Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Bioengineering

Выделение первичных клеток человека Колон опухоль из хирургических тканей и культивирование их прямо на мягкий эластичный субстратов для тяговых цитометрии

doi: 10.3791/52532 Published: June 4, 2015

Abstract

Раковые клетки реагируют на механическую жесткость матрицы сложным образом с помощью скоординированный иерархическую механо-химическую систему, состоящую из рецепторов адгезии и связанные сигнальной трансдукции мембранных белков, архитектуру цитоскелета и молекулярные двигатели 1, 2. Механоре- различных раковых клеток в пробирке исследовали в первую очередь с иммортализованных клеточных линий или мышиных получены первичные клетки, а не с первичными раковых клеток человека. Следовательно, очень мало известно о механоре- первичных человеческих клеток рака толстой кишки в пробирке. Здесь оптимизирован протокол разработан, что описано выделение первичных человеческих клеток толстой кишки у здоровых и раковых хирургических образцов тканей человека. Изолированные толстой кишки клетки затем культивируют успешно на мягкие (2 кПа жесткость) и жесткой (10 кПа жесткость) полиакриламидные гидрогели и жесткого полистирола (~ 3.6 ГПа жесткость) субстратов функционализованных внеклеточного матрикса (фибронектинв этом случае). Флуоресцентные микросферы, внедренные в мягких гелей вблизи поверхности клеточной культуры, и тяги анализ выполняется для оценки клеточных напряжений сократительные помощью бесплатного программного обеспечения с открытым доступом. Кроме того, иммунофлюоресценции микроскопии на различных подложках жесткости обеспечивает полезную информацию о первичной клеточной морфологии, цитоскелета и винкулина содержащей фокальные адгезии как функцию жесткости подложки.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

В последние годы она становится все более очевидным, что механическое микро-среды, в дополнение к био-химических факторов, играет важную роль в регуляции клеточных функций. Клетки могут воспринимать и реагировать на жесткости подложки, на которой они придерживались (как в 2D культуры) или в окружении (например, в 3D культуры) 3-7. Поступая таким образом, клетки могут модулировать их дифференциацию 3, 4, морфологию миграции / моторику 5, био-физических свойств 6, 7, рост и другие процессы.

Раковые клетки также реагируют на матрицы жесткости 2D и 3D, используя скоординированный, иерархическую механо-химическую комбинацию рецепторов адгезии и трансдукции сигнала, связанные мембранные белки, архитектуру цитоскелета и молекулярные моторы 1, 2. Например, эпителиальных клеток молочной железы (МИК) образуют нормальную паренхиму ацинарных при культивировании на 150 Па субстратов, что похожа на жесткостьздорового ткани молочной железы. Интересно, что они проявляют признаки развивающейся опухоли, как структурные, так и транскрипционные, при культивировании на жестких подложек (> 5000 Па), которые имитируют жесткость опухоли стромы 8. Кроме того, еще один эксперимент показывает, что рак молочной канцерогенез сопровождается коллагена сшивание и ЕСМ жесткости 9. Недавние эксперименты показывают, что карциномы толстой кишки человека (НСТ-8) клетки обладают метастазы, как фенотип (MLP), когда они культивируют на 2D подложек, имеющих физиологически соответствующую жесткость (20-47 кПа), но не на очень жесткой (3,6 ГПа) субстраты 10- 12 которые пребывают клетки первой форме опухолевидные кластеры клеток и затем отделить друг от друга, начиная от периферии. Как этого эпителия к округлой морфологического (Е к R перехода) происходит изменение, они размножаются, уменьшить клетка-клетка и клетка-ECM адгезию, и стать миграционная. НСТ-8 клетки культивировали на очень жестких полистирольных подложках не обладают этимизлокачественные черты. Таким образом, была выдвинута гипотеза, что НСТ-8 метастатической клетки становятся из-за их воздействия соответствующей микросреде. Стоит отметить, что эти эксперименты проводились с иммортализованных клеточных линий рака или мышиных получены первичные клетки, а не с первичными раковых клеток человека.

