Abstract
癌细胞响应不同癌细胞使用粘附受体组成的协调，分层机械化学系统和相关的信号转导的膜蛋白，细胞骨架结构，以及分子马达1,2与基质的机械刚度以复杂的方式。Mechanosensitivity 体外是与永生化细胞系或鼠衍生的原代细胞，不与原代人肿瘤细胞研究主要。因此，知之甚少初级人结肠癌细胞的体外 mechanosensitivity。这里，一个优化的协议被开发，描述从健康和癌外科人类组织样品的原代人结肠细胞的分离。孤立的结肠细胞，然后软（2千帕刚度）和僵硬（10千帕刚度）聚丙烯酰胺水凝胶和刚性聚苯乙烯（〜3.6 GPA刚度）由细胞外基质官能化基底（纤连蛋白培养成功在这种情况下）。荧光微珠嵌入在细胞培养物表面附近软凝胶，和牵引试验被执行以评估使用免费开放存取软件蜂窝收缩应力。此外，在不同的刚度衬底免疫荧光显微镜提供有关主细胞形态，细胞骨架组织及纽蛋白含有粘着斑作为底刚度的函数的有用信息。
Introduction
近年来它已成为越来越明显的是，机械微环境中，除了生物化学因素，在调节细胞功能中起重要作用。细胞可以感知并就它们所附着到（如在2D培养）或（在3D培养如）包围3-7基板刚度作出响应。通过这样做，细胞可以调节它们的分化3，形态4，迁移/蠕动5，生物物理性质6，生长7，等工序。
癌细胞也使用粘附受体的协调，分层机械化学组合和相关的信号转导的膜蛋白，细胞骨架结构，以及分子马达1,2的二维和三维矩阵刚度作出响应。例如，乳腺上皮细胞（的MECs）上为150Pa衬底培养时形成正常腺泡实质是类似于刚度健康的乳腺组织。有趣的是，它们表现出的显影肿瘤的标志，其结构和转录，当较硬基板（> 5000帕），模仿一个肿瘤基质8的刚度进行培养。此外，另一实验表明，乳房肿瘤发生是伴随着胶原交联和ECM加强9。最近的实验表明，人结肠癌（HCT-8）细胞显示样表型（MLP）转移时，他们就具有生理学相关刚度（20-47千帕）2D基板培养，但不能在非常僵硬（3.6 GPA）衬底-10- 12。这些细胞的第一种形式的肿瘤样细胞团，然后相互分离，从外围开始。作为这种上皮到圆形形态（E至R转变）发生变化时，它们增殖，减少细胞 - 细胞和细胞-ECM粘附，并成为迁移的。 HCT-8细胞培养上很辛苦聚苯乙烯基板没有表现出这些恶性特征。因此，已经假定HCT-8细胞成为转移性由于其暴露于适当的微环境。值得注意的是，这些实验进行了永生化癌细胞株或鼠衍生的原代细胞，不与原代人癌细胞。
最近的一项研究提出，扩充蜂窝牵引应力可被用作一个潜在的生物物理签名为转移细胞13。研究涉及测量牵引力为在聚丙烯酰胺凝胶不同的人类肿瘤细胞株。据发现，转移性癌细胞可以发挥显著较高牵引应力相比，非转移性的细胞在所有情况下13。然而，这些结果直接矛盾对鼠衍生的乳腺癌细胞系14中的早些时候发表的研究结果。此外，最近的一项研究强调了他们的细胞骨架重构亲永生和初级人体细胞之间的显着差异蛋白分析和细胞存活蛋白表达15。因此，重新许多生物物理测定法包括牵引原发性人类癌细胞的是重要的。这将解决的问题的原代细胞是否概括永生化癌细胞系牵引趋势。
这里所描述的协议被优化用于原代人结肠细胞（包括健康的和癌性的），并为它们对软底物（聚丙烯酰胺凝胶），以及在培养皿中培养的隔离。该协议基于消化外科组织样品成单细胞悬浮液16的结果酶解。据我们所知，这是直接在软水剂基质与牵引嵌入荧光微球培养流式细胞仪分离原发性结肠癌肿瘤和正常细胞的第一个示范。透明凝胶基质也让免疫。这个实验表明在F-肌动蛋白组织和差异粘着斑在原代人结肠癌细胞作为基材硬度的变化。该细胞培养平台开辟了探索原代人细胞的各种生物物理性质，如细胞刚度和牵引作为癌症预后参数的可能性。
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Protocol
下面所描述的协议如下UIUC人类研究伦理委员会的指导方针。
1.收集和外科组织消解
- 收集后右结肠切除术（ 图1A和1B）的肿瘤组织样品。收集来自邻近部位的健康组织为好。
- 马上转移的组织，以15毫升小瓶含12毫升HBSS解决方案。继续冰瓶内的绝缘泡沫箱。
