات المائية بولي أكريلاميد والبوليسترين جامدة (~ 3.6 جيغا صلابة) ركائز functionalized من قبل المصفوفة خارج الخلية (فبرونيكتينفي هذه الحالة). هي جزء لا يتجزأ بلي الفلورسنت في المواد الهلامية اللينة قرب السطح ثقافة الخلية، ويتم تنفيذ الجر فحص لتقييم الضغوط مقلص الخلوية باستخدام البرمجيات الحرة ومفتوحة. بالإضافة إلى ذلك، المناعي المجهري على ركائز صلابة مختلفة ويوفر معلومات مفيدة عن التشكل الأساسي الخلية، وتنظيم الهيكل الخلوي وvinculin تحتوي على الالتصاقات البؤرية بوصفها وظيفة من الركيزة صلابة.
Introduction
في السنوات الأخيرة أصبح من الواضح بشكل متزايد أن الميكانيكية البيئة الصغيرة، بالإضافة إلى العوامل البيولوجية والكيميائية، ويلعب دورا هاما في تنظيم وظائف الخلية. الخلايا يمكن الشعور والاستجابة للصلابة الركيزة التي تقوم على الالتزام لهم (كما هو الحال في الثقافة 2D) أو تحيط بها (كما في الثقافة 3D) 3-7. بذلك، يمكن خلايا تعدل التمايز بها 3، 4 التشكل، والهجرة / حركية 5، البيولوجية الخصائص الفيزيائية 6، 7 النمو، وغيرها من العمليات.
تستجيب الخلايا السرطانية أيضا إلى 2D و 3D مصفوفة الصلابة باستخدام منسقة الهرمي الجمع والميكانيكية والكيميائية للمستقبلات الالتصاق والبروتينات المرتبطة الغشاء نقل الإشارة، والهندسة المعمارية هيكل الخلية، والمحركات الجزيئية 1، 2. على سبيل المثال، الخلايا الظهارية الثديية (MECs) النموذج العادي حمة عنيبية عندما مثقف على 150 ركائز با مشابه لصلابةنسيج الثدي صحية. ومن المثير للاهتمام، ويحمل بصمات ورم النامية، على حد سواء الهيكلية والنسخي، عندما مثقف على ركائز أكثر صرامة (> 5000 باسكال) التي تحاكي صلابة من سدى الورم 8. بالإضافة إلى ذلك، تظهر تجربة أخرى أن تكون الأورام الثدي يترافق يشابك الكولاجين وECM تشنج 9. وتبين التجارب الحديثة أن سرطان القولون البشري (HCT-8) خلايا عرض ورم خبيث مثل النمط الظاهري (MLP) عندما تكون مثقف على ركائز 2D وجود تصلب ذات الصلة من الناحية الفسيولوجية (20-47 كيلو باسكال)، ولكن ليس على قاسية جدا (3.6 جيد جدا) ركائز 10- 12. هذه الخلايا شكل أول مجموعات الخلايا تشبه الورم ومن ثم تنأى عن بعضها البعض، بدءا من المحيط. لأن هذا الظهارية لتقريب الصرفي (E إلى R الانتقالية) يحدث تغير، فإنها تتكاثر، والحد من خلية خلية وخلية ECM التصاق، وتصبح المهاجرة. HCT-8 الخلايا المستزرعة على ركائز البوليسترين صعبة للغاية لا تظهر هذهالصفات الخبيثة. وبالتالي فقد تم الافتراض أن HCT-8 تصبح الخلايا المتنقل وذلك بسبب تعرضها لمناسبة البيئة الصغيرة. ومن الجدير بالذكر أن هذه التجارب التي أجريت مع خطوط الخلايا السرطانية مخلد أو الفئران المستمدة الخلايا الأولية، وليس مع خلايا سرطانية بشرية الأولية.
تقترح دراسة حديثة أن المعزز الإجهاد الجر الخلوية يمكن أن تستخدم كتوقيع الفيزيائية الحيوية المحتملة للخلايا النقيلي 13. ودراسة ينطوي على قياس قوة الجر لمختلف خطوط الخلايا السرطانية البشرية على المواد الهلامية بولي أكريلاميد. تبين أن الخلايا السرطانية المنتشر يمكن أن تمارس أعلى بكثير الإجهاد الجر مقارنة مع الخلايا غير المنتشر في جميع الحالات (13). ومع ذلك، فإن هذه النتائج تتناقض بشكل مباشر على نتائج الدراسة التي نشرت في وقت سابق على الفئران المستمدة خطوط خلايا سرطان الثدي 14. أيضا، تبرز الدراسة الأخيرة وجود فروق ملحوظة بين الخلايا البشرية مخلد والابتدائية في هيكل الخلية على إعادة المواليةالتنميط البروتين وبقاء الخلية البروتين التعبير (15). وبالتالي، فإنه من المهم إعادة النظر في العديد من فحوصات الفيزيائية الحيوية بما في ذلك الجر للخلايا السرطانية البشرية الأولية. وسوف يعالج مسألة ما إذا كانت الخلايا الأولية ألخص خلد خطوط الخلايا السرطانية الجر الاتجاه.