Недавнее исследование предполагает, что дополненной сотовой тяги стресс может быть использован в качестве потенциального биофизической подписи для метастатических клеток 13 .The исследование включает измерение силы тяги для различных линий раковых клеток человека на полиакриламидном геле. Установлено, что метастатические раковые клетки могут оказывать значительно большее тяговое усилие по сравнению с не-метастатических клеток во всех случаях 13. Тем не менее, эти результаты прямо противоречат ранее опубликованные выводы о мышиных получены линии клеток рака молочной железы 14. Кроме того, недавнее исследование подчеркивает замечательные различия между иммортализованных и первичных клеток человека в их цитоскелета реконструкции проTein профилирование и экспрессии белка выживания клеток 15. Следовательно, важно, чтобы повторно многие из биофизических анализов, включая тяги для первичных раковых клеток человека. Это будет решать вопрос первичные клетки воспроизводят ли увековечен клеточных линий рака тяги тенденцию.

Протокол, описанный здесь, оптимизирована для выделения первичных человеческих клеток толстой кишки (как здоровых, так и раковых), и для их культивирования на мягких подложках (полиакриламидных гидрогелей), а также на чашках Петри. Протокол основан на пищеварение и, как следствие ферментативной диссоциации хирургического образца ткани в одной клеточной суспензии 16. По нашим сведениям, это первая демонстрация культивирования изолированных первичной опухоли толстой кишки и нормальные клетки непосредственно на мягких гидрогелевых субстратов со встроенными люминесцентными микросфер для тяги цитометрии. Прозрачные гелевые подложки также позволяют иммуноокрашивания. Этот анализ показал, различия в F-актин организации ифокальные адгезии в первичных человеческих клеток толстой кишки, как изменения субстрат жесткости. Эта ячейка культуры платформа открывает возможность изучения различных биофизических свойств первичных человеческих клеток, таких как жесткость клеток и тяги в качестве параметров для прогнозирования рака.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Протокол, описанный ниже следующим рекомендациям UIUC человек исследовательские комитета по этике.

1. Сбор и пищеварение хирургической образец ткани

  1. Соберите образец опухолевой ткани сразу после двоеточия резекции (рис 1А и 1В). Соберите ткань от соседнего здорового сайт.
  2. Передача ткани сразу к 15 мл флакон, содержащий 12 мл раствора HBSS. Держите флакон на льду внутри изолированной коробкой пены.
  3. Транспортировать ткани, содержащий флакон с культурой капотом ткани для дальнейшей переработки в пределах 45 мин. Держите флакон на ледяной блок внутри капота.
  4. Налейте в комплект поставки ткани в 6-луночного планшета, содержащего 6-7 мл раствора HBSS с помощью пипетки.
    Примечание: количество ткани на лунку не является критическим в этом полоскания.
  5. Держите тарелку 6 а на ледяную глыбу. Промойте ткань в растворе HBSS в два раза.
  6. Вырезать ткани чисто в разделенных секций с стерильных SCISСор. Фарш ткани на меньшие части не более 1-2 мм 3 в размере стерильным скальпелем лезвия.
  7. Взвесить меченого 0,1% трипсин, содержащий флакон (1 мл 0,1% раствора трипсина) перед передачей ткани. Передача ~ 20 мг ткани в каждом из 0,1% трипсина флаконах с пипеткой.
  8. Постарайтесь свести к минимуму передачу ССРХ в трипсин флакон, чтобы избежать дальнейшего разведения трипсина.
  9. Взвесьте трипсина флаконов после передачи ткани; документировать разницу в качестве массы ткани.
  10. Налейте ~ 20 мг ткани и 1 мл трипсина в каждую лунку 24-луночного планшета.
  11. Поместите 24-луночного планшета на шейкере в холодильнике при 4 ° С в течение 16-20 ч. В течение этого периода ожидания или в более раннее время, подготовить гель субстраты полиакриламидные и функционализации их ECM белков, как описано в разделе 3.

