Abstract
Kankercellen reageren op mechanische stijfheid matrix op een complexe wijze met een gecoördineerde hiërarchische mechanisch-chemisch systeem bestaande uit adhesiereceptoren en geassocieerde signaaltransductie membraaneiwitten, het cytoskelet architectuur en moleculaire motors 1, 2. Mechanische gevoeligheid van verschillende kankercellen in vitro voornamelijk onderzocht met onsterfelijk gemaakte cellijnen of primaire cellen van muizen afgeleide, niet met primaire humane kankercellen. Derhalve is er weinig bekend over de mechanische gevoeligheid van primaire humane colon kankercellen in vitro. Hier, wordt een geoptimaliseerd protocol ontwikkeld die de isolatie van primaire humane colon van gezonde cellen en kankercellen chirurgische menselijke weefselmonsters beschreven. Geïsoleerd colon cellen worden vervolgens met succes gekweekt op zachte (2 kPa stijfheid) en stijf (10 kPa stijfheid) polyacrylamide hydrogels en stijve polystyreen (~ 3,6 GPa stijfheid) substraten gefunctionaliseerd door een extracellulaire matrix (fibronectinein dit geval). Fluorescerende microbolletjes zijn ingebed in zachte gels in de buurt van de celkweek oppervlak, en tractie test wordt uitgevoerd om cellulaire samentrekkende spanningen met behulp van gratis open toegang software te beoordelen. Bovendien immunofluorescentie microscopie van verschillende stijfheid substraten nuttige informatie over primaire celmorfologie, cytoskelet organisatie en vinculin met focale adhesies als functie van substraat stijfheid.
Introduction
De laatste jaren is het steeds duidelijker geworden dat de mechanische micro-omgeving, naast biochemische factoren, speelt een belangrijke rol bij het reguleren cel functionaliteiten. Cellen kunnen detecteren en reageren op de stijfheid substraat waarop zij worden nageleefd (zoals in 2D kweek) en omringd door (zoals in 3D kweek) 3-7. Hierdoor kunnen cellen hun differentiatie 3, morfologie 4, migratie / motiliteit 5, biofysische eigenschappen 6, 7 groei, en andere processen moduleren.
Kankercellen ook reageren op de 2D- en 3D-matrix stijfheid met behulp van een gecoördineerde, hiërarchische mechanisch-chemische combinatie van adhesie receptoren en bijbehorende signaaltransductie membraaneiwitten, het cytoskelet architectuur en moleculaire motoren 1, 2. Bijvoorbeeld, borstklier epitheelcellen (MEC) vormen normale acinaire parenchym wanneer gekweekt op 150 Pa substraten die vergelijkbaar is met de stijfheidgezonde borstklierweefsel. Interessant is dat ze de kenmerken van een zich ontwikkelende tumor, zowel structureel als transcriptie, indien gekweekt op stijver substraten (> 5000 Pa), die de stijfheid van een tumor stroma 8 nabootsen. Bovendien, een ander experiment toont aan dat borst tumorigenese gepaard gaat met collageen verknoping en ECM verstijving 9. Recente experimenten tonen dat humane colon carcinoma (HCT-8) cellen vertonen metastase fenotype (MLP) wanneer zij gekweekt op 2D substraten met fysiologisch relevante stijfheid (20-47 kPa), maar niet op zeer stijf (3,6 GPa) substraten 10- 12 .Deze cellen eerste vorm tumorachtige celclusters en dissociëren van elkaar, vanaf de periferie. Aangezien dit epitheliale naar afgeronde morfologische (E R overgang) verandering optreedt, ze vermenigvuldigen, te verminderen cel-cel en cel-ECM adhesie, en word trekvogels. HCT-8 cellen gekweekt op heel hard polystyreen substraten zijn deze niet vertonenkwaadaardige trekken. Dus het is de hypothese dat HCT-8 cellen uitgezaaide vanwege hun blootstelling aan geschikte micro-omgeving. Vermeldenswaard is dat deze experimenten uitgevoerd met geïmmortaliseerde kankercellijnen of muizen afgeleide primaire cellen, niet met primaire humane kankercellen worden uitgevoerd.