تم تحسين البروتوكول الموصوفة هنا لعزل الخلايا الأولية البشرية القولون (على حد سواء صحية والسرطانية)، وللزراعة منها على ركائز الناعمة (الهلاميات المائية بولي أكريلاميد)، وكذلك في أطباق بتري. ويستند هذا البروتوكول على الهضم ويترتب على ذلك تفارق الأنزيمية من عينة الأنسجة جراحية في تعليق وحيد الخلية 16. على حد علمنا، وهذا هو أول مظاهرة من زراعة معزولة ورم القولون الابتدائي والخلايا الطبيعية مباشرة على ركائز هيدروجيل لينة مع بلي الفلورسنت المدمجة للالجر الخلوي. ركائز هلام شفاف يسمح أيضا المناعية. وكشف هذا الاختبار الاختلافات في المؤسسة F-أكتين والالتصاقات البؤرية في خلايا القولون البشري الأولية باعتبارها الركيزة التغييرات صلابة. هذه المنصة زراعة الخلايا يفتح إمكانية استكشاف مختلف الخصائص الفيزيائية الحيوية من خلايا الإنسان الأولية مثل تصلب الخلايا والجر كمعلمات لprognostics السرطان.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
البروتوكول هو موضح أدناه يتبع المبادئ التوجيهية لجنة أخلاقيات البحث البشري UIUC.
1. جمع وهضم جراحة الأنسجة عينة
- جمع عينات الأنسجة السرطانية مباشرة بعد استئصال القولون (1A الشكل و1B). جمع الأنسجة من موقع صحي مجاور كذلك.
- نقل الأنسجة على الفور إلى 15 مل قارورة تحتوي على 12 مل HBSS الحل. الحفاظ على قارورة على الجليد داخل مربع رغوة معزول.
- نقل الأنسجة التي تحتوي على قنينة للثقافة غطاء محرك السيارة الأنسجة لمزيد من المعالجة في غضون 45 دقيقة. الحفاظ على قارورة على كتلة الجليد داخل غطاء محرك السيارة.
- صب الأنسجة الموردة إلى لوحة 6 جيدا تحتوي على 6-7 مل من محلول HBSS باستخدام ماصة.
ملاحظة: كمية من الأنسجة لكل بئر ليست حرجة في هذه الخطوة الشطف. - الحفاظ على لوحة 6 جيدا على كتلة الجليد. شطف الأنسجة في حل HBSS مرتين.
- قطع الأنسجة نظيفة إلى أقسام مفصولة SCIS العقيمةسور. اللحم المفروم الأنسجة إلى أقسام أصغر لا تزيد عن 1-2 مم 3 في حجم بشفرة مشرط معقم.
- تزن المسمى 0.1٪ التربسين قارورة (التي تحتوي على 1 مل من 0.1٪ محلول التربسين) قبل نقل الأنسجة. نقل ~ 20 الأنسجة ملغ في كل من 0.1٪ قارورة التربسين مع ماصة.
- محاولة للحد من نقل HBSS في قارورة التربسين لتجنب المزيد من التخفيف من التربسين.
- وزن قارورة التربسين بعد نقل الأنسجة. توثيق الفرق كما كتلة الأنسجة.
- صب ~ 20 ملغ الأنسجة و 1 مل التربسين في كل بئر من 24 لوحة جيدا.
- وضع لوحة جيدا 24 على شاكر في الثلاجة عند 4 درجة مئوية لمدة 16-20 ساعة. خلال هذه الفترة الانتظار أو في وقت سابق، وإعداد بولي أكريلاميد ركائز جل وfunctionalize لهم البروتينات ECM كما هو موضح في القسم 3.
2. الأنزيمية تفكك الأنسجة عينة إلى واحد تعليق خلية وزراعة الخلايا المعزولة على ECM Functionalized مطاطا Substratوفاق وأطباق البوليسترين الصلبة
- بعد 16-20 ساعة من الحضانة في التربسين جيدا في 4 درجات مئوية على شاكر، نقل أنسجة من 4 ° C التربسين إلى 4 درجات مئوية كاملة قارورة وسائط النمو (التي تحتوي على 2-3 مل من وسائط النمو الكامل) باستخدام ماصة. ضمان الحد الأدنى من نقل التربسين إلى وسائط النمو.