2. Ферментативный диссоциации образец ткани в одну ячейку Подвеска и культивирования изолированных клеток на ECM функционализированных упругой SubstratES и жесткого полистирола Блюда

  1. После 16-20 часов инкубации в трипсина и при 4 ° С на шейкере, передачи ткани от 4 ° C трипсина до 4 ° C полного роста медиа-флаконе (содержащую 2-3 мл полной среды роста) с помощью пипетки. Убедитесь, минимальный передачу трипсина в питательных средах.
    Примечание: Комплект препарат ростовую среду заключается в следующем: RPMI 1640, базовая среда с добавлением лошадиной сыворотки до конечной концентрации 10% и пенициллин-стрептомицина до 1% от всего раствора.
  2. Поместите ткань, содержащую медиа флакон в теплой водяной бане при 37 ° С в течение 12-15 мин.
  3. Передача ткани в 15 мл флакон, содержащий раствор HBSS помощью пипетки, слегка встряхнуть.
  4. Повторите 2.3.
  5. Удалить ткани из раствора HBSS и передачи до 0,1% раствора коллагеназы (в HBSS) флакон, содержащий 1 мл раствора. Инкубировать в течение 45 мин при 37 ° С и 5% СО 2 окружающей среды в увлажненном инкубаторе для клеточных культур. Во время периода ожидания, теплый growtч носителе в 15 мл флакон при 37 ° С на водяной бане.
  6. Вытащите все фрагменты тканей в пипетку минимизирующей коллагеназы переносом. Извлечь только тканевые фрагменты в предварительно нагретой флаконах культура СМИ.
  7. Поместите хорошо фильтрующего 40 мкм в каждую лунку луночный планшет 6. Смочите фильтр с клеточной культуры 1 мл.
  8. Растирают ткани в средах с стеклянной пипетки 10 мл несколько раз до тех пор, ткань не полностью диссоциированы.
  9. Поддержание пипетки как можно ближе к основанию флакона.
  10. Депозит решение на фильтр для удаления мусора и недиссоциированной части.
  11. Центрифуга клеточной суспензии фильтруют в среде при 150 х г в течение 5 мин при комнатной температуре.
  12. Удалить супернатант и ресуспендируют затем осадок клеток с 2 мл свежей культуральной среды.
  13. Граф клеток с использованием гемоцитометра (если требуется). Семя изоляции первичных клеток на внеклеточного матрикса (ЕСМ) с функциональными гелями и полистирола блюд в нужной концентрации.

3. Подготовка и Функционализация различную жесткость полиакриламид (ПА) Гели и полистирола субстратов

Примечание: Для наглядной демонстрации разделе 3, зрители / читатели сослался на недавнее журнале визуализированных экспериментов (Юпитер) статьи 17.

  1. Принятие опубликованные протоколы 18, 19, 12 мм, включите 2 стеклянная крышка скользит химически обеспечить ковалентное связывание гидрогеля.
    1. Во-первых, удовольствие стеклянная крышка скользит с 3- Aminopropyltrymethoxysilane (ATS) в течение 7 мин при комнатной температуре.
    2. Извлеките АТС полностью деионизированной воды для полоскания и лечения крышка скользит с 0,5% глутарового альдегида (разведенного в PBS с 70% -ным глутаровым альдегидом маточного раствора) раствора в течение 30 мин.
  2. Получение 2 гелевые решения кПа путем смешивания 5% вес / объем раствора акриламида и 0,05% N, метиленбисакриламида (BIS) раствора N 'в 10 мМ HEPES-буферным раствором 20. Используйте 8% вес / объем акриламид и 0,13% N, метиленбисакриламида (бис) решение N 'в 10 мМ HEPES-буферным раствором для 10 кПа геля 20.
    1. В обоих случаях используется 1: 200 персульфат аммония (10% вес / объем) и 1: 2000, N, N, N ', N' тетраметилэтилендиамина (TEMED) в качестве инициатора и катализатора процесса полимеризации, соответственно.
    2. Кроме того, добавить 100 мкл флуоресцентных бисером 2 решения гель кПа в тайне маркеров 21, 22.
  3. Депозит каплю 20 мкл предварительно полимерный гель раствора ПА на 12 мм 2 активированного покровным стеклом. Поместите другой 12 мм 2 регулярного покровным стеклом на капли. Убедитесь, что падение распространяется между покровных стеклах в связи с капиллярности. Обратить бутерброд для 2 кПа гели для обеспечения, что большинство из бисера приблизится к поверхности клеточной культуры.
  4. Лечение гель Па в течение 45 мин при комнатной температуре.
  5. Снимите верхний покровное использованием одного края бритву.
    Примечание: Во время пилинга, отряд исходит из одного краясэндвича. Гель остается прилипший к активированному стекло.
  6. Хранить гели в растворе PBS перед использованием.
  7. Функционализации PA гели и стекло с молекул ECM, фибронектина человека в концентрации 50 мкг / мл по опубликованным методам 23.
    1. Вкратце, инкубировать субстратов с 2 мл чистого гидрата гидразина O / N.
    2. Удалить гидразингидрат и промыть тщательно субстраты с дистиллированной водой.
    3. Промыть субстратов с 5% уксусной кислоты в течение 30 мин.
    4. Удалить уксусную кислоту и промыть тщательно субстраты с дистиллированной водой.
    5. Хранить подложек, погруженных в деионизированной воде в течение 30 мин.
    6. Инкубируйте субстратов с окисленной фибронектина в течение 35 мин при концентрации 50 мкг / мл.
    7. Промыть субстратов с PBS на шейкере при низких оборотах в течение 10 мин.
    8. Перед покрытие клетки инкубируют все субстраты на 37 ° C в течение 2-3 мл культуральной среды в течение 30 мин.
      Примечание: Пластина клеток в скудно Заполнитьd способом (1000-3000 клеток / см 2). Каждый гель-стекла покрыта скольжения должна содержаться в 35 мм чашки Петри. Разрешить клетки придерживаться полностью, прежде чем любой микроскопии (по крайней мере O / N).