- 传送后45分钟的含有组织小瓶组织培养罩作进一步的处理。保持罩内的冰块上的小瓶。
- 倒入供给组织成含有6-7毫升的HBSS溶液用移液管6孔板。
注意：每孔组织的量不在这个漂洗步骤的关键。 - 保持一个冰块在6孔板。在冲洗液HBSS组织两次。
- 干净切割组织与无菌分离SCIS节SOR。百果组织成更小的部分不超过1-2毫米3大小用无菌手术刀片更大。
- 称重经标记的0.1％胰蛋白酶小瓶（含有1毫升0.1％的胰蛋白酶溶液）转移所述组织之前。转移〜20 mg组织到每个所述的0.1％胰蛋白酶的小瓶用吸管的。
- 尽量减少的HBSS转移到胰蛋白酶小瓶，以避免进一步的稀释胰蛋白酶。
- 权衡组织转移后的胰蛋白酶小瓶;文件的差异作为组织肿块。
- 倾〜20毫克组织和1ml胰蛋白酶于24孔板的每个孔中。
- 把24孔平板在摇床上于冰箱，在4℃下进行16-20小时。在此等待期间或更早的时候，准备聚丙烯酰胺凝胶基质和如在第3节描述的ECM的蛋白质功能化他们。
组织样本单细胞悬液2酶解和ECM功能化的弹性Substrat培养分离细胞ES和刚性聚苯乙烯餐具
- 后在摇床胰酶以及在4℃下16-20小时温育的，从4℃的胰蛋白酶转移组织至4℃完全生长培养基小瓶（含有2-3ml的完全生长培养基的）用移液管。保证胰蛋白酶最小转移到生长介质。
注意：完全生长培养基配方如下：补充有马血清为10％和青霉素 - 链霉素至总溶液的1％的最终浓度的RPMI 1640基础培养基中。 - 将包含媒体的小瓶中的温水浴，在37℃下进行12-15分钟的组织。
- 转移组织到15ml小瓶中含有用吸管的HBSS溶液，轻轻摇动。
- 重复2.3。
- 从HBSS溶液，并转移到0.1％的胶原酶溶液（在HBSS中）含有1ml溶液小瓶去除组织。孵育45分钟，在37℃和5％CO 2的环境中的潮湿的细胞培养箱中。在等待期间，温growt在37℃] C H媒体在15ml小瓶在水浴中。
- 所有的组织碎片拔出吸管将胶原酶最小化交叉污染。喷射刚组织碎片进入预热培养基瓶中。
- 放置一个40μm的良好的插入滤波器入6孔板的每个孔中。滋润过滤用1毫升细胞培养基。
- 磨碎组织在媒体用10毫升玻璃吸管数次，直至组织被完全离解。
- 保持枪头尽可能接近到小瓶的底部。
- 存款的解决方案到过滤，清除杂物及未解离部分。
- 离心机过滤的细胞悬浮液中的媒体，在150×g离心5分钟，在RT。
- 事后去除上清，重悬细胞沉淀用2毫升的新鲜培养基。
- 计数使用血球（如果需要）的细胞。种子被隔绝在细胞外基质（ECM）官能化的凝胶和聚苯乙烯菜肴所需浓度的原代细胞。
3.准备和变刚度聚丙烯酰胺（PA）凝胶和聚苯乙烯基质功能化
注意：对于视觉第3节的示范，观众/读者可以参考最近的杂志可视化实验（朱庇特）第17条。
- 采用协议公布的18，19，激活12毫米2玻璃盖玻片化学确保共价水凝胶结合。
- 首先，请客玻璃盖玻片3- Aminopropyltrymethoxysilane（ATS）在室温下7分钟。
- 用DI水漂洗完全除去ATS和治疗盖玻片，用0.5％戊二醛（从70％戊二醛原液在PBS中稀释）处理30分钟溶液。
- 通过将5％w / v的丙烯酰胺溶液和0.05％的N，在10mM的HEPES缓冲盐水20 -N'甲基双丙烯酰胺（BIS）溶液得到2千帕凝胶溶液。使用8％w / v的丙烯酰胺和0.13％的N，在10mM的HEPES缓冲盐水-N'甲基双丙烯酰胺（BIS）溶液为10千帕的凝胶20。
- 在这两种情况下，使用1：200的过硫酸铵（10％重量/体积）和1：2000 N，N，N'，N'四甲基乙二胺（TEMED），为中，引发剂和催化剂用于聚合过程分别。
- 此外，添加100μl的荧光珠，以2千帕凝胶溶液作为受托标记21,22。
- 存款下降了20微升的12 平方毫米激活盖玻片预聚合物PA凝胶溶液。广场上的下降，另有12个平方毫米普通玻璃盖玻片。确保降盖玻片之间的利差，由于毛细作用。倒置三明治为2千帕的凝胶，以确保大多数的珠来对细胞培养物表面附近。
- 治愈PA凝胶在室温45分钟。
- 剥离使用单刃剃须刀顶盖滑。
注：在剥离，剥离从一个边缘进行的三明治。凝胶仍然附着在活化载玻片。 - 使用之前储存在PBS液凝胶。