ملاحظة: إكمال صياغة وسائط النمو على النحو التالي: RPMI 1640 قاعدة المتوسطة تستكمل مع مصل الحصان إلى تركيز النهائي من 10٪ والبنسلين ستربتومايسين إلى 1٪ من الحل الكلي. - وضع الأنسجة التي تحتوي على قارورة وسائل الإعلام في حمام ماء دافئ عند 37 درجة مئوية لمدة 12-15 دقيقة.
- نقل الأنسجة إلى 15 مل قارورة تحتوي على حل HBSS باستخدام ماصة، ويهز بلطف.
- تكرار 2.3.
- إزالة الأنسجة من HBSS الحل ونقل إلى 0.1٪ محلول كولاجيناز (في HBSS) قارورة تحتوي على 1 مل من محلول. احتضان لمدة 45 دقيقة عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO 2 البيئة في ترطيب حاضنة الثقافة الخلية. خلال فترة الانتظار، growt الدافئح وسائل الإعلام في 15 مل قارورة عند 37 درجة مئوية في حمام مائي.
- سحب جميع أجزاء الأنسجة إلى ماصة التقليل كولاجيناز المرحلة. إخراج مجرد شظايا الأنسجة في قارورة سائل الإعلام والثقافة قبل تحسنت.
- وضع 40 ميكرون فلتر جيدا تضاف إلى كل بئر من لوحة 6 جيدا. بلل تصفية مع 1 مل سائل الإعلام ثقافة الخلية.
- الأنسجة يسحن في وسائل الإعلام مع كوب 10 مل ماصة عدة مرات حتى يتم فصل الأنسجة تماما.
- الحفاظ على طرف ماصة أقرب وقت ممكن لقاعدة القارورة.
- إيداع الحل على فلتر لإزالة الحطام وقطع undissociated.
- أجهزة الطرد المركزي التي تمت تصفيتها تعليق خلية في وسائل الإعلام في 150 x ج لمدة 5 دقائق على RT.
- إزالة طاف بعد ذلك و resuspend بيليه الخلية مع 2 مل سائل الإعلام والثقافة الطازجة.
- عد الخلايا باستخدام عدادة الكريات (إذا لزم الأمر). البذور عزل الخلايا الأولية في المصفوفة خارج الخلية (ECM) المواد الهلامية functionalized وأطباق البوليسترين في التركيز المطلوب.
3. إعداد وFunctionalization من مختلف تصلب بولي أكريلاميد (PA) الهلام والبوليستيرين ركائز
ملاحظة: للحصول على مظاهرة البصرية قسم 3، والمشاهدين / يحال القراء إلى مجلة الأخيرة من التجارب متصور (إن الرب) من المادة 17.
- اعتماد بروتوكولات نشرت 18، 19، 12 مم تفعيل 2 غطاء زجاجي ينزلق كيميائيا لضمان التساهمية ملزم من هيدروجيل.
- أولا، غطاء زجاجي ينزلق معاملتهم مع 3- Aminopropyltrymethoxysilane (ATS) لمدة 7 دقائق على RT.
- إزالة ATS تماما مع DI شطف المياه ومعالجة غطاء ينزلق مع 0.5٪ غلوتارالدهيد (المخفف في برنامج تلفزيوني من 70٪ محلول المخزون غلوتارالدهيد) حل لمدة 30 دقيقة.
- الحصول على 2 كيلو باسكال حلول هلام عن طريق خلط 5٪ ث / ت حل الأكريلاميد و 0.05٪ N، -methylenebisacrylamide (مكرر) حل N 'في المياه المالحة 10 ملي HEPES مخزنة-20. استخدام 8٪ ث / ت الأكريلاميد و 0.13٪ N، -methylenebisacrylamide (مكرر) حل N 'في 10 المالحة ملي HEPES مخزنة لمدة 10 كيلو باسكال هلام 20.
- في كلتا الحالتين، استخدم 1: 200 فوق كبريتات الأمونيوم (10٪ ث / ت) و 1: 2000 N، N، N '، N' -tetramethylethylenediamine (TEMED) باعتباره المبادر والمحفز لعملية البلمرة، على التوالي.
- أيضا، إضافة 100 الخرز ميكرولتر فلوري إلى 2 كيلو باسكال حل هلام كعلامات الائتمانية 21، 22.
- إيداع قطرة 20 ميكرولتر قبل البوليمر PA حل الجل على 12 مم 2 تنشيط الغطاء الزجاجي الانزلاق. وضع آخر 12 مم 2 منتظم زلة غطاء زجاجي على الهبوط. تأكد من أن انخفاض ينتشر بين زلات غطاء بسبب الشعرية. عكس شطيرة ل2 المواد الهلامية كيلو باسكال لضمان أن معظم من الخرز تأتي بالقرب من سطح خلية ثقافة.
- علاج هلام السلطة الفلسطينية لمدة 45 دقيقة في RT.
- تقشر أعلى زلة غطاء باستخدام حافة شفرة حلاقة واحدة.