4. Тяговые силовой микроскопии и иммунофлуоресценции микроскопии Анализы

  1. Анализ тяги силовой микроскопии
    1. Теплый 0,25% трипсина-ЭДТА / 10% -ный раствор ДСН при 37 ° С в водяной бане в течение 10 минут, прежде чем начать эксперименты тяговые.
    2. Удалить один гель из клеточной культуры инкубатор на время и место на люминесцентном перевернутый столик микроскопа (32X увеличение).
    3. Найти одну ячейку в поле зрения. Снимите крышку блюдо Петри.
    4. Возьмите фазового контраста изображения клеток (например, рисунок 3).
    5. Переключитесь в режим визуализации флуоресценции и выберите соответствующий фильтр. Не перемещайте столик микроскопа или образец в течение этого времени.
    6. Возьмите образ displac флуоресцентные бисеромред сотовой тяги (рис 4C).
    7. Добавить 1 мл раствора трипсина / SDS в чашку Петри, чтобы отделить клетки от геля. Не перемещайте столик микроскопа или образец в течение этого времени. Кроме того, принять контрольный снимок клетки, чтобы обеспечить полное удаление из геля.
    8. Получать опорный (нулевой силы) изображение шариков после удаления клеток.
    9. Повторите шаги 4.1.2-4.1.8 для всех других гелей.
    10. Сделать стек изображения, используя ImageJ из двух изображений, полученных в шаге 4.1.6 и 4.1.8 для каждого случая. Для создания стека изображений, используйте следующую последовательность команд в ImageJ после открытия изображения: Image → стеки → Картинки укладывать.
    11. Чтобы получить поле перемещений и сцепление, использовать ImageJ плагины следующие опубликованных методов 21, 22 Получить коды и подробные учебники для этих плагинов с помощью следующей ссылке:. https://sites.google.com/site/qingzongtseng/imagejplugins.
      1. Совместите изображения в стеке, используя 'шаблон' Matching плагин. Использование в следующей последовательности команд в ImageJ после открытия стека изображений, сформированных на этапе 4.1.10: Плагины → Шаблон Matching → Выровнять Ломтики в Stack → ОК. Сохранить стек изображения, следовательно. Используйте этот новый стек изображения в следующих шагах.
      2. Получить поле смещения, используя PIV (изображение велосиметрия частиц) плагин (рис 4D). Использование в следующей последовательности команд после открытия стек изображения, сохраненный на шаге 4.1.11.1: Плагины → PIV → Итерационный PIV (Начальный) → ОК → Примите этот PIV и выход → ОК. Сохранить выход PIV в той же директории, в оригинальной стек изображений. Используйте это в качестве входных в следующем шаге.
      3. Наконец использовать (преобразовать тягу Фурье цитометрии) FTTC плагин для получения тяги карту (рис 4E). Использование следующая последовательность команд: Плагины → FTTC → InsERT свойства материала, т.е., модуль Юнга и коэффициент Пуассона ПА гель → OK → Выберите выходной файл PIV сохраненный на шаге 4.1.11.2 → ОК. Сохранить FTTC приводит в той же директории, как в стек изображений и выхода PIV.
  2. Иммунофлюоресценции микроскопии Анализы
    1. Возьмите субстраты для иммуноокрашиванию для ламинарного капотом и удалить культуральной среды.
    2. Промыть субстратов с PBS и зафиксировать клетки с 4% параформальдегида в PBS в течение 20 мин при комнатной температуре.
    3. Вымойте субстратов с PBS 3 раза (5 мин каждый раз). Следовательно, инкубировать субстратов с усилителем сигнала 500 мкл в течение 30 мин и промывают PBS.
    4. Инкубируйте клетки с моноклональными анти-антитела винкулина в разведении 1: 250 в PBS в течение 45 мин при комнатной температуре. Вымойте субстратов с PBS 3 раза (5 мин каждый раз).
    5. Инкубируйте образцы с вторичным антителом Alexa Fluor 488 козьего анти-мышиного IgG в разведении 1: 200в PBS при комнатной температуре в течение 30 мин. Вымойте субстратов с PBS 3 раза (5 мин каждый раз).
    6. Для визуализации F-актина структуру, инкубировать клетки с TRITC фаллоидином конъюгатов в концентрации 50 мкг / мл в течение 45 мин при комнатной температуре. Вымойте субстратов с PBS 3 раза (5 мин каждый раз).
    7. Изображение образцы, использующие сканирующего лазерного микроскопа конфокальной (рис 5А - 5D).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Протокол, описанный выше, успешно применяется для нескольких образцов ткани (п = 12) из четырех разных пациентов соответствии с руководящими принципами институциональной наблюдательный совет. иллюстрирует характерную колоректального опухоли сразу после операции, из которых срезы ткани для клеточных культур получают. Типичный участок ткани в HBSS раствора после перевода в ламинарном шкафу в течение последующей обработки показано на фиг.1В. Схема пищеварения и ферментативной диссоциации хирургического образца ткани в суспензии отдельных клеток, показан на фиг.2.