- 官能PA凝胶和玻璃使用ECM分子，人纤连蛋白在50微克/毫升以下公开的方法23的浓度。
- 简单地说，孵化用2毫升纯水合肼O / N基板。
- 除去水合肼和去离子水彻底冲洗衬底。
- 洗，用5％乙酸在基板30分钟。
- 除去乙酸和去离子水彻底冲洗衬底。
- 保持浸渍于去离子水中30分钟的衬底。
- 孵育氧化纤维连接蛋白35分钟的基板在50微克/毫升的浓度。
- 冲洗在摇床上用PBS基板在低转速10分钟。
- 电镀细胞之前孵育2-3毫升培养基所有基板在37℃下30分钟。
注：板细胞在人口稀少填充ð方式（1,000-3,000个/厘米2）。每个凝胶覆盖的玻璃滑需要被包含在35毫米的培养皿。使细胞的任何显微镜（至少O / N）之前完全遵守。
4.牵引力显微镜和免疫荧光显微测定
- 牵引力显微镜分析
- 暖0.25％胰蛋白酶-EDTA / 10％SDS在37℃溶液在水浴10分钟前牵引实验开始。
- 除去从细胞培养培养箱一种凝胶在时间和地点上的荧光倒置显微镜阶段（32X放大倍率）。
- 发现在视场的单个细胞。取出培养皿的盖子。
- 取细胞的相衬图像（ 例如 ， 图3）。
- 切换成像模式荧光和选择适当的过滤器。在此期间不要移动显微镜阶段或样品。
- 取的荧光珠displac的图像由蜂窝牵引（ 图4C）编
- 加入1毫升胰蛋白酶/ SDS溶液到培养皿分离从凝胶中的细胞。在此期间不要移动显微镜阶段或样品。此外，取单元的控制图像，以确保完全除去从凝胶。
- 取的珠的参考（零力）图像的单元除去后。
- 对于所有其他凝胶重复步骤4.1.2-4.1.8。
- 请使用ImageJ从步骤4.1.6和4.1.8每一种情况下获得的两个图像图像堆栈。要生成图像堆栈，用命令的ImageJ的下列顺序打开图片后：图像→堆叠→图像堆栈。
- 为了获得位移场和牵引，使用ImageJ的插件下面公布的方法21，22获得这些插件使用下面的链接代码和详细的教程。 https://sites.google.com/site/qingzongtseng/imagejplugins。
- 对齐用的“模板匹配”插件堆栈中的图像。使用以下工作步骤4.1.10生成的图像堆栈后序列中的ImageJ命令：在堆栈插件→模板匹配→对齐→切片确定。保存图像堆栈因此。在下面的步骤使用这个新的图像堆栈。
- 获得使用的PIV（粒子图像测速）插件（ 图4D）的位移场。使用下面的打开保存在步骤4.1.11.1图像堆栈后命令序列：插件→PIV→迭代PIV（基本）→OK→接受这个PIV和输出→确定。在同一目录下的PIV输出保存为原始图像堆栈。以此为输入下一个步骤。
- 最后使用FTTC（傅立叶变换牵引术）的插件，以获得牵引力地图（ 图4E）。命令使用以下顺序：→插件→FTTC插件ERT的材料特性， 即 ，杨氏模量和PA的凝胶→确定→泊松比选择保存在步骤4.1.11.2→OK了PIV输出文件。下次FTTC在同一目录中的结果如在图像堆栈和PIV输出。
- 免疫荧光显微镜测定
- 就拿基板被免疫染色的层流罩，取出培养基。
- 冲洗用PBS基板和固定细胞用PBS中的4％多聚甲醛20分钟，室温。
- 为3次（每次5分钟）洗涤，用PBS基板。因此，孵育用500μl信号增强基板30分钟并漂洗用PBS。
- 孵育细胞与单克隆抗粘着斑蛋白抗体以1：250稀释在PBS中在RT下45分钟。为3次（每次5分钟）洗涤，用PBS基板。
- 孵育二级抗体的Alexa Fluor 488山羊抗 - 小鼠IgG的样品以1：200稀释在PBS中在RT下30分钟。为3次（每次5分钟）洗涤，用PBS基板。
- 为了显现的F-肌动蛋白的结构，孵育细胞TRITC鬼笔环肽缀合物的浓度50微克/毫升，在室温45分钟。为3次（每次5分钟）洗涤，用PBS基板。
- 图像（ 图5A - 5D）使用共焦扫描激光显微镜的样品。
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Representative Results
上述协议被成功地用于对来自四个不同患者的多个组织样品（n = 12）下的机构审查委员会的指导方针。 图1A示出了从该组织切片的细胞培养物获得的手术后右一代表结肠直肠肿瘤。在转移到层流罩，以便进一步处理后的HBSS溶液的典型组织截面示于图1B。消化外科组织样品成单细胞悬浮液酶解的示意图示于图2。
成功的组织分离后，分离原代人细胞接种在PA凝胶和聚苯乙烯菜肴。相差显微照片（ 图3A和3B）示出了主人结肠癌和正常细胞的有代表性的形态作为底物刚性的功能。显而易见的是相比在PA凝胶（ 图3A和3B）原发性结肠癌细胞（健康的和癌性的）传播更多的聚苯乙烯的菜肴。
牵引试验是在ECM（纤连蛋白）从病理H＆E染色（ 图4A）确认浸润性腺癌后，涂上柔和的2千帕凝胶进行。 PA凝胶均匀地用纤连蛋白涂覆， 如图4B所示 。为便于比较，所有的牵引实验对肿瘤和健康结肠细胞应在同一时间进行。 图4C示出了嵌入在凝胶内的纳米级的荧光珠的快照。从流离失所者和参考珠图像，位移场使用ImageJ的PIV插件21，22得到。通过侵入结肠肿瘤细胞上的2千帕凝胶产生一名代表珠位移场显示在图4D图4E表示牵引STRE使用对应于位移图4D 21，22场ImageJ的FTTC插件SS获得。
图5显示了F-肌动蛋白和纽含有软2千帕凝胶和刚性聚苯乙烯基质的原代人结肠细胞的粘着斑。无肌动蛋白纤维是目前在软凝胶（ 图5A1 - 5A2）少蔓延细胞。含有粘着斑点状纽蛋白是存在于软胶囊（ 图5B1 - 5B2）。相反，原代细胞以及展示形态蔓延，明确应力纤维和聚苯乙烯硬质基材离散拉长粘着斑（ 图5C - 5D）。
结肠切除后， 图1（A）肿瘤。从肿瘤的细胞分离（B）组织切片。 请点击此处查看该图的放大版本。
图2.消化外科组织样本成单细胞悬液酶解的。 请点击此处查看该图的放大版本。
图3.成功的初级人类结肠癌细胞培养（包括癌症和正常），在不同的刚度凝胶和聚苯乙烯菜。相衬图像显示TY（ 一 ）肿瘤细胞，并在不同的硬度基材（B）正常细胞形态皮卡尔。 请点击此处查看该图的放大版本。
图4（A）H＆E染色证实浸润性腺癌。 （B）的纤连蛋白的染色揭示出凝胶使用ECM分子均匀地涂布。嵌入在凝胶作为受托标志（C）纳米珠。 （ 四）在4.1.11.2描述了使用PIV插件ImageJ的中肿瘤细胞产生软凝胶PA代表位移场。 （E）的牵引应力经由FTTC插头上获得对应于位移（D）中字段软凝胶施加的肿瘤细胞在ImageJ的在4.1.11.3描述。 请点击此处查看该图的放大版本。
F-肌动蛋白和纽软凝胶和硬聚苯乙烯基质的图5免疫荧光染色。无肌动蛋白纤维存在于较少扩散（A1）的肿瘤上软2千帕凝胶细胞或（A2）的正常细胞。含有粘着斑点状纽蛋白是存在于软胶囊（B1 - B2）。相反，原代细胞以及展示形态蔓延，明确应力纤维（C1 - C2）和离散细长的粘着斑（D1 - D2）在刚性基材的聚苯乙烯。2 / 52532fig5large.jpg“目标=”_空白“>点击此处查看该图的放大版本。
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Discussion
蜂窝牵引强调最近成为转移状态13一个潜在的生物物理指标。然而，随着原发肿瘤细胞没有实验数据的牵引文献中存在的日期。此外，还未见报道的是不同的刚度聚丙烯酰胺凝胶直接分离培养原发性结肠癌细胞。因此，我们建立对凝胶和聚苯乙烯（ 图2）优化的原发性结肠癌细胞的培养条件。在软凝胶制剂邻近细胞培养表面的荧光微珠封装允许位移场和由人原代细胞（ 图4C，4D和4E）产生牵引力的测量。此外，免疫荧光分析能够提供关于组织细胞骨架和粘着斑为底硬度变化（ 图5A - 5D）的重要信息。注意，不同的癌症和正常永生化细胞线也表现出增大蔓延，肌动蛋白束的压力形成和成熟拉长粘着斑增加基材的刚度4，24-25。
该协议可以很容易地通过/修改后用于从不同的人体器官或其他动物的手术组织的原代细胞的分离。胰蛋白酶和胶原酶 - - 组织中的解离剂的孵育时间需要凭经验优化为每个应用程序。此外，该过滤器大小以除去碎片和未解离的组织部位也是选择基于在悬浮状态预期的最大细胞大小（在此协议为40μm）的重要参数。
该方法的一个限制是，一些软凝胶可能缺乏的邻近细胞培养表面（第3.3节），其可以在以下牵引术的测量（第4.1节）产生不利影响的荧光珠一致定位。这可以通过检查容易地规避使用荧光显微镜的细胞培养之前凝胶表面的胎圈密度和分布。因此，凝胶具有相对不均匀珠分布可以被丢弃。另一种方法是使用一种最近提出的方法，其允许的细胞培养表面17附近的磁珠精确定位。
时应注意开始处理手术标本，尽快为他们收到，最好在45分钟内。在该协议中最关键的步骤是在胰蛋白酶和胶原酶溶液的组织的最佳的曝光时间来实现分离收率，还保持足够的细胞活力。前软凝胶中培养细胞，珠密度和分布需要使用荧光显微镜来确认。另外，一个空力图像需要确认该细胞完全从凝胶表面脱离之后被获取。
总之，一个协议描述了重sults分离单个细胞悬液从手术癌变/正常组织样本。从手术标本其次是他们的软，硬基质栽培单一的原发肿瘤细胞的这种隔离允许各种生物物理下游测量， 例如 ，使用原子力显微镜细胞刚度，内用流变学显微注射颗粒，细胞迁移/运动和囊泡动力学分析。这些测量可以用于癌症预后。的协议已被成功地用于鼠心肌细胞的提取和培养，以及26。这里介绍的方法可用于从各种器官的手术组织并培养他们直接对力学生物学研究不同的刚度衬底隔离的原代人细胞。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| HBSS | Life technologies | 14175-095 | |
| PBS | Lonza | 17-516F | |
| Trypsin | Worthington | LS003736 | |
| Collagenese | Worthington | LS004176 | |
| 3- Aminopropyltrymethoxysilane (ATS) | Sigma-Aldrich | 281778 | |
| Glutaraldehyde | Polysciences, Inc. | 01201-5 | |
| Acrylamide | Sigma-Aldrich | A4058 | |
| N-methylenebisacrylamide (bis) | Sigma-Aldrich | M1533 | |
| HEPES buffer solution | Sigma-Aldrich | 83264 | |
| Ammonium persulfate | Bio-Rad | 161-0700 | |
| Human fibronectin | BD biosciences | 354008 | |
| Hydrazine hydrate | Sigma-Aldrich | 18412 | Hazardous |
| Acetic acid | Sigma-Aldrich | A6283 | |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | RT15710 | |
| Signal enhancer | Life technologies | I36933 | |
| Monoclonal anti vinculin antibody | Sigma-Aldrich | V9131 | |
| Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG | Life technologies | A11001 | |
| TRITC phalloidin conjugates | Sigma-Aldrich | P1951 | |
| 0.1 µm fluroscent beads | Life technologies | F8801 | |
| 0.25% Trypsin-EDTA | Life technologies | 25200-056 | |
| Materials | |||
| 12 mm2 glass cover slips | Corning | 2865-12 | |
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