ملاحظة: أثناء تقشير، مفرزة العائدات من حافة واحدةمن الساندويتش. يبقى جل ملتصقة على شريحة زجاجية تفعيلها. - تخزين المواد الهلامية في حل PBS قبل الاستخدام.
- Functionalize المواد الهلامية PA والزجاج مع جزيئات ECM، فبرونيكتين الإنسان بتركيز 50 ميكروغرام / مل الطرق التالية نشرت 23.
- لفترة وجيزة، واحتضان ركائز مع 2 مل نقية هيدرات الهيدرازين O / N.
- إزالة هيدرات الهيدرازين وشطف ركائز جيدا بالماء DI.
- غسل ركائز مع حمض الخليك 5٪ لمدة 30 دقيقة.
- إزالة حمض الخليك وشطف ركائز جيدا بالماء DI.
- الحفاظ على ركائز مغمورة في الماء DI لمدة 30 دقيقة.
- احتضان ركائز مع فبرونيكتين المؤكسد لمدة 35 دقيقة في تركيز 50 ميكروغرام / مل.
- شطف ركائز مع برنامج تلفزيوني على شاكر في انخفاض دورة في الدقيقة لمدة 10 دقيقة.
- احتضان كل ركائز عند 37 درجة مئوية في 2-3 مل سائل الإعلام والثقافة لمدة 30 دقيقة قبل طلاء الخلايا.
ملاحظة: لوحة الخلايا في البرامج شعبية قليلةد بطريقة (1،000-3،000 خلية / سم 2). يحتاج كل الزجاج الانزلاق غطت جل لتكون واردة في طبق بيتري 35 ملم. تسمح للخلايا التمسك تماما قبل أي المجهر (على الأقل O / N).
4. قوة الجر المجهري والمناعي المجهري فحوصات
- قوة الجر المجهري الفحص
- دافئ 0.25٪ التربسين-EDTA / 10٪ SDS الحل عند 37 درجة مئوية في حمام مائي لمدة 10 دقيقة قبل أن تبدأ التجارب الجر.
- إزالة جل واحدة من الحاضنة زراعة الخلايا في وقت ومكان على الفلورسنت المقلوب مرحلة المجهر (32X التكبير).
- العثور على خلية واحدة في مجال الرؤية. إزالة غطاء صحن بيتري.
- التقاط صورة النقيض من المرحلة الخلية (على سبيل المثال، الشكل 3).
- تشغيل وضع التصوير لمضان وتحديد المرشح المناسب. لا تتحرك المرحلة المجهر أو عينة خلال هذا الوقت.
- التقاط صورة من الخرز الفلورسنت displacإد بواسطة الجر الخلوية (الشكل 4C).
- إضافة 1 مل التربسين / SDS حل لطبق بيتري لفصل الخلايا من هلام. لا تتحرك المرحلة المجهر أو عينة خلال هذا الوقت. أيضا، التقاط صورة السيطرة على خلية لضمان إزالة كاملة من هلام.
- تأخذ إشارة (قوة فارغة) صورة من الخرز بعد إزالة الخلية.
- كرر الخطوات 4.1.2-4.1.8 لجميع المواد الهلامية الأخرى.
- جعل كومة الصورة باستخدام يماغيج من الصورتين المكتسبة في الخطوة 4.1.6 و4.1.8 لكل حالة. لتوليد صورة كومة، استخدم التسلسل التالي من الأوامر في يماغيج بعد فتح الصور: صورة → → الأكوام الصور إلى كومة.
- للحصول على مجال النزوح والجر، واستخدام الإضافات يماغيج نفذ نشرت 21، 22 الحصول على رموز والدروس التفصيلية لهذه الإضافات باستخدام الرابط التالي:. https://sites.google.com/site/qingzongtseng/imagejplugins.
- محاذاة الصور في كومة باستخدام 'مطابقة قالب' البرنامج المساعد. استخدام التالية سلسلة من الأوامر في يماغيج بعد فتح مكدس صورة إنشاؤها في الخطوة 4.1.10: الإضافات → قالب مطابقة → محاذاة شرائح في كومة → OK. حفظ الصورة كومة بالتالي. استخدام هذه الصورة كومة الجديد في الخطوات التالية.
- الحصول مجال النزوح باستخدام التعريف الشخصي (الجسيمات velocimetry صورة) المساعد (الشكل 4D). استخدام التالية سلسلة من الأوامر بعد فتح مكدس الصورة المحفوظة في خطوة 4.1.11.1: الإضافات → → التعريف الشخصي التكرارية التعريف الشخصي (الأساسية) → → OK قبول هذا التعريف الشخصية والمخرجات → طيب. حفظ الإخراج التعريف الشخصي في نفس الدليل كما في الصورة كومة الأصلي. استخدام هذا كمدخل في الخطوة التالية.