После успешного ткани диссоциации, изолированные первичные человеческие клетки высевают на PA гелей и полистирола блюд. Фазового контраста микрофотографии (фиг.3А и 3В) показывают репрезентативную морфологию первичного рака толстой кишки человека и нормальных клеток в зависимости от жесткости подложки. Очевидно, чтопервичный клетки толстой кишки (как здоровых, так и раковых) распространяться на более полистирола блюд по сравнению с гелей PA (фиг.3А и 3В).

Тяговые анализы выполняются на ECM (фибронектина) покрытием Soft 2 кПа гели после подтверждения инвазивного аденокарциномы от патологического Н & Е окрашивания (рис 4а). PA гели равномерно покрыты фибронектина, как показано на фиг.4В. Для простоты сравнения все тяговые эксперименты для опухоли и здоровых клеток толстой кишки должны быть выполнены одновременно. Фиг.4С показан снимок наноразмерных флуоресцентных шариков, погруженных внутри геля. Из перемещенных лиц и ссылка борта изображений, поля смещения получаются с помощью плагина ImageJ PIV 21, 22. Поле смещения представитель шарик генерируется инвазивных опухолей толстой кишки на 2 кПа геля отображается на рисунке 4D. Рисунок 4E показывает тяги STREсс получены с использованием ImageJ FTTC плагин, соответствующий смещению поле на рис 4D 21, 22.

На рисунке 5 показана F-актин и винкулин содержащий координационные спайки первичных клеток толстой кишки человека на мягких гелей 2 кПа и жестких полистирольных подложках. Нет актина волокна не присутствовал в менее распространенных клеток на мягких гелей (рис 5A1 - 5А2). Мелкоточечный винкулин содержащий координационные спайки присутствуют на мягких гелей (рис 5B1 - 5В2). Наоборот, первичные клетки также показывают распространение морфологию, хорошо определенные актина стресс волокна и дискретные удлиненные координационные спайки на жестких полистирольных подложках (рис 5C - 5D).