Een recent onderzoek stelt aangevulde cellulaire traction stress, kunnen worden toegepast als een mogelijke biofysische signatuur voor metastatische cellen 13 .De studie omvat het meten trekkracht voor verschillende humane kankercellijnen op polyacrylamide gels. Het blijkt dat metastatische kankercellen significant hoger traction stress kan uitoefenen in vergelijking met niet-metastatische cellen in alle gevallen 13. Echter, deze resultaten direct in tegenspraak met de eerder gepubliceerde bevindingen muizen afgeleide borstkankercellijnen 14. Ook een recent onderzoek ook opvallende verschillen tussen geïmmortaliseerde en primaire humane cellen in het cytoskelet remodeling proeiwit profilering en overleving van de cel eiwit expressie 15. Daarom is het belangrijk voor veel van de biofysische analyses inclusief tractie voor primaire humane kankercellen opnieuw. Dit zal de vraag te beantwoorden of de primaire cellen recapituleren geïmmortaliseerde kanker cellijnen tractie trend.
De hier beschreven protocol geoptimaliseerd voor isolatie van primaire humane colon cellen (zowel gezonde en kanker), en ze te kweken op zachte substraten (polyacrylamide hydrogels) en op petrischalen. Het protocol is gebaseerd op de spijsvertering en de daaruit voortvloeiende enzymatische dissociatie van chirurgische weefselmonster in enkele celsuspensie 16. Voor zover wij weten is dit de eerste demonstratie van het kweken geïsoleerde primaire colon tumor en normale cellen direct op zachte hydrogel substraten met ingebedde fluorescente microkraaltjes tractie cytometrie. Transparante gel substraten immunokleuring ook mogelijk. Deze test toonde verschillen in F-actine organisatiefocale adhesies in primaire menselijke dikke darm cellen als substraat stijfheid veranderingen. Dit celcultuur platform opent de mogelijkheid van het verkennen van de verschillende biofysische eigenschappen van primaire menselijke cellen zoals mobiele stijfheid en tractie als parameters voor kanker prognostiek.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
De hieronder beschreven protocol volgt de richtlijnen van UIUC menselijk onderzoek ethische commissie.
1. Verzameling en de spijsvertering van Surgical weefselmonster
- Verzamel de tumorweefsel monster direct na colon resectie (figuur 1A en 1B). Verzamel weefsel van een aangrenzende gezonde site ook.
- Breng het weefsel onmiddellijk naar een 15 ml flesje met 12 ml HBSS oplossing. Houd de flacon op het ijs in een geïsoleerde schuim doos.
- Vervoeren het weefsel met flacon een weefselkweek kap voor verdere verwerking binnen 45 min. Houd de flacon op een ijsblok in de kap.
- Giet de meegeleverde weefsel in een 6-wells plaat met 6-7 ml van HBSS oplossing met behulp van een pipet.
Let op: Bedrag van weefsel per put is niet kritisch in deze spoelen stap. - Houd de 6 wells plaat op een ijsblok. Spoel het weefsel in HBSS oplossing tweemaal.
- Snijd weefsel netjes in gescheiden secties met steriele GCBsor. Gehakt weefsel in kleinere secties niet groter dan 1-2 mm3 in grootte met een steriele scalpel.
- Weeg een gemerkt 0,1% trypsine injectieflacon (met 1 ml van 0,1% trypsine oplossing) alvorens het weefsel. Overdracht ~ 20 mg weefsel in elk van de 0,1% trypsine flesjes met een pipet.
- Probeer de overdracht van HBSS in de trypsine flacon minimaliseren verdere verdunning van trypsine te voorkomen.
- Weeg de trypsine flesjes na weefsel overdracht; documenteren van het verschil als de massa weefsel.
- Giet ~ 20 mg weefsel en 1 ml trypsine in elk putje van een 24 putjesplaat.
- Plaats de 24 wells plaat op schudder in koelkast bij 4 ° C gedurende 16-20 uur. Tijdens deze wachttijd of op een eerder tijdstip, bereiden polyacrylamidegel substraten en functionaliseren ze met ECM-eiwitten zoals beschreven in paragraaf 3.