- أخيرا استخدام FTTC (تحويل فورييه الجر الخلوي) المساعد الآن الحصول علي خريطة الجر (الشكل 4E). استخدام التسلسل التالي من الأوامر: الإضافات → FTTC → الوظائفERT خصائص المواد، أي معامل يونغ، ونسبة بواسون من PA هلام → → OK اختر ملف الإخراج التعريف الشخصية المحفوظة في خطوة 4.1.11.2 → OK. نتائج البحث حفظ FTTC في نفس الدليل كما في كومة الصورة والإخراج التعريف الشخصي.
- المناعي المجهري فحوصات
- اتخاذ ركائز أن immunostained إلى غطاء محرك السيارة الصفحي وإزالة وسائل الإعلام الثقافة.
- شطف ركائز مع برنامج تلفزيوني وإصلاح الخلايا مع بارافورمالدهيد 4٪ في برنامج تلفزيوني لمدة 20 دقيقة في RT.
- غسل ركائز مع برنامج تلفزيوني لمدة 3 مرات (5 دقائق في كل مرة). ونتيجة لذلك، واحتضان ركائز مع 500 ميكرولتر إشارة محسن لمدة 30 دقيقة ويشطف مع برنامج تلفزيوني.
- احتضان الخلايا مع وحيدة النسيلة الأجسام المضادة لمكافحة vinculin في 1: 250 التخفيف في برنامج تلفزيوني لمدة 45 دقيقة في RT. غسل ركائز مع برنامج تلفزيوني لمدة 3 مرات (5 دقائق في كل مرة).
- احتضان العينات مع الأجسام المضادة الثانوية اليكسا فلور 488 الماعز المضادة للماوس مفتش في 1: 200 التخفيففي برنامج تلفزيوني في RT لمدة 30 دقيقة. غسل ركائز مع برنامج تلفزيوني لمدة 3 مرات (5 دقائق في كل مرة).
- لتصور هيكل F-الأكتين، واحتضان الخلايا مع TRITC phalloidin تقارن بتركيز 50 ميكروغرام / مل لمدة 45 دقيقة في RT. غسل ركائز مع برنامج تلفزيوني لمدة 3 مرات (5 دقائق في كل مرة).
- صورة العينات باستخدام المجهر متحد البؤر المسح بالليزر (الشكل 5A - 5D).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
ويعمل البروتوكول المذكورة أعلاه بنجاح للحصول على عينات الأنسجة المتعددة (ن = 12) من أربعة مرضى مختلفة في إطار المبادئ التوجيهية للمجلس المراجعة المؤسسية. ويوضح الشكل 1A ورم القولون والمستقيم ممثل الحق بعد الجراحة التي يتم الحصول على أقسام الأنسجة لمزارع الخلايا. ويرد قسم الأنسجة نموذجية في HBSS حل بعد نقلها إلى غطاء محرك السيارة الصفحي لمزيد من المعالجة في الشكل 1B. ويرد التخطيطي للهضم والتفكك الأنزيمي من عينة الأنسجة جراحية في تعليق خلية واحدة في الشكل 2.
بعد نجاح تفكك النسيج، هي المصنفة الخلايا البشرية الأولية معزولة على المواد الهلامية السلطة الفلسطينية وأطباق البوليسترين. الميكروسكوب الطوري (3A الشكل و3B) توضح التشكل التمثيلي الأساسي سرطان القولون البشري والخلايا الطبيعية بوصفها وظيفة من الركيزة صلابة. ومن الواضح أنخلايا القولون الأساسي (على حد سواء صحية والسرطانية) انتشرت أكثر على أطباق البوليسترين بالمقارنة مع المواد الهلامية PA (الشكل 3A و 3B).
يتم إجراء فحوصات الجر على ECM (فبرونيكتين) المغلفة لينة 2 المواد الهلامية كيلو باسكال بعد التأكد من غدية الغازية من المرضي H & E تلطيخ (الشكل 4A). والمغلفة المواد الهلامية السلطة الفلسطينية بشكل موحد مع فبرونيكتين كما هو مبين في الشكل 4B. لسهولة المقارنة، ينبغي إجراء جميع التجارب الجر للورم وخلايا القولون صحية في نفس الوقت. ويبين الشكل 4C لقطة من الخرز الفلورسنت النانوية جزءا لا يتجزأ من داخل هلام. من الصور النازحين والمرجعية حبة، يتم الحصول على حقول النزوح باستخدام البرنامج المساعد يماغيج التعريف الشخصي 21 و 22. يتم عرض تمثيلي مجال التشريد حبة التي تولدها الخلايا السرطانية القولون الغازية على 2 كيلو باسكال جل في الشكل 4D. ويبين الشكل 4E الجر تعزيز بنية الشعحصلت SS باستخدام يماغيج FTTC المساعد المقابلة للنزوح الميدانية في الشكل 4D 21، 22.