Фигура 1
Рисунок 1. () опухоли толстой кишки после резекции, (Б) тканей срезы опухоли для выделения клеток. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 2
Рисунок 2. Схема пищеварения и ферментативной диссоциации хирургического образца ткани в одной клеточной суспензии. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 3
Рисунок 3. Успешное первичной культуры клеток человеческой толстой кишки (как рак и нормальный) на различных гелей жесткости и полистирола блюдо. Фазового контраста изображения показывают тиPical морфология (А) Опухолевые клетки и (Б) нормальные клетки на различных подложках жесткости. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 4
Рисунок 4. () H & E окрашивание, подтверждающий инвазивной аденокарциномы. Окрашивание (B) фибронектина показывает, что гели равномерно покрыта молекул ECM. Бисер (С) Наноразмерных встроенные внутри геля в тайне маркеров. (D), представитель поле смещения генерируются опухолевой клетки на мягкой Звуковая геля, используя плагин PIV в ImageJ как описано в 4.1.11.2. (Е) Антипробуксовочная стресс оказывает опухолевой клетки на мягкий гель, соответствующей смещению поле (D), полученный с помощью вилки FTTC в в ImageJ как описано в 4.1.11.3. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 5
Рисунок 5. иммунофлуоресцентного окрашивания F-актина и винкулина на мягкий гель и на жестких полистирольных подложках. Нет актина волокна не присутствовал в менее распространены (A1) опухолевой клетки или (А2) нормальной клетки на мягкие гели 2 кПа. Мелкоточечный винкулин содержащий координационные спайки присутствуют на мягких гелей (В1 - В2). Наоборот, первичные клетки также показывают распространение морфологию, а определенные актина стресс волокна (С1 - С2) и дискретные удлиненные координационные спайки (D1 - D2), на жестких полистирольных подложках.2 / 52532fig5large.jpg "цель =" _ пустое "> Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Сотовый тяги стресс в последнее время появились в качестве потенциального биофизической показателя метастатической стадии 13. Однако никаких экспериментальных данных, тяги с первичных опухолевых клеток не существует в литературе до сих пор. Кроме того, непосредственно культивирования изолированных первичных клеток толстой кишки на различных гелей жесткость полиакриламида пока не сообщается. Следовательно, мы устанавливаем оптимальные условия культивирования клеток первичной толстой кишки на гелей и полистирола (рис 2). Флуоресцентные микрошарики инкапсуляции вблизи поверхности клеточной культуры в процессе подготовки мягкий гель позволяет измерять поля смещения и тяги, генерируемого первичных человеческих клеток (рис 4C, 4D и 4E). Кроме того, иммунофлюоресценции анализы могут предоставить важную информацию о организации цитоскелета и координационных спаек, как изменения жесткости подложки (рис 5А - 5D). Обратите внимание, что другой рак и нормальной клетки увековеченныйлинии также показывают дополненной распространения, актина формирование стресс расслоение и зрелые удлиненные координационные спайки с повышенной жесткостью субстрата 4, 24-25.

Протокол может быть легко приняты / изменены для выделения первичных клеток из хирургических тканей различных органов человека и других животных. Инкубационный период ткани в диссоциации агентов - трипсина и коллагеназы - должна быть оптимизирована эмпирически для каждого приложения. Кроме того, размер фильтра для удаления мусора и недиссоциированные части ткани, также является важным параметром, чтобы выбрать на основе ожидаемого максимального размера клеток в подвешенном состоянии (40 мкм в данном протоколе).

Одним из ограничений метода является то, что несколько мягкие гели могут не последовательное локализацию флуоресцентных шариков возле поверхности клеточной культуры (раздел 3.3), которые могут негативно повлиять на следующую тягу цитометрии измерений (раздел 4.1). Это может быть легко обойти, рассматриваяПоверхность гель для плотности и распределения борта с помощью флуоресцентной микроскопии, прежде клеточной культуре. Следовательно, гели с относительно неоднородной распределения борта могут быть отброшены. Другой подход заключается в использовании недавно предложенный метод, который позволяет точную локализацию шариков вблизи поверхности клеточной культуры 17.