2. Enzymatische dissociatie van weefselmonster in enkele celsuspensie en kweken van geïsoleerde cellen op ECM Gefunctionaliseerde Elastic Substrates en Rigid polystyreen Gerechten
- Na 16-20 uur incubatie in zowel trypsine bij 4 ° C op schudinrichting overbrengen weefsel van 4 ° C trypsine tot 4 ° C compleet groeimedium injectieflacon (die 2-3 ml compleet kweekmedium) met een pipet. Zorg voor een minimale overdracht van trypsine in groeimedia.
Opmerking: de volledige groeimedia formulering als volgt: RPMI 1640 basismedium gesupplementeerd met paardenserum tot een eindconcentratie van 10% en penicilline-streptomycine tot 1% van de totale oplossing. - Plaats het weefsel bevattende media flacon in een warmwaterbad bij 37 ° C gedurende 12-15 min.
- Overdracht van het weefsel aan een 15 ml flacon met HBSS oplossing met behulp van een pipet, schud voorzichtig.
- Herhaal 2.3.
- Verwijder weefsel uit HBSS oplossing en transfer naar 0,1% collagenase oplossing (in HBSS) injectieflacon met 1 ml oplossing. Incubeer gedurende 45 minuten bij 37 ° C en 5% CO2 in een bevochtigde omgeving celkweek incubator. Tijdens de wachttijd, warm growth media in een 15 ml flesje bij 37 ° C in een waterbad.
- Trek alle weefsel fragmenten in pipet minimaliseren collagenase overdracht. Werp gewoon het weefsel fragmenten in voorverwarmde kweekmedia flacons.
- Plaats een 40 micrometer goed insert filter in elk putje van een 6-wells plaat. Bevochtig het filter met 1 ml celcultuur media.
- Vermaal weefsel in de media met een 10 ml glazen pipet meerdere keren totdat het weefsel volledig is gescheiden.
- Handhaaf de pipetpunt zo dicht mogelijk bij de bodem van de flacon.
- Stort de oplossing op het filter om vuil en ongedissocieerde onderdelen te verwijderen.
- Centrifugeer gefilterd celsuspensie in media bij 150 xg gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
- Verwijder de bovenstaande vloeistof achteraf en resuspendeer celpellet met 2 ml vers kweekmedium.
- Tel de cellen met een hemocytometer (indien nodig). Geïsoleerd zaad primaire cellen aan de extracellulaire matrix (ECM) gefunctionaliseerd gels en polystyreen gerechten op de gewenste concentratie.
3. Voorbereiding en functionalisering van andere stijfheid Polyacrylamide (PA) Gels en polystyreen Substrates
Opmerking: Voor visuele demonstratie van hoofdstuk 3, de kijkers / lezers worden verwezen naar een recente Journal of Visualized Experiments (Jupiter) artikel 17.
- Vaststelling gepubliceerde protocollen 18, 19, activeer 12 mm 2 glazen dekglaasjes chemisch covalente binding van de hydrogel te waarborgen.
- Ten eerste behandelen glazen dekglaasjes met 3- Aminopropyltrymethoxysilane (ATS) gedurende 7 minuten bij kamertemperatuur.
- Verwijder de ATS volledig met DI-water spoelen en te behandelen dekglaasjes met 0,5% Glutaraldehyde (verdund in PBS van 70% Glutaraldehyde voorraad oplossing) oplossing voor 30 min.
- Verkrijgen 2 kPa gel oplossingen door mengen 5% g / v acrylamide-oplossing en 0,05% N, N'-methylenebisacrylamide (bis) oplossing in 10 mM HEPES-gebufferde zoutoplossing 20. Met 8% w / v acrylamide en 0,13% N, N'-methylenebisacrylamide (bis) oplossing in 10 mM HEPES-gebufferde zoutoplossing 10 kPa gel 20.
- In beide gevallen gebruikt 1: 200 ammoniumpersulfaat (10% w / v) en 1: 2000 N, N, N ', N'-tetramethylethyleendiamine (TEMED) als initiator en katalysator voor de polymerisatie resp.
- Ook, voeg 100 ul fluorescerende kralen 2 kPa geloplossing als fiduciaire markers 21, 22.
- Stort een daling van 20 pi pre-polymeer PA gel oplossing op de 12 mm 2 geactiveerd glas dekglas. Leg nog eens 12 mm 2 standaard glazen deksel slip op de drop. Zorg ervoor dat de daling zich verspreidt tussen de dekglaasjes als gevolg van capillaire werking. Inverteer de sandwich van 2 kPa gels zodat de meeste van de korrels naderen de celkweek oppervlak.