ويبين الشكل 5 F-الأكتين وvinculin تحتوي على التصاقات تنسيق خلايا القولون البشري الأولية على لينة 2 المواد الهلامية كيلو باسكال وركائز البوليسترين جامدة. لم يكن الألياف الأكتين الحالي في أقل انتشار الخلايا على المواد الهلامية اللينة (الشكل 5A1 - 5A2). منقط vinculin تحتوي على الالتصاقات البؤرية موجودة على المواد الهلامية اللينة (الشكل 5B1 - 5B2). على العكس من ذلك، تظهر الخلايا الأولية التشكل انتشارها بشكل جيد، ألياف الأكتين الإجهاد واضحة المعالم والتصاقات منفصلة ممدود التنسيق على ركائز صلبة البوليسترين (أرقام 5C - 5D).
الشكل 1. (A) ورم القولون بعد استئصال. أقسام (B) نسيج من الورم لعزل الخلية. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2. تخطيطي لعملية الهضم والتفكك الأنزيمي من عينة الأنسجة جراحية في تعليق خلية واحدة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3. الناجحة زراعة الخلايا القولون البشري الابتدائية (كل من السرطان وطبيعية) على المواد الهلامية صلابة مختلفة وعلى البوليسترين طبق وتظهر الصور المرحلة المقابل تايمورفولوجيا pical من (A) خلايا الورم و (ب) الخلايا الطبيعية على ركائز صلابة مختلفة. يرجى النقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
الرقم 4. (A) H & E تلطيخ يؤكد غدية الغازية. (B) [فيبرونكتين تلطيخ يكشف عن أن المواد الهلامية والمغلفة بشكل موحد مع جزيئات ECM. حبات (C) النانو جزءا لا يتجزأ من داخل هلام كعلامات الائتمانية. (D) مجال النزوح الممثل الناتجة عن الخلايا السرطانية على لينة هلام PA باستخدام التعريف الشخصي المساعد في يماغيج كما هو موضح في 4.1.11.2. (E) الإجهاد الجر التي تبذلها الخلايا السرطانية على هلام لينة المقابلة للنزوح الميدانية في (D) التي تم الحصول عليها عن طريق FTTC المكونات في في يماغيج كما هو موضح في 4.1.11.3. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
وكان الرقم 5. مناعي تلطيخ F-الأكتين وvinculin على هلام لينة وعلى ركائز البوليسترين الصلبة لا ألياف الأكتين الحالي في أقل انتشار (A1) الخلايا السرطانية أو (A2) الخلية الطبيعية على لينة 2 المواد الهلامية كيلو باسكال. منقط vinculin تحتوي على الالتصاقات البؤرية موجودة على المواد الهلامية اللينة (B1 - B2). على العكس من ذلك، تظهر الخلايا الأولية التشكل انتشارها بشكل جيد، ألياف الأكتين الإجهاد واضحة المعالم (C1 - C2) والالتصاقات البؤرية ممدود منفصلة (D1 - D2) على ركائز البوليسترين جامدة.2 / 52532fig5large.jpg "الهدف =" _ فارغة "> اضغط هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
وقد ظهرت الإجهاد الجر الخلوية مؤخرا كمؤشر الفيزيائية الحيوية المحتمل للدولة النقيلي 13. ومع ذلك، لا توجد بيانات الجر تجريبية مع خلايا الورم الرئيسي موجود في الأدب حتى الآن. أيضا، لا يتم الإبلاغ عن زراعة خلايا القولون مباشرة الأساسي معزولة على مختلف المواد الهلامية صلابة بولي أكريلاميد حتى الان. وبالتالي، فإننا إنشاء الأمثل القولون الأساسي الظروف ثقافة الخلية على المواد الهلامية والبوليسترين (الشكل 2). بلي الفلورسنت التغليف بالقرب من سطح زراعة الخلايا خلال إعداد هلام لينة يمكن قياس مجال النزوح والجر التي تولدها خلايا الإنسان الأولية (الشكل 4C، 4D و4E). بالإضافة إلى ذلك، يمكن أن المقايسات المناعي توفر معلومات هامة بشأن تنظيم الهيكل الخلوي والالتصاقات البؤرية عن التغيرات الركيزة صلابة (الشكل 5A - 5D). لاحظ أن السرطان المختلفة والخلايا خلد العاديةخطوط تظهر أيضا زدت الانتشار، الأكتين تشكيل حزمة التوتر وتنضج الالتصاقات البؤرية ممدود مع زيادة صلابة الركيزة 4، 24-25.