Внимание должно быть принято, чтобы начать обработку хирургические образцы, как только они будут получены, предпочтительно в течение 45 минут. Наиболее важным шагом в протоколе это оптимальное время воздействия на ткани в трипсин и коллагеназы решение для достижения выхода изоляции, но сохраняя достаточное жизнеспособность клеток. Перед культивирования клеток на мягких гидрогелей, плотность и распределение шарик должен быть подтвержден с помощью флуоресцентной микроскопии. Кроме того, нулевая сила изображение должно быть приобретены после подтверждения, что клетка полностью отделен от поверхности геля.

Таким образом, протокол описано, что повторноетаты диссоциируют отдельных клеток отстранение от хирургического раковой / нормальной образца ткани. Эта изоляция отдельных первичных опухолевых клеток из образцов хирургических последующим их культуры на мягких и твердых субстратов позволяет различные вниз по течению биофизических измерений, например, жесткость клеток с использованием АСМ, внутриклеточный реологических помощью микроинъекции частицы, миграция клеток / моторику и анализ динамики пузырька. Эти измерения могут быть использованы для прогнозирования рака. Протокол был успешно использован для извлечения и культуры мышиных кардиомиоцитах, а также 26. Метод, представленный здесь, может быть использован для выделения первичных клеток человека от хирургических тканей различных органов и культуры им прямо на различную жесткость подложки для mechanobiology исследований.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reagents
HBSS Life technologies 14175-095
PBS Lonza 17-516F
Trypsin Worthington LS003736
Collagenese Worthington LS004176
3- Aminopropyltrymethoxysilane (ATS)  Sigma-Aldrich 281778
Glutaraldehyde Polysciences, Inc. 01201-5
Acrylamide Sigma-Aldrich A4058
N-methylenebisacrylamide (bis) Sigma-Aldrich M1533
HEPES buffer solution Sigma-Aldrich 83264
Ammonium persulfate Bio-Rad 161-0700
Human fibronectin BD biosciences 354008
Hydrazine hydrate Sigma-Aldrich 18412 Hazardous
Acetic acid Sigma-Aldrich A6283
Paraformaldehyde  Electron Microscopy Sciences RT15710
Signal enhancer Life technologies I36933
Monoclonal anti vinculin antibody  Sigma-Aldrich V9131
Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG Life technologies A11001
TRITC phalloidin conjugates  Sigma-Aldrich P1951
0.1 µm fluroscent beads Life technologies F8801
0.25% Trypsin-EDTA Life technologies 25200-056
Materials
12 mm2 glass cover slips Corning 2865-12