- Hard de PA gel gedurende 45 minuten bij kamertemperatuur.
- Trek het deksel slip met behulp van een enkele rand scheermes.
Opmerking: Tijdens het schillen, onthechting voortkomt uit een randvan de sandwich. De gel blijft hechtend aan de geactiveerde glasplaatje. - Bewaar de gels in PBS oplossing voor gebruik.
- Functionaliseren PA gels en glas met ECM-moleculen, menselijke fibronectine in een concentratie van 50 ug / ml volgens gepubliceerde werkwijzen 23.
- In het kort, incubeer substraten met 2 ml pure hydrazinehydraat O / N.
- Verwijder hydrazinehydraat en spoel de substraten grondig met DI water.
- Was de substraten met 5% azijnzuur gedurende 30 min.
- Verwijder azijnzuur en spoel de substraten grondig met DI water.
- Houd de substraten ondergedompeld in DI-water gedurende 30 min.
- Incubeer de substraten met geoxideerde fibronectine gedurende 35 min bij een concentratie van 50 ug / ml.
- Spoel de substraten met PBS op schudinrichting bij lage rpm gedurende 10 min.
- Incubeer alle substraten bij 37 ° C in 2-3 ml kweekmedium gedurende 30 min voor het uitplaten van de cellen.
Opmerking: Plaat cellen in een dun populated manier (1000-3000 cellen / cm 2). Elke gel bedekte glas slip moet worden opgenomen in een 35 mm petrischaal. Laat cellen volledig hechten voordat microscopie (ten minste O / N).
4. Traction Force Microscopy en immunofluorescentiemicroscopie Testen
- Traction Force Microscopy Assay
- Warm 0,25% trypsine-EDTA / 10% SDS-oplossing bij 37 ° C in een waterbad gedurende 10 minuten voor tractie experimenten beginnen.
- Verwijder een gel uit de celkweek incubator op een tijd en plaats van de fluorescentie microscoop omgekeerde fase (32x vergroting).
- Een cel in gezichtsveld. Verwijder de petrischaal deksel.
- Neem een fase contrast beeld van de cel (bijvoorbeeld figuur 3).
- Schakel de imaging-modus om fluorescentie en selecteer de gewenste filter. Verplaats de microscoop podium of monster gedurende deze tijd.
- Neem een beeld van de fluorescerende kralen displaced door cellulaire tractie (Figuur 4C).
- Voeg 1 ml trypsine / SDS oplossing petrischaal de cel gel los. Verplaats de microscoop podium of monster gedurende deze tijd. Ook een controle beeld van de cel te nemen om volledige verwijdering van de gel te waarborgen.
- Neem een referentie (null kracht) beeld van de kralen nadat de cel wordt verwijderd.
- Herhaal de stappen 4.1.2-4.1.8 voor alle andere gels.
- Maak een image stack met ImageJ van de twee beelden verworven in stap 4.1.6 en 4.1.8 voor elk geval. Om de afbeelding stapel genereren, gebruiken volgende reeks commando's in ImageJ na het openen van de afbeeldingen: Afbeelding → Stacks → Afbeeldingen te stapelen.
- Om het veld verplaatsing en de tractie te krijgen, gebruiken ImageJ plugins volgende gepubliceerde methoden 21, 22 verkrijgen codes en gedetailleerde tutorials voor deze plugins via de volgende link:. https://sites.google.com/site/qingzongtseng/imagejplugins.
- Lijn de beelden in de stapel met behulp van de 'Template Matching' plugin. Gebruik volgende reeks commando's in ImageJ na het openen van het beeld stack gegenereerd in stap 4.1.10: Plugins → Template Matching → Align Slices in Stack → OK. Sla de afbeelding stapel dus. Met deze nieuwe afbeelding stapel in de volgende stappen.
- Verkrijgen van het veld verplaatsing met de PIV (Particle Image Velocimetry) plugin (figuur 4D). Gebruik volgende reeks commando's na het openen van de afbeelding stapel opgeslagen in stap 4.1.11.1: Plugins → PIV → Iterative PIV (Basic) → OK → Accepteer deze PIV en output → Ok. Sla de PIV output in dezelfde map als in het originele beeld stack. Gebruik dit als input in de volgende stap.
- Eindelijk gebruik maken van de FTTC (Fourier-transformatie tractie cytometrie) plugin om de tractie kaart (Figuur 4E) te verkrijgen. Gebruik volgende reeks commando's: Plugins → FTTC → Insert eigenschappen van het materiaal, dat wil zeggen, Young's modulus en de verhouding van de PA gel → OK → Poisson's Kies het PIV output bestand opgeslagen in stap 4.1.11.2 → OK. Save FTTC resulteert in dezelfde map als in het beeld stack en PIV output.
- Immunofluorescentiemicroscopie Assays
- Neem de substraten te immunostained aan de laminaire kap en verwijder het kweekmedium.
- Spoel de substraten met PBS en bevestig de cellen met 4% paraformaldehyde in PBS gedurende 20 min bij kamertemperatuur.
- Was de substraten met PBS gedurende 3 maal (5 min per keer). Bijgevolg incubeer de substraten met 500 gl signaal versterker gedurende 30 min en spoel met PBS.
- Incubeer de cellen met monoklonale anti-vinculin antilichaam bij een 1: 250 verdunning in PBS gedurende 45 min bij kamertemperatuur. Was de substraten met PBS gedurende 3 maal (5 min per keer).
- Incubeer de monsters met secundaire antilichaam Alexa Fluor 488 geit anti-muis IgG bij een 1: 200 verdunningin PBS bij kamertemperatuur gedurende 30 min. Was de substraten met PBS gedurende 3 maal (5 min per keer).
- Om de F-actine structuur visualiseren, incubeer cellen met TRITC falloïdine conjugaten bij een concentratie van 50 ug / ml gedurende 45 minuten bij kamertemperatuur. Was de substraten met PBS gedurende 3 maal (5 min per keer).
- Afbeelding van de monsters met behulp van confocale laser scanning microscoop (Figuur 5A - 5D).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De bovenbeschreven protocol met succes toegepast voor meerdere weefselmonsters (n = 12) vanaf vier patiënten onder richtlijnen van het Institutional Review Board. Figuur 1A illustreert een representatieve colorectale tumor direct na operatie waaruit de weefselcoupes van celcultures verkregen. Een typische weefselsectie in HBSS oplossing na overdracht aan de laminaire kap voor verdere verwerking getoond in figuur 1B. Een schema van enzymatische digestie en dissociatie van chirurgische weefselmonster in enkele celsuspensie wordt getoond in figuur 2.
Na een succesvolle weefsel dissociatie, worden geïsoleerde primaire menselijke cellen gezaaid op PA gels en polystyreen gerechten. Fase contrast microfoto (figuur 3A en 3B) illustreren de representatieve morfologie van primaire humane dikke darm en normale cellen als functie van substraat stijfheid. Het is duidelijk datprimaire colon cellen (zowel gezonde en kanker) verspreiden zich op polystyreen schotels vergeleken met PA gels (figuur 3A en 3B).
Traction testen worden uitgevoerd op ECM (fibronectine) gecoate soft 2 kPa gels na bevestiging van invasieve adenocarcinoom van pathologische H & E kleuring (Figuur 4A). PA gels gelijkmatig gecoat met fibronectine zoals getoond in figuur 4B. Voor de overzichtelijkheid moeten alle tractie experimenten tumor en gezonde darm cellen worden uitgevoerd op hetzelfde moment. Figuur 4C toont een momentopname van nanoschaal fluorescerende kralen ingebed in de gel. Uit de verplaatste en referentie bead afbeeldingen, worden de verplaatsingsvelden verkregen met de ImageJ PIV plug 21, 22. Een representatieve bead verplaatsingsveld opgewekt door invasieve colontumorcellen on 2 kPa gel wordt getoond in figuur 4D. Figuur 4E toont traction stress verkregen met behulp van ImageJ FTTC plugin overeenkomen veld om verplaatsing in figuur 4D 21, 22.
Figuur 5 toont de F-actine en vinculin die focale adhesies van primaire humane colon cellen op zachte gels 2 kPa en polystyrol substraten. Nr actine vezel aanwezig in de minder spread cellen op zachte gels (Figuur 5A1 - 5A2). Punctaat vinculin met focale adhesies aanwezig zijn op zachte gels (Figuur 5B1 - 5B2). Omgekeerd primaire cellen vertonen goed gespreid morfologie, goed gedefinieerde actine stress-vezels en discrete langwerpig focale adhesies op harde ondergronden polystyreen (figuren 5C - 5D).
Figuur 1. (A) Tumor colon na resectie. (B) Weefsel secties van de tumor voor celisolatie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2. Schematische voorstelling van de spijsvertering en de enzymatische dissociatie van chirurgische weefselmonster in enkele celsuspensie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3. Succesvolle primaire humane colon celkweek (zowel kanker en normaal) op verschillende stijfheid gels en op polystyreen schotel. Fase contrast beelden tonen tyPical morfologie van (A) Tumorcellen en (B) de normale cellen op verschillende stijfheid ondergronden. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4. (A) H & E-kleuring bevestigd invasief adenocarcinoom. (B) Fibronectine blijkt dat gels uniform worden bekleed met ECM-moleculen. (C) nanoschaal kralen ingebed in gel als fiduciaire markers. (D) Vertegenwoordiger verplaatsing veld gegenereerd door tumorcellen op zachte PA gel met behulp van PIV plugin in ImageJ, zoals beschreven in 4.1.11.2. (E) Traction stress-uitgeoefend door tumorcellen op zachte gel overeenkomend veld om verplaatsing in (D) verkregen via FTTC plug in in ImageJ, zoals beschreven in 4.1.11.3. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5. Immunofluorescente kleuring van F-actine en vinculin op zachte gel en harde polystyreen substraten. Nr actine vezel aanwezig in de minder spread (A1) tumorcel of (A2) normale cellen op zachte gels 2 kPa. Punctaat vinculin met focale adhesies aanwezig op zachte gels zijn (B1 - B2). Omgekeerd primaire cellen vertonen goed gespreid morfologie, goed gedefinieerde actine stress-vezels (C1 - C2) en discrete langwerpig focale adhesies (D1 - D2) op harde polystyreen substraten.2 / 52532fig5large.jpg "target =" _ blank "> Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Cellular tractie spanning is onlangs naar voren gekomen als een potentiële biofysische indicator van metastatische staat 13. Echter, geen experimentele tractie gegevens met primaire tumorcellen bestaat in de literatuur tot nu toe. Ook wordt direct kweken geïsoleerde primaire colon cellen op verschillende stijfheid polyacrylamidegelen nog niet gemeld. Vandaar dit een optimale primaire colon celkweekomstandigheden op gels en polystyreen (figuur 2) vast. Fluorescerende microbolletjes inkapseling buurt celcultuur oppervlak tijdens zachte gel voorbereiding maakt het meten van de verplaatsing veld en traction gegenereerd door primaire menselijke cellen (Figuur 4C, 4D en 4E). Bovendien kan immunofluorescentie assays belangrijke informatie over cytoskelet organisatie en focale adhesies als substraat stijfheid veranderingen (- 5D figuur 5A) te verschaffen. Merk op dat verschillende kanker en normale geïmmortaliseerde cellijnen ook tonen versterkt verspreiden, actine stress-bundel vorming en volwassen langgerekte focale adhesies met een verhoogde stijfheid substraat 4, 24-25.
Het protocol kan gemakkelijk worden vastgesteld / gewijzigd voor isolatie van cellen uit primaire chirurgische weefsels van verschillende menselijke organen of andere dieren. De incubatietijd van weefsel in de dissociatie agents - trypsine en collagenase - moet empirisch worden geoptimaliseerd voor elke toepassing. Bovendien is de grootte filter voor het verwijderen van puin en ongedissocieerde weefseldelen is ook een belangrijke parameter moet kiezen, gebaseerd op de verwachte maximale celgrootte onderbroken toestand (40 urn dit protocol).
Een beperking van de methode is dat een paar zachte gels consistente lokalisatie van de fluorescerende kralen in de buurt van celcultuur oppervlak (paragraaf 3.3), die nadelig kan zijn voor de volgende tractie cytometrie metingen (paragraaf 4.1) kunnen missen. Dit kan gemakkelijk worden omzeild door het onderzoekende gel oppervlak kraal dichtheid en distributie met behulp van fluorescentie microscopie voor celkweek. Bijgevolg kan gels met relatief niet-homogene verdeling kraal worden weggegooid. Een andere benadering is een recentelijk voorgestelde methode die precieze lokalisatie van de korrels bij de celkweek oppervlak 17 dit toelaat.
Voorzichtigheid moet worden genomen om te beginnen met de verwerking van de chirurgische monsters zodra zij worden ontvangen, bij voorkeur binnen 45 minuten. De meest cruciale stap in het protocol is de optimale belichtingstijd van het weefsel in de trypsine en collagenase oplossing isolatieopbrengst bereiken, maar voldoende cellevensvatbaarheid behouden. Voor het kweken van de cellen op zachte hydrogels, de kraal dichtheid en verdeling moet worden bevestigd met behulp van fluorescentiemicroscopie. Ook, een null kracht moet worden verworven na het bevestigen dat de cel volledig los van het gel oppervlak.
Samengevat, wordt een protocol beschreven dat hergebruiktaten gescheiden enkele cellen schorsing van chirurgische kanker / normaal weefselmonster. Deze isolatie van enkele primaire tumor cellen van chirurgische exemplaren gevolgd door hun cultuur op de zachte en harde substraten maakt verschillende downstream biofysische metingen, bijvoorbeeld, mobiele stijfheid met AFM, intracellulaire reologie behulp gemicroinjecteerd deeltjes, celmigratie / beweeglijkheid en blaasje dynamiek analyse. Deze metingen kunnen worden gebruikt voor de prognose van kanker. Het protocol is met succes gebruikt voor de extractie en cultuur van murine cardiomyocyten en 26. De hier gepresenteerde methode kan worden gebruikt om primaire humane cellen te isoleren van chirurgische weefsels van diverse organen en kweken ze rechtstreeks op verschillende stijfheid substraat Mechanobiology studies.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| HBSS | Life technologies | 14175-095 | |
| PBS | Lonza | 17-516F | |
| Trypsin | Worthington | LS003736 | |
| Collagenese | Worthington | LS004176 | |
| 3- Aminopropyltrymethoxysilane (ATS) | Sigma-Aldrich | 281778 | |
| Glutaraldehyde | Polysciences, Inc. | 01201-5 | |
| Acrylamide | Sigma-Aldrich | A4058 | |
| N-methylenebisacrylamide (bis) | Sigma-Aldrich | M1533 | |
| HEPES buffer solution | Sigma-Aldrich | 83264 | |
| Ammonium persulfate | Bio-Rad | 161-0700 | |
| Human fibronectin | BD biosciences | 354008 | |
| Hydrazine hydrate | Sigma-Aldrich | 18412 | Hazardous |
| Acetic acid | Sigma-Aldrich | A6283 | |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | RT15710 | |
| Signal enhancer | Life technologies | I36933 | |
| Monoclonal anti vinculin antibody | Sigma-Aldrich | V9131 | |
| Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG | Life technologies | A11001 | |
| TRITC phalloidin conjugates | Sigma-Aldrich | P1951 | |
| 0.1 µm fluroscent beads | Life technologies | F8801 | |
| 0.25% Trypsin-EDTA | Life technologies | 25200-056 | |
| Materials | |||
| 12 mm2 glass cover slips | Corning | 2865-12 | |
References
- Ingber, D. E. Can cancer be reversed by engineering the tumor microenvironment. Semin. Cancer Biol. 18, 356-364 (2008).
- Kumar, S., Weaver, V. M. Mechanics, malignancy, metastasis: the force journey of a tumor cell. Cancer Metastasis Rev. 28, 113-127 (2009).
- Engler, A. J., Sen, S., Sweeney, H. L., Discher, D. E. Matrix elasticity directs stem cell lineage specification. Cell. 126, 677-689 (2006).
- Yeung, T., et al. Effects of substrate stiffness on cell morphology, cytoskeletal structure, and adhesion. Cell Motil. Cytoskeleton. 60, 24-34 (2005).
- Pelham, R. J., Wang, Y. L. Cell locomotion and focal adhesions are regulated by substrate flexibility. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 94 (25), 3661-3665 (1997).
- Solon, J., Levental, I., Sengupta, K., Georges, P. C., Janmey, P. A. Fibroblast adaptation and stiffness matching to soft elastic substrates. Biophys. J. 93, 4453-4461 (2007).
- Wang, H. B., Dembo, M., Wang, Y. L. Substrate flexibility regulates growth and apoptosis of normal but not transformed cells. Am. J. Physiol. Cell. Physiol. 279, 1345-1350 (2000).
- Paszek, M. J., et al. Tensional homeostasis and the malignant phenotype. Cancer Cell. 8, 241-254 (2005).
- Levental, K. R., et al. Matrix crosslinking forces tumor progression by enhancing integrin signaling. Cell. 139, 891-906 (2009).
- Tang, X., et al. Mechanical force affects expression of an in vitro metastasis-like phenotype in HCT-8 cells. Biophys. J. 99, 2460-2469 (2010).
- Ali, M. Y., Saif, M. T. A. Substrate Stiffness Mediated Metastasis Like Phenotype of Colon Cancer Cells is Independent of Cell to Gel Adhesion. Cell. Mol. Bioeng. , (2014).
- Ali, M. Y., Chuang, C. Y., Saif, M. T. A. Reprogramming cellular phenotype by soft collagen gels. Soft Matter. , (2014).
- Kraning-Rush, C. M., Califano, J. P., Reinhart-King, C. A. Cellular traction stresses increase with increasing metastatic potential. PLoS ONE. 7 (2), e32572 (2012).
- Indra, I., Undyala, V., Kandow, C., Thirumurthi, U., Dembo, M., Beningo, K. A. An in vitro correlation of mechanical forces and metastatic capacity. Phys. Biol. 8 (1), (2011).
- Alge, C. S., Hauck, S. M., Priglinger, S. G., Kampik, A., Ueffing, M. Differential protein profiling of primary versus immortalized human RPE cells identifies expression patterns associated with cytoskeletal remodeling and cell survival. J. Proteome Res. 5 (4), 862-878 (2006).
- Oikonomou, E., Kothonidis, K., Zografos, G., Nasioulas, G., Andera, L., Pintzas, A. Newly established tumourigenic primary human colon cancer cell lines are sensitive to TRAIL-induced apoptosis in vitro and in vivo. Br. J. Cancer. 97 (1), 73-84 (2007).
- Knoll, S. G., Ali, M. Y., Saif, M. T. A. A novel method for localizing reporter fluorescent beads near the cell culture surface for traction force microscopy. J. Vis. Exp. (91), (2014).
- Wang, Y. L., Pelham, R. Preparation of a flexible, porous polyacrylamide substrate for mechanical studies of cultured cells. Methods in Enzymology. 298, 489-496 (1998).
- Tang, X., Ali, M. Y., Saif, M. T. A. A novel technique for micro-patterning proteins and cells on polyacrylamide gels. Soft Matter. 8, 3197-3206 (2012).
- Tse, J. R., Engler, A. J. Preparation of hydrogel substrates with tunable mechanical properties. Current Protocols in Cell Biology. , 10-16 (2010).
- Tseng, Q., et al. Spatial organization of the extracellular matrix regulates cell–cell junction positioning. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 109 (5), 1506-1511 (2012).
- Chopra, A., et al. Augmentation of integrin-mediated mechanotransduction by hyaluronic acid. Biomaterials. 35 (1), 71-82 (2014).
- Damljanovic, V., Lagerholm, B. C., Jacobson, K. Bulk and micropatterned conjugation of extracellular matrix proteins to characterized polyacrylamide substrates for cell mechanotransduction assays. Biotechniques. 39 (6), 847-851 (2005).
- Tilghman, R. W., et al. Matrix rigidity regulates cancer cell growth and cellular phenotype. PLoS ONE. 5 (9), e12905 (2010).
- Ulrich, T. A., de Juan Pardo, E. M., Kumar, S. The mechanical rigidity of the extracellular matrix regulates the structure, motility, and proliferation of glioma cells. Cancer Res. 69, 4167-4174 (2009).
- Williams, B. J., Anand, S. V., Rajagopalan, J., Saif, M. T. A. A self-propelled biohybrid swimmer at low Reynolds number. Nat. Commun. 5, (2014).