بروتوكول يمكن اعتمادها بسهولة / تعديل لعزل الخلايا الأولية من الأنسجة الجراحية المختلفة بالأعضاء البشرية أو غيرها من الحيوانات. فترة حضانة من الأنسجة في عوامل التفكك - التربسين وكولاجيناز - يحتاج إلى أن يكون الأمثل تجريبيا لكل تطبيق. وبالإضافة إلى ذلك، فإن حجم فلتر لإزالة الحطام وقطع الأنسجة undissociated هو أيضا معيارا هاما للاختيار على أساس الحجم المتوقع أقصى خلية في دولة مع وقف التنفيذ (40 ميكرون في هذا البروتوكول).
واحد الحد من هذه الطريقة أن عدد قليل من المواد الهلامية اللينة قد تفتقر توطين ثابت من الخرز الفلورسنت بالقرب من سطح خلية ثقافة (القسم 3.3) والتي قد تؤثر سلبا على الجر التالية الخلوي القياسات (القسم 4.1). هذا يمكن التحايل بسهولة عن طريق فحصسطح هلام لكثافة حبة والتوزيع باستخدام المجهر الفلورسنت قبل ثقافة الخلية. ونتيجة لذلك، والهلام مع توزيع حبة نسبيا غير متجانسة يمكن التخلص منها. نهج آخر هو استخدام الطريقة المقترحة مؤخرا التي تتيح توطين دقيقة من الخرز بالقرب من سطح خلية ثقافة 17.
وينبغي اتخاذ الحذر لبدء معالجة العينات الجراحية في أقرب وقت ورودها، ويفضل في غضون 45 دقيقة. الخطوة الأكثر أهمية في البروتوكول هي المرة التعرض الأمثل للنسيج في حل التربسين وكولاجيناز لتحقيق العائد العزلة، ولكن الحفاظ على بقاء الخلية كافية. قبل زرع الخلايا على الهلاميات المائية لينة، وكثافة حبة والتوزيع يحتاج إلى تأكيد باستخدام المجهر الفلورسنت. أيضا، تحتاج الى صورة القوة فارغة يتم الحصول عليها بعد التأكد من أن الخلية منفصل تماما عن سطح هلام.
باختصار، يوصف البروتوكول الذي إعادةsults فصل الخلايا واحد من تعليق الجراحية السرطانية عينة الأنسجة / العادية. هذه العزلة من الخلايا السرطانية الأولية واحدة من العينات الجراحية تليها ثقافتهم على ركائز المادية وغير المادية تسمح مختلف القياسات الفيزيائية الحيوية المصب، على سبيل المثال، وصلابة الخلية باستخدام AFM، الريولوجيا الخلايا باستخدام الجزيئات microinjected، خلية الهجرة / الحركة، وتحليل ديناميات الحويصلة. ويمكن استخدام هذه القياسات بالنسبة لتشخيص سرطان. وقد تم استخدام بروتوكول بنجاح لاستخراج وثقافة العضلية الفئران وكذلك 26. الطريقة المعروضة هنا يمكن أن تستخدم لعزل الخلايا البشرية الأولية من الأنسجة الجراحية من مختلف الأجهزة والثقافة بشكل مباشر على الصخور صلابة مختلفة للدراسات mechanobiology.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| HBSS | Life technologies | 14175-095 | |
| PBS | Lonza | 17-516F | |
| Trypsin | Worthington | LS003736 | |
| Collagenese | Worthington | LS004176 | |
| 3- Aminopropyltrymethoxysilane (ATS) | Sigma-Aldrich | 281778 | |
| Glutaraldehyde | Polysciences, Inc. | 01201-5 | |
| Acrylamide | Sigma-Aldrich | A4058 | |
| N-methylenebisacrylamide (bis) | Sigma-Aldrich | M1533 | |
| HEPES buffer solution | Sigma-Aldrich | 83264 | |
| Ammonium persulfate | Bio-Rad | 161-0700 | |
| Human fibronectin | BD biosciences | 354008 | |
| Hydrazine hydrate | Sigma-Aldrich | 18412 | Hazardous |
| Acetic acid | Sigma-Aldrich | A6283 | |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | RT15710 | |
| Signal enhancer | Life technologies | I36933 | |
| Monoclonal anti vinculin antibody | Sigma-Aldrich | V9131 | |
| Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG | Life technologies | A11001 | |
| TRITC phalloidin conjugates | Sigma-Aldrich | P1951 | |
| 0.1 µm fluroscent beads | Life technologies | F8801 | |
| 0.25% Trypsin-EDTA | Life technologies | 25200-056 | |
| Materials | |||
| 12 mm2 glass cover slips | Corning | 2865-12 | |
References
- Ingber, D. E. Can cancer be reversed by engineering the tumor microenvironment. Semin. Cancer Biol. 18, 356-364 (2008).
- Kumar, S., Weaver, V. M. Mechanics, malignancy, metastasis: the force journey of a tumor cell. Cancer Metastasis Rev. 28, 113-127 (2009).
- Engler, A. J., Sen, S., Sweeney, H. L., Discher, D. E. Matrix elasticity directs stem cell lineage specification. Cell. 126, 677-689 (2006).
- Yeung, T., et al. Effects of substrate stiffness on cell morphology, cytoskeletal structure, and adhesion. Cell Motil. Cytoskeleton. 60, 24-34 (2005).
- Pelham, R. J., Wang, Y. L. Cell locomotion and focal adhesions are regulated by substrate flexibility. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 94 (25), 3661-3665 (1997).
- Solon, J., Levental, I., Sengupta, K., Georges, P. C., Janmey, P. A. Fibroblast adaptation and stiffness matching to soft elastic substrates. Biophys. J. 93, 4453-4461 (2007).
- Wang, H. B., Dembo, M., Wang, Y. L. Substrate flexibility regulates growth and apoptosis of normal but not transformed cells. Am. J. Physiol. Cell. Physiol. 279, 1345-1350 (2000).
- Paszek, M. J., et al. Tensional homeostasis and the malignant phenotype. Cancer Cell. 8, 241-254 (2005).
- Levental, K. R., et al. Matrix crosslinking forces tumor progression by enhancing integrin signaling. Cell. 139, 891-906 (2009).
- Tang, X., et al. Mechanical force affects expression of an in vitro metastasis-like phenotype in HCT-8 cells. Biophys. J. 99, 2460-2469 (2010).
- Ali, M. Y., Saif, M. T. A. Substrate Stiffness Mediated Metastasis Like Phenotype of Colon Cancer Cells is Independent of Cell to Gel Adhesion. Cell. Mol. Bioeng. , (2014).
- Ali, M. Y., Chuang, C. Y., Saif, M. T. A. Reprogramming cellular phenotype by soft collagen gels. Soft Matter. , (2014).
- Kraning-Rush, C. M., Califano, J. P., Reinhart-King, C. A. Cellular traction stresses increase with increasing metastatic potential. PLoS ONE. 7 (2), e32572 (2012).
- Indra, I., Undyala, V., Kandow, C., Thirumurthi, U., Dembo, M., Beningo, K. A. An in vitro correlation of mechanical forces and metastatic capacity. Phys. Biol. 8 (1), (2011).
- Alge, C. S., Hauck, S. M., Priglinger, S. G., Kampik, A., Ueffing, M. Differential protein profiling of primary versus immortalized human RPE cells identifies expression patterns associated with cytoskeletal remodeling and cell survival. J. Proteome Res. 5 (4), 862-878 (2006).
- Oikonomou, E., Kothonidis, K., Zografos, G., Nasioulas, G., Andera, L., Pintzas, A. Newly established tumourigenic primary human colon cancer cell lines are sensitive to TRAIL-induced apoptosis in vitro and in vivo. Br. J. Cancer. 97 (1), 73-84 (2007).
- Knoll, S. G., Ali, M. Y., Saif, M. T. A. A novel method for localizing reporter fluorescent beads near the cell culture surface for traction force microscopy. J. Vis. Exp. (91), (2014).
- Wang, Y. L., Pelham, R. Preparation of a flexible, porous polyacrylamide substrate for mechanical studies of cultured cells. Methods in Enzymology. 298, 489-496 (1998).
- Tang, X., Ali, M. Y., Saif, M. T. A. A novel technique for micro-patterning proteins and cells on polyacrylamide gels. Soft Matter. 8, 3197-3206 (2012).
- Tse, J. R., Engler, A. J. Preparation of hydrogel substrates with tunable mechanical properties. Current Protocols in Cell Biology. , 10-16 (2010).
- Tseng, Q., et al. Spatial organization of the extracellular matrix regulates cell–cell junction positioning. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 109 (5), 1506-1511 (2012).
- Chopra, A., et al. Augmentation of integrin-mediated mechanotransduction by hyaluronic acid. Biomaterials. 35 (1), 71-82 (2014).
- Damljanovic, V., Lagerholm, B. C., Jacobson, K. Bulk and micropatterned conjugation of extracellular matrix proteins to characterized polyacrylamide substrates for cell mechanotransduction assays. Biotechniques. 39 (6), 847-851 (2005).
- Tilghman, R. W., et al. Matrix rigidity regulates cancer cell growth and cellular phenotype. PLoS ONE. 5 (9), e12905 (2010).
- Ulrich, T. A., de Juan Pardo, E. M., Kumar, S. The mechanical rigidity of the extracellular matrix regulates the structure, motility, and proliferation of glioma cells. Cancer Res. 69, 4167-4174 (2009).
- Williams, B. J., Anand, S. V., Rajagopalan, J., Saif, M. T. A. A self-propelled biohybrid swimmer at low Reynolds number. Nat. Commun. 5, (2014).