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Ingber, D. E. Can cancer be reversed by engineering the tumor microenvironment. Semin. Cancer Biol. 18, 356-364 (2008).
  2. Kumar, S., Weaver, V. M. Mechanics, malignancy, metastasis: the force journey of a tumor cell. Cancer Metastasis Rev. 28, 113-127 (2009).
  3. Engler, A. J., Sen, S., Sweeney, H. L., Discher, D. E. Matrix elasticity directs stem cell lineage specification. Cell. 126, 677-689 (2006).
  4. Yeung, T., et al. Effects of substrate stiffness on cell morphology, cytoskeletal structure, and adhesion. Cell Motil. Cytoskeleton. 60, 24-34 (2005).
  5. Pelham, R. J., Wang, Y. L. Cell locomotion and focal adhesions are regulated by substrate flexibility. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 94, (25), 3661-3665 (1997).
  6. Solon, J., Levental, I., Sengupta, K., Georges, P. C., Janmey, P. A. Fibroblast adaptation and stiffness matching to soft elastic substrates. Biophys. J. 93, 4453-4461 (2007).
  7. Wang, H. B., Dembo, M., Wang, Y. L. Substrate flexibility regulates growth and apoptosis of normal but not transformed cells. Am. J. Physiol. Cell. Physiol. 279, 1345-1350 (2000).
  8. Paszek, M. J., et al. Tensional homeostasis and the malignant phenotype. Cancer Cell. 8, 241-254 (2005).
  9. Levental, K. R., et al. Matrix crosslinking forces tumor progression by enhancing integrin signaling. Cell. 139, 891-906 (2009).
  10. Tang, X., et al. Mechanical force affects expression of an in vitro metastasis-like phenotype in HCT-8 cells. Biophys. J. 99, 2460-2469 (2010).
  11. Ali, M. Y., Saif, M. T. A. Substrate Stiffness Mediated Metastasis Like Phenotype of Colon Cancer Cells is Independent of Cell to Gel Adhesion. Cell. Mol. Bioeng. (2014).
  12. Ali, M. Y., Chuang, C. Y., Saif, M. T. A. Reprogramming cellular phenotype by soft collagen gels. Soft Matter. (2014).
  13. Kraning-Rush, C. M., Califano, J. P., Reinhart-King, C. A. Cellular traction stresses increase with increasing metastatic potential. PLoS ONE. 7, (2), e32572 (2012).
  14. Indra, I., Undyala, V., Kandow, C., Thirumurthi, U., Dembo, M., Beningo, K. A. An in vitro correlation of mechanical forces and metastatic capacity. Phys. Biol. 8, (1), (2011).
  15. Alge, C. S., Hauck, S. M., Priglinger, S. G., Kampik, A., Ueffing, M. Differential protein profiling of primary versus immortalized human RPE cells identifies expression patterns associated with cytoskeletal remodeling and cell survival. J. Proteome Res. 5, (4), 862-878 (2006).
  16. Oikonomou, E., Kothonidis, K., Zografos, G., Nasioulas, G., Andera, L., Pintzas, A. Newly established tumourigenic primary human colon cancer cell lines are sensitive to TRAIL-induced apoptosis in vitro and in vivo. Br. J. Cancer. 97, (1), 73-84 (2007).
  17. Knoll, S. G., Ali, M. Y., Saif, M. T. A. A novel method for localizing reporter fluorescent beads near the cell culture surface for traction force microscopy. J. Vis. Exp. (91), (2014).
  18. Wang, Y. L., Pelham, R. Preparation of a flexible, porous polyacrylamide substrate for mechanical studies of cultured cells. Methods in Enzymology. 298, 489-496 (1998).
  19. Tang, X., Ali, M. Y., Saif, M. T. A. A novel technique for micro-patterning proteins and cells on polyacrylamide gels. Soft Matter. 8, 3197-3206 (2012).
  20. Tse, J. R., Engler, A. J. Preparation of hydrogel substrates with tunable mechanical properties. Current Protocols in Cell Biology. 10-16 (2010).
  21. Tseng, Q., et al. Spatial organization of the extracellular matrix regulates cell–cell junction positioning. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 109, (5), 1506-1511 (2012).
  22. Chopra, A., et al. Augmentation of integrin-mediated mechanotransduction by hyaluronic acid. Biomaterials. 35, (1), 71-82 (2014).
  23. Damljanovic, V., Lagerholm, B. C., Jacobson, K. Bulk and micropatterned conjugation of extracellular matrix proteins to characterized polyacrylamide substrates for cell mechanotransduction assays. Biotechniques. 39, (6), 847-851 (2005).
  24. Tilghman, R. W., et al. Matrix rigidity regulates cancer cell growth and cellular phenotype. PLoS ONE. 5, (9), e12905 (2010).
  25. Ulrich, T. A., de Juan Pardo, E. M., Kumar, S. The mechanical rigidity of the extracellular matrix regulates the structure, motility, and proliferation of glioma cells. Cancer Res. 69, 4167-4174 (2009).
  26. Williams, B. J., Anand, S. V., Rajagopalan, J., Saif, M. T. A. A self-propelled biohybrid swimmer at low Reynolds number. Nat. Commun. 5, (2014).
Выделение первичных клеток человека Колон опухоль из хирургических тканей и культивирование их прямо на мягкий эластичный субстратов для тяговых цитометрии
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Ali, M. Y., Anand, S. V., Tangella, K., Ramkumar, D., Saif, T. A. Isolation of Primary Human Colon Tumor Cells from Surgical Tissues and Culturing Them Directly on Soft Elastic Substrates for Traction Cytometry. J. Vis. Exp. (100), e52532, doi:10.3791/52532 (2015).More

Ali, M. Y., Anand, S. V., Tangella, K., Ramkumar, D., Saif, T. A. Isolation of Primary Human Colon Tumor Cells from Surgical Tissues and Culturing Them Directly on Soft Elastic Substrates for Traction Cytometry. J. Vis. Exp. (100), e52532, doi:10.3791/52532 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter